Przewodnik po generowaniu i wykorzystywaniu NPC pochodzących z hiPSC do badania chorób neurologicznych

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie komórek progenitorowych neuronów lub NPC z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub hiPSCs jako platformy do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych przyczyniających się do chorób neurologicznych. Jest to osiągane poprzez różnicowanie hiPSCs z wykorzystaniem podwójnych inhibitorów smad w rozetki neuralne. Drugim krokiem jest pobranie tych rozetek neuralnych i umożliwienie im wzrostu w ekspandowalne populacje NPC.

Następnie przeprowadzono transdukcję lentiwirusem z wykorzystaniem infekcji wirowej (spin infection). Krok ten, służący poprawie wydajności, został zastosowany w celu manipulacji ekspresją genów. Ostatnim etapem była hodowla NPC w zawiesinie, aby umożliwić im spontaniczne formowanie neurosfer.

Ostatecznie platforma ta może być wykorzystana do analizy różnorodnych fenotypów komórkowych. Przykładem jest pomiar wpływu manipulacji genetycznych na migrację neuronów. Metoda ta pozwala zatem na uzyskanie wglądu w mechanizmy komórkowe, takie jak migracja.

Metodę tę można również zastosować do badania innych procesów biologicznych, takich jak replikacja, stres oksydacyjny, apoptoza oraz wypustkowanie neurytów. Różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych lub wysokich PSC prowadzi do powstania widocznych rozetek neuralnych, które charakteryzują się postacią okrągłych skupisk komórek neuroepithelialnych z polaryzacją apikalno-bazalną, co umożliwia enzymatyczną selekcję rozetek neuralnych w 14. dniu. Odessać medium z przylegających ciał embrionalnych lub ebs i dodać 1 mL odczynnika do selekcji rozetek neuralnych na każdą studzienkę płytki 6-dołkowej; inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.

Po jednej godzinie za pomocą pipety P 1000 delikatnie usunąć enzym z każdej dołki i dodać 1 mL pożywki D-M-E-M-F 12 do każdej dołki. Aby wypłukać rozety, zebrać 1 mL D-M-E-M-F 12 i szybko go wydmuchnąć z powrotem do dołki, odrywając w ten sposób rozety od płytki.

Zebrać rozety do probówki typu Falcon. Pipetować kolejny 1 ml DMEM/F12 i szybko wnieść go do tej samej studni, aby odczepić pozostałe rozety. Nie triturować i starać się nie rozbijać agregatów rozet. Zebrać rozety neuralne do tej samej probówki typu Falcon.

Jeśli rozetki nie odrywają się łatwo po zebraniu wszystkich rozetek neuralnych, można dodać więcej enzymu i powtórzyć tę procedurę. Wirować probówkę Falcon z prędkością 300 G przez trzy minuty. Odessać płuczkę i resuspenderować.

Rozzawiesić rozetki w 2 mL pożywki dla komórek progenitorowych neuronów. Przenieść komórki na 6-dołkową płytkę ścienną powleczoną laminatem poli-L-ornityny i hodować w temperaturze 37°C przez jeden tydzień. W tym laboratorium komórki progenitorowe neuronów (NPCs) hoduje się na płytkach z Matrigel, dokarmiając je co drugi dzień i utrzymując bardzo wysoką gęstość.

Aby przeprowadzić pasaż NPC, najpierw odessać medium, a następnie dodać 1 mL ciepłego Accutane do każdego dołka płytki 6-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 do 15 minut. Ostrożnie przenieść odłączone komórki do probówki 15 mL zawierającej DMEM/F12, minimalizując stres mechaniczny. Nie triturować komórek. Osadzić komórki w enzymie poprzez wirowanie przy 1000 ×g przez 5 minut. Po wirowaniu odessać nadsącz i resuspender NPC.

W około jednym mililitrze medium NPC na każdą oryginalną studzienkę płytki sześciodołkowej, po resuspensji i zliczeniu komórek, oczekuje się od 5 do 10 milionów komórek na konfluentną studzienkę. W celu utrzymania NPC, uzupełnij płytkę NPC, siejąc około 1 do 2 milionów komórek na studzienkę płytki sześciodołkowej. Efektywność tworzenia neurosfer różni się w zależności od eksperymentu i linii komórkowych, lecz zazwyczaj jest najwyższa, gdy w studzience nieprzylgającej płytki sześciodołkowej wysieje się od 200 000 do miliona komórek; w przypadku wystąpienia agregacji, należy zmniejszyć liczbę wysiewanych komórek. Idealnie proces ten powinien odbyć się w ciągu jednego do dwóch dni od pasażowania.

NP NPCs należy transdukować wektorami lentiwirusowymi lub retrowirusowymi, aby zwiększyć odsetek przetransfekowanych komórek. Należy zastosować metodę spin-infekcji. Odessać medium z każdej studni i zastąpić je odpowiednimi lentiwirusami lub retrowirusami nadekspresyjnymi lub kontrolnymi, o mianie dostosowanym do pożądanego rozcieńczenia wielokrotności infekcji (MOI).

W pożywce NPC zastosować 1,5 ml na dołek płytki 6-dołkowej, a następnie wirować przy 1000 G i temperaturze pokojowej przez jedną godzinę w wirówce do płytek. Po wirowaniu umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze, aby ograniczyć obumieranie komórek. Pożywkę należy wymienić w ciągu ośmiu godzin od zakażenia z wirowaniem.

Procedurę należy rozpocząć od jednokrotnego przemycia NEUROSPHERES pochodzących z NPC w pożywce NPC w celu usunięcia szczątków komórkowych. Należy przechylić płytkę pod kątem 45 stopni, pozwolić neurosferom osiąść, a następnie usunąć jak największą ilość pożywki, uważając, aby nie odessać neurosfer. Następnie należy dodać świeżą pożywkę.

Następnie, pod mikroskopem, ręcznie wyłowić pochodzące z NPC NEUROSFERY za pomocą pipety P 200 i przenieść jedną neurosferę do każdego dołka płytki 96-dołkowej pokrytej Matrigelem. Ważne jest wybranie neurosfer o zbliżonych rozmiarach w celu zmniejszenia zmienności wyników. Do neurosfer w każdym dołku płytki 96-dołkowej dodać dodatkowe 0,5 mg Matrigelu rozcieńczonego w zimnej pożywce NPC.

Za pomocą końcówki pipety ręcznie wyśrodkuj każdą pojedynczą neurosferę w środku dołka. Pozostaw neurosfery na 48 godzin w celu umożliwienia ich migracji. Po utrwaleniu i barwieniu komórek wybranymi markerami immunohistochemicznymi, sfotografuj neurosfery w całości, korzystając z obiektywu mikroskopu Forex. Do pomiaru migracji radialnej wykorzystaj oprogramowanie Image J.

Użyj narzędzia do zaznaczania ręcznego, aby ręcznie obrysować krawędź najdalej migrujących komórek. Upewnij się, że pole powierzchni (area) jest zaznaczone w oknie ustawień pomiarów znajdującym się w zakładce analyze. Następnie użyj funkcji measure, aby obliczyć powierzchnię powstałego kształtu.

Wykorzystując wartość pomiaru pola powierzchni oraz wzór na pole koła, wyznacz w ten sam sposób promień zewnętrzny, obrysowując krawędź oryginalnej sfery neuros. Zmierz pole powierzchni i oblicz promień wewnętrzny. Całkowitą migrację radialną oblicz jako różnicę między promieniem zewnętrznym a wewnętrznym.

Obrazy te przedstawiają etapy wysokowydajnej różnicowania neuronowego z wysokowydajnych PSC do ciał embrionalnych, rozet neuralnych, NPC oraz neuronów; zwalidowane NPC wykazują ekspresję markera NPC nesting oraz czynnika transkrypcyjnego komórek macierzystych układu nerwowego SOX two w większości komórek. Barwienie na beta trzy tubulinę jest również widoczne we wszystkich populacjach NPC. NPC wykazują ponadto ekspresję czynnika transkrypcyjnego komórek macierzystych układu nerwowego PAC six oraz markera progenitorów mózgu four brainin.

TBR2, ale nie markery śródmózgowia, takie jak LMX1A i FOXA2. NPC mogą różnicować się do 70–80% neuronów dodatnich pod kątem beta III tubuliny (zaznaczonych na zielono) oraz 20–30% astrocytów dodatnich pod kątem kwaśnego białka włóknistego glejowego (zaznaczonych na czerwono) w przypadku wysokiej jakości NPC pochodzących z PSC. Wysokiej jakości NPC wykazują ekspresję nestyny i SOX2 w większości komórek, podczas gdy niskiej jakości NPC posiadają jedynie obszary komórek negatywnych pod kątem SOX2 i nestyny. Czterotygodniowe neurony zróżnicowane z wysokiej jakości NPC wykazują ekspresję MAP2 oraz beta III tubuliny.

Po udanej transdukcji wektorem lentiwirusowym lub retrowirusowym o wysokim mianie, ponad 80% komórek zostaje oznakowanych fluorescencyjnym reporterem. Wykorzystanie wektora w procesie generowania neurosfer pozwala na uzyskanie populacji neurosfer o stosunkowo jednorodnej wielkości, które mogą pozostawać w dobrej kondycji w hodowli przez około jeden tydzień.

Przy regularnym dokarmianiu migracja neurosfer zachodzi intensywnie w zdrowych neurosferach, co ilustrują te obrazy w świetle przechodzącym przed i po 48 godzinach migracji w matrigelu po jego wytworzeniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie schizofrenii do badania neuromigracji w NPC pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych. Należy pamiętać, że praca z retrowirusem może być potencjalnie niebezpieczna, a wszystkie prace z kulturami tkankowymi powinny być prowadzone w warunkach BL2+, gdy wirus może być obecny.