Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Ogólnym celem tej procedury jest określenie topologii integralnych białek błonowych. Osiąga się to poprzez ekspresję wysięku, białka między białkiem zielonej fluorescencji lub GFP a ogonami aminowymi lub karboksylowymi błony. Białko będące przedmiotem zainteresowania w komórkach do celów kontrolnych może być wyrażane rozpuszczalne białka fluorescencyjne, takie jak RFP.

Następnie błona plazmatyczna podlega selektywnemu przenikaniu. Używając detergentu, rozpuszczalne białka fluorescencyjne opuszczą komórkę, podczas gdy białka fluorescencyjne związane z błoną zostaną zatrzymane w komórce. Ostatnim etapem jest zastosowanie proteazy do komórek przepuszczalnych i określenie retencji lub utraty sygnału fluorescencyjnego.

Ostatecznie zmiany intensywności fluorescencji obserwowane za pomocą obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej służą do pokazania topologii i orientacji integralnych białek błonowych. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mapowanie epitopów, jest to, że procedura nie wymaga dużego specjalistycznego sprzętu ani różnych odczynników, które mogą być trudne do zdobycia. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii białek błonowych, takie jak to, które domeny integralnego białka błonowego mogą znajdować się w cytozolu, a które domeny mogą znajdować się w świetle organelli, takich jak retikulum endoplazmatyczne, złoto G lub endosomy.

Rozpocznij tę procedurę od wygenerowania i walidacji białka fluorescencyjnego KY zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie transfekować białko fluorescencyjne KY do ludzkich embrionalnych komórek nerkowych lub komórek HEK 2 93 przy użyciu dowolnej standardowej metody transfekcji o wysokiej wydajności i niskiej toksyczności, w tym technologii opartych na lipidach, wirusach lub elektroporacji w celu wygenerowania przejściowej lub stabilnej ekspresji, komórki są następnie powlekane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych polilizyną. Utrzymuj komórki przez pięć do 48 godzin w odpowiednich pożywkach do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych zdolnym do dwutlenku węgla.

Monitoruj komórki pod kątem ekspresji białka fuzyjnego GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej epi, a wewnętrzny sygnał fluorescencyjny sygnału fluorescencyjnego GFP zwykle osiąga maksimum w ciągu 24 do 72 godzin. Po transfekcji. Wykorzystanie komórek, gdy sygnał fluorescencyjny osiągnie maksymalny poziom, ekspresję białka można również monitorować za pomocą analizy immunoblot przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania lub części GFP.

Aby rozpocząć, skonfiguruj system perfuzyjny zasilany grawitacyjnie do leczenia komórek. Przygotuj 50-mililitrowe strzykawki do roztworów z rurką polietylenową, która jest podłączona do niezależnych zbiorników i do kolektora z pojedynczym wylotem w wannie. Ustaw pipetę ssącą tak, aby utrzymać stałą objętość kąpieli i uzyskać wymianę roztworu poprzez ręczne przełączanie między zbiornikami perfuzyjnymi w celu przenikania błony plazmatycznej.

Najpierw usuń pożywkę do hodowli komórkowych z komórek. Umyj komórki trzy razy po jednej minucie każda. W buforze KHM umieść szkiełka nakrywkowe na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego i zbierz pierwszy obraz, który reprezentuje kontrolny nieprzepuszczalny obraz w celu selektywnego przenikania błony plazmatycznej.

Dodaj cyfrę toiny w buforze KHM do komórek, perfuzjuj komórki buforem i cyfrą toiny z szybkością pięciu mililitrów na minutę przez 10 do 60 sekund. Potwierdzenie, że błona plazmatyczna jest odpowiednio przepuszczalna, można łatwo wykonać poprzez ekspresję rozpuszczalnej cząsteczki GFP lub RFP, która łatwo dyfunduje z komórki za błoną. Przenikanie następnie potwierdza, że interesujący nas chimer białka GFP jest zintegrowany z błoną, potwierdzając komórkowe zatrzymywanie sygnału fluorescencyjnego po digonie i przenikaniu błony plazmatycznej.

Następnie ekspresja specyficznego dla narządu białka fluorescencyjnego, takiego jak białko mitochondrialne, o którym mowa w protokole tekstowym. Określ optymalne warunki odciągania, tak jak poprzednio. Potwierdzić, że wykop i stężenie są odpowiednie dla zastosowanego typu komórki, upewniając się, że morfologia wewnątrzkomórkowych kanałów narządowych pozostaje stała przy długotrwałym narażeniu.

Kopać toin. Po umyciu komórek w buforze KHM dodaj proteazę bezpośrednio na komórki. Przeglądaj komórki z natężeniem przepływu pięciu mililitrów na minutę, używając grawitacyjnego systemu perfuzyjnego do ciągłego kąpania preparatu.

Następnie określ, czy sygnał fluorescencyjny utrzymuje się, czy ulega degradacji. Zbieraj obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej pod odpowiednimi zestawami filtrów, korzystając z funkcji przechwytywania obrazu wideo w sterowanym komputerowo mikroskopie fluorescencyjnym. Określ ilościowo natężenie sygnału fluorescencyjnego w funkcji warunków inkubacji.

Uzyskaj średnią intensywność pikseli w obszarze zainteresowania, który otacza pojedynczą komórkę. Utrata większej niż 90% początkowej intensywności sygnału w ciągu 30 do 60 sekund jest zgodna z proteolityczną degradacją białka GFP ky. Całkowite zanik rozpuszczalnego sygnału fluorescencyjnego powinien nastąpić w ciągu 10 do 60 sekund od przyłożenia cyfry.

Potwierdzenie, że białko będące przedmiotem zainteresowania jest związane z organellami wewnątrzkomórkowymi, uzyskuje się poprzez odnotowanie zatrzymywania sygnału fluorescencyjnego po digonie i przenikaniu. Ogon karboksylowy kinazy zakotwiczonej w błonie LTK 2 został połączony z GFP i uległ ekspresji przejściowo fluorescencyjnej ltk. Dwa sygnały GFP zostały szybko utracone po dodaniu proteinazy K, co wskazuje, że lokalizacja końca karboksylowego ltk dwa znajduje się w cytozolu.

Cavi i GFP to białko błony plazmatycznej z ugrupowaniem GFP przyłączonym do domeny cytozolowej. Podobnie jak w przypadku LTK dwa, sygnał z cavi i GFP jest niewrażliwy na cyfrę, ale wrażliwy na późniejsze dodanie proteazy DS czerwone mito koduje czerwone białko fluorescencyjne połączone z mitochondrialną sekwencją docelową z oksydazy cytochromu C po przenikaniu digonów, a także dodanie proteinazy K. Fluorescencja związana z czerwonym mito DS pozostaje stabilna. Jest to zgodne z tym, że Fluor Four znajduje się w mitochondriach, gdzie nie jest narażony na działanie cytozolu.

Gdy ugrupowanie fluorescencyjne przyłączone do białka błonowego jest skierowane na zewnątrz komórki, jak w GPI zakotwiczone białko prionowe przyłączone do żółtego białka fluorescencyjnego. Leczenie proteinazą powinno szybko wygasić sygnał fluorescencyjny bez wcześniejszej potrzeby penetracji kop imp , zgodnie z oczekiwaniami. Po leczeniu proteinazą zewnątrzkomórkowy sygnał fluorescencyjny szybko zanikał dla komórek wyrażających ten konstrukt.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć, jak określić topologię interesującego Cię białka błonowego.