Podejścia spektrometrii mas do badania struktury i interakcji białek w liofilizowanych proszkach

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie struktury białka w wysokiej rozdzielczości za pomocą wymiany emitowanego wodorowo-deuterowego i znakowania litycznego łańcucha bocznego w połączeniu ze spektrometrią mas. Osiąga się to poprzez pierwszą liofilizację, białko w obecności różnych substancji pomocniczych. W przypadku wymiany deuteru wodorowego w stanie stałym liofilizowane białko jest wystawione na działanie pary tlenku deuteru w szczelnie zamkniętym osuszaczu w kontrolowanej wilgotności względnej i temperaturze.

W celu znakowania litycznego białko jest liofilizowane substancjami pomocniczymi i czynnikiem fotoreaktywnym. Fiolka jest następnie naświetlana światłem UV w celu kowalencyjnego przyłączenia środka do białka. Dla każdej metody próbki są odtwarzane i analizowane przy użyciu spektrometru mas zarówno z rozdzielczością nienaruszonego białka, jak i peptydu.

Te dwie metody dostarczają uzupełniających się informacji. Preparaty, w których struktura białka jest wysoce zachowana, wykazują zmniejszony wychwyt deuteru i zwiększone znakowanie lityczne, podczas gdy te o zaburzonej strukturze wykazują zwiększony wychwyt deuteru i zmniejszone znakowanie lityczne. Znakowanie chemiczne, takie jak wymiana wodorowo-deuterowa i sieciowanie fotograficzne w połączeniu z analizą spektrometrii mas, zostało ostatnio dostosowane do badania struktury i interakcji białek w żywych nośnikach.

Główną przewagą tych technik nad istniejącymi metodami, takimi jak spektroskopia CD i FDIR, jest to, że struktura i środowisko białek mogą być badane z wysoką rozdzielczością w stanie stałym. Na początek umieść 200 mililitrów tlenku deuteru w dolnej komorze osuszacza i dodaj 400 gramów węglanu potasu Aby uzyskać nasycony roztwór, umieść w środku porcelanową płytkę osuszającą i szczelnie zamknij osuszacz. Pozwól mu osiągnąć równowagę w temperaturze pięciu stopni Celsjusza, aby osiągnąć stabilną wilgotność względną bliską 43%Następnie umieść niezakorkowane fiolki zawierające liofilizowane białko w górnej komorze osuszacza, zamknij osuszacz i inkubuj w temperaturze pięciu stopni Celsjusza.

Aby zainicjować reakcję wymiany wodorowo-deuterowej w celu pobrania próbki, należy zakryć fiolkę natychmiast po wyjęciu jej z osuszacza, a następnie wygasić reakcję przez błyskawiczne zamrożenie fiolki i ciekłego azotu. Przechowywać fiolkę w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do czasu analizy spektrometrii mas. Użyj spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości do analizy próbek, aby zminimalizować wymianę wsteczną.

W jaki sposób system chromatografii cieczowej znajduje się w chłodni? Aby najpierw skonfigurować urządzenie, podłącz pętlę próbki i pułapkę białkową do zaworu, który steruje procesami odsalania i elucji. Następnie skalibruj system, wstrzykując mieszankę strojeniową o niskim stężeniu do spektrometru mas i ustawiając zakres stosunku masy do ładunku od 200 do 3 200

Następnie schłodzić układ chłodniczy do stabilnej temperatury roboczej około zera stopni Celsjusza. Przygotować bufor hartowniczy zawierający 0,2% kwasu mrówkowego i 5% metanolu w wodzie i schłodzić go na lodzie. Po przeniesieniu próbek do ciekłego azotu ostrożnie wyjąć fiolkę i ponownie rozpuścić próbkę przez dodanie dwóch mililitrów buforu hartującego.

Następnie załaduj odpowiednią metodę HPLC i spektrometrii mas. Aby przeanalizować próbkę w tym miejscu, odsolić 20 pikomoli mioglobiny w pułapce białkowej przez 1,7 minuty za pomocą 5% acetylu nitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego. Następnie eluuj białko w ciągu 3,3-minutowego gradientu, zwiększając do 80% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego.

Wstrzyknąć próbkę i zebrać widma masowe w zakresie stosunku masy do ładunku od 200 do 3, 200. Aby określić masę nienaruszonego białka jako odniesienie, należy zastosować tę samą metodę z próbką białka o nadmiernej wartości. Uzyskaj masę białka poprzez dekonwolucję surowych widm za pomocą oprogramowania do analizy danych W przypadku analizy próbki mioglobiny ustaw zakres masy od 15 do 18, kilodaltony rozdzielczość masy na jeden dalton, a pik latawca na 90%W przypadku analizy peptydów przygotuj próbki przy użyciu tego samego protokołu, co w przypadku nienaruszonych białek.

Gdy próbki są gotowe do analizy, podłącz unieruchomioną kolumnę pepinową i kolumnę analityczną do zaworu i zastąp pułapkę białkową pułapką peptydową. Kalibracja systemu dla peptydów została przeprowadzona dla nienaruszonych białek, ale ustawiając zakres stosunku masy do ładunku od 100 do 1700, a następnie schłodzić układ chłodniczy do stabilnej temperatury roboczej około zera stopni. Po skalibrowaniu systemu należy zaprogramować odpowiednią metodę HPLC i spektrometrii mas.

Tutaj trawić 20 pikomoli mioglobiny na kolumnie Pepin z 0,1% kwasem mrówkowym w wodzie, zaprogramować metodę wychwytywania i odsalania peptydów w pułapce peptydowej przez 1,7 minuty za pomocą 10% nitrylu acetylowego i 0,1% kwasu mrówkowego, a następnie wymukować peptydy w ciągu czterech minut z gradientem zwiększającym się do 60% nitrylu acetylu i 0,1% kwasu mrówkowego. Następnie wstrzyknąć próbkę i zebrać widma masowe w zakresie stosunku masy do ładunku od 100 do 1700. Przeanalizuj niedatowaną próbkę peptydu za pomocą tandemowej spektrometrii mas w celu identyfikacji fragmentów trawiennych.

Następnie porównaj eksperymentalnie wyznaczony fragment z wygenerowanymi przez oprogramowanie przewidywanymi masami. Następnie ustaw odcięcie masy na 10 części na milion, aby wyeliminować masy z dużym błędem dla peptydów z dopasowaniami. Zwróć uwagę na stan naładowania sekwencji peptydów i czas retencji.

Użyj skompilowanych danych peptydowych, aby obliczyć średnią liczbę deuteros zawartych w jednym fragmencie peptycznym Korzystając z oprogramowania do analizy danych Najpierw liofilizuj białko substancją pomocniczą i lucyną, jak wskazano w protokole tekstowym. Po przygotowaniu próbek należy włączyć sieciownik UV zawierający lampy UV o długości fali 365 nanometrów. Pozwól lampom ogrzać się przez pięć minut.

Gdy lampy się ogrzeją, wyłącz je i umieść niezakorkowane fiolki zawierające preparat w komorze sieciownika. Naświetlać próbki światłem UV przez 40 minut i dołączyć próbki bez fotoleucyny jako kontrolę: Po napromieniowaniu nakryj nakrętką i przechowuj fiolki w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza do czasu analizy spektrometrii mas. Przygotować próbki do analizy, dodając wodę destylowaną do spektrometrii mas w celu uzyskania końcowego stężenia białka wynoszącego dwa mikromolowe.

Następnie przeanalizuj próbki przy użyciu tej samej metody spektrometrii mas, co w przypadku nienaruszonych białek deuterowanych. Ale nie używaj chłodzonego systemu lc. Pozyskanie danych spektrometrii mas dla nieznakowanej próbki białka w celu określenia natywnej masy białka.

Wykonaj analizę danych jak w przypadku próbek OBNIŻONYCH do analizy poziomu peptydów. Najpierw wykonaj znakowanie fotolityczne w stanie stałym z nienaruszonymi białkami i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie należy rozpuścić próbkę w 100-milimolowym buforze wodorowęglanowym amonu, aby uzyskać końcowe stężenie białka 10 mikromolów.

Wymieszaj próbkę z trypsyną w stosunku 10 do jednego mola białka do trypsyny i inkubuj tę mieszaninę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 16 godzin. W międzyczasie podłącz pętlę próbki, pułapkę peptydową i kolumnę analityczną do zaworu systemu HPLC. Po strawieniu białka należy wygasić reakcję, dodając 0,1% kwasu mrówkowego do wody, aby uzyskać końcowe stężenie białka wynoszące dwa mikromolowe.

Następnie zaprogramuj system za pomocą metod HPLC i spektrometrii mas. Tutaj wstrzyknąć i odsolić 20 pikomoli strawionej mioglobiny w pułapce peptydowej przez 1,5 minuty za pomocą 5% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego, wymyć peptydy, zwiększając gradient w ciągu 22 minut do 55% nitrylu acetylowego i zebrać widma masowe w zakresie od 100 do 1700 stosunek masy do ładunku. Użyj narzędzia online, aby obliczyć teoretyczną masę peptydu.

Addukt fotoleucyny z numerami fotoleucyny uzyskanymi wcześniej z analizy nienaruszonych białek. Uwzględnij co najmniej cztery pominięte dekolty. Utwórz listę mas w programie Excel dla adduktu fotoleucyny peptydowej.

Następnie dopasuj teoretyczną listę mas do mas zaobserwowanych doświadczalnie, ustawiając punkt odcięcia, aby zidentyfikować masy o niskim błędzie. Podczas wymiany wodorowo-deuterowej rozwijanie białka pozwala na zastąpienie wodoru białkami deuteru, które zachowują swoją strukturę i są mniej podatne na wymianę deuteru. Gdy spektrometrię mas wymiany deuteru wodorowego w stanie stałym przeprowadzono na preparatach mioglobiny zawierających talozę i sorbitol, preparat zawierający sorbitol wykazał o 46% większy wychwyt deuteru, co sugeruje, że struktura mioglobiny w sorbitolu jest bardziej zaburzona podczas procesu litycznego.

Fotoleucyna sieciuje krzyżowo dostępne łańcuchy boczne aminokwasów. Analiza sorbitolu i TLO zawierających preparaty mioglobiny za pomocą fotolitycznej spektrometrii mas w stanie stałym wykazała większy absorpcję fotoeine w preparacie TLO niż w jego odpowiedniku. Sugeruje to, że łańcuchy boczne pozostały dostępne w sformułowaniu TLO.

Zarówno wymiana wodorowo-deuterowa, jak i znakowanie lityczne wykorzystują dostępne na rynku regiony i łatwo dostępne oprzyrządowanie MS do charakteryzowania białek w stanie stałym dla dowolnego preparatu. Całkowity czas od przygotowania próbki do pełnej analizy danych wynosi mniej niż dwa tygodnie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać informacje o strukturze białka w wysokiej rozdzielczości i jego znaczeniu w projektowaniu stabilnych liofilizowanych preparatów białkowych.