Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja
6 marca 2015
Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.
Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie ludzkich wejść z tkanek jelitowych. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie błony śluzowej jelita z leżącej poniżej tkanki podśluzówkowej. Drugim krokiem jest inkubacja błony śluzowej z EDTA, aby promować dysocjację nabłonka od tkanki łącznej.
Następnie krypty jelitowe są oddzielane od zdysocjowanego nabłonka. Na koniec krypty jelitowe są hodowane w macierzy błony podstawnej. Ostatecznie techniki immunohistochemiczne są wykorzystywane do pokazania organizacji nabłonka, a także specyficznych markerów nabłonkowych hodowanych OID.
Implikacją tej metody jest fakt, że możemy teraz generować OID z biopsji specyficznych dla pacjenta, co oznacza, że możemy teraz wykorzystać tę tkankę w laboratorium do przyjrzenia się chorobom jelit i diagnozom, czego wcześniej nigdy nie byliśmy w stanie zrobić. Po przygotowaniu i odczynników, zgodnie z protokołem tekstowym, rozmrozić błonę podstawną na lodzie i wstępnie inkubować 24-dołkową płytkę w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza, gdy tkanka zostanie otrzymana. Użyj PBS KO bez wapnia i magnezu lub DPBS do umycia tkanki, aż DPBS będzie czysty
.Umieść chusteczkę na pokrytej silikonem szklanej szalce Petriego wypełnionej lodowatym DPBS, stroną śluzówkową skierowaną do góry i za pomocą szpilek minuchin zabezpiecz tkankę, rozciągając ją i przypinając. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, użyj nożyczek do mikropreparacji i drobno zakrzywionych kleszczyków, aby usunąć leżącą pod spodem błonę śluzową i tkankę łączną. Następnie stroną błony śluzowej skierowaną do góry, rozciągnij i przypnij wypreparowaną błonę śluzową płasko do szklanej szalki Petriego pokrytej silikonem.
Za pomocą zakrzywionych kleszczy delikatnie zeskrob powierzchnię błony śluzowej. Ten krok jest konieczny, aby poprawić jakość preparatu. Przykryj błonę śluzową świeżo przygotowanym dwumilimolowym buforem chelatującym EDTA.
Następnie, po umyciu tkanki na lodzie, trzy do czterech razy zgodnie z protokołem tekstowym pod mikroskopem preparacyjnym, użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie zeskrobać błonę śluzową, aby uwolnić krypty jelitowe za pomocą pipety. Delikatnie usuń zawiesinę krypty z szalki Petriego i przenieś ją do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie sprawdź tkankę, aby upewnić się, że prawie wszystkie krypty zostały usunięte z błony śluzowej.
Przefiltruj zawiesinę krypty przez filtr o średnicy 150 mikrometrów dwa razy i użyj mikroskopu, aby sprawdzić przepływ Po umyciu zawiesiny krypty i przeniesieniu potrzebnej liczby krypt do pięciomililitrowej probówki z okrągłym dnem, zgodnie z protokołem tekstowym, odwirować frakcję krypty przez 10 minut w temperaturze 150 G i czterech stopniach Celsjusza. Następnie usunąć supernatant za pomocą wstępnie schłodzonych końcówek pipet i matrycy membrany podstawnej Resuspend. Śrut krypty.
Nałóż 50 mikrolitrów zawiesiny krypty w matrycy błony podstawnej na studzienkę do wstępnie podgrzanej płyty, powoli wyrzucając matrycę błony podstawnej w środku studzienki. Inkubować płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby umożliwić pełną polimeryzację matrycy błony podstawnej. Następnie nałóż na matrycę błony podstawnej 500 mikrolitrów kompletnego ludzkiego podłoża mini jelitowego, uzupełnionego o 2,5 mikromola każdego z CHIR 9 0 2 2 1.
Thien inkubuje tkankę, zmieniając podłoże po dwóch dniach, a następnie co drugi dzień. Rysunek ten pokazuje typowy przykład świeżo wyizolowanych krypt z całej tkanki. Liczba krypt wyizolowanych z biopsji jest mniejsza niż w całej tkance.
Dwa ugryzienia biopsyjne są zwykle wykonywane podczas jednego przejścia. Każde ugryzienie biopsyjne daje powierzchnię o powierzchni 10 milimetrów kwadratowych ze średnią od 50 do 100 zagnieceń na biopsję. Po hodowli i macierzy błony podstawnej przez pięć do sześciu dni, Cripsy zaokrąglają się, tworząc kule entero dla jelita cienkiego i kule okrężnicy dla okrężnicy i są pasażowane po siedmiu dniach.
Wejścia lub OID powstałe z pokazanych tutaj biopsji ulegają takiemu samemu rozwojowi przy mniejszej gęstości podczas wysiewu. Dlatego pakowanie odbywa się zwykle po 10 do 12 dniach w kulturze. Jak pokazano tutaj, zarówno OID, jak i OID mają stronę luminalną i są wyłożone nabłonkiem.
Komórki proliferacyjne można zaobserwować w obrębie OID i znajdują się one na końcach pąków. Obrazowanie konfokalne OID barwionych e katryną tutaj na zielono pokazuje komórki nabłonkowe. Rysunek ten przedstawia wejście rosnące u pacjenta z mukowiscydozą i enteropatią kępkową spowodowaną wrodzoną mutacją w genie cząsteczki adhezyjnej komórek nabłonka.
Postępując zgodnie z tą procedurą lub metodą, taką jak PCR w czasie rzeczywistym lub zachodnia krew, można użyć do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytanie dotyczące interesującego genu lub prob. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak konsekwentnie izolować ludzkie Crips, aby móc skutecznie generować dane wejściowe w swoim laboratorium, aby odpowiedzieć na pytania specyficzne dla pacjenta.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę hodowli ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego oraz kolonoidów z krypt jelita grubego. Protokół przedstawia kluczowe warunki hodowli niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania tych organoidów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Gastroenterologia
Wstęp
- Ludzkie enteroidy i kolonoidy są pochodne z tkanek jelita.
- Metoda ta umożliwia prowadzenie specyficznych dla pacjenta badań nad chorobami jelit.
- Wcześniejsze techniki nie pozwalały na efektywne wykorzystanie biopsji pacjentów.
- Immunohistochemia jest stosowana do analizy organizacji nabłonka.
Cel badania
- Wygenerowanie ludzkich organoidów z tkanek jelitowych.
- Ułatwienie badań nad chorobami jelit oraz diagnostyki.
- Poprawa zrozumienia zachowania komórek nabłonkowych w kulturze.
Zastosowane metody
- Oddzielenie błony śluzowej jelita od tkanki podśluzowej.
- Inkubacja z EDTA w celu dysocjacji nabłonka.
- Hodowla krypt jelitowych w matrycy błony podstawnej.
- Wykorzystanie obrazowania konfokalnego i immunohistochemii do analizy.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja krypt jelitowych z biopsji.
- Generowanie organoidów naśladujących strukturę jelit.
- Obserwacja komórek proliferujących w obrębie organoidów.
- Wykazanie rozwoju organoidów specyficznych dla pacjenta.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na wydajną generację ludzkich enteroidów.
- Otwiera ona możliwości badania specyficznych dla pacjenta schorzeń jelit.
- Przyszłe zastosowania obejmują analizę ekspresji genów oraz modelowanie chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ludzkie modele enteroidów i kolonoidów stanowią fizjologicznie istotny system do badania biologii nabłonka jelitowego oraz mechanizmów chorobowych. Podejście to umożliwia modelowanie chorób specyficznych dla pacjenta, wspierając walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka w fazie przedklinicznej w programach odkrywania leków ukierunkowanych na gastroenterologię. Metoda ta łączy biologię odkrywczą z badaniami translacyjnymi poprzez generowanie skalowalnych i powtarzalnych modeli tkanek pochodzenia ludzkiego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych z wykorzystaniem pochodzących od pacjenta komórek nabłonkowych jelita, które zachowują natywną różnorodność komórkową i polaryzację.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez modelowanie istotnych dla przebiegu choroby fenotypów nabłonkowych z materiału biopsyjnego.
- Wartość translacyjna: Zwiększa pewność prognostyczną dzięki zachowaniu specyficznego dla pacjenta tła genetycznego w skalowalnym systemie hodowli 3D.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Umożliwia generowanie standaryzowanych monowarstw nabłonkowych i sferoidów odpowiednich do wysokoprzepustowego obrazowania (high-content imaging) oraz procesów screeningu związków.
- Wynik ilościowy: Pozwala na pomiar organizacji, proliferacji i różnicowania nabłonka za pomocą immunohistochemii i obrazowania konfokalnego.
- Powtarzalność: Ustanawia spójne warunki izolacji i hodowli krypt, co jest kluczowe dla standaryzacji analizy pomiędzy laboratoriami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Modelowanie chorób: Umożliwia badanie specyficznych dla pacjenta schorzeń jelit, takich jak mukowiscydoza i enteropatia kępkowa, z wykorzystaniem organoidów pochodzących z biopsji.
- Ciągłość przedkliniczna: Wspiera przejście z etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez utrzymanie struktury nabłonka i aktywności komórek macierzystych w czasie.
- Korelacja z biomarkerami: Umożliwia zestawienie fenotypów organoidów z biomarkerami klinicznymi w celu podejmowania decyzji o dalszych etapach badań w oparciu o ocenę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków, dostarczając ludzkich modeli nabłonkowych do badań nad wiązaniem z celem, testów modulacji szlaków sygnałowych oraz badań toksyczności przed optymalizacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez kontrolowaną manipulację nabłonkiem jelitowym pochodzącym od pacjentów.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty do przesiewania związków dzięki standaryzowanemu wysiewowi krypt i osadzaniu w matrycy.
- Analityka: Umożliwia odczyty oparte na obrazowaniu (np. polaryzacja nabłonka, markery proliferacji), co pozwala na analizę porównawczą w różnych warunkach genetycznych lub terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez zachowanie specyficznych dla pacjenta mutacji i fenotypów nabłonkowych istotnych w zaburzeniach przewodu pokarmowego.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy odnawialną platformę do zastosowań w wielu projektach w zakresie walidacji celów, badań nad mechanizmem działania oraz profilowania bezpieczeństwa.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Przewidywalność i pewność w walidacji celu dzięki zastosowaniu fizjologicznie istotnych ludzkich modeli nabłonkowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane protokoły dysocjacji i hodowli zapewniają powtarzalność w różnych ośrodkach i przez różnych operatorów.
- Wartość strategiczna: Wsparcie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu poprzez redukcję niepewności biologicznej we wczesnej ocenie przedklinicznej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwienie priorytetyzacji związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich skuteczność i toksyczność w ludzkich systemach jelitowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Do pomyślnego generowania organoidów wymagana jest biegłość w technikach sekcji tkanek, izolacji krypt oraz hodowli 3D.
- Dostęp do macierzy błony podstawnej, zdefiniowanych mediów hodowlanych oraz inkubatorów z kontrolą stężenia CO2 jest niezbędny dla spójnego formowania organoidów.
- Standaryzacja przetwarzania biopsji i kwantyfikacji krypt jest konieczna dla współpracy międzyfunkcyjnej oraz porównywalności danych.
- Adaptacja do różnych regionów jelit (np. jelito cienkie vs jelito grube) wymaga optymalizacji warunków dysocjacji i hodowli.
- Długoterminowe utrzymanie wymaga regularnego pasażowania i wymiany medium, aby zapobiec utracie różnicowania oraz przerostowi.
