Name: Przewodnik po generowaniu i wykorzystywaniu NPC pochodzących z hiPSC do badania chorób neurologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metodę różnicowania komórek progenitorowych układu nerwowego (NPC) z hiPSC przy użyciu inhibitorów SMAD do badania chorób neurologicznych. Protokół umożliwia generowanie ekspandowalnych populacji NPC i formowanie neurosfer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kristen Brennand jest badaczką Fundacji Komórek Macierzystych w Nowym Jorku. Laboratorium Brennanda jest wspierane przez Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 oraz New York Stem Cell Foundation.

1. Różnicowanie hiPSC do neuronalnych komórek progenitorowych
<ol>
	<li>Hoduj i rozszerzaj hiPSC w pożywkach z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HES) (Tabela 1) współhodowanych na warstwie zasilającej mysi fibroblast embrionalny (mEF), aż duże (ale subkonfluentne) kolonie będą gotowe do różnicowania neuronalnego za pomocą pośredniej postaci ciała zarodka (EB) (ryc. 2). Rutynowe warunki hodowli hiPSC są dobrze opisane w innym miejscu 16,17; krótko mówiąc, hoduj hiPSC w pożywce HES na warstwie zasilającej mEF aż do zlewania się, a następnie enzymatycznie pasażuj z kolagenazą (1 mg / ml w DMEM) i rozszerzaj się około 1: 3 co 7 dni.</li>
	<li>Aby przygotować płytki pokryte poli-L-ornityną/lamininą, pokryj płytki 10 μg/ml poli-L-ornityny w sterylnej wodzie dla powierzchni plastikowych (50 μg/ml dla powierzchni szklanych) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3-24 godziny. Umyj co najmniej raz sterylną wodą, a następnie pokryj 5 μg/ml Lamininy w sterylnym PBS w temperaturze pokojowej przez 3-24 godz. 
	UWAGA: W przypadku zapakowania w folię talerze można przechowywać do sześciu miesięcy w temperaturze -20 ºC.</li>
	<li>W dniu 1 enzymatycznie podkonfluwające się hiPSC (zwykle hodowane na mEF lub hiPSC hodowane w określonych pożywkach, takich jak TeSR 18 na Matrigel) z płytki jako duże kolonie za pomocą 1 mg / ml Kolagenazy IV w DMEM / F12. 
	UWAGA: Po 1-2 godzinach inkubacji w temperaturze 37 ºC, kolonie będą unosić się w naczyniu.</li>
	<li>Delikatnie przemyć kolonie hiPSC (przez osiadanie, nie odwirowywanie) 1-2x DMEM/F12, ponownie zawiesić w 2 ml / studzience pożywki N2 / B27 (Tabela 1) i przenieść do nieprzylegających naczyń 6-dołkowych (połączyć 3 dołki w 1 dołku) 19, 
	UWAGA: W ciągu nocy kolonie utworzą unoszące się w powietrzu kuliste skupiska zwane "ciałami embrionalnymi" (EB). Spodziewaj się znacznej śmierci komórkowej.</li>
	<li>W dniu 2 przechyl płyty i pozwól EB się osadzić. Ostrożnie usuń media i umyj raz za pomocą DMEM/F12, aby usunąć zanieczyszczenia. Podawać pożywką N2/B27 uzupełnioną podwójnymi inhibitorami SMAD (0,1 μM LDN193189 i 10 μM SB431542) 12.</li>
	<li>W dniach 3-7 neuralizacja nastąpi w kontekście podwójnego hamowania SMAD; sprawdź, czy EB są okrągłe, ale nie torbielowate. Podawać EB co drugi dzień pożywką N2/B27 uzupełnioną o 0,1 μM LDN193189 i 10 μM SB431542.</li>
	<li>W dniach 7-14, po posiewie EB na płytkach pokrytych poli-L-ornityną/laminą, sprawdź za pomocą mikroskopu jasnego pola, czy rozety nerwowe zaczynają pojawiać się w ciągu kilku dni (scharakteryzowane jako okrągłe skupiska komórek neuroepitelialnych o polaryzacji apiko-podstawnej; Rysunek 1). Kontynuuj podawanie przylegających EB co drugi dzień pożywką N2/B27 uzupełnioną 0,1 μM LDN193189, 10 μM SB431542 i 1 μg/ml lamininy.</li>
</ol>
2. Zbiór rozet nerwowych
UWAGA: Zalecamy, aby rozety neuronalne były zbierane enzymatycznie za pomocą odczynnika Neural Rosette Selection 20 lub podobnego odczynnika selekcyjnego. Chociaż rozety neuronowe można ręcznie pobrać na 6-dołkową płytkę pokrytą poli-L-ornityną/laminą, opanowanie tej metodologii wymaga intensywnego szkolenia i, w zależności od umiejętności użytkownika, może wymagać drugiej rundy zbierania w 20 dniu, aby jeszcze bardziej wzbogacić NPC i zubożyć typy komórek nienerwowych.
<ol>
	<li>W celu enzymatycznej selekcji rozet nerwowych w dniu 14, odessać pożywkę z przylegających EB i dodać 1 ml odczynnika do wyboru rozety neuronalnej na dołek dla płytki 6-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Za pomocą pipetmana P1000 delikatnie usuń enzym z każdej studzienki. Dodaj 1 ml DMEM/F12 na studzienkę do przemycia.</li>
	<li>Za pomocą P1000 zbierz 1 ml DMEM/F12 i szybko wyrzuć DMEM/F12 z powrotem do studzienki, odrywając w ten sposób rozety od płytki. Zbierz rozety do probówki sokoła.</li>
	<li>Odpipetować kolejny 1 ml DMEM/F12 i szybko wypuścić do tego samego dołka, aby odłączyć pozostałe rozety. (Nie rozcierać. Staraj się nie rozbijać agregatów rozety). Zbierz rozety neuronalne do tej samej rurki sokoła.</li>
	<li>W razie potrzeby powtórz krok 2.4. Jeśli rozety nie odklejają się łatwo, dodaj więcej enzymu i powtórz proces (kroki 2.1-2.4)</li>
	<li>Wiruj komórki w odległości 300 x g przez 3 min. Odessać płuczkę i ponownie zawiesić rozety w 2 ml pożywki NPC (Tabela 1). Przenieś komórki (1:1) do 6-dołkowej płytki pokrytej poli-L-ornityną/laminą.</li>
	<li>Od 15 do 21 dni rozety nerwowe będą się rozszerzać; karmić rozety co drugi dzień pożywką NPC.</li>
	<li>Oceń jakość rozet nerwowych i upewnij się, że płaskie komórki podobne do fibroblastów nie rozszerzają się w hodowli. 
	UWAGA: Jeśli nie ma rozet, kultura NPC może czasami zostać uratowana przez ręczne wybieranie, wybierając tylko najlepsze z wybranych rozet do Accutase. Dysocjacja trwa 15 minut w temperaturze 37 ºC. Osadzanie, mycie i płytkowanie w pożywce NPC na 24-dołkowej płytce pokrytej poli-L-ornityną/laminą.</li>
</ol>
3. Ekspansja nerwowych komórek progenitorowych
UWAGA: NPC hiPSC mogą być uprawiane na płytkach pokrytych Matrigelem lub Poli-L-Ornityną/Lamininą. Zazwyczaj używamy płytek Matrigel, ponieważ można je przygotować szybciej i przy niższych kosztach.
<ol>
	<li>Aby przygotować płytki powlekane Matrigelem, należy szybko rozmrozić i ponownie zawiesić 1 mg zamrożonej porcji Matrigelu w 24 ml zimnego DMEM/F12 i natychmiast rozprowadzić 2 ml do każdego dołka z dwóch sześciodołkowych płytek. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Matrigel należy jedynie zassać, a nie umyć, bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Karmić NPC co drugi dzień i utrzymywać bardzo wysokie zagęszczenie, w przeciwnym razie spontanicznie różnicują się w neurony. 
	UWAGA: Chociaż bardziej doświadczeni NPC są zazwyczaj dzieleni 1:4 co tydzień, NPC o bardzo niskim przejściu mogą być dzieleni 1:2 tak rzadko, jak raz na dwa tygodnie.</li>
	<li>Aby podzielić, najpierw odessać pożywkę i dodać 1 ml ciepłej Accutase (1X) na dołek 6-dołkowej płytki. Inkubować w temperaturze 37 ºC przez 10-15 minut.</li>
	<li>Delikatnie przenieś oderwane komórki do 15 ml probówki zawierającej DMEM/F12 przy jak najmniejszym obciążeniu mechanicznym. Nie miareczkować komórek w enzymie. Granulki przez wirowanie z prędkością 1 000 x g przez 5 min.</li>
	<li>Odessać płuczkę i ponownie zawiesić NPC w ~1 ml pożywki NPC na oryginalną studzienkę 6-dołkową. 
	UWAGA: Spodziewaj się, że zlewająca się studzienka z 6-dołkowej płytki ma 5-10 milionów komórek; Można to potwierdzić, licząc 10 μl podwielokrotności komórek za pomocą hematocytometru przed ponownym posiewem.</li>
	<li>Po ponownym zawieszeniu, ponownie umieść NPC jako NPC, neurony lub neurosfery. Aby utrzymać NPC, płytkuj około 1-2 miliony komórek na dołek 6-dołkowej płytki. Skuteczność tworzenia neurosfery może się różnić w zależności od eksperymentów i linii komórkowych, ale generalnie występuje najlepiej, jeśli od 200 000 do 1 000 000 komórek zostanie wysianych na studzience nieprzylegającej płytki 6-dołkowej; Jeśli dojdzie do zlepiania się neurosfer, zmniejsz liczbę wysiewanych komórek. Aby różnicować się do neuronów, umieść około 200 000 komórek na dołku na 6-dołkowej płytce, zastępując pożywkę NPC pożywką Neuron</li>.
	<li>Immunohistochemicznie zwaliduj każdą ustaloną linię NPC. Po namnażeniu wystarczającej ilości materiału komórkowego oznacz NPC przeciwciałami przeciwko NESTIN i SOX2. Zwalidowane linie NPC powinny być również różnicowane w neurony przez 4-6 tygodni i znakowane przeciwciałami przeciwko βIII-TUBULINIE i MAP2AB.
	<ol>
		<li>Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie w PBS w temperaturze 4°C przez 10 min. Utrwal NPC w RT przez 15 min w 1,0% Triton w PBS, a następnie zablokuj 5% surowicę osła 0,1% Tritonem w RT przez 30 min.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w 5% surowicy osła z 0,1% Tritonem, przez noc w temperaturze 4°C. 
		UWAGA: Zalecamy następujące przeciwciała: kozioł anty-Sox2, 1:200; mysz anty-ludzka Nestin, 1:200; królicza anty-βIII-tubulina, 1:500; mysia anty-βIII-tubulina, 1:500; mysz anty-MAP2AB, 1:200. (Rysunek 2).</li>
		<li>Po przemyciu PBS inkubować komórki przeciwciał drugorzędowych z odpowiednim sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym dla kozy, myszy lub królika w stosunku 1:300, w 5% surowicy osła z 0,1% Tritonem przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej. Aby uwidocznić jądra, wybarwić komórki 0,5 μg/ml DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol), a następnie zamontować za pomocą Vectashield.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Transdukcja NPC
<ol>
	<li>Stosować spinfection (wirowanie płytek do hodowli komórkowych w obecności wirusa w dawce 1,000 x g przez 1 godzinę) w celu zwiększenia odsetka transfekowanych komórek 21. Odessać pożywkę i zastąpić odpowiednimi nadekspresjami (lub kontrolą) lentiwirusy (lub retrowirusy), o pożądanej wielokrotności infekcji (MOI) (zwykle 1-10), rozcieńczone w pożywce NPC. Użyć 1,5 ml objętości na dołek płytki 6-dołkowej (lub odpowiednio przeskalowanej objętości dla innych rodzajów płytek do hodowli tkankowych). Wirować w temperaturze 1.000 x g i temperaturze 37 ºC przez 1 godzinę w wirówce płytkowej. 
	UWAGA: Najlepiej jest transdukować NPC za pomocą wektorów lentiwirusowych lub retrowirusowych w ciągu 1-2 dni od rozszczepienia. Niezależnie od tego, czy używasz wirusów komercyjnych, czy przygotowanych laboratoryjnie, pomocne może być odpowiednie mianowanie partii wirusa z wyprzedzeniem poprzez seryjne rozcieńczanie. (Rysunek 3).</li>
	<li>Aby zmniejszyć śmierć komórkową, wymień pożywkę w ciągu 8 godzin od infekcji. 
	UWAGA: Integracja wirusa i ekspresja transgenu powinny być wykrywalne w ciągu 24 godzin przez fluorescencję genu reporterowego. (Jeśli wirus nie ma fluorescencyjnego reportera, jest to trudniejsze do oceny; udana transfekcja może być najlepiej zweryfikowana za pomocą immunoblot, immunohistochemii lub qPCR dla produktów nadekspresji). Pełne odciągnięcie może zająć 3-7 dni; Wielokrotne infekcje dodatkowym wirusem mogą być wymagane w celu zwiększenia odsetka transfekowanych komórek. Nawracające infekcje mogą występować codziennie, ale nie muszą być tak częste. Idealnie, jeśli używasz reportera fluorescencyjnego, >80% komórek powinno być oznakowanych.</li>
</ol>
5. Test migracji neurosfery
UWAGA: Neurosfery tworzą się spontanicznie, po enzymatycznej dysocjacji NPC (w sposób identyczny jak w przypadku ekspansji NPC - kroki 3.3-3.6), jeśli komórki są hodowane w zawiesinie w pożywce NPC.
<ol>
	<li>Krótko mówiąc, hoduj zdysocjowane NPC w pożywkach NPC przez 48 godzin na nieprzylegających płytkach, aby wygenerować neurosfery. (Rysunek 4).</li>
	<li>W przypadku migracji neurosfery przygotuj świeże płytki Matrigel przy użyciu zimnych pożywek NPC, a nie DMEM, na 96-dołkowej płytce, 1-2 godziny przed pobraniem neurosfery. Nie odsysaj Matrigelu ze studzienek.</li>
	<li>Jak pierwotnie opublikowano dla embrionalnych neurosfer pochodzących z komórek macierzystych 22, ręcznie wybierz neurosfery pochodzące z NPC pod mikroskopem, po jednokrotnym umyciu w pożywce NPC w celu usunięcia resztek komórkowych. Przenieś jedną neurosferę do każdej studzienki 96-dołkowej płytki pokrytej Matrigelem.</li>
	<li>Dodaj dodatkowe 0,5 mg Matrigel, rozcieńczonego w zimnym pożywce NPC, do neurosfer w każdej 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Ręcznie wyśrodkuj każdą pojedynczą neurosferę w środku studzienki za pomocą końcówki pipety. 
	UWAGA: Ważne jest, aby wybrać neurosfery o podobnej wielkości, aby zmniejszyć zmienność wyników.</li>
	<li>Pozwól na migrację przez 48 godzin, a następnie utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu i wybarwij pożądanymi markerami immunohistochemicznymi.</li>
	<li>Jeśli ma być określona migracja radialna, sfotografuj neurosfery w całości za pomocą obiektywu mikroskopowego 4x. Wyklucz z analizy wszelkie neurosfery stykające się z krawędzią studzienki lub drugą neurosferą. 
	UWAGA: Jeśli migracja trwa dłużej niż 48 godzin, wynikająca z niej migracja promieniowa będzie prawdopodobnie zbyt duża, aby można ją było sfotografować za pomocą obiektywu 4x.</li>
	<li>Zmierz średnią migrację z każdej neurosfery za pomocą oprogramowania NIH ImageJ (ryc. 5). Można tego dokonać za pomocą jednej z metod analizy opisanych poniżej:
	<ol>
		<li>Migracja promieniowa:
		<ol>
			<li>Ręcznie obrysuj krawędź najdalej migrujących komórek za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego, a następnie użyj funkcji Zmierz (Ctrl+M), aby obliczyć obszar wynikowego kształtu. Przed pomiarem powierzchni upewnij się, że pole jest zaznaczone w oknie Ustaw pomiary znajdującym się w zakładce Analizuj. Użyj wartości pomiaru powierzchni i równania dla pola pola okręgu (A=πr2), aby określić promień (zewnętrzny).</li>
			<li>Śledź krawędź oryginalnej neurosfery, zmierz obszar i oblicz promień (wewnętrzny) w ten sam sposób. Oblicz całkowitą migrację promieniową jako różnicę między promieniem zewnętrznym i wewnętrznym.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Największa migracja komórkowa:
		<ol>
			<li>Zmierz odległość przebytą przez pięć najdalszych komórek od krawędzi wewnętrznej neurosfery za pomocą narzędzia do zaznaczania w linii prostej, a następnie funkcji Zmierz (Ctrl+M).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brennand, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+differences+in+hiPSC+NPCs+derived+from+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia.</a> Mol Psychiatry. , (2014).</li>
<li>Nicholas, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+hPSC-derived+forebrain+interneurons+requires+an+extended+timeline+and+mimics+human+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development.</a> Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).</li>
<li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+cortical+development+in+vitro+using+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).</li>
<li>Hashimoto-Torii, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+heat+shock+factor+1+in+neuronal+response+to+fetal+environmental+risks+and+its+relevance+to+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders.</a> Neuron. 82, 560-572 (2014).</li>
<li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+neuronal+differentiation+and+mitochondrial+dysfunction+in+hair+follicle-derived+induced+pluripotent+stem+cells+of+schizophrenia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients.</a> Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).</li>
<li>Paulsen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+oxygen+metabolism+associated+to+neurogenesis+of+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+a+schizophrenic+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).</li>
<li>Yu, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+hippocampal+neurogenesis+using+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).</li>
<li>Brennand, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+schizophrenia+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).</li>
<li>Wen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+dysregulation+in+a+human+iPS+cell+model+of+mental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders.</a> Nature. , (2014).</li>
<li>Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+pf+Inflammation+and+Tumor+Microenvironment+in+the+Development+of+Gastrointestinal+Cancers%3A+What+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Can+Do%5BTitle%5D)+AND+%22Current+stem+cell+research+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do.</a> Current stem cell research & therapy. , (2014).</li>
<li>An, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Correction+of+Huntington%27s+Disease+Phenotypes+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Pankratz, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+neural+development+and+treatment+of+rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143, 527-539 (2010).</li>
<li>Sareen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+7+and+19+trisomy+in+cultured+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells.</a> PLoS One. 4, e7630(2009).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Cowan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li>
<li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460, 1127-1131 (2009).</li>
<li>Xia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+model+spinocerebellar+ataxia+type+2+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+neuroscience+%3A+MN%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro.</a> Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Delaloy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+coordinates+proliferation+and+migration+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors.</a> Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480, 547-551 (2011).</li>
<li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisaliśmy metody, za pomocą których różnicuje się hiPSC w NPC, typ komórek nerwowych, w którym znaczna część sygnatury genowej neuronów pochodzących z hiPSC jest zachowana i która może służyć jako wskaźnik zastępczy dla szlaków rozwojowych potencjalnie przyczyniających się do patogenezy choroby 8,11. Dodatkowo, jak już szczegółowo opisaliśmy, NPC są solidnie replikującą się i łatwą do transdukcji populacją neuronalną, która naszym zdaniem może być odpowiednia do molekularnych i biochemicznych badań predyspozy...

Badania ekspresji genów neuronów zróżnicowanych in vitro z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) przez nas 1 i innych 2,3 wskazują, że neurony hiPSC przypominają raczej tkankę mózgową płodu niż dorosłego. Obecnie modele oparte na hiPSC mogą być bardziej odpowiednie do badania predyspozycji do chorób neurologicznych, a nie późnych cech choroby. Wcześniej informowaliśmy, że znaczna część sygnatury genów neuronów pochodzących ze schizofrenii hiPSC jest konserwatywna w nerwowych komórkach progenitorowych (NPC) pochodzących ze schizofrenii, co wskazuje, że NPC mogą być użytecznym typem komórek do badania szlaków molekularnych przyczyniających się do schizofrenii 1. My i inni odnotowaliśmy nieprawidłową migrację, zwiększony stres oksydacyjny i reaktywne formy tlenu, wrażliwość na podprogowe stresy środowiskowe i upośledzoną funkcję mitochondriów u NPC hiPSC schizofrenii 1,4-6, a także zmniejszoną łączność neuronalną i funkcję synaps w neuronach hiPSC schizofrenii 5,7-10. Jeśli czynniki molekularne przyczyniające się do nieprawidłowej migracji i/lub stresu oksydacyjnego u NPC hiPSC schizofrenii leżą również u podstaw zmniejszonej łączności neuronalnej w neuronach pochodzących ze schizofrenii hiPSC, NPC mogą być solidną i wysoce replikacyjną populacją neuronalną, za pomocą której można badać mechanizmy odpowiedzialne za chorobę. Ponadto, ponieważ można szybko wygenerować dużą liczbę komórek i nie trzeba czekać tygodniami lub miesiącami na dojrzewanie neuronów, testy oparte na NPC są odpowiednie do badania większych kohort pacjentów i są bardziej podatne na wysokoprzepustowe badania przesiewowe. Uważamy, że NPC hiPSC mogą służyć jako wskaźnik zastępczy dla szlaków rozwojowych potencjalnie przyczyniających się do patogenezy choroby, co zostało już wykazane w zaburzeniach tak różnych, jak schizofrenia 1 i choroba Huntingtona 11.
Aby odróżnić NPC od hiPSC, początkowa indukcja neuronalna jest realizowana przez podwójne hamowanie SMAD (0,1μM LDN193189 i 10μM SB431542) 12. Poprzez antagonizowanie sygnalizacji BMP i TGFβ za pomocą tych małych cząsteczek, specyfikacja endodermy i mezodermy jest blokowana, przyspieszając różnicowanie neuronów i prowadząc do powstania widocznych rozet nerwowych w ciągu tygodnia od posiewu. Wzorce neuronalne pojawiają się na wczesnym etapie tego procesu, prawdopodobnie w okresie tworzenia się rozety nerwowej i bezpośrednio po niej. Wobec braku innych wskazówek, te prymitywne komórki nerwowe przyjmują los podobny do losu przodomózgowia w przedniej części mózgu13. Bezpośrednio po utworzeniu rozety neuronalnej i trwającej przez cały okres ekspansji NPC, NPC przodomózgowia są hodowane z FGF2 8,14. Mają potencjał podwójnej linii i mogą być różnicowane do populacji neuronalnych składających się z 70-80% neuronów βIII-TUBULINA-dodatnich i 20-30% astrocytów glial-fibrylarnych kwaśnych białek fibrylarnych (GFAP) (ryc. 1). Większość neuronów hiPSC w przodomózgowiu jest VGLUT1-dodatnia, a więc przypuszczalnie glutaminergijna, chociaż około 30% neuronów jest GAD67-dodatnich (GABAergicznych) 8.
NPC są rutynowo przepasywane ponad dziesięć razy in vitro, zachowując przy tym spójne profile różnicowania i bez gromadzenia nieprawidłowości kariotypu. Grupy zgłaszały przejście NPC ponad 40 razy 15, jednak okazuje się, że powyżej dziesięciu pasaży NPC wykazują zwiększoną skłonność do różnicowania astrocytów. NPC dobrze tolerują wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie i mogą zostać przekształcone w neurosfery, po prostu hodując je na nieprzylegających płytkach. NPC są skutecznie transdukowane przez wektory wirusowe, co umożliwia szybką ocenę molekularnych i komórkowych konsekwencji zaburzeń genetycznych i można je łatwo rozbudować w celu uzyskania wystarczającej ilości materiału do badań biochemicznych. Ponadto, ponieważ wektory wirusowe pozwalają na silną nadmierną ekspresję i/lub knockdown genów istotnych dla choroby, zarówno w komórkach nerwowych kontrolnych, jak i pochodzących od pacjenta, można wykorzystać tę platformę do przetestowania wpływu tła genetycznego na te manipulacje. Chociaż NPC nie nadają się do testów synaptycznych lub opartych na aktywności wymagających dojrzałych neuronów, mogą być praktyczną alternatywą dla wielu prostych analiz molekularnych lub biochemicznych komórek nerwowych pochodzących od pacjenta.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#11330</td><td>dla mediów HES</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#10565</td><td>dla ośrodków neuronowych</td></tr><tr><td>KO-Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>#10828</td><td>Musi być przetestowany</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>#35050</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#11140</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#17502-048</td><td>Musi być testowany</td></tr><tr><td>seryjnie B27-RA</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#12587-010</td><td>Musi być testowany</td></tr> seryjnie <tr><td>FGF2</td><td>Life Technologies</td><td>#13256-029</td><td>Ponowne zawieszenie w PBS + 1% BSA</td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>#04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>#04-0010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>#450-02</td><td>Ponowne zawieszenie w PBS + 0,1% BSA</td></tr><tr><td>GDNF&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp;#450-10</td><td>Ponowne zawieszenie w PBS + 0,1% BSA</td></tr><tr><td>Dibutyryl cyclic-AMP</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;#D0627</td><td>Ponowne zawieszenie w PBS + 0,1% BSA</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>#A0278</td><td>Ponowne zawieszenie w H20</td></tr><tr><td>STEMdiff Odczynnik do wyboru rozety neuronowej</td><td>Stemcell Technologies</td><td>&nbsp;#05832</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innowacyjny Technologie komórkowe</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Life Technologies</td><td>#17104019</td><td></td></tr><tr><td>CF1 mEFs</td><td>Milipore</td><td>#PMEF-CF</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornityna</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Laminina, naturalna mysz 1 mg</td><td>Life Technologies</td><td>#23017-015</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD</td><td>#354230</td><td>Zawiesić na lodzie w zimnym DMEM w stężeniu 10 mg/ml, użyć 1 mg na dwie równoważne płytki 6-dołkowe</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe poddane hodowli tkankowej</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe o ultra niskim nasadce</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>kozia anty-Sox2&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc&shy; 17320</td><td>zastosowanie w stosunku 1:200</td></tr><tr><td>mysi anty-ludzki Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>użycie w 1:200</td></tr><tr><td>królików anty-&beta; III-tubulina</td><td>Covance</td><td>PRB&shy; Użycie 435P</td><td>w 1:500</td></tr><tr><td>myszy anty-&beta; III-tubulina</td><td>Covance</td><td>MMS&nieśmiały; 435P</td><td>zastosowanie w 1:500</td></tr><tr><td>mysz anty-MAP2AB</td><td>Sigma</td><td>M1406</td><td>użycie w 1:200</td></tr><tr><td>Wirówka płytkowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Coulter Allegra X-14 (z nośnikiem płyty SX4750)</td><td></td></tr></tbody></table>

przewodnik po generowaniu i wykorzystywaniu npc pochodzących z hipsc do badania chorób neurologicznych

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

Badania pośmiertne chorób neurologicznych nie są idealne do identyfikacji przyczyn inicjacji choroby, ponieważ wiele chorób obejmuje długi okres progresji choroby przed wystąpieniem objawów. Ponieważ fibroblasty pochodzące od pacjentów i osób zdrowych mogą być skutecznie przeprogramowywane w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), a następnie różnicowane w neuronalne komórki progenitorowe (NPC) i neurony w celu badania tych chorób, możliwe jest teraz podsumowanie zdarzeń rozwojowych, które wystąpiły przed wystąpieniem objawów u pacjentów. Przedstawiamy metodę, za pomocą której można skutecznie różnicować hiPSC w NPC, które oprócz tego, że są zdolne do dalszego różnicowania się w funkcjonalne neurony, mogą być również silnie pasażowane, zamrażane i rozmrażane lub przekształcane w neurosfery, umożliwiając szybkie genetyczne badania przesiewowe w celu identyfikacji czynników molekularnych, które wpływają na fenotypy komórkowe, w tym replikację, migrację, stres oksydacyjny i / lub apoptozę. Nanokomórki NPC hiPSC pochodzące od pacjentów to wyjątkowa platforma, idealnie nadająca się do empirycznego testowania komórkowych lub molekularnych konsekwencji manipulowania ekspresją genów.

Rozetki neuronalne można zidentyfikować morfologicznie, korzystając z mikroskopu w polu jasnym, po ich charakterystycznym wyglądzie jako okrągłych skupisk komórek neuroepithelialnych o polarności apikalno-bazalnej (Rycina 1). Chociaż NPC są zazwyczaj hodowane przy bardzo wysokiej gęstości komórek, bezpośrednio po pasażowaniu widoczne są ciała komórkowe o lekko piramidowym kształcie oraz bipolarna struktura neurytów (Rycina 1D). Zwalidowane NPC wykazują ekspresję NESTIN i SOX2 w większośc...

Ten protokół opisuje, jak neuronalne komórki progenitorowe mogą być odróżniane od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w celu uzyskania solidnej i replikacyjnej populacji komórek nerwowych, która może być wykorzystana do identyfikacji ścieżek rozwojowych przyczyniających się do patogenezy choroby w wielu zaburzeniach neurologicznych.

Przewodnik po generowaniu i wykorzystywaniu NPC pochodzących z hiPSC do badania chorób neurologicznych

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie komórek progenitorowych neuronów lub NPC z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub hiPSCs jako platformy do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych przyczyniających się do chorób neurologicznych. Jest to osiągane poprzez różnicowanie hiPSCs z wykorzystaniem podwójnych inhibitorów smad w rozetki neuralne. Drugim krokiem jest pobranie tych rozetek neuralnych i umożliwienie im wzrostu w ekspandowalne populacje NPC.Następnie przeprowadzono transdukcję lentiwirusem z wykorzystaniem infekcji wirowej (spin infection). Krok ten, służący poprawie wydajności, został zastosowany w celu manipulacji ekspresją genów. Ostatnim etapem była hodowla NPC w zawiesinie, aby umożliwić im spontaniczne formowanie neurosfer.Ostatecznie platforma ta może być wykorzystana do analizy różnorodnych fenotypów komórkowych. Przykładem jest pomiar wpływu manipulacji genetycznych na migrację neuronów. Metoda ta pozwala zatem na uzyskanie wglądu w mechanizmy komórkowe, takie jak migracja.Metodę tę można również zastosować do badania innych procesów biologicznych, takich jak replikacja, stres oksydacyjny, apoptoza oraz wypustkowanie neurytów. Różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych lub wysokich PSC prowadzi do powstania widocznych rozetek neuralnych, które charakteryzują się postacią okrągłych skupisk komórek neuroepithelialnych z polaryzacją apikalno-bazalną, co umożliwia enzymatyczną selekcję rozetek neuralnych w 14. dniu. Odessać medium z przylegających ciał embrionalnych lub ebs i dodać 1 mL odczynnika do selekcji rozetek neuralnych na każdą studzienkę płytki 6-dołkowej; inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.Po jednej godzinie za pomocą pipety P 1000 delikatnie usunąć enzym z każdej dołki i dodać 1 mL pożywki D-M-E-M-F 12 do każdej dołki. Aby wypłukać rozety, zebrać 1 mL D-M-E-M-F 12 i szybko go wydmuchnąć z powrotem do dołki, odrywając w ten sposób rozety od płytki.Zebrać rozety do probówki typu Falcon. Pipetować kolejny 1 ml DMEM/F12 i szybko wnieść go do tej samej studni, aby odczepić pozostałe rozety. Nie triturować i starać się nie rozbijać agregatów rozet. Zebrać rozety neuralne do tej samej probówki typu Falcon.Jeśli rozetki nie odrywają się łatwo po zebraniu wszystkich rozetek neuralnych, można dodać więcej enzymu i powtórzyć tę procedurę. Wirować probówkę Falcon z prędkością 300 G przez trzy minuty. Odessać płuczkę i resuspenderować.Rozzawiesić rozetki w 2 mL pożywki dla komórek progenitorowych neuronów. Przenieść komórki na 6-dołkową płytkę ścienną powleczoną laminatem poli-L-ornityny i hodować w temperaturze 37°C przez jeden tydzień. W tym laboratorium komórki progenitorowe neuronów (NPCs) hoduje się na płytkach z Matrigel, dokarmiając je co drugi dzień i utrzymując bardzo wysoką gęstość.Aby przeprowadzić pasaż NPC, najpierw odessać medium, a następnie dodać 1 mL ciepłego Accutane do każdego dołka płytki 6-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 do 15 minut. Ostrożnie przenieść odłączone komórki do probówki 15 mL zawierającej DMEM/F12, minimalizując stres mechaniczny. Nie triturować komórek. Osadzić komórki w enzymie poprzez wirowanie przy 1000 ×g przez 5 minut. Po wirowaniu odessać nadsącz i resuspender NPC.W około jednym mililitrze medium NPC na każdą oryginalną studzienkę płytki sześciodołkowej, po resuspensji i zliczeniu komórek, oczekuje się od 5 do 10 milionów komórek na konfluentną studzienkę. W celu utrzymania NPC, uzupełnij płytkę NPC, siejąc około 1 do 2 milionów komórek na studzienkę płytki sześciodołkowej. Efektywność tworzenia neurosfer różni się w zależności od eksperymentu i linii komórkowych, lecz zazwyczaj jest najwyższa, gdy w studzience nieprzylgającej płytki sześciodołkowej wysieje się od 200 000 do miliona komórek; w przypadku wystąpienia agregacji, należy zmniejszyć liczbę wysiewanych komórek. Idealnie proces ten powinien odbyć się w ciągu jednego do dwóch dni od pasażowania.NP NPCs należy transdukować wektorami lentiwirusowymi lub retrowirusowymi, aby zwiększyć odsetek przetransfekowanych komórek. Należy zastosować metodę spin-infekcji. Odessać medium z każdej studni i zastąpić je odpowiednimi lentiwirusami lub retrowirusami nadekspresyjnymi lub kontrolnymi, o mianie dostosowanym do pożądanego rozcieńczenia wielokrotności infekcji (MOI).W pożywce NPC zastosować 1,5 ml na dołek płytki 6-dołkowej, a następnie wirować przy 1000 G i temperaturze pokojowej przez jedną godzinę w wirówce do płytek. Po wirowaniu umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze, aby ograniczyć obumieranie komórek. Pożywkę należy wymienić w ciągu ośmiu godzin od zakażenia z wirowaniem.Procedurę należy rozpocząć od jednokrotnego przemycia NEUROSPHERES pochodzących z NPC w pożywce NPC w celu usunięcia szczątków komórkowych. Należy przechylić płytkę pod kątem 45 stopni, pozwolić neurosferom osiąść, a następnie usunąć jak największą ilość pożywki, uważając, aby nie odessać neurosfer. Następnie należy dodać świeżą pożywkę.Następnie, pod mikroskopem, ręcznie wyłowić pochodzące z NPC NEUROSFERY za pomocą pipety P 200 i przenieść jedną neurosferę do każdego dołka płytki 96-dołkowej pokrytej Matrigelem. Ważne jest wybranie neurosfer o zbliżonych rozmiarach w celu zmniejszenia zmienności wyników. Do neurosfer w każdym dołku płytki 96-dołkowej dodać dodatkowe 0,5 mg Matrigelu rozcieńczonego w zimnej pożywce NPC.Za pomocą końcówki pipety ręcznie wyśrodkuj każdą pojedynczą neurosferę w środku dołka. Pozostaw neurosfery na 48 godzin w celu umożliwienia ich migracji. Po utrwaleniu i barwieniu komórek wybranymi markerami immunohistochemicznymi, sfotografuj neurosfery w całości, korzystając z obiektywu mikroskopu Forex. Do pomiaru migracji radialnej wykorzystaj oprogramowanie Image J.Użyj narzędzia do zaznaczania ręcznego, aby ręcznie obrysować krawędź najdalej migrujących komórek. Upewnij się, że pole powierzchni (area) jest zaznaczone w oknie ustawień pomiarów znajdującym się w zakładce analyze. Następnie użyj funkcji measure, aby obliczyć powierzchnię powstałego kształtu.Wykorzystując wartość pomiaru pola powierzchni oraz wzór na pole koła, wyznacz w ten sam sposób promień zewnętrzny, obrysowując krawędź oryginalnej sfery neuros. Zmierz pole powierzchni i oblicz promień wewnętrzny. Całkowitą migrację radialną oblicz jako różnicę między promieniem zewnętrznym a wewnętrznym.Obrazy te przedstawiają etapy wysokowydajnej różnicowania neuronowego z wysokowydajnych PSC do ciał embrionalnych, rozet neuralnych, NPC oraz neuronów; zwalidowane NPC wykazują ekspresję markera NPC nesting oraz czynnika transkrypcyjnego komórek macierzystych układu nerwowego SOX two w większości komórek. Barwienie na beta trzy tubulinę jest również widoczne we wszystkich populacjach NPC. NPC wykazują ponadto ekspresję czynnika transkrypcyjnego komórek macierzystych układu nerwowego PAC six oraz markera progenitorów mózgu four brainin.TBR2, ale nie markery śródmózgowia, takie jak LMX1A i FOXA2. NPC mogą różnicować się do 70–80% neuronów dodatnich pod kątem beta III tubuliny (zaznaczonych na zielono) oraz 20–30% astrocytów dodatnich pod kątem kwaśnego białka włóknistego glejowego (zaznaczonych na czerwono) w przypadku wysokiej jakości NPC pochodzących z PSC. Wysokiej jakości NPC wykazują ekspresję nestyny i SOX2 w większości komórek, podczas gdy niskiej jakości NPC posiadają jedynie obszary komórek negatywnych pod kątem SOX2 i nestyny. Czterotygodniowe neurony zróżnicowane z wysokiej jakości NPC wykazują ekspresję MAP2 oraz beta III tubuliny.Po udanej transdukcji wektorem lentiwirusowym lub retrowirusowym o wysokim mianie, ponad 80% komórek zostaje oznakowanych fluorescencyjnym reporterem. Wykorzystanie wektora w procesie generowania neurosfer pozwala na uzyskanie populacji neurosfer o stosunkowo jednorodnej wielkości, które mogą pozostawać w dobrej kondycji w hodowli przez około jeden tydzień.Przy regularnym dokarmianiu migracja neurosfer zachodzi intensywnie w zdrowych neurosferach, co ilustrują te obrazy w świetle przechodzącym przed i po 48 godzinach migracji w matrigelu po jego wytworzeniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie schizofrenii do badania neuromigracji w NPC pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych. Należy pamiętać, że praca z retrowirusem może być potencjalnie niebezpieczna, a wszystkie prace z kulturami tkankowymi powinny być prowadzone w warunkach BL2+, gdy wirus może być obecny.

a-guide-to-generating-using-hipsc-derived-npcs-for-study-neurological

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przewodnik po generowaniu i wykorzystywaniu pochodnych hiPSC NPC w badaniach nad chorobami neurologicznymi

Opisujemy metodologię łączącą zautomatyzowaną hodowlę komórek z obrazowaniem wysokotreściowym w celu wizualizacji i kwantyfikacji wielu procesów oraz struktur komórkowych w sposób wysokoprzepustowy. Takie metody mogą wspomagać dalszą adnotację funkcjonalną genomów, a także identyfikację sieci genów związanych z chorobami i potencjalnych punktów uchwytu dla leków.

Badania wysokoprzepustowe wysokiej treści (High Content Screening) w chorobach neurodegeneracyjnych

Ten film demonstruje test migracji neurosfery komórek prekursorowych neuronów - test in vitro do badania odpowiedzi migracyjnej neuronalnych komórek prekursorowych z neurosfery - za pomocą analizy mikroskopowej.

Test neurosfery NPC: Test in vitro do oceny odpowiedzi migracyjnej neuronalnych komórek prekursorowych z neurosfery

Ten film demonstruje protokół izolowania komórek z hipokampów szczurów, w tym neuronów, astrocytów i mikrogleju.

Uzyskiwanie różnych populacji komórek nerwowych z hipokampa szczura

Modelowanie rozwoju ludzkiego mózgu zostało utrudnione z powodu bezprecedensowej złożoności tkanki nabłonka nerwowego. W tym artykule opisano metodę wytwarzania organoidów mózgowych w celu wyznaczenia wczesnych zdarzeń rozwoju ludzkiego mózgu i modelowania małogłowia in vitro.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu pochodzących z iPSC w celu modelowania wczesnych zaburzeń neurorozwojowych

Procesy neurorozwojowe, takie jak proliferacja, migracja i rozrost neurytów, są często zaburzone w chorobach neuropsychiatrycznych. W związku z tym przedstawiamy protokoły szybkiej i powtarzalnej oceny tych procesów neurorozwojowych u ludzkich NPC pochodzących z iPSC. Protokoły te pozwalają również na ocenę wpływu odpowiednich czynników wzrostu i terapii na rozwój NPC.

Szybkie wykrywanie fenotypów neurorozwojowych w ludzkich neuronalnych komórkach prekursorowych (NPC)

To badanie przedstawia i opisuje protokoły do uzyskania dwóch specyficznych ludzkich organoidów nerwowych jako odpowiedniego i dokładnego modelu do badania: 1) rozwoju glejaka u człowieka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie u ludzi oraz 2) różnicowania dopaminergicznego neuronów generującego trójwymiarowy organoid.

Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych

Prezentowany protokół opisuje metodę badania wzrostu neurytów i oceny neurotoksyczności związków małocząsteczkowych.

Test wzrostu neurytów i ocena neurotoksyczności z ludzkimi neuronami pochodzącymi z neuronów progenitorowych

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Ten protokół pokazuje, jak symulacje neuronalne oparte na fizyce mogą być wykorzystywane do interpretacji biomarkerów elektro fizjologicznych neuroterapeutyków i ujawniania ich wpływu na obwody neuronalne, zapewniając uzasadnione mechanistycznie podejście do rozwoju neuroterapeutyki.

Protokół do ujawnienia neuronalnych mechanizmów działania neuroterapeutycznego na elektroencefalografii z wykorzystaniem ludzkiego neurosolvera kory nowej mózgu

Wprowadzenie

W ostatnich latach neuroterapia stała się coraz bardziej popularna jako metoda leczenia różnych zaburzeń psychicznych i neurologicznych. Jednak mechanizmy działania neuroterapii na poziomie neuronalnym pozostają częściowo niejasne. Elektroencefalografia (EEG) jest jednym z najczęściej stosowanych narządów diagnostycznych w neuroterapii, ponieważ umożliwia rejestrację aktywności elektrycznej mózgu w czasie rzeczywistym. W tym artykule przedstawiamy protokół do badania neuronalnych mechanizmów działania neuroterapii na EEG za pomocą ludzkiego neurosolvera kory nowej mózgu.

Materiał i metody

1. Przygotowanie danych

Aby rozpocząć, zebrane zostaną dane EEG od pacjentów, którzy przechodzą neuroterapię. Dane te będą przetwarzane w celu usunięcia artefaktów i zakłóceń, a następnie zostaną przefiltrowane w celu uzyskania odpowiednich zakresów częstotliwości.

2. Modelowanie matematyczne

Następnie, wykorzystując ludzki neurosolver kory nowej mózgu, dane EEG zostaną przekształcone w model matematyczny opisujący aktywność neuronalną w korze nowej mózgu. Neurosolver kory nowej mózgu jest zaawansowanym narzędziem komputerowym, które pozwala na symulację działania neuronów i sieci neuronowych w korze mózgu.

3. Analiza wrażliwości

Po utworzeniu modelu matematycznego, przeprowadzona zostanie analiza wrażliwości w celu zidentyfikowania kluczowych parametrów i zmiennych, które mają wpływ na działanie neuroterapii. Analiza ta pomoże zrozumieć, jak neuroterapia modyfikuje aktywność neuronalną w korze mózgu i jak te zmiany wpływają na działanie terapeutyczne.

4. Weryfikacja modelu

Na koniec, model matematyczny zostanie zweryfikowany poprzez porównanie jego prognoz z rzeczywistymi danymi EEG pacjentów, którzy przeszli neuroterapię. Ta weryfikacja pomoże określić dokładność i przydatność modelu w przewidywaniu działania neuroterapii.

Wyniki

Protokół ten pozwoli na lepsze zrozumienie mechanizmów działania neuroterapii na poziomie neuronalnym. Dzięki zastosowaniu ludzkiego neurosolvera kory nowej mózgu, będziemy w stanie zidentyfikować kluczowe elementy aktywności neuronalnej, które są modyfikowane przez neuroterapię i które mają bezpośredni wpływ na efekty terapeutyczne.

Podsumowanie

Przedstawiony protokół do badania neuronalnych mechanizmów działania neuroterapii na EEG z wykorzystaniem ludzkiego neurosolvera kory nowej mózgu zapewnia nowatorskie podejście do zrozumienia i ulepszania neuroterapii. Dzięki temu protokołowi będziemy w stanie lepiej zrozumieć, jak neuroterapia działa na poziomie neuronalnym i jak te informacje mogą być wykorzystane do ulepszania metod leczenia różnych zaburzeń psychicznych i neurologicznych.

Poznaj metodę różnicowania komórek progenitorowych układu nerwowego (NPC) z hiPSC przy użyciu inhibitorów SMAD do badania chorób neurologicznych. Protokół umożliwia generowanie ekspandowalnych populacji NPC i formowanie neurosfer.

Przewodnik po generowaniu i wykorzystywaniu NPC pochodzących z hiPSC do badania chorób neurologicznych

Przeglądaj więcej filmów