Name: Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Poznaj metodę izolacji krypt jelitowych i hodowlę enteroidów oraz kolonoidów z ludzkich biopsji. Technika ta umożliwia badania nad chorobami jelit i modelowanie pacjentospecyficzne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy Dr. Hansowi Cleversowi (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Holandia) za uprzejmy dar w postaci komórek TOPflash.
Ten projekt był częściowo wspierany przez NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Centrum Zdrowia Układu Pokarmowego); NIH UL1RR026314 (CTSA).

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty z użyciem tkanek ludzkich opisane tutaj zostały zatwierdzone przez IRB w CCHMC (IRB #2012-2858; #2014-0427). Świadomą zgodę na pobranie, przechowywanie i wykorzystanie próbek uzyskano od dawców z CCHMC.
1. Przygotowanie do kultury
UWAGA: Wszystkie odczynniki są wymienione w Tabeli 1.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy EDTA w następujący sposób: przygotować 0,5 M kwas etylenodiaminotetraoctowy o pH 8 (EDTA) w ultraczystymH2O, przefiltrować wysterylizowany filtrem 0,22 μm. Opcjonalnie roztwór podstawowy EDTA należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez czas nieokreślony.</li>
	<li>Przygotować bufor chelatujący w następujący sposób: zmieszać 2% sorbitolu, 1% sacharozy, 1% albuminy surowicy bydlęcej frakcji V (BSA) i 1x roztwór gentamycyny/amfoterycyny w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco bez Ca2+ i Mg2+ (DPBS), przefiltrować wysterylizowany filtrem 0,22 μm. Przygotować bufor chelatujący na świeżo.</li>
	<li>Przygotować pożywkę kondycjonowaną Wnt-3A w następujący sposób: Pożywka kondycjonowana Wnt-3A jest wytwarzana we własnym zakresie przy użyciu linii komórkowej L Wnt-3A zgodnie z instrukcjami producenta (ATCC, CRL-2647). Uzupełnij pożywkę 2 mM glutaminą, 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny, 100 g/ml streptomycyny, 1 suplementem N2, 1 suplementem B27, 1% BSA i przefiltruj wysterylizowany filtrem 0,22 μm. 
	UWAGA: Przetestuj każdą partię pod kątem aktywności Wnt za pomocą testu TOPflash. Użyj stabilnej linii komórkowej HEK293 TOPflash (laboratorium Hansa Cleversa) z zestawem do oznaczania lucyferazy Renilla zgodnie z instrukcjami producenta. Znormalizować test TOPflash za pomocą 100 ng/ml ludzkiego rekombinowanego Wnt-3A. Potwierdzić co najmniej 10-krotną zmianę aktywności kondycjonowanego podłoża w porównaniu z kontrolą. Podziel świeżą pożywkę kondycjonowaną Wnt-3A na 10 ml podwielokrotności w 15 ml stożkowych probówkach i zamrażaj w temperaturze -20°C przez okres do 6 miesięcy. Rozmrożone porcje należy przechowywać do 5 dni w temperaturze 4°C bez utraty aktywności.</li>
	<li>Przygotuj ludzkie podłoże dla minijelit w następujący sposób: Uzupełnij zaawansowaną pożywkę DMEM/F12 z 2 mM glutaminy, 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny, 100 g / ml streptomycyny, 1 suplementem N2, 1 suplementem B27, 1% BSA i filtrem sterylizowanym filtrem 0,22 μm. 
	UWAGA: Podziel świeżą ludzką pożywkę z minijelita na 10 ml porcji w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml i zamrażaj w temperaturze -20°C przez okres do 3 miesięcy. Rozmrożone porcje należy przechowywać do 5 dni w temperaturze 4°C bez utraty aktywności.</li>
	<li>Przygotować kompletną pożywkę dla ludzkiego minijelita w następujący sposób: przygotować świeże podłoże przed hodowlą krypt lub zmianą pożywki na pożywkę dla ludzkiego minijelita (patrz 1.4) uzupełnioną 50% pożywką kondycjonowaną Wnt-3A (patrz 1.3), 1 μg/ml R-spondyny 1 (rozcieńczenie 1:1 000 1 mg/ml podstawy), 100 ng/ml Noggin (rozcieńczenie 1:1 000 100 g/ml podstawy), 50 ng/ml EGF (rozcieńczenie 1:10 000 500 μg/ml podstawy), 500 nM A-83-01 (rozcieńczenie 1:1 000 dla 500 M zapasów), 10 μM SB202190 (1:3 000 rozcieńczenie dla 30 mM zapasów), 10 nM [Leu]15-Gastrin 1 (rozcieńczenie 1:10 000 dla 100 μM), 10 mM nikotynamidu (1:100 rozcieńczenie 1 M zapasu) i 1 mM N-acetylocysteiny (1:1 000 rozcieńczenie 1 M zapasu). 
	UWAGA: Przechowuj kompletne ludzkie podłoże minijelitowe do 2 dni w temperaturze 4°C bez utraty aktywności.</li>
</ol>
2. Izolacja krypty od całej tkanki
UWAGA: Z pobrania tkanek ważne jest, aby utrzymać próbkę w soli fizjologicznej. Zaleca się trzymanie tkanki na lodzie podczas transportu. Przygotowanie próbki do izolacji krypty powinno być wykonane jak najszybciej. 
UWAGA: Wszystkie odczynniki są wymienione w Tabeli 1, narzędzia, sprzęt i materiały eksploatacyjne są wymienione w Tabeli 2.
<ol>
	<li>Przygotuj wszystkie odczynniki przed rozpoczęciem eksperymentu. Rozmrozić matrycę błony podstawnej na lodzie i wstępnie inkubować 24-dołkową płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C. 
	UWAGA: Alternatywnie należy wykonać cienką warstwę matrycy membrany podstawnej, używając 15 μl/dołek w środku płytki 24-dołkowej i umieścić ją w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C. Ten fakultatywny krok utrzymuje macierz błony podstawnej jako kroplę podczas polimeryzacji.</li>
	<li>Umyj tkankę lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco bez Ca2+ i Mg2+ (DPBS). Kontynuuj, aż zawartość DPBS będzie jasna.</li>
	<li>Za pomocą szpilek o średnicy 0,2 mm zabezpiecz chusteczkę na szklanej szalce Petriego pokrytej silikonem wypełnionej lodowatym DPBS. Rozciągnij i przypnij tkankę płasko stroną śluzówkową skierowaną do góry.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym usuń leżącą błonę śluzową z błony podśluzowej i tkanki łącznej za pomocą nożyczek do mikropreparowania i kleszczyków z drobnym zakrzywionym punktem (ryc. 2A, B).</li>
	<li>Rozciągnij i przypnij rozciętą błonę śluzową płasko na szklanej szalce Petriego pokrytej silikonem, stroną z błoną śluzową skierowaną do góry. Pozostałą błonę podśluzową i tkankę łączną można wyrzucić lub wykorzystać do dalszych eksperymentów (ryc. 2C).</li>
	<li>Delikatnie zeskrob powierzchnię błony śluzowej zakrzywionymi kleszczami. Ten krok jest konieczny, aby poprawić jakość preparatu.
	<ol>
		<li>W przypadku jelita cienkiego delikatnie zeskrob błonę śluzową, aby usunąć kosmki.</li>
		<li>W przypadku okrężnicy delikatnie zeskrob błonę śluzową, aby usunąć śluz i zanieczyszczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj błonę śluzową 3-4 razy lodowatym buforem chelatacyjnym, aby usunąć kosmki i zanieczyszczenia.</li>
	<li>Przykryj błonę śluzową świeżo przygotowanym 2mM buforem chelatacyjnym EDTA (200 μl 0,5 M EDTA w 49,6 ml buforu chelatacyjnego).</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego na lodzie i delikatnie potrząsaj przez 30 minut na poziomym wytrząsarce orbitalnej.</li>
	<li>Umyj tkankę 3-4 razy lodowatym buforem chelatacyjnym bez EDTA. Po umyciu pozostaw błonę śluzową w lodowatym buforze chelatacyjnym.</li>
	<li>Przetwarzaj błonę śluzową pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą zakrzywionych i cienkich kleszczy. Delikatnie zeskrob błonę śluzową, aby uwolnić krypty jelitowe za pomocą zakrzywionych kleszczy.</li>
	<li>Delikatnie usunąć zawiesinę krypty z płytki Petriego za pomocą pipety i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: sprawdź tkankę, aby upewnić się, że prawie wszystkie krypty zostały usunięte z błony śluzowej.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę krypt przez siatkę 150 μm 2 razy. 
	UWAGA: sprawdzić przepływ pod kątem wzbogacenia krypty pod mikroskopem (rysunek 2D).</li>
	<li>Odwirować zawiesinę krypty przez 5 minut w temperaturze 50 xg, 4°C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 5 ml lodowatego buforu chelatacyjnego.</li>
	<li>Policz liczbę krypt na 10 μl kropli z zawiesiny z kroku 2.15. Przenieść liczbę krypt potrzebną do poszycia do probówki okrągłodennej o pojemności 5 ml. Użyj od 200 do 500 krypt na studzienkę 24-dołkowego naczynia, aby ustalić enteroidy lub kolonoidy.</li>
	<li>Odwirować frakcję krypty przez 10 minut w temperaturze 150 g w temperaturze 4°C. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Wykorzystaj krypty do późniejszej kultury.</li>
</ol>
3. Izolacja krypty od biopsji
<ol>
	<li>Przygotuj wszystkie odczynniki przed rozpoczęciem eksperymentu. Rozmrozić matrycę błony podstawnej na lodzie i wstępnie inkubować 24-dołkową płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Przemyć biopsję lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem Dulbecco bez Ca2+ i Mg2+ (DPBS).</li>
	<li>Za pomocą szpilek o średnicy 0,1 mm zabezpiecz biopsję na pokrytej silikonem szklanej szalce Petriego wypełnionej lodowatym DPBS. Rozciągnij i przypnij błonę śluzową płasko stroną błony śluzowej skierowaną do góry (ryc. 2E).</li>
	<li>Delikatnie zeskrob powierzchnię błony śluzowej zakrzywionymi kleszczami, aby usunąć kosmki i zanieczyszczenia. Ten krok jest konieczny, aby poprawić jakość preparatu.</li>
	<li>Umyj biopsję 3-4 razy lodowatym buforem chelatacyjnym, aby usunąć kosmki i zanieczyszczenia.</li>
	<li>Przykryj biopsję świeżo przygotowanym buforem chelatacyjnym 2mM EDTA (200 μl 0,5 M EDTA w 49,8 ml buforu chelatacyjnego).</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego na lodzie i delikatnie potrząsaj przez 30 minut na poziomym wytrząsarce orbitalnej.</li>
	<li>Przemyj biopsję 3-4 razy lodowatym buforem chelatacyjnym bez EDTA. Po umyciu pozostaw biopsję w lodowatym buforze chelatacyjnym.</li>
	<li>Wykonaj biopsję pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą zakrzywionych i cienkich kleszczy. Delikatnie zeskrob błonę śluzową, aby uwolnić krypty jelitowe za pomocą zakrzywionych kleszczy.</li>
	<li>Delikatnie usunąć zawiesinę krypty z płytki Petriego za pomocą pipety i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: sprawdź tkankę, aby upewnić się, że prawie wszystkie krypty zostały usunięte z błony śluzowej.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę krypty przez nylonową siatkę 150 μm 2 razy. 
	UWAGA: sprawdzić przepływ pod kątem wzbogacenia krypty pod mikroskopem.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę krypty przez 5 minut w temperaturze 50 xg, 4°C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml lodowatego buforu chelatacyjnego. Przenieść zawiesinę krypty do probówki o pojemności 1,5 ml do mikrofuge.</li>
	<li>Odwirować frakcję krypty przez 10 minut w temperaturze 150 x g, 4°C. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Wykorzystaj krypty do późniejszej kultury.</li>
</ol>
4. Kultura krypty w matrycy błony podstawnej
<ol>
	<li>Używając wstępnie schłodzonych końcówek pipet, ponownie zawiesić osad krypty (z kroku 2.18 lub 3.15) w matrycy błony podstawnej (200 do 500 krypt/50 μl matrycy błony podstawnej).</li>
	<li>Na wstępnie podgrzaną płytę nanieść 50 μl zawiesiny krypty w matrycy błony podstawnej na studzienkę. Powoli wysuń matrycę membrany podstawnej na środku studni.</li>
	<li>Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C i 5% CO2 na 30 minut, aby umożliwić pełną polimeryzację matrycy błony podstawnej.</li>
	<li>Na matrycę błony podstawnej nałożyć 500 μl kompletnego ludzkiego podłoża minijelitowego uzupełnionego 2,5 μM CHIR99021 (rozcieńczenie 1:4 000 10 mM zapasu) i 2,5 μM tiazowiwiny (rozcieńczenie 1:4 000 10 mM).</li>
	<li>Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C, 5% CO2 .</li>
	<li>Co 2 dni należy wymieniać pożywkę na świeżą, kompletną pożywkę z ludzkiego minijelita.</li>
</ol>
5. Pasażowanie hodowanych enteroidów i kolonoidów.
UWAGA: Enteroidy pasażowe i kolonoidy co 7 do 10 dni po początkowym posiewie. Ogólnie rzecz biorąc, podziel jedną studnię na 3 do 4 dołków.
<ol>
	<li>Przygotuj wszystkie odczynniki przed rozpoczęciem eksperymentu. Rozmrozić matrycę błony podstawnej na lodzie i wstępnie inkubować 24-dołkową płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Usuń podłoże za pomocą sterylnych końcówek i nałóż 1 ml lodowatego DPBS.</li>
	<li>Pipetować tam i z powrotem za pomocą końcówki o pojemności 1 000 μl. Przenieść roztwór do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Na 1 ml pożywki dodać 2 ml ludzkiego podłoża dla minijelit uzupełnionych 5% FBS.</li>
	<li>Odwirowywać roztwór przez 5 minut w temperaturze 50 x g, 4°C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad z 2 ml enzymu dysocjacji komórek uzupełnionego 10 μM Y-27632 (rozcieńczenie 1:1,000 10 mM zapasu). Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37°C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Oddzielić grudki komórek za pomocą strzykawki Luer-Lock o pojemności 3 ml wyposażonej w igłę 18 G do napełniania/napełniania. Delikatnie odpipetować roztwór w tę i z powrotem za pomocą strzykawki 10 razy.</li>
	<li>Odwirowywać zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 500 x g, 4°C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Używając wstępnie schłodzonych końcówek pipet, ponownie zawiesić osad komórkowy w matrycy błony podstawnej.</li>
	<li>Na wstępnie podgrzaną płytę nanieść 50 μl zawiesiny krypty w matrycy błony podstawnej na studzienkę. Powoli wysuń matrycę membrany podstawnej na środku studni.</li>
	<li>Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C, 5% CO2 na 20 minut, aby umożliwić pełną polimeryzację matrycy błony podstawnej.</li>
	<li>Na matrycę błony podstawnej nałożyć 500 μl kompletnego ludzkiego podłoża dla minijelit uzupełnionego 10 μM Y-27632 (rozcieńczenie 1:1,000 10 mM zapasu).</li>
	<li>Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C, 5% CO2 .</li>
	<li>Po 2 dniach zastąp pożywkę świeżą, kompletną pożywką dla ludzkiego minijelita uzupełnioną 10 μM Y-27632 (rozcieńczenie 1:1,000 10 mM bulionu). Następnie co drugi dzień należy zastępować pożywkę świeżą, kompletną pożywką z ludzkiego minijelita.</li>
</ol>
6. Zamrażanie hodowanych enteroidów i kolonoidów
UWAGA: Zazwyczaj zamraża się jeden dobrze w 2-3 kriowiałach.
<ol>
	<li>Powtórz kroki od 5.1 do 5.8.</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulat zimnym środkiem zamrażającym. Przenieść 1 ml roztworu zamrażającego do oznakowanego kriowialu. Umieść kriowial w pojemniku do zamrażania zawierającym 500 ml alkoholu izopropylowego.</li>
	<li>Przenieś pojemnik do zamrażania do zamrażarki o temperaturze 80°C na 24 godziny, a następnie przenieś kriowial do przechowywania ciekłego azotu. 
	UWAGA: Enteroidy i kolonoidy należy przechowywać przez okres do 1 roku.</li>
</ol>

<ol><li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317 (19), 2702-2710 (2011).</li>
<li>Shroyer, N. F., Kocoshis, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShroyer%2C+NF+%22Pediatric+Gastrointestinal+and+Liver+Diseases%22">Pediatric Gastrointestinal and Liver Diseases</a>. Hyams, J. R. W. III , Elsevier. 324-336 (2010).</li>
<li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium%3A+strategies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. , (2014).</li>
<li>Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+intestinal+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation.</a> Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3, 217-240 (2013).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A nomenclature for intestinal in vitro cultures.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (12), G1359-G1363 (2012).</li>
<li>Ramalingam, S., Daughtridge, G. W., Johnston, M. J., Gracz, A. D., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+levels+of+Sox9+expression+mark+colon+epithelial+stem+cells+that+form+colonoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct levels of Sox9 expression mark colon epithelial stem cells that form colonoids in culture.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (1), G10-G20 (2012).</li>
<li>Furstenberg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+mouse+jejunal+epithelial+cells+with+CD24+yields+a+population+with+characteristics+of+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sorting mouse jejunal epithelial cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (3), G409-G417 (2011).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Intestinal+Stem+Cells+Based+on+Surface+Marker+Combinations+and+Colony-Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay.</a> Gastroenterology. , (2013).</li>
<li>Yan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+markers+Bmi1+and+Lgr5+identify+two+functionally+distinct+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 466-471 (2012).</li>
<li>Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dll1%2B+secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nat Cell Biol. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li>
<li>Yui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+engraftment+of+colon+epithelium+expanded+in+vitro+from+a+single+adult+Lgr5%28%2B%29+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell.</a> Nat Med. 18 (4), 618-623 (2012).</li>
<li>Durand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+intestinal+stem+cells+after+Paneth+cell+ablation+induced+by+the+loss+of+transcription+factor+Math1+%28Atoh1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), 8965-8970 (2012).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li>
<li>Akcora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CSF-1+receptor+fashions+the+intestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The CSF-1 receptor fashions the intestinal stem cell niche.</a> Stem Cell Res. 10 (2), 203-212 (2013).</li>
<li>Farin, H. F., Van Es, J. H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+sources+of+Wnt+regulate+intestinal+stem+cells+and+promote+formation+of+Paneth+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).</li>
<li>Rothenberg, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cKit%28%2B%29+colonic+crypt+base+secretory+cell+that+supports+Lgr5%28%2B%29+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice.</a> Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peyer%27s+patch+M+cells+derived+from+Lgr5%28%2B%29+stem+cells+require+SpiB+and+are+induced+by+RankL+in+cultured+%27miniguts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured 'miniguts.</a> Mol Cell Biol. 32 (18), 3639-3647 (2012).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+expansion+of+human+colonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells.</a> Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. , (2014).</li>
<li>Fuller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cells+remain+viable+after+prolonged+tissue+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cells remain viable after prolonged tissue storage.</a> Cell Tissue Res. 354 (2), 441-450 (2013).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).</li>
<li>Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+potentiates+TGF-beta+signaling+to+promote+colonic+crypt+regeneration+after+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury.</a> Science. 338 (6103), 108-113 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+Marked+by+the+R-Spondin+Receptor+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem Cells Marked by the R-Spondin Receptor Lgr5.</a> Gastroenterology. , (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 16-19 (2009).</li>
<li>Tojo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ALK-5+inhibitor+A-83-01+inhibits+Smad+signaling+and+epithelial-to-mesenchymal+transition+by+transforming+growth+factor-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta.</a> Cancer Sci. 96 (11), 791-800 (2005).</li>
<li>Gafni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li>
<li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Exp Biol Med (Maywood). , (2014).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>Kovbasnjuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%3A+preclinical+models+of+non-inflammatory+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea.</a> Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S3(2013).</li>
<li>Fujii, M., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+intestinal+stem+cells%3A+applications+for+colorectal+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research.</a> Front Genet. 5, 169(2014).</li>
<li>Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+gene+expression+control+in+primary+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral gene expression control in primary organoid cultures.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda ta zapewnia kompletny system odtwarzający linie nabłonka jelitowego i dynamikę nabłonka, które stanowią przydatne narzędzie do badania biologii nabłonka jelitowego. Przedstawiona tutaj metoda została zaadaptowana z oryginalnego badania na myszach przeprowadzonego przez Sato i Cleversa22 , które skutecznie prowadzi do ludzkich enteroidów i okrężnic. Tutaj ręcznie podnieśliśmy krypty przez mikrodysekcję, aby uniknąć jakichkolwiek zanieczyszczeń komórkowych. Ta metoda pozwala na bezpośrednią wizualizację krypt i prowadzi do spójności w miarę upływu czasu w porównaniu z oryginalną kolekcją krypt poprzez "potrząsanie". Inne grupy opracowały podobne techniki, stosując nieco inne podejścia, zwłaszcza zastępując chelatację przez EDTA kolagenazą25. Oprócz różnic w zbieraniu krypt, techniki te wykorzystują określoną pożywkę, która jest wymagana do hodowli ludzkich enteroidów w kulturze22. Aby zwiększyć efektywność wzrostu podczas wysiewu krypt, dodajemy inhibitor GSK3 (CHIR99021) przez pierwsze dwa dni 12.
Obchodzenie się z tkanką lub biopsjami jest ważne, a izolacja krypty powinna być wykonana zaraz po przybyciu tkanki do laboratorium. Jednak opóźniona izolacja krypty i hodowla mogą być przeprowadzone do 24 godzin po pobraniu tkanki (dane nie pokazane), jak opisano wcześniej dla tkanki myszy26. Tkanka jelitowa powinna być umieszczona w stożkowej probówce całkowicie wypełnionej DPBS, aby uniknąć uszkodzenia tkanek i powinna być utrzymywana w temperaturze 4°C. Opóźnione przygotowanie pozwala na wysyłkę tkanek, ale podczas transportu należy unikać wahań temperatury. Całkowity czas potrzebny na wstępne poszycie krypty wynosi około 2 godzin, z czego 15 do 30 minut zajmuje przetworzenie tkanki i 1 do 2 godzin izolacja i płytka krypty. Mikrodysekcja tkanki jest krytycznym wyznacznikiem i predykatem czystego preparatu krypty. Jednak uwolnienie krypty przez uścisk dłoni, jak opisano w różnych protokołach, jest możliwe22,23.
Pomimo podobieństw do mysiego układu enteroidów (enteroidów), ludzkie enteroidy wymagają określonych cząsteczek, aby zwiększyć i utrzymać ich wzrost w czasie. Czynniki wzrostu, Egf, Noggin, R-spondyna są stosowane podobnie jak organoidy nabłonka myszy. Jednak użycie Wnt-3A ma kluczowe znaczenie. Zauważyliśmy, że zarówno tworzenie, jak i wydajność wzrostu są większe przy użyciu pożywki kondycjonowanej Wnt-3A niż ludzkiego białka rekombinowanego. Jednocześnie wykazano poprawę warunków hodowli przy użyciu inhibitora kinazy syntazy glikogenu 3 (CHIR99021)12. Rekombinowane czynniki wzrostu mogą zostać zastąpione przez Wnt-3A, R-spondynę i pożywki kondycjonowane przez Noggin. Linia komórek L z ekspresją Wnt-3A jest dostępna na rynku (ATCC). Inne grupy rozwinęły linie komórkowe z ekspresją R-spondyny 1-23,27, Noggin-19 i Wnt-3A / R-spondyny3 / Noggin-28. W pożywce hodowlanej stosuje się dwa małocząsteczkowe inhibitory, które są niezbędne do utrzymania kultury29. A-83-01 jest selektywnym inhibitorem transformującego czynnika wzrostu β i receptorów aktywinowo-węzłowych (kinaza aktywinopodobna 4, 5, 7) i jest SB202190 inhibitorem kinazy białkowej aktywowanej mitogenem p38 (MAPK). Oba inhibitory były stosowane odpowiednio do podtrzymania samoodnawiania się ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz do tworzenia ludzkich naiwnych pluripotencjalnych komórek macierzystych30-32. Również nikotynamid, prekursor dinukleotydu nikotynamidoadeninowego, jest niezbędny do utrzymania ekspansji enteroidów i kolonoidów w sposób długotrwały22,29.
Chelatacja EDTA jest ważnym krokiem, ponieważ decyduje o wydajności preparatu krypty. Odnieśliśmy sukces w leczeniu 2 mM EDTA. Jednak stężenie EDTA można modyfikować z 2 mM do 15 mM w zależności od rodzaju tkanki. W takim przypadku czas inkubacji musi być określony empirycznie. Po wstępnym poszyciu krypta zaokrągla się i ostatecznie tworzy enteroidy. Jednak enteroidy lub kolonoidy często wykazują fenotyp "macierzysty", tworząc kule z niewielką ilością zróżnicowanych komórek lub bez nich. W takim przypadku różnicowanie można zainicjować poprzez odstawienie Wnt-3A, nikotynamidu i inhibitora p38 MAPK. Stosowanie inhibitora Notch, takiego jak DAPT lub DBZ, pomaga zwiększyć różnicowanie w enteroidach22.
Model ten podsumowuje fizjologię jelit z ciągłymi zdarzeniami pączkowania krypt wynikającymi z przedziału komórek macierzystych, a także domen nabłonka przypominających kosmki, zawierających zarówno absorpcyjne, jak i wydzielnicze zróżnicowane linie. Co ciekawe, system ten nie zawiera żadnych komórek mezenchymalnych i wykorzystuje określone warunki pożywki, aby spełnić wymagania dotyczące sygnału niszowego.
Podobnie jak model mysi, ludzkie enteroidy mogą być generowane z izolowanych komórek nabłonka jelitowego w celu przetestowania zdolności tych komórek do funkcjonowania jako komórka macierzysta. W kilku badaniach wykorzystano klaster markerów różnicowania (CD44, CD24 lub CD166) i komórki EPHB2 dodatnie w celu wzbogacenia komórek o właściwościach macierzystych12,23,33. Łącznie badania te wykazują przydatność ludzkich kultur enteroidów do testowania pnia. Inni badacze używają tego modelu do badania chorób jelit, takich jak zakaźne choroby biegunkowe, mukowiscydoza lub rak jelita grubego 22,34-37. Badania te pokazują, że ludzkie enteroidy stanowią wiarygodny model choroby człowieka z możliwością przejścia na spersonalizowane badania przesiewowe. Ludzkie enteroidy mogą być genetycznie modyfikowane za pomocą transfekcji DNA lub zakażenia cząstkami wirusa38. Stanowi to potężne narzędzie do badania funkcji specyficznych dla genów w organoidach ludzkiego nabłonka lub korygowania mutacji genetycznych. Niedawno Schwank i współpracownicy zademonstrowali możliwość edycji genomu za pomocą systemu CRISPR/Cas9 i skorygowania mutacji w genie CFTR powodującej mukowiscydozę24. Ludzkie enteroidy stanowią cenny system do badania biologii jelitowych komórek macierzystych i nabłonkowej błony śluzowej oraz służą jako nowatorski system eksperymentalny do badania zarówno prawidłowej, jak i nieprawidłowej fizjologii przewodu pokarmowego.

Nabłonek wyściółkowy przewodu pokarmowego jest w ciągłej odnowie. Proces ten jest wywoływany przez proliferację jelitowych komórek macierzystych (ISC), które w sposób ciągły wytwarzają potomstwo, które szybko zastępuje nabłonek jelitowy w miarę jego przewracania się. Przedział proliferacyjny, na który składają się ISC, jest ograniczony do dna krypt. ISC dają początek potomstwu, które ostatecznie różnicuje się w linie absorpcyjne lub wydzielnicze. Przemieszczając się z krypty na kosmki lub nabłonek powierzchniowy, komórki różnicują się stopniowo, migrując w górę przed złuszczeniem do światła1. ISC dają początek wszystkim typom komórek nabłonka jelitowego, w tym enterocytom, komórkom mikrofałdowym, komórkom enteroendokrynnym, komórkom kubkowym, komórkom kępki i komórkom Panetha. Okrężnica charakteryzuje się wydłużonymi kryptami złożonymi głównie z kolonocytów i komórek kubkowych, z rozproszonymi komórkami enteroendokrynnymi i kępkowymi2.
Systemy hodowli ex vivo stanowią obiecujące narzędzie do badania utrzymania ISC i homeostazy tkanek jelitowych. Trudno jest jednak polegać na technologiach hodowli tkankowych, ponieważ warunki fizjologiczne nie są w pełni odtworzone, a mikrośrodowisko nabłonkowe często ulega zmianie3,4. Dużym postępem w dziedzinie ISC było opracowanie technik hodowli tkankowych w celu utrzymania i namnażania poszczególnych mysich ISC przy użyciu zdefiniowanych czynników wzrostu w celu zastąpienia normalnych sygnałów niszy jelitowej. Długoterminowe warunki hodowli zostały opisane przez Sato i wsp., w których pojedyncze krypty lub wyizolowane komórki macierzyste z nabłonka jelitowego rosną, tworząc trójwymiarowe struktury nabłonkowe zawierające wiele domen podobnych do krypt 5-7. Te trójwymiarowe struktury podlegają zdarzeniom rozszczepienia, aby stale się rozszerzać. Co ciekawe, wszystkie typy komórek jelitowych specyficzne dla tkanki pochodzenia są wytwarzane, a także są wytłaczane do światła8. Korzystając z modyfikacji tego systemu, organoidy nabłonkowe mogą być generowane z żołądka, jelita cienkiego i okrężnicy. Mówiąc dokładniej, organoidy nabłonkowe z jelita cienkiego to enteroidy9, a te z okrężnicy to kolonoidy9,10. Te nabłonkowe systemy hodowli organoidów wykorzystano do przetestowania zdolności izolowanych pojedynczych komórek do funkcjonowania jako komórki macierzyste in vitro, testując w ten sposób "macierzystość" izolowanych komórek5,6,10-15. Inni badacze używali zarówno enteroidów, jak i kolonoidów do badania funkcji poszczególnych komórek nabłonkowych16-21. W ten sposób hodowle enteroidów i kolonoidów mogą być wykorzystywane do oceny funkcji zarówno komórek macierzystych, jak i niemacierzystych oraz dostarczają nowych informacji na temat podstawowych interakcji komórkowych w jelitach.
W 2011 roku Sato i współpracownicy stworzyli długoterminową hodowlę organoidów nabłonkowych pochodzących z ludzkiego jelita cienkiego i okrężnicy22,23. Oprócz różnic w składzie pożywki, ludzkie enteroidy nabłonkowe i kolonoidy wykazują te same cechy, co ich mysi odpowiedniki. Ponadto mogą być generowane z chorych tkanek, takich jak przełyk Barretta, gruczolak lub gruczolakorak oraz mukowiscydoza22,24. Ludzkie enteroidy stanowią cenny system do badania biologii jelitowych komórek macierzystych i nabłonkowej błony śluzowej oraz służą jako nowy system eksperymentalny do badania zarówno prawidłowej, jak i nieprawidłowej fizjologii przewodu pokarmowego3.
Tutaj opisujemy metody tworzenia enteroidów i kolonoidów z ludzkich krypt jelita cienkiego i okrężnicy (Rysunek 1). W niniejszym przeglądzie metodologicznym kładziemy nacisk na zbiór krypt z całych tkanek i biopsji. Podsumowujemy modalności hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i kolonoidów oraz możliwe strategie eksperymentalne przeprowadzane przez ten model.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Ca2+, Mg2+ free (DPBS)</td><td>Technologie życia; Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP439-500</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA) frakcja V</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Gzntamycyna/amfoterycyna B roztwór</td><td>Technologie życiowe; Pożywka kondycjonowana Gibco</td><td>R-015-10</td><td></td></tr><tr><td>Wnt-3A</td><td>we własnych</td><td></td><td></td></tr><tr>zaawansowanych technologiach<td>DMEM/F12</td><td>Life; Gibco</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M Life</td><td>technologie; Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutamina)</td><td>Technologie życia; Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Technologie życia; Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplement</td><td>Life technologie; Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Technologie Suplement</td><td>Life; Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nikotydamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, bez fenolu (matryca błony podstawnej)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>ludzki rekombinowany Noggin</td><td>R& D</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>ludzka rekombinowana R-Spondin</td><td>Preprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>ludzka rekombinowana EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>człowiek [Leu]15- Gastrin 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td></td></tr><tr><td>Tiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), czerwień fenolowa (enzym dysocjacji komórek)</td><td>Technologie życia; Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Technologie życia płodowej surowicy bydlęcej</td><td>; Gibco</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>CTS Synth-a-Freeze Medium (medium zamrażające)</td><td>Technologie życia; Gibco</td><td>A13713-01</td><td></td></tr><tr><td>L Linia komórkowa Wnt-3A</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>Test lucyferazy Renilla</td><td>Promega</td><td>E2710</td><td></td></tr><tr><td>ludzka rekombinowana Wnt-3A</td><td>R& Linia ogniw D</td><td>5036-WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 TOPflash</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Nabłonek przewodu pokarmowego jest stale odnawiany, gdy się przewraca. Proces ten jest wywoływany przez proliferację jelitowych komórek macierzystych (ISC) i potomstwa, które stopniowo migrują i różnicują się w kierunku czubka kosmków. Procesy te, niezbędne dla homeostazy przewodu pokarmowego, zostały szeroko zbadane przy użyciu wielu podejść. Technologie ex vivo, zwłaszcza pierwotne hodowle komórkowe, okazały się obiecujące dla zrozumienia funkcji nabłonka jelitowego. Stworzono długoterminowy system hodowli pierwotnej krypt jelitowych myszy w celu wygenerowania trójwymiarowych organoidów nabłonkowych. Te struktury nabłonkowe zawierają domeny przypominające krypty i kosmki, przypominające normalny nabłonek jelitowy. Powszechnie nazywane "enteroidami", gdy pochodzą z jelita cienkiego i "kolonoidami", gdy pochodzą z okrężnicy, różnią się od organoidów, które również zawierają tkankę mezenchymy. Ponadto te enteroidy / kolonoidy w sposób ciągły wytwarzają wszystkie typy komórek znajdujące się normalnie w nabłonku jelitowym. Ten system hodowli narządowej in vitro szybko staje się nowym złotym standardem w badaniach biologii jelitowych komórek macierzystych i fizjologii komórek nabłonkowych. Technologia ta została niedawno przeniesiona do badań nad ludzkimi jelitami. Ustanowienie enteroidów nabłonkowych i kolonoidów pochodzenia ludzkiego z jelita cienkiego i okrężnicy było możliwe dzięki wykorzystaniu specyficznych pożywek hodowlanych, które umożliwiają ich wzrost i utrzymanie w czasie. W tym miejscu opisujemy metodę tworzenia systemu kryptograficznego jelita cienkiego i okrężnicy na podstawie całej tkanki ludzkiej lub biopsji. Kładziemy nacisk na metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okrężnic.

Rycina 2D przedstawia typowy przykład świeżo wyizolowanych krypt z całej tkanki (Rycina 2D). Liczba krypt wyizolowanych z biopsji jest niższa niż w przypadku całej tkanki. Używając standardnych kleszczy biopsyjnych z igłą, zazwyczaj pobieramy dwa fragmenty biopsji podczas jednego przejścia. Każdy fragment biopsji daje powierzchnię 10 mm2 ze średnią liczbą od 50 do 100 krypt na biopsję (Rycina 2F).
Po hodowli w macierzy błony podstawnej krypty zaokrąglają się, tworząc enterosfery w przypadku jelita cienkiego oraz kolonosfery w przypadku okrężnicy. Pączkowanie krypt zazwyczaj następuje w ciągu 5 do 6 dni po wysianiu. Niemniej jednak nie jest rzadkością obserwowanie tworzenia się sfer przez enteroidy (enteroids) lub kolonoidy (colonoids) w macierzy błony podstawnej (Rycina 3A-C; Film 1). Pasażowanie można przeprowadzić po 7 dniach, w zależności od wielkości enteroidów. Enteroidy lub kolonoidy otrzymane z biopsji przechodzą taki sam rozwój w hodowli. Jednak ze względu na mniejszą gęstość krypt podczas wysiewania, pasażowanie zazwyczaj wykonuje się po 10 do 12 dniach hodowli (Rycina 4a,b). Hodowle enteroidów i kolonoidów powiększają się w sposób powtarzalny.
Zarówno enteroidy, jak i kolonoidy posiadają stronę światłową i są wyścielone nabłonkiem (Rycina 5A, B). W obrębie enteroidów można zaobserwować komórki proliferujące, które znajdują się w wierzchołkach pączków (Rycina 5C, D). Obrazowanie konfokalne enteroidów barwionych na E-kadherynę (Ecad) ukazuje komórki nabłonkowe (Rycina 5E).
Zarówno enteroidy, jak i kolonoidy mogą być hodowane z tkanek pobranych od pacjentów z zaburzeniami genetycznymi/wrodzonymi. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywne enteroidy pochodzące od pacjenta z mukowiscydozą (Rysunek 6A) oraz enteroidy z tufting enteropathy wynikającej z wrodzonej mutacji w genie cząsteczki adhezyjnej komórek nabłonkowych (EpCAM) (Rysunek 6B). Poza defektem genetycznym enteroidy nie wykazują różnic w stanie podstawowym.
<img alt="Schemat izolacji krypt jelitowych; proces hodowli enteroidów; analiza DNA i białek; testy funkcjonalne." src="/files/ftp_upload/52483/52483fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat dysocjacji krypt oraz generowania ludzkich enteroidów i kolonoidów w hodowli. Krypty (z ludzkiego jelita cienkiego lub grubego) są izolowane poprzez chelatowanie EDTA. Hodowane krypty tworzą enteroidy w przypadku jelita cienkiego oraz kolonoidy w przypadku jelita grubego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie całej tkanki i biopsji, obrazy mikroskopowe, badanie histologiczne, analiza struktury komórkowej." src="/files/ftp_upload/52483/52483fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Proces preparowania w celu izolacji krypt. (A) Próbka jelita cienkiego zostaje rozciągnięta i przypięta na płasko w szalce Petriego powleczonej silikonem. (B) Błona śluzowa zostaje oddzielona od leżącej pod nią błony podśluzowej. (C) Preparowana błona śluzowa zostaje rozciągnięta i przypięta na płasko w szalce Petriego powleczonej silikonem. (D) Po chelatacji EDTA krypty zostają wyizolowane z tkanki. (E) Jedna biopsja zostaje rozciągnięta i przypięta na płasko w szalce Petriego powleczonej silikonem. (F) Po chelatacji EDTA krypty zostają wyizolowane z biopsji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat wzrostu krypt; jelito cienkie (część bliższa), jelito cienkie (część dalsza), jelito grube. Zdjęcia mikroskopowe z dnia 1, 3, 7 pokazujące różnicowanie." src="/files/ftp_upload/52483/52483fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Hodowla krypt oraz generowanie ludzkich enteroidów i kolonoidów z tkanki całkowitej. (A) Krypty jelita czczego wysiane w macierzy błony podstawnej po izolacji. Krypty zamykają się po 3 do 4 hr, a po tym czasie zaczynają pęcznieć, tworząc enterosfery. W 7 dniu powstają enteroidy jelita czczego. (B) Po izolacji i hodowli krypty jelita krętego zachowują się podobnie do krypt jelita czczego i tworzą enteroidy jelita krętego. (C) Krypty jelita grubego wysiane w macierzy błony podstawnej po izolacji. Krypty zamykają się i po 7 dniach tworzą kolonoidy (Paski skali: 100 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzrost mikroorganizmów w ciągu 7 dni w dwunastnicy i okrężnicy, obrazy mikroskopowe, analiza eksperymentalna." src="/files/ftp_upload/52483/52483fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Hodowla krypt oraz generowanie ludzkich enteroidów i kolonoidów z biopsji. (A) Krypty dwunastnicy wysiane w macierzy błony podstawnej po izolacji. Krypty zamykają się po 3 do 4 hr, a następnie zaczynają pęcznieć, tworząc enterosfery. W 7 dniu formują się enteroidy. (B) Po izolacji i hodowli krypty okrężnicy są wysiewane w macierzy błony podstawnej. Krypty zamykają się, tworząc kolonosfery, a po 7 dniach kolonoidy (Paski skali: 100 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe tkanek narządowych; a: morfologia, b: histologia, c-e: analiza fluorescencyjna DAPI/EdU/ECAD." src="/files/ftp_upload/52483/52483fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Linie komórkowe jelita w ludzkich enteroidach. (A) Ludzki enteroid po 6 dniach hodowli. (B) Przekroje enteroidów z (A) barwione hematoksyliną i eozyną wykazują wyściółkę nabłonkową (Paski skali: 100 µm). (C-D) Obrazowanie konfokalne enteroidów po barwieniu EdU (magenta) wykazuje obecność komórek proliferujących. (E) Obrazowanie konfokalne enteroidów wykazuje obecność: E-kadheryny dla komórek nabłonkowych (ECAD, zielony) (Pasek skali: 50 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia mukowiscydozy, enteropatii kępkowej, zmian nabłonkowych, porównawcza analiza organoidów." src="/files/ftp_upload/52483/52483fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Hodowla krypt i generowanie ludzkich enteroidów z tkanki chorobowej. (A) Enteroidy uzyskane z preparatu pacjenta z mukowiscydozą. (B) Enteroidy uzyskane z preparatu pacjenta z wrodzoną enteropatią kępkową (Paski skali: 100 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Film 1. Tworzenie ludzkiego enteroidu z enterosfery w kulturze. Film z przyspieszonym zapisem z 32 godzin przedstawia enterosferę wyhodowaną z ludzkiego jelita cienkiego, która kurczy się, tworząc enteroid w kulturze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/Movie1_v2.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa odczynnika</td>
			<td>Firma</td>
			<td>Numer katalogowy</td>
			<td>Rozpuszczalnik</td>
			<td>Stężenie roztworu stokowego</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
			<td>Komentarz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor solny fosforanowy Dulbecco z jonami wapnia (DPBS Ca)2+, Mg2+ wolny od (DPBS)</td>
			<td>Technologie życia; Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etylenodiamina 
			kwas etylenodiaminooctowy (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788</td>
			<td>ultraczysta woda destylowana2O</td>
			<td>0,5 M</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP439-500</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>Proszek</td>
			<td>2%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacharoza</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>Proszek</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA) frakcja V</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>Proszek</td>
			<td>1%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór gentamycyny/amfoterycyny B</td>
			<td>Technologie życia; Gibco</td>
			<td>R-015-10</td>
			<td>-</td>
			<td>500x</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pożywka warunkowana Wnt-3A</td>
			<td>wewnętrzny</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Technologie życia; Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Technologie życia; Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>-</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamina)</td>
			<td>Technologie życia; Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>-</td>
			<td>100X</td>
			<td>1X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicylina-streptomycyna (10 000 J/ml)</td>
			<td>Technologie życia; Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
			<td>-</td>
			<td>100X</td>
			<td>1X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suplement N2</td>
			<td>Technologie życia; Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>-</td>
			<td>100X</td>
			<td>1X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suplement B27</td>
			<td>Technologie życia; Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>-</td>
			<td>50X</td>
			<td>1X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylocysteina</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikotynamid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>DPBS (bufor fosforanowy z dodatkiem dekstrozy)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, GFR, bez fenolu (matryca błony podstawnej)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>WYMAGANE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rekombinowany ludzki Noggin</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>6057-NG/CF</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>100 μg /ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
			<td rowspan="3">Inni dostawcy: R&amp;D; Anaspec i Preprotech</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ludzka rekombinowana R-spondyna</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>1 μg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rekombinowany ludzki EGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644-.2MG</td>
			<td>DBPS</td>
			<td>500 μg/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 μM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>500 μM</td>
			<td>500 nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-5MG</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 μM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ludzka [Leu]15-gastryna 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145-.1MG</td>
			<td>DPBS</td>
			<td>100 μM</td>
			<td>10 nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>2.5 μM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiazowiwina</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0017</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>2.5 μM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzym TrypLE Express (1X), czerwień fenolowa (enzym do dysocjacji komórek)</td>
			<td>Technologie życia; Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Do pasażowania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płodowa surowica bydlęca</td>
			<td>Technologie życia; Gibco</td>
			<td>10082-147</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Do pasażowania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podłoże CTS Synth-a-Freeze (podłoże do mrożenia)</td>
			<td>Technologie życia; Gibco</td>
			<td>A13713-01</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Do zamrażania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linia komórkowa L Wnt-3A</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Produkcja pożywki warunkowanej Wnt-3A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test luminescencyjny lucyferazy Renilla</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2710</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Aktywność pożywki warunkowanej Wnt-3A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rekombinowane ludzkie białko Wnt-3A</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>5036-WN/CF</td>
			<td>DPBS (bufor fosforanowo-cukrowy)</td>
			<td>100 μg /ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
			<td>Aktywność pożywki warunkowanej Wnt-3A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linia komórkowa HEK293 TOPflash</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Aktywność medium warunkowanego Wnt-3A; dar z laboratorium Hansa Cleversa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Szczegółowa lista odczynników z preferowanym producentem i numerem katalogowym.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sprzęt</td>
			<td>Materiały eksploatacyjne</td>
			<td>Narzędzia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza</td>
			<td>probówki stożkowe 15 i 50 ml</td>
			<td>standardowa pęseta Dumont #5 (F.S.T.; #11251-20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tlenek węgla (II)2 Inkubator</td>
			<td>Probówki do mikrowirówki</td>
			<td>pinceta zakrzywiona precyzyjna Dumont #7 (F.S.T.; #11274-20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomikroskop</td>
			<td>płytki 24-dołkowe</td>
			<td>Precyzyjne nożyczki (F.S.T.; #14060-09)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wirówka</td>
			<td>0.22 μm filtry (Sartorius)</td>
			<td>nożyczki sprężynowe Vannasa (F.S.T.; #15018-10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkubator wytrząsowy</td>
			<td>Pipety serologiczne</td>
			<td>piny minutien o średnicy 0,2 mm (F.S.T.; #26002-20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pojemnik do mrożenia (Nalgene)</td>
			<td>Końcówki do mikropipet</td>
			<td>piny minutien o średnicy 0,1 mm (F.S.T.; #26002-10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silikon Sylgard 184 (Dow Corning)</td>
			<td>150 μm oczka siatki, sito nylonowe (Dynamic Aqua-supply)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szklana szalka Petriego</td>
			<td>polipropylowe probówki z dnem okrągłym o pojemności 5 ml (Falcon)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipeta serologiczna</td>
			<td>igła stępiona do napełniania 18G (BD)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikropipeta</td>
			<td>strzykawki 3 ml z końcówkami Luer-Lock (BD)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Probówki kriogeniczne</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Szczegółowy wykaz materiałów eksploatacyjnych, narzędzi i sprzętu niezbędnych do izolacji i hodowli krypt.

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie ludzkich enterocytów z tkanek jelitowych. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie błony śluzowej jelita z leżącej poniżej tkanki podśluzowej. Drugim krokiem jest inkubacja błony śluzowej z EDTA w celu promowania dysocjacji nabłonka od tkanki łącznej.Następnie krypty jelitowe są oddzielane od rozdzielonego nabłonka. Na koniec krypty jelitowe są hodowane w macierzy błony podstawnej. Ostatecznie wykorzystuje się techniki immunohistochemiczne, aby wykazać organizację nabłonkową oraz specyficzne markery nabłonkowe hodowanych organoidów jelitowych (OIDs).Implikacją tej metody jest fakt, że możemy teraz generować OID z biopsji specyficznych dla pacjenta, co oznacza, że możemy wykorzystać tę tkankę w laboratorium do badania chorób i diagnozowania schorzeń jelit, czego wcześniej nie potrafiliśmy zrobić. Po przygotowaniu buforów i odczynników zgodnie z protokołem tekstowym, rozmrozić błonę podstawną na lodzie i wstępnie inkubować płytkę 24-dołkową w inkubatorze z dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 °C po otrzymaniu tkanki. Użyć PBS KO bez wapnia i magnezu lub DPBS do płukania tkanki, aż DPBS stanie się przejrzysty.Umieść tkankę w szklanej płytce Petri powlekanej silikonem, wypełnionej lodowatym DPBS, stroną śluzówkową do góry, a następnie rozciągnij i przymocuj tkankę za pomocą szpilek minuchin. Następnie, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, użyj nożyczek do mikrodysekcji oraz zakrzywionej pęsety z cienkimi końcami, aby oddzielić śluzówkę od podśluzówki i tkanki łącznej. Po tym rozciągnij i przymocuj wypreparowaną śluzówkę na płasko w powlekanej silikonem szklanej płytce Petri, stroną śluzówkową do góry.Używając zakrzywionej pęsety, delikatnie zeskrob powierzchnię błony śluzowej. Krok ten jest niezbędny w celu poprawy jakości preparatu. Przykryj błonę śluzową świeżo przygotowanym 2 mM buforem chelatującym EDTA.Następnie po trzykrotnym lub czterokrotnym przemyciu tkanki w lodzie zgodnie z protokołem tekstowym pod mikroskopem dissectingowym, za pomocą zakrzywionych pęset delikatnie zeskrobć błonę śluzową, aby uwolnić krypty jelitowe za pomocą pipety. Delikatnie przenieść zawiesinę krypt z szalki Petriego do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. Następnie sprawdzić tkankę, aby upewnić się, że prawie wszystkie krypty zostały usunięte z błony śluzowej.Przefiltrować zawiesinę krypt dwukrotnie przez filtr o oczkach 150 µm i sprawdzić przepływ pod mikroskopem. Po przemyciu zawiesiny krypt i przeniesieniu wymaganej liczby krypt do probówki o zaokrąglonym dnie o pojemności 5 mL, zgodnie z protokołem tekstowym, odwirować frakcję krypt przez 10 minut przy 150 ×g i temperaturze 4 °C. Następnie usunąć supernatant za pomocą schłodzonych wcześniej końcówek do pipety i resuspender osad krypt w macierzy błony podstawnej.Nanieść do każdego dołka wcześniej ogrzanej płytki 50 µL zawiesiny krypt w macierzy błony podstawnej, powoli wypuszczając macierz błony podstawnej na środek dołka. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 30 minut, aby umożliwić całkowitą polimeryzację macierzy błony podstawnej. Następnie przykryć macierz błony podstawnej 500 µL pełnej pożywki do ludzkich mini-jelit, uzupełnionej o 2,5 µM CHIR 9 0 2 2 1.And Thien inkubują tkankę, wymieniając medium po dwóch dniach, a następnie co drugi dzień. Na tej rycinie przedstawiono typowy przykład świeżo wyizolowanych krypt z całej tkanki. Liczba krypt wyizolowanych z biopsji jest mniejsza niż w przypadku całej tkanki.Zazwyczaj podczas jednego przejścia wykonuje się dwa pobrania biopsji. Każde pobranie daje powierzchnię 10 mm², zawierającą średnio od 50 do 100 crypts na biopsję. Po hodowli w macierzy błony podstawnej przez pięć do sześciu dni, crypts zagregowane tworzą enterosfery w przypadku jelita cienkiego oraz kolonosfery w przypadku jelita grubego, a następnie są pasażowane po siedmiu dniach.Organoidy lub OID-y utworzone z biopsji pokazane tutaj przechodzą ten sam rozwój przy niższej gęstości wysiewu. Dlatego pakowanie jest zazwyczaj przeprowadzane po 10 do 12 dniach hodowli. Jak pokazano tutaj, zarówno OID-y, jak i OID-y wykazują stronę luminalną i są wyścielone nabłonkiem.Komórki proliferujące można zaobserwować w obrębie OID, gdzie znajdują się one w końcówkach pąków. Obrazowanie konfokalne OID barwionych na e-katrynę (tutaj kolor zielony) ukazuje komórki nabłonkowe. Rysunek przedstawia enteroidy wyhodowane z pacjenta z mukowiscydozą oraz enteropatią kłaczkowatą spowodowaną wrodzoną mutacją w genie cząsteczki adhezyjnej komórek nabłonkowych.Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać metody takie jak real time PCR lub Western blot, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące interesującego nas genu lub białka. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak konsekwentnie izolować ludzkie CRISPR, aby móc efektywnie generować linie komórkowe w swoim laboratorium w celu znalezienia odpowiedzi na pytania specyficzne dla danego pacjenta.

establishment-human-epithelial-enteroids-colonoids-from-whole-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ustanowienie ludzkich enteroidów i kolonii nabłonkowych jelit i okrężnicy z całej tkanki i biopsji

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnego organoidu guza jelita grubego u myszy. Metoda ta wykorzystuje tę cechę, że komórki nowotworowe jelita grubego przeżywają i rosną w organoidy w pożywkach zawierających ograniczone czynniki wzrostu, podczas gdy normalny nabłonek okrężnicy nie.

Metody in vitro Hodowla organoidowa pierwotnych guzów jelita grubego myszy

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Enteroidy wyłaniają się jako nowy model w badaniach nad chorobami ludzkimi. Protokół opisuje, w jaki sposób symulować enteroidalny model ludzkiego martwiczego zapalenia jelit za pomocą leczenia lipopolisacharydami (LPS) enteroidów generowanych z tkanki noworodka. Pobrane enteroidy wykazują zmiany zapalne podobne do tych obserwowanych w ludzkim martwiczym zapaleniu jelit.

Nowy ludzki nabłonkowy enteroidalny model martwiczego zapalenia jelit

Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.

Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

W tym protokole opisujemy, jak generować monowarstwy mysiego pierwotnego nabłonka jelita grubego bezpośrednio z krypt jelitowych. Zapewniamy eksperymentalne podejścia do generowania zlewających się monowarstw na filtrach przepuszczalnych, monowarstw konfluentnych do gojenia ran drapanych i badań biochemicznych oraz rzadkich i zlewających się monowarstw do analizy immunofluorescencyjnej.

Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

Ten protokół opisuje model wierzchołkowego martwiczego zapalenia jelit (NEC) w naczyniu, wykorzystujący enteroidy jelita cienkiego z odwróconą polaryzacją, umożliwiającą dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Zapewniamy protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu wykrycia przerwania nabłonka związanego z NEC oraz metodę określania żywotności enteroidów wierzchołkowych poddanych protokołowi NEC-in-a-dish.

In vitro Wierzchołkowy model enteroidalny martwiczego zapalenia jelit

Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów, trójwymiarowego modelu jelitowego, z tkanki jelitowej płodu. Do charakterystyki modelu wykorzystano obrazowanie immunofluorescencyjne biomarkerów nabłonkowych. Wierzchołkowa ekspozycja lipopolisacharydów, endotoksyny bakteryjnej, przy użyciu techniki mikroiniekcji indukowała przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od dawki, mierzoną przez wyciek dekstranu fluorescencyjnego.

Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych

Opisujemy protokół szczegółowo opisujący izolację mysich krypt okrężnicy w celu opracowania 3-wymiarowych kolonoidów. Ustalone okokrody mogą być następnie ostatecznie różnicowane, aby odzwierciedlić skład komórkowy nabłonka gospodarza przed otrzymaniem prowokacji zapalnej lub skierowaniem do utworzenia monowarstwy nabłonka.

Badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy

Opisano metodę propagacji ludzkich guzów siatkówczaka u myszy. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane bezpośrednio do oczu myszy z niedoborem odporności. Guzy wtórne zostały pomyślnie wywołane z wykorzystaniem zarówno komórek pobranych bezpośrednio z ludzkich guzów, jak i hodowanych tumorsfer.

Ustanowienie i propagacja guzów retinoblastomy ludzkiej u myszy z niedoborem odporności

Poznaj metodę izolacji krypt jelitowych i hodowlę enteroidów oraz kolonoidów z ludzkich biopsji. Technika ta umożliwia badania nad chorobami jelit i modelowanie pacjentospecyficzne.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Przeglądaj więcej filmów