Name: Wytwarzanie ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez dedyferencjację dojrzałych adipocytów w hodowlach sufitowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj metodę dedyferencjacji dojrzałych adipocytów do komórek macierzystych w hodowlach sufitowych. Technika ta pozwala uzyskać około miliona komórek na gram tkanki tłuszczowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (371697-2011, AT). Autorzy pragną podziękować za pomoc chirurgom bariatrycznym, dr S. Biron, F-S. Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau, a także Christine Racine i Caroline Gagnon z Banku Tkanek IUCPQ. Dziękujemy panu Jacques'owi Cadorette'owi z działu audiowizualnego IUCPQ za nakręcenie i montaż filmów.

Oświadczenie etyczne: Projekt został zatwierdzony przez Komisję Etyki Badań IUCPQ przed rekrutacją pacjentów. Na potrzeby tego artykułu/filmu uzyskaliśmy tkanki od 2 pacjentów: 1) 62-letniego mężczyzny z BMI 50,7 kg/m2 oraz 2) 35-letniej pacjentki z BMI 57 kg/m2. Eksperymenty można przeprowadzić z obydwoma przedziałami tłuszczu, ale na potrzeby tego filmu zostały ograniczone do jednej komory tłuszczowej. Techniczne aspekty filmu przeprowadzono z pacjentem 1, a immunofluorescencję FABP4 przeprowadzono na odróżnicowanych komórkach od pacjenta 2.
1. Przetwarzanie próbek
<ol>
	<li>Poproś chirurgów o pobranie tkanki tłuszczowej z przedziałów tłuszczowych omentalnych i podskórnych w czasie laparoskopowej operacji bariatrycznej.</li>
	<li>Szybko przynieś próbki tłuszczu do laboratorium w RT i natychmiast przetwórz.</li>
	<li>Trawienie należy przeprowadzać w laboratorium, w niesterylnej atmosferze. Komórki zostaną ostatecznie przeniesione do pomieszczenia hodowlanego i hodowane w sterylnych warunkach. Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy przygotować bufor KRH z wodą destylowaną i przefiltrowaną, a następnie przeprowadzić filtrację (filtr 0,22 μM) przed mineralizacją. Dokładnie oczyścić probówki z etanolem przed przeniesieniem do okapu do hodowli komórkowych w celu przygotowania kolby i płytki.</li>
	<li>Umieść tkankę tłuszczową na wstępnie zważonym naczyniu i zapisz wagę. Umieścić mały kawałek każdej próbki tkanki (mniej niż 1cm2) w 10% buforze formaliny w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny przed zatopieniem parafiny. Użyj tej osadzonej próbki do eksperymentów immunohistochemicznych (technika nie pokazana).</li>
	<li>Umieścić kolejny kawałek w probówce o pojemności 50 ml i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C w celu dalszych badań na całych tkankach tłuszczowych (np. ekspresja genów - technika nie pokazana).</li>
</ol>
2. Trawienie kolagenazy
<ol>
	<li>Umieść pozostały kawałek tkanki tłuszczowej w probówce o pojemności 50 ml w celu strawienia.</li>
	<li>Dodać 4 ml KRH-WB uzupełnionego kolagenazą (350 j./ml) na gram próbki w probówce do wytrawiania.</li>
	<li>Tkankę tłuszczową rozdrobnić nożyczkami.</li>
	<li>Zawiesinę mielonej tkanki tłuszczowej umieścić w shakerze o temperaturze 37 °C, maksymalnie 90 obr./min, na 45-minutową inkubację (maksymalnie 1 godz.).</li>
</ol>
3. Oczyszczanie adipocytów i preadipocytów
<ol>
	<li>Wlej półprzezroczysty roztwór z kilkoma kawałkami tłuszczu przez nylonową siatkę o grubości 400 μM do plastikowej zlewki.</li>
	<li>Pęsetą wetrzeć preparat komórkowy w nylonową siatkę i zmyć 5 ml KRH-WB.</li>
	<li>Delikatnie przenieś przefiltrowaną zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 50 ml z plastikową rurką i strzykawką o pojemności 60 ml przymocowaną na końcu rurki.</li>
	<li>Pozostaw zawiesinę z dojrzałymi adipocytami na około 10 minut, pozwalając komórkom dotrzeć do górnej części buforu przez flotację.</li>
	<li>Powoli zasysaj bufor na dnie probówki za pomocą ssania strzykawki o pojemności 60 cm3.</li>
	<li>Dodaj 20 ml KRH-WB do umycia. Powtórz od kroku 3.4 dla 2 dodatkowych prań.</li>
	<li>Zebrać bufor, aby doprowadzić zawiesinę adipocytów do końcowej objętości 5 lub 10 ml, w zależności od ilości komórek. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 5.</li>
	<li>Odzyskać frakcję zrębowo-naczyniową z buforu zebranego za pomocą strzykawki o pojemności 60 cm3 przez odwirowanie (3 000 obr./min, RT, 5 min) w celu dalszej pierwotnej hodowli komórek, jeśli jest to pożądane (technika nie pokazana).</li>
</ol>
4. Liczba dojrzałych komórek adipocytów
<ol>
	<li>Załadować 10 μl delikatnie wstrząśniętej zawiesiny adipocytów do komory zliczającej (hemocytometru). Wykonaj zliczanie komórek w poczwórnym stopniu.</li>
	<li>Oblicz liczbę izolowanych dojrzałych komórek.</li>
</ol>
5. Dedyferencjacja dojrzałych adipocytów do kolby T-25
<ol>
	<li>Napełnij kolbę do hodowli tkankowych o długości 25 cmdo 3/4 objętości surowicą cielęcą DMEM/F12-20%.</li>
	<li>W zależności od liczby komórek wlej 500 000 dojrzałych komórek do kolby.</li>
	<li>Napełnić kolbę całkowicie za pomocą probówki o pojemności 50 ml z podłożem i usunąć jak najwięcej pęcherzyków.</li>
	<li>Nakręcić niewentylowaną nakrętkę na kolbie.</li>
	<li>Oczyścić kolbę etanolem przed inkubacją, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Inkubować kolbę do góry dnem przez tydzień, nie dotykając jej, aby uniknąć ruchów w kulturze, które mogą zakłócić przyleganie komórek.</li>
	<li>Przed odwróceniem kolby po 7 dniach odwróconej hodowli, delikatnie manipulować kolbą i usunąć całe podłoże z kolby przez aspirację, unikając gwałtownych ruchów.</li>
	<li>Dodać 12 ml DMEM-F12-20% surowicy cielęcej i hodować komórki standardowymi technikami. Do kolby można dodać filtrowany, wentylowany korek.</li>
</ol>
6. Dedyferencjacja dojrzałych adipocytów do płytki 6-dołkowej
<ol>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na dnie każdego dołka płytki 6-dołkowej</li>
	<li>Dodaj plastikową tuleję 1/2" na wierzchu każdego szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Napełnij studzienki 8 ml 20% surowicy cielęcej-pożywki DMEM.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na każdej plastikowej tulei.</li>
	<li>Włożyć końcówkę pipety między szkiełko podstawowe a rurkę, aby wstrzyknąć komórki znajdujące się pod szkiełkiem podstawowym (50 000 komórek na dołek).</li>
	<li>Inkubować płytki w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez tydzień.</li>
	<li>Odwrócony szkiełko nakrywkowe z dołączonymi komórkami do każdej studzienki zawierającej 2 ml pożywki uzupełnionej 20% surowicą cielęcą i kontynuować hodowlę.</li>
	<li>Użyj szkiełka nakrywkowego z komórkami przechodzącymi dedyferencjację do kilku celów, w tym immunofluorescencji (technika nie pokazana).</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ceiling+culture+of+mature+human+adipocytes%3A+use+in+studies+of+adipocyte+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions.</a> J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).</li>
<li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+cells+exhibit+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential.</a> J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).</li>
<li>Poloni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dedifferentiated+adipocytes+show+similar+properties+to+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).</li>
<li>Perrini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+gene+expression+and+cytokine+release+profiles+highlight+the+heterogeneity+of+distinct+subsets+of+adipose+tissue-derived+stem+cells+in+the+subcutaneous+and+visceral+adipose+tissue+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans.</a> PLoS One. 8 (3), e57892(2013).</li>
<li>Kishimoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteoblastic+differentiation+ability+of+human+dedifferentiated+fat+cells+is+higher+than+that+of+adipose+stem+cells+from+the+buccal+fat+pad%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oral+Investig%22%5BJournal%5D)">The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad.</a> Clin Oral Investig. , (2013).</li>
<li>Kou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenotype+and+tissue-specific+nature+of+multipotent+cells+derived+from+human+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).</li>
<li>Jumabay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+derived+from+mouse+and+human+white+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).</li>
<li>Sugawara, A., Sato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+dedifferentiated+fat+cells+for+periodontal+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration.</a> Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).</li>
<li>Kikuta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+effects+of+dedifferentiated+fat+cell+transplantation+in+rabbit+models+of+bone+defect+and+ovariectomy-induced+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis.</a> Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).</li>
<li>Obinata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+%28DFAT%29+cells+improves+urethral+sphincter+contractility+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Urol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model.</a> Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).</li>
<li>Jumabay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+fat+cells+convert+to+cardiomyocyte+phenotype+and+repair+infarcted+cardiac+tissue+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats.</a> J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).</li>
<li>Ohta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+cells%2C+dedifferentiated+fat+cells+%28DFAT%29%2C+promoted+functional+recovery+from+spinal+cord+injury-induced+motor+dysfunction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats.</a> Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).</li>
<li>Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Navarrete%2C+JMF-r+%22Adipose+Tissue+Biology%22">Adipose Tissue Biology</a>. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).</li>
<li>Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+models+for+differentiation%3A+preadipocytes+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%22%5BJournal%5D)">Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes.</a> Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).</li>
<li>Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+an+adipose+tissue+depot+for+sampling%3A+factors+in+selection+and+depot+specificity%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity).</a> Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).</li>
<li>Tchernof, A., Despres, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+human+visceral+obesity%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of human visceral obesity: an update.</a> Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).</li>
<li>Rodbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+Isolated+Fat+Cells.+I.+Effects+of+Hormones+on+Glucose+Metabolism+and+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis.</a> J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).</li>
<li>Watson, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Markers+and+Functional+Attributes+of+Human+Adipose-Derived+Stem+Cells+and+Dedifferentiated+Adipocyte+Cells+from+Subcutaneous+Fat+of+an+Obese+Diabetic+Donor%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor.</a> Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Dedyferencjacja dojrzałych adipocytów za pomocą techniki hodowli sufitowej to nowe podejście do pozyskiwania komórek macierzystych tkanki tłuszczowej z niewielkiej próbki natywnej tkanki tłuszczowej. Opierając się na naszym doświadczeniu i doświadczeniach innych2, jeden gram tkanki wystarcza do pokrycia kolby o średnicy 25cm2 i uzyskania populacji komórek DFAT, dla których jednorodność została wykazana przez Poloni i współpracowników3. Dedyferencjacja adipocytów wydaje się możliwa w przyp...

In vitro dedyferencjacja dojrzałych adipocytów osiągana jest za pomocą techniki zwanej hodowlą sufitową1. Ze względu na ich naturalną tendencję do unoszenia się w roztworach wodnych, izolowane dojrzałe adipocyty przylegają do powierzchni odwróconej kolby całkowicie wypełnionej pożywką hodowlaną. W ciągu kilku dni komórki modyfikują swoją sferyczną morfologię i stają się komórkami podobnymi do fibroblastów. Powstałe komórki, zwane komórkami odróżnicowanego tłuszczu (DFAT), są multipotencjalne2. Artykuły naukowe na temat dedyferencjacji adipocytów, zwłaszcza na komórkach ludzkich, są ograniczone. Jednak dostarczyli już interesujących informacji na temat multipotencji, fenotypu komórek i zdolności replikacyjnych komórek DFAT2. Udało się odróżnicować dojrzałe adipocyty pochodzące z różnych przedziałów tłuszczowych, w tym pochodzące z ludzkiej trzewnej i podskórnej tkanki tłuszczowej2-4. Oprócz tych magazynów, Kishimoto i współpracownicy pobrali próbki tkanki tłuszczowej z policzkowych poduszek tłuszczowych i zdedyferencjowali adipocyty do komórek DFAT5. Matsumoto i współpracownicy z powodzeniem wygenerowali podskórne komórki DFAT od pacjentów w różnym wieku, a większość komórek miała wysoki wskaźnik proliferacji i mniej niż 6% starzenia się nawet po 10 pasażach w hodowli2.
Komórki DFAT zostały pomyślnie ponownie zróżnicowane w kilka linii, w tym linie adipogenne, osteogenne, chondrogenne i neurogenne2,3,6. Komórki te wykazują ekspresję kilku markerów embrionalnych komórek macierzystych, takich jak Nanog i cztery zidentyfikowane czynniki pluripotencjalne: Oct4, c-myc, Klf4 i Sox23. Wyrażają również markery specyficzne dla każdego z trzech listków zarodkowych7. Ponadto komórki DFAT są podobne do mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego (MSC pochodzących z BM) w oparciu o ich sygnaturę epigenetyczną3. Wykorzystując zdolność komórek macierzystych DFAT, wiele grup badało ich potencjał w leczeniu lub ulepszaniu różnych chorób8,9. Poprawę stanów patologicznych, takich jak infraklityczna tkanka serca, uraz rdzenia kręgowego i dysfunkcja zwieracza cewki moczowej, zaobserwowano po wstrzyknięciach komórek DFAT w szczurzych modelach choroby10-12. 
Oprócz właściwości komórek macierzystych DFAT, mogą one stanowić nowy model komórkowy do badań nad fizjologią adipocytów. Linia komórkowa 3T3-L1 jest często wykorzystywana do tego celu, ponieważ komórki te różnicują się w przylegające, magazynujące lipidy adipocyty pod wpływem stymulacji adipogennej13. Jednak komórki te pochodzą z tkanki zarodkowej myszy13. Za pomocą tego modelu nie można również zbadać specyficzności dla depotów i może on nie odzwierciedlać w pełni fizjologii ludzkich adipocytów14. Inne laboratoria pracują z wyizolowanymi komórkami tłuszczowymi z mysich magazynów tłuszczu, ale dystrybucja tłuszczu nie jest dymorficzna u myszy, a anatomiczna konfiguracja jamy brzusznej gryzonia uniemożliwia ekstrapolację bezpośrednio naludzi15. W celu zbadania adipocytów w kontekście fizjopatologii otyłości u człowieka niezbędne stało się uwzględnienie rozmieszczenia tkanki tłuszczowej i różnic specyficznych dla magazynu tłuszczu16. Pewne ograniczenia pierwotnych hodowli preadipocytów, w tym ilości komórek uzyskanych z próbek biopsji tkanki tłuszczowej i ich starzenie się po kilku pasażkach w hodowli, stworzyły potrzebę alternatywnych modeli. Perrini i współpracownicy zbadali specyficzność depotową w ekspresji genów komórek DFAT pochodzących z trzewnej i podskórnej tkanki tłuszczowej i porównali je z komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej (ASC) z tego samego magazynu tłuszczu. Wykazali, że różnice w ekspresji i funkcji genów występują głównie między magazynami niż między typami komórek, co sugeruje, że komórki DFAT są fizjologicznie zbliżone do ASC z tego samego magazynu. Komórki DFAT mogą stanowić interesującą alternatywę dla dostępnych modeli do badań nad dystrybucją tłuszczu w patofizjologii otyłości człowieka. Co więcej, hodowla sufitowa jest obiecującą metodą pozyskiwania dorosłych komórek macierzystych do celów inżynierii tkankowej. 
Tutaj opisujemy trawienie kolagenazą, szeroko stosowaną technikę izolowania dojrzałych adipocytów z podskórnych i/lub trzewnych próbek tłuszczu17, oraz kolejne kroki w celu przeprowadzenia hodowli sufitowej i deróżnicowania tych komórek na multipotencjalne komórki podobne do fibroblastów.

<table><tbody><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyna</td><td>Sigma</td><td>A4036</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>CaCl 2</td><td></td><td></td> Można <td>użyć</td></tr> <tr><td>dowolnej markiMgCl 2</td><td></td><td></td> <td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td></td><td></td><td>Można użyć dowolnej marki</td></tr><tr><td>kolagenazy typu I</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LS-004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Dodaj do podłoża: 20% surowicy cielęcej, gentamycyna (50 &mikro; g/ml) i fungizone (2,5 &mikro; g / ml)</td></tr> <tr><td>Surowica cielęca, uzupełniona żelazem, od cieląt karmionych mieszanką modyfikowaną</td><td>Sigma</td><td>C8056-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>1/2 W plastikowej tulei</td><td>Iberville</td><td>2704-CP</td><td>SKU:1000120918 (Home Depot)</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Linde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalin soluton, neutralnie buforowany, 10%</td> <td>SIGMA</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna pęseta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 60 cc</td><td>Strzykawka</td><td></td><td></td>BD</tr><tr><td>Rurka</td><td></td><td></td><td></td>z tworzywa sztucznego</tr><tr><td>Bufor zapasowy Krebs-Ringer-Henseleit (KRH)</td><td></td><td></td><td>Przygotuj bufor zapasowy w następujący sposób: 25 mM HEPES pH 7,6, 125 mM NaCl, 3,73 mM KCl, 5 mM CaCl2,2H2O, 2,5 mM MgCl2,6H2O, 1 mM K2HPO4. Dostosuj pH do 7,4.</td></tr><tr><td>Bufor roboczy Krebsa-Ringera-Henseleita (KRH-WB)</td><td></td><td></td><td>Do buforu KRH dodać świeżo następujące składniki: 4% albuminę surowicy bydlęcej, 5 mM glukozy, 0,1 i mikro; M adenozyna, 560 i mikro; M kwas askorbinowy</td></tr><tr><td>KRH-WB uzupełniony kolagenazą</td><td></td><td></td> typu I <td>Dodać 350 j./ml kolagenazy typu I</td></tr><tr><td>T25 bez wentylowanej nasadki kolby do hodowli tkankowych</td><td>Sarsted lub innej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli tkankowych</td><td>BD Falcon lub innej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkło pokrywowe mikroskopu 22x22</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne zlewki</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez dedyferencjację dojrzałych adipocytów w hodowlach sufitowych

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

>jove_content<Wykazano, że dojrzałe adipocyty zmieniają swój fenotyp w komórki podobne do fibroblastów in vitro za pomocą techniki zwanej hodowlą sufitową. Dojrzałe adipocyty można również wyizolować ze świeżej tkanki tłuszczowej w celu specyficznej dla depotów charakterystyki ich funkcji i właściwości metabolicznych. W tym miejscu opisujemy sprawdzony protokół izolacji dojrzałych adipocytów z tkanek tłuszczowych za pomocą trawienia kolagenazy oraz kolejne kroki do wykonania hodowli sufitowych. Krótko mówiąc, tkanki tłuszczowe są inkubowane w buforze Krebsa-Ringera-Henseleita zawierającym kolagenazę w celu rozerwania macierzy tkankowej. Pływające dojrzałe adipocyty są zbierane na górnej powierzchni buforu. Dojrzałe komórki umieszcza się w kolbie T25 całkowicie wypełnionej pożywką i inkubuje do góry nogami przez tydzień. Alternatywne podejście do hodowli na płytkach 6-dołkowych pozwala na scharakteryzowanie adipocytów ulegających dedyferencjacji. Morfologia adipocytów drastycznie zmienia się w czasie hodowli. Immunofluorescencję można łatwo przeprowadzić na szkiełkach hodowanych na płytkach 6-dołkowych, jak wykazano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego FABP4. Białko FABP4 jest obecne w dojrzałych adipocytach, ale jest regulowane w dół poprzez dedyferencjację komórek tłuszczowych. Dedyferencjacja dojrzałych adipocytów może stanowić nową drogę dla terapii komórkowej i inżynierii tkankowej.

Podczas dedyferencjacji w dojrzałych adipocytach zachodzą znaczące zmiany morfologiczne (Rysunek 1). Jak pokazano na Rysunku 2, komórki podlegające dedyferencjacji zostały zabarwione przeciwciałem anty-FABP4 w celu analizy fluorescencyjnej. Komórki o okrągłej morfologii wykazywały ekspresję białka FABP4, podczas gdy większość komórek fibroblastopodobnych nie wykazywała takiej ekspresji. Po dedyferencjacji komórki DFAT mogą być hodowane z zastosowaniem standardowych procedur przez kilka p...

Dojrzałe adipocyty mogą stanowić obfite źródło komórek macierzystych poprzez dedyferencjację, co prowadzi do jednorodnej populacji komórek podobnych do fibroblastów. Trawienie kolagenazą służy do izolowania dojrzałych adipocytów z ludzkiego tłuszczu. Celem naszego protokołu jest uzyskanie multipotencjalnych, odróżnicowanych komórek tłuszczowych z ludzkich dojrzałych adipocytów.

Wytwarzanie ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez dedyferencjację dojrzałych adipocytów w hodowlach sufitowych

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Dojrzałe adipocyty mają zdolność do różnicowania się w komórki prekursorowe in vitro. Osiąga się to poprzez kulturę uszczelnioną (seal culture), technikę, w której dojrzałe komórki są hodowane w kolbie całkowicie wypełnionej pożywką i inkubowane w pozycji odwróconej. Pływające komórki przylegają do ścianek kolby i zmieniają swoją morfologię, przechodząc z formy okrągłej komórki wypełnionej lipidami w wydłużoną komórkę typu fibroblastycznego. Homogenne.Populacje wydłużonych komórek można uzyskać i wyhodować po otrzymaniu próbek tkanek w laboratorium. Zważ tkankę tłuszczową i, w zależności od wymaganej liczby adipocytów, umieść odpowiednią objętość próbki w probówce 50 ml w celu trawienia; można spodziewać się uzyskania około 1 miliona komórek na gram tkanki.Hodowle przyplahtowe wykonuje się przy użyciu 500 000 komórek na kolbę o pojemności 25 centymetrów oraz 50 000 komórek na każdą studzienkę płytki sześcioStudzienkowej; dodać bufor roboczy KRH uzupełniony kolagenazą, posiekać tkankę nożyczkami i inkubować preparat w temperaturze 37°C przez 45 minut. Podczas inkubacji przygotować zestaw przewodów i strzykawkę. Przełożyć półprzezroczysty roztwór przez nylonową siatkę do plastikowego zlewka za pomocą pęsety.Przecieraj preparat komórkowy przez sito i delikatnie przemywaj 5 ml roboczego buforu KRH. Przenieś przefiltrowaną zawiesinę komórkową do probówki 50 ml za pomocą strzykawki. Pozostaw dojrzałe adipocyty na około 10 minut.Komórki wypłyną na powierzchnię buforu. Powoli odessać bufor z dna. Za pomocą strzykawki i drenu dodać 20 ml roboczego buforu KRH w celu przemycia.Powtórz etapy płukania dwukrotnie. Zbierz bufor, aby doprowadzić zawiesinę adipocytów do końcowej objętości 5 ml, a następnie przystąp do zliczenia komórek za pomocą hemocytometru; napełnij kolbę T 25 do trzech czwartych jej objętości medium D-M-E-M-F 12 uzupełnionym o 20% surowicy cielęcej i przenieś 500 000 dojrzałych adipocytów do kolby. Dopełnij kolbę medium i usuń pęcherzyki powietrza z górnej powierzchni.Zakręć kolbę za pomocą odpowiedniej zatyczki. Inkubuj kolbę w pozycji odwróconej przez jeden tydzień w inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% carbon dioxide. Unikaj poruszania kolbą, ponieważ pozostałe pęcherzyki powietrza mogą zaburzyć adhezję komórek.Umieść szkiełko nakrywkowe na dnie dołków. Włóż plastikową tuleję do dołka i wypełnij go 8 ml pożywki. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.Umieść szkiełko nakrywkowe na tulei, pozostawiając miejsce na włożenie końcówki pipety. Pobierz próbkę 50 000 komórek i wstrzyknij je, umieszczając końcówkę pomiędzy szkiełkiem nakrywowym a tuleją. Inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w atmosferze 5% carbon dioxide przez tydzień lub krócej.W zależności od projektu eksperymentu, niezbędne są co najmniej trzy dni, aby komórki przylgnęły do szkiełka podstawowego w innej płytce. Odwróć szkiełka podstawowe w 2 ml pożywki. W dalszej kulturze szkiełka podstawowe można następnie utrwalić w formalinie na potrzeby eksperymentów immunofluorescencyjnych lub do ekstrakcji D-N-A-R-N-A i białek.Dediferencjacja dojrzałych adipocytów powoduje istotne zmiany w morfologii komórek. W trakcie tego procesu adipocyty tracą swój fenotyp i wykazują obniżoną ekspresję transkryptów zazwyczaj związanych z ich funkcją magazynowania lipidów. Przedstawiony obraz immunofluorescencyjny obrazuje komórki tłuszczowe w różnych stadiach dediferencjacji.Komórki o okrągłej morfologii nadal wykazują ekspresję FABP4, markera dojrzałych adipocytów, podczas gdy komórki wydłużone, zgodnie z literaturą, nie wykazują już jego ekspresji. Zróżnicowane komórki tłuszczowe, często nazywane komórkami D-fat, można uzyskać od młodych, starszych, szczupłych lub cierpiących na otyłość pacjentów. Wykazują one zdolność do długotrwałej hodowli oraz udowodnioną wielopotencjalność.Doceniam również ich potencjał w inżynierii tkankowej i terapii komórkowej. Mogą one stanowić nowy model dla specyficznych badań nad fizjologią adipocytów.

generation-human-adipose-stem-cells-through-dedifferentiation-mature

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Generowanie ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez dedyferencjację dojrzałych adipocytów w kulturach sufitowych

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej świni (pADSC) z podskórnych tkanek tłuszczowych z badaniem multipotencji. Multipotencjalne pADSC są wykorzystywane do wyznaczania procesów różnicowania adipocytów i badania transdyferencjacji do wielu linii komórkowych mezenchymy mezodermalnej lub dalszych linii ektodermy i endodermy do badań regeneracyjnych.

Izolacja i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z podskórnych tkanek tłuszczowych świń

Zmodyfikowaliśmy warunki generowania komórek DFAT i podajemy tutaj informacje dotyczące użycia ulepszonej pożywki do produkcji tych komórek.

Skuteczna metoda uzyskiwania odróżnicowanych komórek tłuszczowych

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Celem tego protokołu jest przetestowanie zdolności komórek progenitorowych pochodzących z ludzkiej okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej do różnicowania się w wiele linii komórkowych. Różnicowanie porównano z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z ludzkiego szpiku kostnego, o których wiadomo, że różnicują się w linie adipocytów, osteocytów i chondrocytów.

Zdolność różnicowania ludzkich okołonaczyniowych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej ludzkiej aorty

Hodowla agregatów dojrzałych adipocytów błonowych (MAAC) to nowa metoda hodowli dojrzałych ludzkich adipocytów. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wyizolować adipocyty z ludzkiej tkanki tłuszczowej i jak skonfigurować MAAC.

Izolacja i hodowla dojrzałych adipocytów ludzkich przy użyciu błonowych dojrzałych kultur zagregowanych adipocytów (MAAC)

Opisujemy 3D ludzki system hodowli pozakomórkowej macierzy i adipocytów in vitro, który pozwala na analizę ról matrycy i adipocytów w przyczynianiu się do fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej.

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

Przedstawiamy protokół izolacji, hodowli i indukcji adipogennej komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej pochodzącej z grzebienia nerwowego (NCADSC) z okołoaortalnej tkanki tłuszczowej Wnt-1 Cre+/-; Myszy Rosa26RFP/+. NCADSC mogą być łatwo dostępnym źródłem ADSC do modelowania adipogenezy lub lipogenezy in vitro.

Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna grzebienia nerwowego Oryginalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej okołoorciowej

Protokół pozwala na generowanie czystej populacji adipocytów z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Kwas retinowy służy do różnicowania iPSC w mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), które są wykorzystywane do produkcji adipocytów. Następnie stosuje się podejście sortowania oparte na barwieniu czerwienią nilową w celu uzyskania czystych adipocytów.

Solidne różnicowanie ludzkich iPSC w czystą populację adipocytów w celu zbadania zaburzeń związanych z adipocytami

Produkty ksenogeniczne (chemiczne lub pochodzenia zwierzęcego) wprowadzone do etapów przygotowania/manipulacji terapii komórkowej są związane ze zwiększonym ryzykiem reaktywności immunologicznej i transmisji patogennej u pacjentów gospodarza. W tym artykule opisano całkowicie wolną od ksenogenów metodę izolacji i ekspansji in vitro ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.

Izolacja i hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej za pomocą innowacyjnej metody wolnej od ksenogenu w terapii u ludzi

Poznaj metodę dedyferencjacji dojrzałych adipocytów do komórek macierzystych w hodowlach sufitowych. Technika ta pozwala uzyskać około miliona komórek na gram tkanki tłuszczowej.

Wytwarzanie ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez dedyferencjację dojrzałych adipocytów w hodowlach sufitowych (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez dedyferencjację dojrzałych adipocytów w hodowlach sufitowych

Przeglądaj więcej filmów