Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Celem poniższego eksperymentu jest zniszczenie białek matczynych przechowywanych w oocytach lub nadekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania w momencie zapłodnienia jaj żab. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie antysensownych oligonukleotydów lub mRNA do enzymatycznie rozregulowanych niedojrzałych oocytów w celu degradacji lub nadekspresji określonego białka. W drugim etapie oocyty są przenoszone do pożywki zawierającej progesteron, która indukuje dojrzewanie oocytów do komórek jajowych.

Następnie plemniki są wstrzykiwane do dojrzałych komórek jajowych in vitro w celu zaobserwowania wpływu knockdownu lub nadekspresji na rozwój embrionalny. Ostatecznie rozwój oligocytów wstrzykiwanych do pływających kijanek jest testem funkcjonalnym nokautacji lub nadekspresji genów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi naczyniami, takimi jak gospodarz do transferu, jest to, że możemy pominąć proces operacji żaby przy użyciu standardowych protokołów.

Zbierz opus nad SAC zawierającym zdrowe cyty w dziewięciocentymetrowej szalce petro zawierającej MBS plus ps. Następnie rozdziel jajnik na kwadratowe kawałki o szerokości od jednego do dwóch centymetrów. Zbierz około pięciu mililitrów rozerwanego jajnika z cytami do nowej 50-mililitrowej tubki.

Następnie kilkakrotnie opłucz chusteczki MBS plus PS i zbierz jajka w 15 mililitrach świeżego MBS plus ps. Teraz dodaj siedem jednostek enzymu defoliacyjnego do zawiesiny i inkubuj zawiesinę z delikatną roślinnością, aż zostaną przynajmniej częściowo zdefoliowane. Zajmie to co najmniej godzinę po inkubacji.

Napełnij probówkę MBS plus Ps, aby zatrzymać reakcję. Pociągnij roztwór na ściankę probówki, a nie bezpośrednio na cyty. Pozwól tkankom osiąść i wyrzuć zupę i środek.

Małe, niedojrzałe cyty będą unosić się na wodzie i należy je również wyrzucić. Powtórz ten krok prania w sumie 10 razy po praniu. Przenieś cyty do dziewięciocentymetrowej naczynia z MBS plus ps.

Przenieś naczynie do mikroskopu preparacyjnego i od tego momentu utrzymuj cyty w temperaturze od 16 do 18 stopni Celsjusza tak bardzo, jak to możliwe. Wybierz dobrej jakości cyty etapu szóstego za pomocą klasyfikacji Dumonta za pomocą szklanej pipety, zbierz je do nowego naczynia z MBS plus ps. Dobrej jakości cyt powinien mieć równomierną pigmentację w półkuli zwierzęcej i wykazywać wyraźną separację między półkulą zwierzęcą a roślinną.

Wszystkie powinny być również mniej więcej tego samego rozmiaru, który miałby średnicę od 1,2 do 1,4 milimetra. Zbierz około dwóch do 300 cytów do każdego wstrzyknięcia, co daje około 1000 cytów na eksperyment. Jakość strony O jest kluczem do sukcesu.

Jeśli Oside wykazuje jakieś nieprawidłowości podczas przygotowania, zalecam skorygowanie jajnika z innego stada i rozpoczęcie od nowa. Przygotowując się do wstrzyknięcia oligonugolaktykum antysensownego, należy ustawić metalowy tłok mikrowtryskiwacza w najniższym położeniu i włożyć szklaną kapilarnę wypełnioną olejem na metalowy tłok. Pod mikroskopem preparacyjnym odetnij końcówkę igły za pomocą małych nożyczek chirurgicznych.

Zrób mniejszą końcówkę, jak to możliwe. Następny laser. Pasek paraformy na stoliku mikroskopu i na nim Dozować trzy mikrolitry roztworu kwasu nukleinowego w jednym mikrogramie na mikrolitr.

W ten sposób napełnij końcówkę igły. Jeśli powietrze jest uwięzione, otwór powinien być większy. Teraz zrób widoczny znak na igle do wstrzykiwań około pół milimetra od końcówki.

Następnie przystąp do wstrzykiwania cytów, aby najpierw wstrzyknąć jeden, znajdź obszar wolny od komórek pęcherzykowych, w którym igła może wniknąć w tym obszarze. Włóż końcówkę wzdłuż granicy równikowej, celując w środkowy punkt pod pęcherzykiem zarodkowym. W tym samym czasie ustabilizuj cyt kleszczami po przeciwnej stronie.

Teraz za pomocą przełącznika nożnego wyrzuć roztwór, wyrzuć od 4,6 do 9,2 nanogramów oligonukleotydów antysensownych lub od 250 pikogramów do 13,8 nanogramów informacyjnego RNA. Po wstrzyknięciu wszystkich cytów przenieś je do pożywki inkubacyjnej i pozwól im inkubować przez kilka dni, aby mogły zajść zmiany. W proteasomie.

Później przenieś cyty z minimalną ilością pożywki do sześciocentymetrowych naczyń pokrytych agrosem zawierających od pięciu do ośmiu mililitrów pożywki do dojrzewania. Następnie pozwól cytom rozwijać się w tym pożywce przez 16 godzin przed wstrzyknięciem im nasienia. Do tego protokołu należy przygotować zamrożone nasienie.

Zapoznaj się z protokołem tekstowym po 16 godzinach inkubacji w celu dojrzewania. Bardzo ostrożnie przenieś cyty do sześciocentymetrowego naczynia pokrytego jajami z MBS plus PS, aby je zmyć. Jeśli cyty są niewłaściwie traktowane, mogą spontanicznie aktywować się przed ixy.

Teraz policz dojrzałe cyty i poszukaj białych plam, które wskazują, że pęcherzyk zarodkowy cytu uległ rozpadowi. Jeśli mniej niż 80% jest dobrych, zbiorowo nie są wystarczająco zdrowe, aby przetrwać procedurę zamku. Kontynuować.

Napełnij nowe naczynie pożywką do wstrzykiwań i delikatnie przenieś wszystkie cyty do naczynia po pół godzinie. Kontynuuj wstrzykiwanie dojrzałych cytów roztworem nasienia przy użyciu tego samego preparatu do wstrzykiwań, który opisano dla oligonukleotydów. Idealnie byłoby, gdyby w roztworze do wstrzykiwań znajdował się jeden lub dwa plemniki na 4,6 nanolitra.

Aby przetestować ten roztwór do wstrzykiwań, zrób krople roztworu DPI o stężeniu 0,3 mikrograma DPI na mililitr i wstrzyknij 4,6 nanolitra do tych kropli. Następnie policz liczbę plemników w każdej kropli za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Po potwierdzeniu stężenia plemników wstrzyknij cytom 4,6 nanolitra roztworu nasienia.

Upewnij się, że czas wymagany do wstrzyknięcia roztworów pozostaje stały i wstrzykuj oocyty równomiernie, z minimalnymi przerwami między wstrzyknięciami. Po każdych 100 wstrzyknięciach wymienia się roztwór nasienia. Po wstrzyknięciu wszystkich dojrzałych oocytów naczynie należy inkubować przez cztery do pięciu godzin, a następnie obejrzeć.

W przypadku zarodków, które przeszły rozszczepienie, bruzdy rozszczepienia mogą nie być tak wyraźne, jak w przypadku normalnych zapłodnionych zarodków, przenoszą wszystkie rozszczepione zarodki na podłoża inkubacyjne i pozostawiają je do inkubacji przez noc. Następnego dnia zarodki, które przeżyły, należy przenieść do rozwoju embrionalnego zarodków zarodków ixy o wartości 0,1 XMMR. Stosowanie dojrzałych oocytów in vitro zostało zbadane w dobrych eksperymentach, prawie 100% oocytów pęcherzyków rozrodczych zareagowało na progesteron i wykazało oznaki dojrzewania.

Około 25% przeszło rozszczepienie. 60 do 80% rozszczepionych zarodków osiągnęło stadium wybuchu żołądka, a około jedna trzecia z nich osiągnęła stadium kijanki pływania. Zarodki ixy były mieszanką zarówno normalnych, jak i nieprawidłowych zarodków, co pokazuje, że wstrzyknięcie antysensownego sogo do zarodkowych cytów pęcherzykowych, a następnie IVM i Dixie umożliwiło wczesny rozwój embrionalny.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak manipulować białkami matczynymi przed faktoryzacją.