Przewodnik po generowaniu i wykorzystywaniu NPC pochodzących z hiPSC do badania chorób neurologicznych

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie neuro komórek progenitorowych lub NPC z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub wysokich PSC jako platformy do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych przyczyniających się do chorób neurologicznych. Osiąga się to poprzez pierwsze różnicowanie wysokich PSC za pomocą podwójnych inhibitorów SMAD w rozety neuronalne. Drugim krokiem jest zebranie tych rozet neuronowych i pozwolenie im na rozwój w rozszerzalne populacje N PC.

Następnie transdukcja lentiwirusowa z infekcją spinową. Krok w celu poprawy wydajności służy do manipulowania ekspresją genów. Ostatnim krokiem jest wyhodowanie NPC w zawieszeniu, tak aby spontanicznie tworzyły neurosfery.

Ostatecznie platforma ta może być wykorzystana do oznaczania różnych fenotypów komórkowych. Na przykład pomiar wpływu manipulacji genetycznej na neuromigrację. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w mechanizmy komórkowe, takie jak migracja.

Może być również stosowany do badania innych procesów biologicznych, takich jak replikacja, stres oksydacyjny, apoptoza i wzrost neurytów. Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych lub wysokich PSC prowadzi do powstawania widocznych rozet nerwowych, które charakteryzują się jako okrągłe skupiska komórek nabłonka nerwowego o podstawowej polaryzacji aico dla enzymatycznej selekcji rozet nerwowych w 14 dniu. Odessać pożywkę z przylegających ciał zarodków lub ebs i dodać jeden mililitr odczynnika selekcyjnego neuronalnego roset na dołek sześciodołkowej płytki inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Po godzinie. Użyj pipety P 1000, aby delikatnie usunąć enzym z każdej studzienki i dodać jeden mililitr D-M-E-M-F 12 na dołek. Aby umyć rozety, zbierz jeden mililitr D-M-E-M-F 12 i szybko wyrzuć go z powrotem do studzienki, odrywając w ten sposób rozety od talerza.

Zbierz rozety do probówki sokoła, odpipetuj kolejny mililitr D-M-E-M-F 12 i szybko wyrzuć go do tej samej studzienki, aby odłączyć pozostałe rozety. Nie tri i staraj się nie rozbijać agregatów rozety. Zbierz rozety neuronalne do tej samej rurki sokoła.

Można dodać więcej enzymu i tę procedurę powtórzyć, jeśli rozety nie odklejają się łatwo, gdy wszystkie rozety nerwowe zostały zebrane. Obracaj probówkę Falcon o masie 300 G przez trzy minuty. Zassać płuczkę i resus.

Zawieś rozety w dwóch mililitrach pożywki z nerwowymi komórkami progenitorowymi. Przenieś komórki na sześciościenną płytę pokrytą laminatem poli L ornityny i rosnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez tydzień. W tym laboratorium neuronalne komórki progenitorowe lub NPC są hodowane na płytkach matrygelowych, karmione co drugi dzień i utrzymywane w bardzo wysokiej gęstości.

Aby podzielić NPC, najpierw odessaj pożywkę, a następnie dodaj jeden mililitr ciepłej accutane na dołek z sześciodołkowej płytki inkubowanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Delikatnie przenieś odłączone komórki do 15-mililitrowej probówki zawierającej D-M-E-M-F 12 przy jak najmniejszym naprężeniu mechanicznym. Nie należy ttritować komórek, gdy znajdują się w osadach enzymatycznych, obracając je w temperaturze 1000 G przez pięć minut po odwirowaniu, odessać supernatant i ponownie zawiesić NPC.

W około jednym mililitrze pożywki NPC na pierwotną studzienkę płytki sześciodołkowej oczekuje się, że po ponownym zawieszeniu i zliczeniu komórek na zlewającą się studzienkę płytki sześciodołkowej przypadnie od pięciu do 10 milionów komórek. Zrepluj płytkę NPC około jednego do 2 milionów komórek na studzienkę płytki sześciodołkowej, aby utrzymać NPC. Skuteczność tworzenia neurosfer różni się w zależności od eksperymentu i linii komórkowych, ale zwykle występuje najlepiej, jeśli od 200 000 do miliona komórek jest osadzonych w studzience sześciościennej płytki nieprzylegającej, jeśli nastąpi zbrylanie, zmniejsz liczbę osadzonych komórek Najlepiej w ciągu jednego do dwóch dni od podziału.

NP NPC powinny być transdukowane za pomocą wektorów lentiwirusowych lub retrowirusowych w celu zwiększenia odsetka transfekowanych komórek. Użyj infekcji spinowej. Odessać pożywkę z każdej studzienki i zastąpić odpowiednią nadekspresją lub kontrolą lentiwirusy lub retrowirusy nachylone do pożądanej liczby rozcieńczonej infekcji.

W pożywkach NPC Użyj 1,5 mililitra na studzienkę sześciodołkowej wirowania płytki w temperaturze 1000 G i temperaturze pokojowej przez jedną godzinę w wirówce płytkowej. Po odwirowaniu umieść płytkę z powrotem w inkubatorze, aby zmniejszyć śmierć komórkową. Wymień nośnik w ciągu ośmiu godzin od zakażenia wirowania.

Rozpocznij tę procedurę od jednokrotnego umycia NEUROSFER pochodzących od NPC w pożywce NPC, aby usunąć resztki komórkowe. Przechyl płytkę pod kątem 45 stopni i pozwól neurosferom się uspokoić, a następnie usuń jak najwięcej mediów bez zasysania neurosfer. Wymień na nowy nośnik.

Następnie ręcznie wybierz NEUROSFERY pochodzące od NPC pod mikroskopem za pomocą pipety P 200 przenieś jedną kulę neuros do każdej studzienki 96-dołkowej płytki pokrytej matrylem. Ważne jest, aby wybrać neurosfery o podobnych rozmiarach, aby zmniejszyć zmienność wyników. Dodaj dodatkowe 0,5 miligrama żelu matri rozcieńczonego w zimnym podłożu NPC do neurosfer w każdej 96-dołkowej płytce.

Za pomocą końcówki pipety ręcznie wyśrodkuj każdą pojedynczą sferę neuros w środku studzienki Pozwól na migrację sfery neuros przez 48 godzin. Po utrwaleniu i zabarwieniu komórek pożądanymi markerami immunohistochemicznymi, sfotografuj neurosfery w całości za pomocą obiektywu mikroskopu Forex. Aby zmierzyć migrację promieniową, należy użyć oprogramowania do pomiaru obrazu J.

Użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby ręcznie prześledzić krawędź najdalej migrujących komórek. Upewnij się, że obszar jest zaznaczony w oknie ustawionych pomiarów znajdującym się w zakładce analiza. A następnie użyj funkcji miary, aby obliczyć obszar wynikowego kształtu.

Użyj wartości pomiaru powierzchni i równania dla pola koła, aby określić promień zewnętrzny w ten sam sposób, prześledź krawędź oryginalnej sfery neuros. Zmierz powierzchnię i oblicz promień wewnętrzny. Oblicz całkowitą migrację promieniową jako różnicę między promieniem zewnętrznym i wewnętrznym.

Obrazy te pokazują etapy wysokiego różnicowania neuronalnego PSC od wysokiego PSC do ciał zarodków, rozet nerwowych, NPC i neuronów zatwierdzonych przez NPC, zagnieżdżenia markera NPC i czynnika transkrypcyjnego neuronalnych komórek macierzystych SOX dwa w większości komórek. Barwienie tubuliną beta trzy jest również widoczne we wszystkich populacjach NPC. NPC wyrażają również czynnik transkrypcyjny neuronalnych komórek macierzystych PAC sześć i marker progenitorowy czterech mózgów.

TBR dwa, ale nie markery śródmózgowia, takie jak LMX jeden A i FOX A, dwa NPC mogą różnicować do 70 do 80% beta trzech neuronów tubuliny dodatnich pokazanych na zielono i 20 do 30% astrocytów fibrylarnych fibrylarnych kwaśnych białek glejowych pokazanych na czerwono, wysokiej jakości PSC. NPC wyrażają neston i SOX dwa w większości komórek, podczas gdy NPC niskiej jakości mają łatki SOX dwa ujemne i zagnieżdżają się tylko w komórkach ujemnych. Czterotygodniowe neurony, różniące się od wysokiej jakości NPC, wyrażają mapę dwie AB i beta trzy turbulentne.

Po udanej transdukcji wektorem lentiwirusowym lub retrowirusowym o wysokim mianie. Ponad 80% komórek jest znakowanych przez reporter fluorescencyjny. Włączenie do generacji sfery wektorowej neuros daje populację neurosfer o stosunkowo jednorodnej wielkości, które mogą pozostać zdrowe w kulturze przez około tydzień.

Przy regularnym karmieniu neuros migracja sfery zachodzi silnie w zdrowych neurosferach, co ilustrują te obrazy jasnego pola przed i po 48 godzinach migracji w matrigel Po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się schizofrenią do zbadania neuromigracji u indukowanych przez człowieka NPC pochodzących z komórek macierzystych PL. Nie zapominaj, że praca z retrowirusem może być potencjalnie niebezpieczna, a wszystkie prace związane z hodowlą tkankową powinny być wykonywane w warunkach BL dwa plus, gdy wirus jest potencjalnie obecny.