Wytwarzanie ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez dedyferencjację dojrzałych adipocytów w hodowlach sufitowych
7 marca 2015
Dojrzałe adipocyty mogą stanowić obfite źródło komórek macierzystych poprzez dedyferencjację, co prowadzi do jednorodnej populacji komórek podobnych do fibroblastów. Trawienie kolagenazą służy do izolowania dojrzałych adipocytów z ludzkiego tłuszczu. Celem naszego protokołu jest uzyskanie multipotencjalnych, odróżnicowanych komórek tłuszczowych z ludzkich dojrzałych adipocytów.
Dojrzałe adipocyty mają zdolność do różnicowania się w komórki prekursorowe in vitro. Osiąga się to poprzez kulturę uszczelnioną (seal culture), technikę, w której dojrzałe komórki są hodowane w kolbie całkowicie wypełnionej pożywką i inkubowane w pozycji odwróconej. Pływające komórki przylegają do ścianek kolby i zmieniają swoją morfologię, przechodząc z formy okrągłej komórki wypełnionej lipidami w wydłużoną komórkę typu fibroblastycznego. Homogenne.
Populacje wydłużonych komórek można uzyskać i wyhodować po otrzymaniu próbek tkanek w laboratorium. Zważ tkankę tłuszczową i, w zależności od wymaganej liczby adipocytów, umieść odpowiednią objętość próbki w probówce 50 ml w celu trawienia; można spodziewać się uzyskania około 1 miliona komórek na gram tkanki.
Hodowle przyplahtowe wykonuje się przy użyciu 500 000 komórek na kolbę o pojemności 25 centymetrów oraz 50 000 komórek na każdą studzienkę płytki sześcioStudzienkowej; dodać bufor roboczy KRH uzupełniony kolagenazą, posiekać tkankę nożyczkami i inkubować preparat w temperaturze 37°C przez 45 minut. Podczas inkubacji przygotować zestaw przewodów i strzykawkę. Przełożyć półprzezroczysty roztwór przez nylonową siatkę do plastikowego zlewka za pomocą pęsety.
Przecieraj preparat komórkowy przez sito i delikatnie przemywaj 5 ml roboczego buforu KRH. Przenieś przefiltrowaną zawiesinę komórkową do probówki 50 ml za pomocą strzykawki. Pozostaw dojrzałe adipocyty na około 10 minut.
Komórki wypłyną na powierzchnię buforu. Powoli odessać bufor z dna. Za pomocą strzykawki i drenu dodać 20 ml roboczego buforu KRH w celu przemycia.
Powtórz etapy płukania dwukrotnie. Zbierz bufor, aby doprowadzić zawiesinę adipocytów do końcowej objętości 5 ml, a następnie przystąp do zliczenia komórek za pomocą hemocytometru; napełnij kolbę T 25 do trzech czwartych jej objętości medium D-M-E-M-F 12 uzupełnionym o 20% surowicy cielęcej i przenieś 500 000 dojrzałych adipocytów do kolby. Dopełnij kolbę medium i usuń pęcherzyki powietrza z górnej powierzchni.
Zakręć kolbę za pomocą odpowiedniej zatyczki. Inkubuj kolbę w pozycji odwróconej przez jeden tydzień w inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% carbon dioxide. Unikaj poruszania kolbą, ponieważ pozostałe pęcherzyki powietrza mogą zaburzyć adhezję komórek.
Umieść szkiełko nakrywkowe na dnie dołków. Włóż plastikową tuleję do dołka i wypełnij go 8 ml pożywki. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
Umieść szkiełko nakrywkowe na tulei, pozostawiając miejsce na włożenie końcówki pipety. Pobierz próbkę 50 000 komórek i wstrzyknij je, umieszczając końcówkę pomiędzy szkiełkiem nakrywowym a tuleją. Inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w atmosferze 5% carbon dioxide przez tydzień lub krócej.
W zależności od projektu eksperymentu, niezbędne są co najmniej trzy dni, aby komórki przylgnęły do szkiełka podstawowego w innej płytce. Odwróć szkiełka podstawowe w 2 ml pożywki. W dalszej kulturze szkiełka podstawowe można następnie utrwalić w formalinie na potrzeby eksperymentów immunofluorescencyjnych lub do ekstrakcji D-N-A-R-N-A i białek.
Dediferencjacja dojrzałych adipocytów powoduje istotne zmiany w morfologii komórek. W trakcie tego procesu adipocyty tracą swój fenotyp i wykazują obniżoną ekspresję transkryptów zazwyczaj związanych z ich funkcją magazynowania lipidów. Przedstawiony obraz immunofluorescencyjny obrazuje komórki tłuszczowe w różnych stadiach dediferencjacji.
Komórki o okrągłej morfologii nadal wykazują ekspresję FABP4, markera dojrzałych adipocytów, podczas gdy komórki wydłużone, zgodnie z literaturą, nie wykazują już jego ekspresji. Zróżnicowane komórki tłuszczowe, często nazywane komórkami D-fat, można uzyskać od młodych, starszych, szczupłych lub cierpiących na otyłość pacjentów. Wykazują one zdolność do długotrwałej hodowli oraz udowodnioną wielopotencjalność.
Doceniam również ich potencjał w inżynierii tkankowej i terapii komórkowej. Mogą one stanowić nowy model dla specyficznych badań nad fizjologią adipocytów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje proces dedyferencjacji dojrzałych adipocytów w multipotencjalne komórki macierzyste. Dzięki zastosowaniu trawienia kolagenazą oraz technik hodowli w warstwie, badacze mogą izolować i hodować te komórki w celu uzyskania homogennej populacji komórek fibroblastopodobnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Biologia adipocytów
- Techniki hodowli komórkowych
Wprowadzenie
- Dojrzałe adipocyty mogą ulegać dedyferencjacji do komórek prekursorowych.
- Proces ten można przeprowadzić in vitro, stosując specyficzne metody hodowli.
- Izolacja adipocytów jest kluczowa dla uzyskania komórek macierzystych.
- Trawienie kolagenazą jest standardową metodą izolacji komórek.
Cel badania
- Uzyskanie wielopotencjalnych, dedyferencjowanych komórek tłuszczowych z dojrzałych adipocytów ludzkich.
- Opracowanie protokołu izolacji i hodowli tych komórek.
- Zbadanie zmian morfologicznych zachodzących podczas dedyferencjacji.
Zastosowane metody
- Trawienie kolagenazą w celu izolacji dojrzałych adypocytów.
- Technika hodowli w warunkach szczelnych (seal culture) w celu promowania dedyferencjacji.
- Ocena morfologii komórek w celu potwierdzenia dedyferencjacji.
- Kwantyfikacja wydajności komórkowej w oparciu o masę tkanki.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja około 1 miliona komórek na gram tkanki tłuszczowej.
- Komórki dedyferencjowane wykazywały wydłużoną morfologię przypominającą fibroblasty.
- Dzięki opisanym metodom uzyskano homogenne populacje komórek.
- Wykazano potencjał dojrzałych adipocytów jako źródła komórek macierzystych.
Wnioski
- Dojrzałe adipocyty można skutecznie przekształcić w wielopotencjalne komórki macierzyste.
- Opisane metody stanowią niezawodne podejście do badań nad komórkami macierzystymi.
- Niniejsze badanie przyczynia się do zrozumienia plastyczności adipocytów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dedyferencjację dojrzałych adipocytów w wielopotencjalne komórki macierzyste można wykorzystać jako nowe źródło dla medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej. Podejście to umożliwia specyficzną dla danego depot charakterystykę funkcji i właściwości metabolicznych adipocytów, co wspiera walidację celów w badaniach nad chorobami metabolicznymi. Metoda ta stanowi skalowalną platformę do generowania komórek o fenotypie fibroblastopodobnym o udowodnionej wielopotencjalności, co ułatwia rozwój modeli przedklinicznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania terapii ukierunkowanych na adipocyty.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie plastyczności adypocytów oraz testowanie hipotez terapeutycznych w obrębie szlaków chorób metabolicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system walidacji funkcjonalnej celów poprzez izolację adypocytów z konkretnych depotów.
- Wartość naukowa: Zwiększa wiarygodność predykcyjną poprzez generowanie homogenicznych populacji dedyferencjowanych komórek w celu wyjaśnienia przebiegu szlaków sygnałowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez ustandaryzowane trawienie kolagenazą oraz techniki hodowli przytwierdzialnej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki kontrolowanej wydajności adipocytów (około 1 miliona komórek na gram tkanki).
- Wartość naukowa: Umożliwia wiarygodną ocenę związków przy użyciu komórek fibroblastopodobnych z potwierdzoną obniżoną ekspresją FABP4 jako markera dedyferencjacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera opracowanie systemów istotnych dla badań nad chorobami w celu specyficznego badania fizjologii adipocytów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki możliwości długotrwałej hodowli dediferencjowanych komórek tłuszczowych.
- Wartość naukowa: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez wykazanie wielopotencyjności i potencjału w inżynierii tkankowej komórek D-fat.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów odkrywczych, od wczesnej walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po badania przedkliniczne, w szczególności w programach dotyczących chorób metabolicznych oraz medycyny regeneracyjnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez modelowanie dedyferencjacji adypocytów in vitro.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania testów i dane ilościowe dzięki standaryzowanej izolacji komórek oraz ocenie morfologii.
- Analityka: Dostarcza mierzalne wyniki, takie jak zmiany w ekspresji FABP4, w celu porównania stanów dedyferencjacji w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez wykazanie długoterminowej hodowli i wielopotencjalności dedyferencjowanych adypocytów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego generowania komórek macierzystych pochodzących z adypocytów w ramach wielu badań specyficznych dla poszczególnych depot.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w przełączaniu fenotypu adipocytów.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i skalowalność dzięki zdefiniowanym protokołom trawienia kolagenazą oraz hodowli odwróconej.
- Wartość strategiczna: Lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez umożliwienie charakterystyki właściwości metabolicznych specyficznych dla danego depotu przed optymalizacją związku wiodącego.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko dzięki walidowanej ocenie wydajności komórek macierzystych i ich potencjału różnicowania.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach izolacji pierwotnych adipocytów oraz trawienia kolagenazą.
- Wymaga infrastruktury do hodowli komórkowej umożliwiającej prowadzenie hodowli przytwierdzonych do górnej ścianki (ceiling cultures) w odwróconych kolbach lub płytkach 6-dołkowych.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójnej wydajności pozyskiwania adipocytów i oceny dedyferencjacji w różnych laboratoriach.
- Wiąże się z koniecznością wprowadzenia modyfikacji przy stosowaniu protokołu w odniesieniu do tkanki tłuszczowej z różnych depotów lub o różnych charakterystykach dawców.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność precyzyjnego napełniania pożywką, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza zakłócających hodowlę w pozycji odwróconej.
