Name: Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj metodę manipulacji i dojrzewania oocytów Xenopus laevis in vitro oraz docytoplazmatyczną iniekcję plemnika, aby badać wczesny rozwój embrionalny i funkcję genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni członkom laboratorium Gurdon za pożyteczną dyskusję. K.M. jest pracownikiem naukowym w Wolfson College i jest wspierany przez Herchel Smith Postdoctoral Fellowship oraz Great Britain Sasakawa Foundation. Laboratorium Gurdon jest wspierane przez granty Wellcome Trust (RG69899) i MRC dla J.B.G.

<ol><li>Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyamoto%2C+K+%22Biology+and+Pathology+of+the+Oocyte%3A+Role+in+Fertility%2C+Medicine%2C+and+Nuclear+Reprogramming%22">Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming</a>. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).</li>
<li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo%3A+a+novel+antisense+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).</li>
<li>Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+the+Spemann+organizer+transplantation+phenomenon+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos.</a> Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).</li>
<li>Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+requirement+for+HIRA-dependent+H3.3+deposition+revealed+at+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus.</a> Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Heasman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+cadherins+and+underexpression+of+beta-catenin+inhibit+dorsal+mesoderm+induction+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos.</a> Cell. 79 (5), 791-803 (1994).</li>
<li>Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+antisense+oligonucleotides+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes.</a> Methods. 51 (1), 75-81 (2010).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Wave1+is+required+for+reprogramming+transcription+in+oocytes+and+for+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development.</a> Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).</li>
<li>Halley-Stott, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+nuclear+transplantation+to+Germinal+Vesicle+stage+Xenopus+oocytes+-+a+method+for+quantitative+transcriptional+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming.</a> Methods. 51 (1), 56-65 (2010).</li>
<li>Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+characterizes+chromatin+presetting+by+NF1+and+Oct1+and+enhances+glucocorticoid+receptor+binding+to+the+MMTV+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter.</a> Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).</li>
<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).</li>
<li>Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+transgenesis+by+sperm+nuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection.</a> Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).</li>
<li>Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+%27autocatalytic%27+nature+of+the+maturation+promoting+factor+%28MPF%29+in+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis.</a> Cell. 4 (3), 269-274 (1975).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+oocyte+nucleus+in+physiological+maturation+in+Rana+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens.</a> Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).</li>
<li>Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+actin+polymerization+is+required+for+transcriptional+reprogramming+of+Oct4+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes.</a> Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).</li>
<li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+RNA%2FCas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Szczegółowo opisujemy tutaj nową metodę wyczerpywania czynników matczynych lub nadmiernej ekspresji czynników egzogennych przed zapłodnieniem. System ten wymaga dwóch mikroiniekcji, ale zamiast tego pomija operację żab, stosowaną w metodzie transferu gospodarza7,17. Optymalne jest usunięcie etapu operacji żaby z punktu widzenia opieki nad zwierzętami. Co więcej, w eksperymentach transferowych nie musimy brać pod uwagę jakości samic żab żywicielskich, co oznacza, że możemy pozbyć się jednego czynnika biologicznego, który wpływa na powodzenie eksperymentów. Dlatego w tym systemie jakość oocytów uzyskanych od żab zaszczepionych PMSG jest głównym czynnikiem biologicznym, który ma kluczowe znaczenie dla udanych eksperymentów. Jakość oocytów można ocenić po pobraniu jajnika lub po deffolikulacji. Jeśli na tych etapach zaobserwuje się jakiekolwiek nieprawidłowości, optymalne jest pobranie kolejnego jajnika od nowej żaby. Kolejnym punktem, w którym można sprawdzić jakość oocytów, jest okres po dojrzewaniu oocytów. Jeśli mniej niż 80% oocytów leczonych progesteronem wykazuje oznaki dojrzewania, możesz nie być w stanie uzyskać wystarczającej liczby zarodków do dalszych analiz. Zastosowanie defoliacji enzymatycznej zamiast ręcznej defolkulacji jest również kolejną zaletą stosowania tego systemu w celu zmniejszenia nakładu pracy wymaganego do defoglikulacji. Jednak nadal możliwe jest, że ręczna defolkulacja może dać lepszy rozwój niż leczenie enzymatyczne.
Jak pokazano na rycinie 3, prawie 10% dojrzałych komórek jajowych in vitro może osiągnąć stadium pływającej kijanki. Dane te zostały zebrane z 13 niezależnych eksperymentów, w tym z 8 i nowych eksperymentów z iniekcjami. Metoda transferu gospodarza wymaga 75-150 oocytów w każdym zabiegu, aby uzyskać znaczące dane, ponieważ 30-60% przenoszonych oocytów może osiągnąć stadiumneuruli 17. Nasza metoda zwykle zaczyna się od 200-300 oocytów w każdej grupie eksperymentalnej, ponieważ około 40-60% rozszczepionych zarodków może osiągnąć etap odpowiedzi mięśniowej. Dane te sugerują, że obie metody wspierają rozsądne tempo rozwoju. Do tej pory uzyskaliśmy 10 żywych żab z kontrolnych oocytów, którym wstrzyknięto mRNA i kontrolne oligocyty wstrzyknięte antysensownym oligocytom przy użyciu tej techniki, co wskazuje, że takie podejście wspiera rozwój poprzez metamorfozę.
Nasza metoda manipulacji oocytami – ICSI daje możliwość zbadania roli czynników matczynych podczas bardzo wczesnego rozwoju embrionalnego, wkrótce po zapłodnieniu. Ponadto nadekspresja czynników modyfikujących chromatynę przed zapłodnieniem może umożliwić przebudowę matczynej chromatyny przed zapłodnieniem w celu zrozumienia matczynych stanów chromatyny niezbędnych do rozwoju. Strategia ta może również dobrze działać z obecnymi systemami edycji genów, takimi jak nukleaza efektorowa podobna do aktywatora transkrypcji (TALEN)18,19 i CRISPR/CAS920,21 , ponieważ mogą one ulegać ekspresji nawet przed zapłodnieniem. Dlatego nasze nowe podejście ma potencjał, aby w przyszłości znaleźć zastosowanie w wielu aplikacjach.

Xenopus laevis jest szeroko stosowanym, potężnym organizmem modelowym do badania rozwoju1. Dzieje się tak, ponieważ jaja Xenopus są niezwykle duże (około 1,2-1,4 mm, w porównaniu do odpowiedników ssaków wynoszące około 0,1 mm) i obfite. Jaja zawierają syntetyzowane i przechowywane przez matkę składniki, które są wystarczające do napędzania rozwoju embrionalnego aż do przejścia w połowie blastuli (MBT, występujące w stadium 8-8,5 z 4 000-8 000 komórek). MBT towarzyszy aktywacja genomu zygotycznego, w wyniku której następnie powstają embrionalne produkty genowe, kierujące dalszym rozwojem.
Liczne badania miały na celu zidentyfikowanie czynników matczynych ważnych dla rozwoju. Wiele badań opiera się na wstrzykiwaniu oligonukleotydów antysensownych (oligonukleotydów), w tym oligonukleotydów morfolino, do zapłodnionych zarodków, w którym to przypadku degradację białek matczynych można zaobserwować w stadiumgastruli 2-4. Alternatywnie, mRNA są wstrzykiwane do zapłodnionych zarodków w celu zakłócenia funkcji genów lub śledzenia losów nadekspresji białek. Jednak wstrzyknięcie do zarodków w stadium jednokomórkowym zwykle nie wpływa na poziom ekspresji białek matczynych w bardzo wczesnych stadiach embrionalnych przed MBT.
Heasman i Wylie ustalili metodę transferu hosta, aby rozwiązać ten problem5. W ich metodzie ręcznie odżelazione oocyty są wstrzykiwane z oligonukleotydami antysensownymi i przenoszone do samic gospodarza6. Białka są regulowane w dół przed zapłodnieniem, dzięki czemu można zbadać rolę obniżonych białek we wczesnym rozwoju embrionalnym. Ta metoda wyczerpania matczynego doprowadziła do zidentyfikowania kilku unikalnych ról rozwojowych białek matczynych, jak omówiono w 7.
W tym raporcie szczegółowo opisujemy naszą ostatnio opracowaną metodę, w której wyczerpanie lub nadekspresja mRNA u matki przed zapłodnieniem jest osiągana bez ręcznej defolkulacji i transferu gospodarza8. Ręczna defolkulacja wymaga dużo czasu, a przeniesienie gospodarza często wymaga umiejętnych technik i specjalnej licencji na chirurgię zwierząt, co utrudnia częste stosowanie metody wyczerpania matek. Defolkulacja i transfer gospodarza są podstawiane odpowiednio przez enzymatyczną defolkulację 9,10 i docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI)11-13. ICSI do jaj był pierwotnie używany do produkcji transgenicznych żab 12. Plemniki i jądra zarodkowe przeszczepiono również do dojrzałych in vitro oocytów 11,14,15. Tutaj pokazujemy naszą metodę krok po kroku wstrzykiwania plemników do dojrzałych komórek jajowych in vitro, którym wstępnie wstrzyknięto oligonukleotydy antysensowne lub mRNA.

<table><tbody><tr><td>Gonadotropina surowicy klaczy w ciąży (PMSG)&nbsp;</td><td>MSD Animal Health</td><td>Vm 01708/4309</td><td>PMSG-Intervet 5000iu proszek i rozpuszczalnik do roztworu do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>Do defoliulacji oocytów. Przechowywać w temperaturze -20&nbsp; &#176;C.</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-205/206</td><td>Do szklanej kapilary mikroiniekcyjnej</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Laboratoria Alpha</td><td>7" Drummond #3-000-203-G/XL</td> Do ściągacza do <td>mikropipet do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>SUTTER Instrument</td><td>Model D-97</td><td>Do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>Do dojrzewania in vitro i ICSI</td></tr><tr><td>14 ml ultra-przezroczysta probówka wirówkowa&nbsp;</td><td>Beckman Coulter United Kingdom Ltd</td><td>344060</td><td>Do oczyszczania plemników</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium (Jodixanol)</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>Do oczyszczania plemników</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Odczynnik do przenikania komórek</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Hybaid&nbsp;</td><td>HB-SHK-1</td> Do mikroskopu preparacyjnego <td>do defolikulacji oocytów</td></tr><tr><td>(mikroskop stereoskopowy z zoomem)</td><td>ZEISS</td><td>Semi SV6</td><td>Do pobierania oocytów i mikroiniekcji</td></tr><tr><td>50 &mu; m filtr porów</td><td>CellTrics</td><td>04-0042-2317</td><td>Do oczyszczania nasienia</td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100XP</td><td>Do oczyszczania nasienia</td></tr><tr><td>50 ml probówka wirówkowa</td><td>Cellstar Greiner Bio-One</td><td>227261 lub 210261</td><td>Reakcja pobierania i defolkulacji oocytów</td></tr><tr><td>15 ml Probówka wirówkowa</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td>Do oczyszczania plemników</td></tr><tr><td>90 mm Petri danie&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>101VR20/C</td><td></td></tr><tr><td>Easy-Grip Naczynie do hodowli komórkowych, 60&nbsp; x&nbsp; 15 mm</td><td>Naczynie do</td> hodowli komórkowych FALCON <td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Easy-Grip, 35&nbsp; x&nbsp; 15 mm</td><td>FALCON</td><td>351008</td><td></td></tr></tbody></table>

manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Jaja były szeroko wykorzystywane do badania rozwoju embrionalnego. Wczesny rozwój embrionalny jest napędzany przez czynniki zmagazynowane przez matkę nagromadzone podczas oogenezy. W celu zbadania roli takich czynników matczynych we wczesnym rozwoju embrionalnym, pożądane jest manipulowanie ich funkcjami od samego początku rozwoju embrionalnego. Konwencjonalne sposoby interferencji genów uzyskuje się poprzez wstrzyknięcie oligonukleotydów antysensownych (oligonukleotydów) lub mRNA do zapłodnionych komórek jajowych, umożliwiając odpowiednio niedostateczną lub nadmierną ekspresję określonych białek. Jednak metody te zwykle wymagają więcej niż kilku godzin, zanim ekspresja białka zostanie zakłócona, a zatem interferencja funkcji genów nie jest skuteczna we wczesnych stadiach embrionalnych. Tutaj wprowadzamy system eksperymentalny, w którym poziomy ekspresji białek matczynych mogą być zmieniane przed zapłodnieniem. Oocyty Xenopus laevis uzyskane z jajników są defllikulowane przez inkubację z enzymami. Oligonukleotydy antysensowne lub mRNA są wstrzykiwane do zdeflkulowanych oocytów na etapie pęcherzyka rozrodczego (GV). Oocyty te są dojrzewające in vitro do komórek jajowych na etapie metafazy II (MII), a następnie następuje docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI). W ten sposób do 10% zarodków ICSI może osiągnąć stadium pływającej kijanki, umożliwiając w ten sposób testy funkcjonalne określonego nokaucji lub nadekspresji genu. Takie podejście może być użytecznym sposobem badania roli czynników przechowywanych przez matkę we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Zbadano rozwój embrionalny zarodków ICSI z oocytów dojrzewających in vitro (Rycina 3A). Wskaźniki dojrzewania oocytów w stadium GV do stadium MII są zmienne i w dużej mierze zależą od jakości oocytów. W pomyślnych eksperymentach prawie 100% oocytów GV reaguje na progesteron i wykazuje oznaki dojrzewania, ostatecznie stając się komórkami jajowymi w stadium MII. Wszystkie dojrzałe oocyty poddano procedurze ICSI, a około 25% wstrzykniętych komórek jajowych uległo podziałowi (Rycina 3A, n = 13 dla oocytów wstrzykniętych z kontrolnym oligo-scrambled oraz n = 7 dla oocytów bez wstrzykniętego oligo). Około 60% lub 80% podzielonych zarodków, otrzymanych odpowiednio z oocytów wstrzykniętych z kontrolnym oligo lub oocytów niewstrzykniętych, osiągnęło stadium blastuli/gastruli. Wśród zarodków w stadium blastuli/gastruli, około połowy w próbkach z wstrzykniętym oligo była dobrej jakości (prawie brak oznak nieprawidłowego podziału i apoptozy), podczas gdy w próbkach niewstrzykniętych 82% zarodków w stadium blastuli/gastruli było dobrej jakości (Rycina 3A). Ostatecznie odpowiednio 41% i 11% podzielonych zarodków w próbkach z wstrzykniętym oligo osiągnęło stadium reakcji mięśniowej oraz stadium pływającego kijanki, podczas gdy w próbkach niewstrzykniętych odpowiednio 60% i 29% podzielonych zarodków osiągnęło te stadia (Rycina 3A). Zarodki ICSI stanowią mieszaninę zarodków prawidłowych i nieprawidłowych (Rycina 3B). Niektóre z nich przechodzą metamorfozę i rozwijają się w dorosłe żaby8. Wyniki te sugerują, że wstrzyknięcie oligosomów antysensownych do oocytów GV, a następnie IVM i ICSI, pozwala na efektywny wczesny rozwój embrionalny. Chociaż samo wstrzyknięcie oligosów antysensownych obniża tempo rozwoju embrionalnego, nadal jesteśmy w stanie uzyskać wystarczającą liczbę zarodków do wielu celów eksperymentalnych, takich jak sprawdzanie tempa rozwoju, RT-PCR, western blot i inne.
<img alt="Obraz mikroskopowy mikroiniekcji w komórkach embrionalnych, ilustrujący wczesne etapy podziału komórkowego." src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Typowe przykłady oocytów Xenopus laevis dobrej lub złej jakości do eksperymentów z dojrzewania in vitro. (A) Przykład oocytów złej jakości. Na przykład oocyty wykazujące niejednorodną pigmentację nie są wykorzystywane w dalszych eksperymentach. Każdy oocyt Xenopus laevis ma średnicę około 1,2-1,4 mm. (B) Częściowo defolikulowany oocyt. Prawa połowa oocytu jest pokryta komórkami treścifolikularnymi, co można rozpoznać po obecności naczyń krwionośnych. Strzałka wskazuje obszar wolny od komórek treścifolikularnych, w który wprowadzana jest igła do iniekcji. (C) Przykład oocytów dobrej jakości, które mają jednakowe rozmiary i wykazują równomiernie pigmentowane półkule zwierzęce z wyraźnym kontrastem między półkulą zwierzęcą a roślinną.
<img alt="Proces dojrzewania oocytów; obraz mikroskopowy przedstawia oocyty przed i po dojrzewaniu." src="/files/ftp_upload/52496/52496fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Xenopus laevis oocyty przed i po dojrzewaniu. Po dojrzewaniu oocytów na szczycie półkul zwierzęcych pojawiają się wyraźne białe plamki, a komórki pęcherzyka ulegają złuszczeniu. Każdy oocyt Xenopus laevis ma średnicę około 1 mm.
<img alt="Wykres rozwoju embrionów z obrazami kijankami; porównuje tempo podziałów, blastulę oraz dane dotyczące odpowiedzi mięśniowej." src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Rozwój embrionów ICSI powstałych z oocytów dojrzałych in vitro. (A) Podsumowanie rozwoju embrionów ICSI do poszczególnych stadiów. Oocyty wstrzyknięto z kontrolnymi, przetasowanymi oligonukleotydami antysensownymi (wstrzyknięcie oligo kontrolnego) lub pozostawiono bez wstrzykiwania (brak wstrzyknięcia), a następnie przeprowadzono IVM i ICSI. Odpowiednia liczba embrionów w każdym stadium jest podana nad słupkami. Przedstawiono średnią ± SEM. N = 4-13 niezależnych eksperymentów/różnych samic. (B) Przykłady przeżywających embrionów ICSI. Embriony w stadium guzka ogonowego powstały w jednym eksperymencie, w którym jako materiał wyjściowy wykorzystano około 200 oocytów.

Opisujemy metody manipulowania niedojrzałymi oocytami Xenopus laevis, dojrzewania in vitro oocytów do komórek jajowych oraz docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Protokół ten umożliwia degradację niektórych białek matczynych i nadekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania podczas zapłodnienia, a zatem jest cenny dla badania ról określonych czynników we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Celem poniższego eksperymentu jest wyciszenie białek macierzystych zmagazynowanych w oocytach lub nadekspresja interesujących białek w momencie zapłodnienia jaj żaby. Osiąga się to poprzez wstrzykiwanie oligosów antysensownych lub mRNA do enzymatycznie odregulowanych niedojrzałych oocytów w celu degradacji lub nadekspresji konkretnego białka. W drugim kroku oocyty przenosi się do pożywki zawierającej progesteron, co indukuje dojrzewanie oocytów do poziomu jaj.Następnie plemniki wstrzykuje się do dojrzałych in vitro komórek jajowych, aby zaobserwować wpływ wyciszenia lub nadekspresji genu na rozwój embrionalny. Ostatecznie rozwój oocytów po wstrzyknięciu oligonukleotydów do stadium pływających kijanków stanowi test funkcjonalny wyciszenia lub nadekspresji genu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transfer do biorcy, jest możliwość pominięcia procesu operacyjnego u żaby przy zastosowaniu standardowych protokołów.Zbierz fragment jajnika z SAC zawierający zdrowe cytocyty do dziewięciocentymetrowej szalki Petriego z MBS oraz ps. Następnie podziel jajnik na kwadratowe fragmenty o szerokości od jednego do dwóch centymetrów. Przenieś około pięciu mililitrów rozdrobnionego jajnika z cytocytami do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Następnie przemyć tkanki kilka razy roztworem MBS z dodatkiem PS, a następnie zebrać jaja w 15 ml świeżego roztworu MBS z dodatkiem ps. Teraz dodać siedem jednostek enzymu defoliacyjnego do zawiesiny i inkubować zawiesinę przy łagodnym mieszaniu, aż zostaną one przynajmniej częściowo odfoliowane. Proces ten potrwa co najmniej godzinę po rozpoczęciu inkubacji.Napełnij probówkę roztworem MBS z dodatkiem Ps, aby zatrzymać reakcję. Nalej roztwór po ściance probówki, unikając bezpośredniego kontaktu z cytami. Pozostaw tkanki do osadzenia się, a następnie odlej supernatant i odczynnik.Małe, niedojrzałe komórki będą unosić się na powierzchni i również powinny zostać usunięte. Powtórz ten etap płukania łącznie 10 razy po zakończeniu pierwszych przemyć. Przenieś komórki do naczynia o średnicy dziewięciu centymetrów z MBS plus ps.Przenieś szalkę pod mikroskop stereoskopowy i od tego momentu staraj się utrzymać cyty w temperaturze od 16 do 18 stopni Celsjusza. Wybierz wysokiej jakości cyty w stadium szóstym zgodnie z klasyfikacją Dumonta; za pomocą szklanej pipety zbierz je do nowej szalki z MBS plus ps. Wysokiej jakości cyt powinien charakteryzować się równomierną pigmentacją w półkuli zwierzęcej oraz wyraźnym rozdzieleniem półkuli zwierzęcej od roślinnej.Powinny one również mieć zbliżony rozmiar, który powinien wynosić od 1,2 do 1,4 milimetra średnicy. Należy zebrać od około 200 do 300 cytów na każdy zastrzyk, co łącznie daje około 1000 cytów na eksperyment. Jakość miejsca O jest kluczem do sukcesu.Jeśli jajnik wykazuje jakiekolwiek nieprawidłowości podczas przygotowania, zaleca się pobranie jajnika z innego stada i ponowne rozpoczęcie procedury. W ramach przygotowania do wstrzyknięcia oligosaddOni-sensownego, należy ustawić metalowy tłok mikroinjektora w najniższej pozycji, a następnie nałożyć na tłok szklaną kapilarę wypełnioną olejem. Pod mikroskopem dissectingowym należy odciąć końcówkę igły za pomocą małych nożyczek chirurgicznych.Utwórz jak najmniejszy możliwy grot. Następnie użyj lasera. Umieść pasek paraformy na stole mikroskopu, a na nim nanieś 3 µL roztworu kwasów nukleinowych o stężeniu 1 µg/µL.W ten sposób należy wypełnić końcówkę igły. Jeśli zatrzymują się pęcherzyki powietrza, otwór należy powiększyć. Teraz wykonaj widoczną zaznaczenie na igle wstrzykującej w odległości około 0,5 mm od końcówki.Następnie przystąp do wstrzykiwania do komórek, zaczynając od jednej z nich; znajdź obszar wolny od komórek folikularnych, w który można wprowadzić igłę. Wprowadź końcówkę wzdłuż granicy równikowej, celując w punkt środkowy pod pęcherzykiem zarodkowym. Jednocześnie ustabilizuj komórkę za pomocą pęsety po przeciwnej stronie.Teraz, korzystając z przełącznika nożnego, wyprowadź roztwór, wstrzykując od 4,6 do 9,2 nanogramów oligosów antysensownych lub od 250 pikogramów do 13,8 nanograma mRNA. Po wstrzyknięciu do wszystkich cytów, przenieś je do medium inkubacyjnego i inkubuj przez kilka dni, aby w proteasomie mogły zajść odpowiednie zmiany.Następnie przenieście oocyty wraz z minimalną ilością medium do szalek hodowlanych o średnicy sześciu centymetrów, zawierających od pięciu do ośmiu mililitrów medium do dojrzewania. Pozostawcie oocyty do rozwoju w tym medium przez 16 godzin przed wykonaniem iniekcji plemnikami. Do realizacji niniejszego protokołu należy przygotować mrożony zapas plemników.Po 16 godzinach inkubacji w celu dojrzewania należy zapoznać się z protokołem tekstowym. Bardzo ostrożnie przenieść cyty do sześciocentymetrowej szalki powlekanej typu egg gross z dodatkiem MBS oraz PS, aby je wypłukać. W przypadku niewłaściwego obchodzenia się z cytami mogą one ulec spontanicznej aktywacji przed ixy.Następnie należy policzyć dojrzałe cyty i poszukać białych plamek, które wskazują na rozpad pęcherzyka zarodkowego cytu. Jeśli mniej niż 80% z nich jest prawidłowych, oznacza to, że jako grupa nie są one wystarczająco zdrowe, aby przetrwać procedurę ixy. Aby kontynuować.Napełnić nową szalkę medium do iniekcji, a po pół godziny delikatnie przenieść wszystkie cyty do szalki. Przystąpić do iniekcji dojrzałych cytów roztworem plemników, korzystając z tego samego przygotowania iniektora, które opisano dla oligosów. W idealnych warunkach w roztworze do iniekcji powinno znajdować się jeden lub dwa plemniki na 4,6 nanolitra.Aby przetestować ten roztwór do wstrzykiwania, przygotuj krople roztworu DPI o stężeniu 0,3 µg DPI/ml i wstrzyknij do nich 4,6 nl. Następnie policz liczbę plemników w każdej kropli za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Po potwierdzeniu stężenia plemników, wstrzyknij do cytes 4,6 nl roztworu plemników.Należy zadbać o to, aby czas wymagany do wstrzykiwania roztworów pozostawał stały i wstrzykiwać spermę do oocytów w sposób miarowy, z minimalnymi przerwami między iniekcjami. Po każdych 100 iniekcjach należy wymienić roztwór nasienny. Po wstrzyknięciu wszystkich dojrzałych oocytów naczynie należy inkubować przez cztery do pięciu godzin, a następnie poddać ocenie.W przypadku embrionów, które przeszły podział, bruzdy podziałowe mogą nie być tak wyraźne jak w normalnych zapłodnionych embrionach; należy przenieść wszystkie podzielone embriony do pożywki inkubacyjnej i inkubować je przez noc. Następnego dnia przeżyłe embriony należy przenieść do 0,1 XMMR w celu rozwoju embrionalnego embrionów ixy. Zastosowanie oocytów dojrzewiałych in vitro zostało zbadane w dobrych eksperymentach, w których prawie 100% oocytów w stadium pęcherzyka zarodkowego zareagowało na progesteron i wykazało oznaki dojrzewania.Około 25% poddało się podziałom. Od 60 do 80% podzielonych embrionów osiągnęło stadium blastuli i gastruli, a około jedna trzecia z nich dotarła do stadium pływającej kijanki. Embriony ixy stanowiły mieszankę zarodków prawidłowych i nieprawidłowych, co wykazało, że wstrzyknięcie antysensownego sogo do germinalnych pęcherzyków żółtkowych, a następnie IVM i Dixie, umożliwiło wczesny rozwój embrionalny.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak manipulować białkami macierzyńskimi przed procesem faktoryzacji.

manipulation-vitro-maturation-xenopus-laevis-oocytes-followed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Manipulacja i in vitro dojrzewanie komórek jajowych Xenopus laevis, połączona z wstrzyknięciem plemnika do cytoplazmy, w celu badania rozwoju zarodkowego

W niniejszym materiale demonstrujemy mikroiniekcję cytoplazmatyczną oocytów Xenopus laevis z substratem importu jądrowego, a także przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą elektronowej mikroskopii sekcji cienkich.<br...

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Procedura zapłodnienia oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza.

Zapłodnienie oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Informujemy tutaj o solidnej i efektywnej ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu mRNA do niezapłodnionych oocytów Branchiostoma lanceolatum. Opracowanie techniki mikroiniekcji w tym podstawowym strunacie utoruje drogę dla dalekosiężnych innowacji technicznych w tym powstającym systemie modelowym, w tym obrazowania in vivo i manipulacji specyficznych dla genów.

Ekspresja białek fluorescencyjnych w Branchiostoma lanceolatum przez wstrzyknięcie mRNA do niezapłodnionych oocytów

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Opisujemy system oocytów i czapeczek zwierzęcych Xenopus do klonowania ekspresji genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie i omawiamy techniki późniejszej analizy takich genów. System ten jest przydatny w funkcjonalnej identyfikacji szerokiej gamy produktów genowych.

Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Zoptymalizowany protokół dojrzewania in vitro oocytów danio pręgowanego, używany do manipulacji produktami genów matki, jest prezentowany tutaj.

Funkcjonalna manipulacja matczynymi produktami genowymi z wykorzystaniem dojrzewania oocytów in vitro u danio pręgowanego

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Opisujemy metodę fizycznego zwężania do tworzenia mini embrionów z zarodków Xenopus laevis o jednokomórkowej liczbie komórek.

Manipulacja fizyczna w celu generowania mini embrionów Xenopusa

Ten protokół opisuje procedury dotyczące in vitro dojrzewania oocytów mysich, in vitro zapłodnienia i późniejszej kultury embrionów do etapu blastocysty.

Dojrzewanie in vitro komórek jajowych myszy, zapłodnienie i hodowlą zarodków przedimplantacyjnych

Poznaj metodę manipulacji i dojrzewania oocytów Xenopus laevis in vitro oraz docytoplazmatyczną iniekcję plemnika, aby badać wczesny rozwój embrionalny i funkcję genów.

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego (Wideo) | JoVE Journal

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Przeglądaj więcej filmów