Name: Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj metodę ochrony proteazy fluorescencyjnej do określania topologii białek błonowych w żywych komórkach. Technika wykorzystuje chimery GFP i selektywną trawienność proteazową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Calcium Imaging Core Facility w CMS za pomoc i wskazówki w przechwytywaniu i analizie obrazów. Badanie to było wspierane przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH) HL102208 do NB. Podejście to zostało pierwotnie zapoczątkowane przez Holgera Lorenza i Jennifer Lippincott-Schwartz z NIH.

1. Generowanie i walidacja chimer białek fluorescencyjnych
<ol>
	<li>Dołączyć białko zielonej fluorescencji (GFP) do zakończeń aminowych lub karboksylowych białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu standardowych strategii rekombinacji DNA13, 
	UWAGA: Chociaż szeroko stosowaliśmy GFP, można zastosować inne warianty, takie jak białko fluorescencyjne cyjanu (CFP), białko fluorescencji żółtej (YFP), DsRed i mCherry. Stale wprowadzane są ulepszenia w zakresie wydajności fałdowania fluoroforu, jasności i fotostabilności, a badacze powinni skorzystać z konstruktów najnowszej generacji.
	<ol>
		<li>Potwierdź prawidłową sekwencję DNA i upewnij się, że ugrupowanie GFP znajduje się w ramce z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Wykonaj sekwencjonowanie przy użyciu standardowych strategii rekombinacji DNA21, 
		UWAGA: Wiele instytucji posiada podstawowe placówki DNA, z którymi badacz powinien się skontaktować w celu uzyskania dodatkowych informacji.</li>
		<li>W przypadku białek błonowych z pojedynczym lub podwójnym przejściem należy wygenerować zarówno amino-, jak i karboksylowe wersje końcowych białek fuzyjnych19.</li>
		<li>W przypadku białek wielozakresowych należy wstawić GFP w przypuszczalnych pętlach zewnątrzbłonowych, a także na końcach. Należy zachować szczególną ostrożność podczas generowania chimer transbłonowych z fluorescencyjnym białkiem fuzyjnym przyłączonym do końca aminowego białka docelowego, ponieważ sekwencje sygnałowe są często rozszczepiane przez proteolizę, gdy białko przejdzie przez translokon ER.</li>
		<li>W przypadku istniejących sekwencji sygnałowych należy wprowadzić fluorescencyjne białko fuzyjne dystalnie do miejsca rozszczepienia, aby wytworzyć dojrzałe białko zawierające nienaruszone białko fluorescencyjne znakowane aminokońcem. Zastosuj standardowe strategie rekombinacji DNA do generowania chimer21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ obecność wystarczającego, odpowiednio zlokalizowanego sygnału fluorescencyjnego w linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania.
	<ol>
		<li>Obserwuj komórki pod mikroskopią epifluorescencyjną przy użyciu wewnętrznej fluorescencji GFP w odpowiednich warunkach zestawu filtrów. W przypadku zestawów filtrów GFP, które obejmują 510-560 nm, upewnij się, że dla zastosowanego fluoroforu używane są właściwe filtry. 
		UWAGA: Wystarczający sygnał uzyskuje się, gdy ocena wzrokowa dostarcza wystarczająco silny sygnał, aby struktura komórkowa, w której znajduje się sygnał, była łatwo rozdzielona ponad tłem. Ponadto wzór barwienia białka GFP powinien być zgodny z markerami dla odpowiednich organelli i najlepiej identyczny z wzorcem natywnego białka nieznakowanego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ, czy w oparciu o oceniane białko zostanie zastosowane podejście transfekcji stabilnej czy przejściowej. 
	UWAGA: Stabilne transfektanty na ogół zapewniają niższe poziomy ekspresji niż systemy przejściowe. Chociaż ekspresja przejściowa zapewnia wysoki poziom ekspresji białek i zwiększa intensywność sygnału (~ 5-24 godziny po transfekcji w zależności od białka), może również prowadzić do artefaktów nadekspresji, takich jak agregacja białek lub nasycenie szlaków docelowych białek, co prowadzi do błędnej lokalizacji subkomórkowej.</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek i hodowla komórkowa
UWAGA: Do analizy FPP można poddawać różne komórki, w tym Hek293, HeLa, COS-7 i CHO14. Poniższy opis opiera się na ekspresji białek błonowych w komórkach Hek293.
<ol>
	<li>Hodować ludzkie embrionalne komórki nerkowe (Hek293) jako przylegające monowarstwy w 6 ml zmodyfikowanego podłoża Eagles (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionego 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% pirogronianem sodu i 250 μg/ml penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Całą pracę należy wykonać z komórkami w kapturze do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym. Hoduj komórki w pożywce hodowlanej do ~80% zlewania się w kolbie T-75.</li>
	<li>Komórki transfekcyjne przy użyciu dowolnej standardowej metody transfekcji o wysokiej wydajności i niskiej toksyczności, w tym technologii opartych na lipidach, wirusach lub elektroporacji, w celu wygenerowania przejściowej lub stabilnej ekspresji. Zazwyczaj 2 μg plazmidowego DNA na 1 x 106 komórek daje dobrą odtwarzalną ekspresję białka. Utrzymywać komórki przez 5–48 godzin w odpowiednich pożywkach do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych zdolnym do emisjiCO2.</li>
	<li>Monitoruj komórki pod kątem ekspresji białka fuzyjnego GFP za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej, wykorzystując wewnętrzny sygnał fluorescencyjny GFP, używając odpowiednich zestawów filtrów zgodnie z protokołem producenta. Sygnał fluorescencji zwykle osiąga maksimum w ciągu 24-72 godzin po transfekcji. Używaj komórek, gdy sygnał fluorescencji osiągnie maksymalny poziom. Monitoruj poziomy ekspresji białek za pomocą analizy immunoblot przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania lub ugrupowaniu GFP.</li>
	<li>Do analizy eksperymentalnej komórek płytkowych na powlekanych szkiełkach nakrywkowych. Oglądaj w konfiguracji z żywymi komórkami lub po utrwaleniu i zamontowaniu na szkiełkach mikroskopowych. Płytki komórkowe, aby osiągnąć 60%-80% konfluencji w ciągu 24-48 godzin.
	<ol>
		<li>Szkiełka nakrywkowe pokryć roztworem polilizyny (0,1 mg/ml), tak aby pokryć całą powierzchnię. Inkubować przez 30 minut w świetle ultrafioletowym w temperaturze pokojowej, a następnie 60 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C. Usunąć nadmiar polilizyny i spłukać szkiełka nakrywkowe w PBS 3 razy.</li>
		<li>Alternatywnie, umieszczono komórki na komorze na szkle nakrywkowym składającym się z płytek do hodowli komórkowych z dnem ze szkła optycznego, aby umożliwić bezpośrednie obrazowanie za pomocą obiektywów zanurzonych w oleju. Rzeczywista konfiguracja mikroskopii zależy od sprzętu dostępnego dla badacza, ale powinna być zdolna do szybkiej zmiany roztworu. W zależności od typu komórki i kształtu komórki, komórki powinny być w około 60-90% zlewające się w momencie testu FPP.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfiguracja mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Użyj obiektywu zanurzeniowego z olejkiem o dużej aperturze numerycznej (NA), aby uzyskać maksymalne zbieranie sygnału i rozdzielczość przestrzenną, takiego jak obiektyw zanurzeniowy z olejkiem 60X, 1,42 NA. Do stymulacji fluoroforów należy użyć następujących laserów: argon gazowy 488 nm (GFP i YFP) oraz dioda 561 (RFP, mCherry).</li>
	<li>Określ optymalną ekspozycję, wzmocnienie i szybkość przechwytywania obrazów dla każdej konstrukcji. Dostosuj intensywność lasera i czas ekspozycji, aby zminimalizować fotowybielanie (patrz krok 7.1.2).</li>
	<li>W przypadku badań z użyciem wielu fluoroforów (np. rozpuszczalnego markera przepuszczalności błony w połączeniu z markerem białka błonowego) należy wybrać odpowiednie zestawy filtrów, aby zminimalizować przesłuchy sygnału i zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu.</li>
</ol>
4. Ustalanie optymalnych warunków dla przepuszczalności błony plazmatycznej
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z komórek, w których występuje ekspresja tylko rozpuszczalnych białek fluorescencyjnych (np. EGFP, DsRed). Przemyj komórki 3 razy (po 1 minutzie) w buforze KHM (110 mM octan potasu, 3 mM MgCl2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Wykonuj eksperymenty z komórkami i wszystkimi odczynnikami w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić komórki na szkiełkach nakrywkowych (patrz krok 2.4) w buforze KHM na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego i zebrać pierwszy obraz, który reprezentuje kontrolny etap "nieprzepuszczalny".</li>
	<li>Aby selektywnie przepuszczalność błony plazmatycznej, dodaj do komórek digitoninę (30 μM) w buforze KHM. Perfuzja komórek z buforem (bufor + digitonina) z szybkością 5 ml/min przez 10-60 sek.</li>
	<li>Określ optymalne stężenie digitoniny, stopniowo zwiększając stężenie digitoniny. Optymalne stężenie digitoniny osiąga się, gdy następuje całkowita utrata sygnału fluorescencji z rozpuszczalnego EGFP w ciągu 10-60 sekund od podania digitoniny. W przypadku wielu komórek zastosowanie 10-50 μM digitoniny jest wystarczające do przepuszczalności błony komórkowej.
	<ol>
		<li>Do wszystkich zastosowań należy stosować najniższe możliwe stężenie digitoniny. Zbierz obrazy po przepuszczalności digitoniny dla przepuszczalnego sygnału tła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź, że chimera białka GFP, która jest przedmiotem zainteresowania, jest zintegrowana z błoną, potwierdzając komórkowe zatrzymywanie sygnału fluorescencji po przepuszczalności digitoniny przez błonę plazmatyczną16.
	<ol>
		<li>Wyrażają białko fluorescencyjne specyficzne dla organelli23. Dobrze sprawdzają się w tym zakresie białka mitochondrialne16, np. wektor pDsRed2-Mito. Określ optymalne warunki wyrażania zgodnie z opisem w kroku 2.1.</li>
		<li>Potwierdzić, że stężenie digitoniny jest odpowiednie dla zastosowanego typu komórki, zapewniając, że morfologia organelli wewnątrzkomórkowych pozostaje stała przez długotrwałe (do 60 minut) narażenie na digitoninę. 
		UWAGA: Stosuj standardowe protokoły mikroskopii immunofluorescencyjnej z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko różnym kompartmentom komórkowym, takim jak lizosomy (np. LAMP1), Golgiego (np. TGN38), retikulum endoplazmatyczne (np. kalneksyna), endosomy (np. Rab5), mitochondria (np. cytochrom c). Jeśli morfologia/integralność organelli wewnątrzkomórkowych zmienia się dramatycznie w ciągu 60 minut, jest prawdopodobne, że stężenie digitoniny było zbyt wysokie i wymaga zmniejszenia stężenia digitoniny i/lub czasu ekspozycji. 
		UWAGA: Digitonina jest toksyczna przez drogi oddechowe i kontakt ze skórą. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Leczenie proteazą białek fluorescencyjnych
<ol>
	<li>Umyj komórki w buforze KHM, a następnie dodaj proteazę (proteinazę K; 50 μg/ml w buforze KHM) bezpośrednio na komórki. Perfuzja komórek z natężeniem przepływu 5 ml/min za pomocą grawitacyjnego systemu perfuzyjnego w celu ciągłej kąpieli preparatu.
	<ol>
		<li>Roztwory należy przechowywać w strzykawkach o pojemności 50 ml i rurkach polietylenowych połączonych niezależnymi zbiornikami z kolektorem z pojedynczym wylotem w kąpieli (natężenie przepływu 5 ml/min). Ustawić pipetę ssącą tak, aby utrzymać stałą (0,5 ml) objętość kąpieli i uzyskać wymianę roztworu poprzez ręczne przełączanie między zbiornikami perfuzyjnymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz obrazy, aby określić, czy sygnał fluorescencyjny utrzymuje się, czy ulega degradacji. Utrata >90% początkowej intensywności sygnału w ciągu 30-60 sekund jest zgodna z proteolityczną degradacją chimery białka GFP (patrz Reprezentatywne wyniki).</li>
	<li>Jeśli nie obserwuje się degradacji sygnału w przypadku proteinazy K, gdy przewiduje się taką stratę, należy zastąpić roztwór proteinazy K trypsyną (4-8 mM) w buforze KHM. W razie potrzeby użyj mieszaniny proteinazy K i trypsyny. Nie ma potrzeby wygaszania aktywności proteazy.</li>
</ol>
6. Alternatywne podejście do białek błony plazmatycznej z domenami zewnętrznymi
<ol>
	<li>W przypadku białek błony plazmatycznej należy wykonać test dla chimer zewnętrznych białek fluorescencyjnych przed przepuszczalnością digitoniny. Umyj komórki na szkiełkach nakrywkowych w buforze KHM (5 ml/min x 3 min) i wykonaj obraz do leczenia przed proteazą i określ ilościowo sygnał fluorescencji przed proteazą, jak w kroku 7.</li>
	<li>Wystawić komórki na działanie proteazy (proteinaza K; 50 μg/ml lub trypsyna 4-8 mM w buforze KHM) pod nieobecność digitoniny poprzez perfuzję komórek pożywką KHM zawierającą proteazę (szybkość przepływu 5 ml/min). Zbierz obrazy białka fluorescencyjnego, aby określić, jak szybko sygnał znika lub jak długo sygnał się utrzymuje.</li>
	<li>Przed przepuszczalnością digitoniny należy wygasić całą aktywność proteazy, myjąc komórki trzykrotnie (po 1 minutzie) w pożywce do hodowli komórkowych zawierającej 10% surowicy (FBS).</li>
	<li>Przemyć komórki przez perfuzję buforem KHM (szybkość przepływu 5 ml/min) przez 2 minuty. Uzyskaj obraz przed przepuszczalnością. Przepuszczalność błony komórkowej zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
	<li>Zbierz obrazy po dodaniu proteazy zgodnie z opisem w kroku 5.</li>
</ol>
7. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Użyj odwróconego mikroskopu zdolnego do rejestracji "żywych komórek", w którym utrata sygnału fluorescencji może być monitorowana w czasie rzeczywistym. Do ciągłego monitorowania należy stosować identyczne parametry (czas ekspozycji, wzmocnienie, intensywność lasera itp.).
	<ol>
		<li>Określić parametry eksperymentalne, obserwując sygnał fluorescencyjny z białka GFP będącego przedmiotem zainteresowania w warunkach kontrolnych (tj. sam bufor KBH). Dostosuj ustawienia wzmocnienia, intensywności lasera i czasu ekspozycji w mikroskopie sterowanym komputerowo, aby upewnić się, że nie ma znaczącej utraty intensywności sygnału w okresie 10-20 minut. 
		UWAGA: Intensywność sygnału nie jest wartością bezwzględną, ale opiera się na systemie mikroskopu i ustawieniach dostępnych dla każdego PI. Monitoruj zmiany względnej intensywności fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, potraktuj komórki w określonych punktach czasowych digitoniną, a następnie proteazą i utrwal komórki przed zamontowaniem na szkiełkach nakrywkowych w celu obrazowania. Określ punkty czasowe empirycznie, postępując zgodnie z procedurami w krokach 4 i 5. W przypadku wstępnego badania należy rozpocząć od 0, 30, 60, 120 i 300 sekund po dodaniu digitoniny lub proteazy.
	<ol>
		<li>Utrwalić komórki (20 minut w temperaturze pokojowej) za pomocą wystarczającej ilości utrwalacza (3,7% paraformaldehydu w PBS), aby całkowicie zanurzyć komórki.</li>
		<li>Ugasić resztki paraformaldehydu poprzez przepłukanie komórek PBS zawierającym 20 mM glicyny (3 x 5 min).</li>
		<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe, usuwając nadmiar płynu z szkiełka nakrywkowego i odwracając szkiełko nakrywkowe na 50 μl podłoża montażowego na szklanych szkiełkach mikroskopowych do obrazowania. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc przed obrazowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieraj obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej (pod odpowiednimi zestawami filtrów kompatybilnymi z używanym fluoroforem) za pomocą funkcji przechwytywania obrazu wideo na sterowanym komputerowo mikroskopie fluorescencyjnym.</li>
	<li>Określ ilościowo natężenie sygnału fluorescencyjnego w funkcji warunków inkubacji. Uzyskaj średnią intensywność pikseli w obszarze zainteresowania (ROI), który otacza pojedynczą komórkę.</li>
</ol>

<ol><li>Sevier, C. S., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+transfer+of+disulphide+bonds+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation and transfer of disulphide bonds in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).</li>
<li>Brodsky, J. L., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+and+quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum%3A+Recent+lessons+from+yeast+and+mammalian+cell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems.</a> Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).</li>
<li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+displaying+the+hydropathic+character+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.</a> J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).</li>
<li>Ott, C. M., Lingappa, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+protein+biosynthesis%3A+why+topology+is+hard+to+predict%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict.</a> J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).</li>
<li>Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+topological+analysis+of+integral+cytoplasmic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins.</a> The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).</li>
<li>Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+transmembrane+alpha-helices+in+prokaryotic+membrane+proteins%3A+the+dense+alignment+surface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method.</a> Protein Eng. 10, 673-676 (1997).</li>
<li>Geest, M., Lolkema, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+topology+and+insertion+of+membrane+proteins%3A+search+for+topogenic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).</li>
<li>Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+protein+topology+mapping+by+the+substituted+cysteine+accessibility+method+%28SCAM%28TM%29%29%3A+application+to+lipid-specific+membrane+protein+topogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis.</a> Methods. 36, 148-171 (2005).</li>
<li>Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+membrane+topology+by+glycosylation+site+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion.</a> J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Zamyatnin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li>
<li>Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+protease+protection+of+GFP+chimeras+to+reveal+protein+topology+and+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization.</a> Nat Methods. 3, 205-210 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning.+a+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning. a Laboratory Manual</a>. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+you+know+the+sex+of+your+cells%3F+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Do you know the sex of your cells? American journal of physiology.</a> Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).</li>
<li>Wang, H., Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+transmembrane+Ser%2FThr+kinase+complexes+with+protein+phosphatase-1+and+inhibitor-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2.</a> J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).</li>
<li>Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+protease+protection+reveals+the+topology+of+the+integral+membrane+protein+Lemur+Tyrosine+Kinase+2+%28LMTK2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2).</a> Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).</li>
<li>Tagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+trafficking+of+caveolar+domains+in+the+cell%3A+caveolae+as+stable%2C+cargo-triggered%2C+vesicular+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters.</a> J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+specifying+subunit+VIII+of+human+cytochrome+c+oxidase+is+localized+to+chromosome+11+and+is+expressed+in+both+muscle+and+non-muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues.</a> J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).</li>
<li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Curr Biol. 5, 635-642 (1995).</li>
<li>Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+phenotyping+of+secretory+and+nuclear+prion+proteins+associated+with+inherited+prion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases.</a> J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).</li>
<li>Ben-Gedalya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin-A-induced+prion+protein+aggresomes+are+dynamic+quality-control+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments.</a> J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).</li>
<li>Rogers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+of+the+Syrian+hamster+prion+protein+utilizing+chimeric+and+mutant+genes+in+a+vaccinia+virus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system.</a> J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).</li>
<li>Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+mislocalization+of+a+tail-anchored+GFP+redefines+the+identity+of+peroxisomal+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER.</a> Traffic. 4, 491-501 (2003).</li>
<li>Brandee, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mislocalization+and+degradation+of+human+P23H-Rhodopsin-GFP+in+knockin+mouse+model+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Prawidłowa orientacja i topologia białek błonowych jest niezbędna do ich prawidłowego funkcjonowania. Pomimo tego, jak ważne jest zrozumienie topologii białek błonowych, istnieje wiele białek, dla których takich danych całkowicie brakuje. FPP zapewnia łatwy i wydajny sposób określania topologii białek błonowych, który może być wykonywany przez większość laboratoriów. Podejście FPP daje znaczące korzyści w porównaniu z poprzednimi metodami określania topologii białek. Na przykład, nie ma potrzeby posiadania panelu wielu p...

Błony plazmatyczne, jak również liczne błony wewnątrzkomórkowe, służą jako bariery oddzielające dwie wodne komory. W przypadku błony plazmatycznej separacja odbywa się między zewnętrzną i wewnętrzną częścią komórki; W przypadku organelli wewnątrzkomórkowych znajduje się między cytoplazmą a światłem organelli. Na przykład błona retikulum endoplazmatycznego (ER) oddziela środowisko utleniające w świetle ER od środowiska redukującego cytozolowe1. Białka błonowe są syntetyzowane na rybosomach związanych z ER i osiągają swoją ostateczną topologię w błonie ER2. Nabycie odpowiedniej orientacji i topologii błony dla białek ma kluczowe znaczenie dla ich prawidłowego funkcjonowania. Prawidłowa topologia pozwala odpowiednim domenom białek błonowych na interakcję z ich partnerami wiążącymi, umożliwia zachodzenie krytycznych modyfikacji potranslacyjnych, a w przypadku białek błony plazmatycznej umożliwia komórce interakcję i reagowanie na środowisko. Aby w pełni docenić funkcję białka błonowego, konieczne jest poznanie, w jaki sposób białko to jest zorientowane w odniesieniu do błony, w której się znajduje, tj. jego topologii błony. Oprócz zdobycia podstawowej wiedzy naukowej, zrozumienie topologii białka błonowego i tego, które aspekty powierzchni białka są narażone na działanie różnych środowisk, ma wyraźne implikacje kliniczne, ponieważ białka błonowe stanowią większość celów farmakologicznych3. Do niedawna metody określania topologii białek błonowych wymagały znacznych inwestycji czasu i pieniędzy lub wymagały trudnych do zdobycia odczynników.
Zarówno podejście eksperymentalne, jak i in silico zostało wykorzystane do określenia topologii błony białek znajdujących się w błonie plazmatycznej. Od czasu pierwszych przewidywań domen obejmujących błonę w oparciu o ocenianą hydrofobowość poszczególnych aminokwasów3, w Internecie dostępnych jest obecnie wiele algorytmów predykcyjnych, które wymagają po prostu wiedzy na temat sekwencji aminokwasów białka. Jednak w takich programach do modelowania często kluczowe są założenia, które mogą prowadzić do nieprawidłowych przypisań topologii4,5. Co więcej, chociaż te prognozy komputerowe mogą wstępnie przypisać regiony obejmujące błonę, nie zawsze określają, czy zakończenia aminowe lub karboksylowe białek znajdują się w cytoplazmie, świetle organelli czy na zewnątrz komórki. Nawet przy zwiększonej mocy obliczeniowej i zastosowaniu algorytmów uczenia maszynowego6 takie dane są nadal modelem i muszą być walidowane przy użyciu danych uzyskanych eksperymentalnie. Bezpośrednie eksperymentalne określenie topologii błony przeprowadzono przy użyciu paneli przeciwciał monoklonalnych ze znanymi epitopami rozmieszczonymi w całym białku, przy czym dokonano oceny ich immunoreaktywności przed i po przenikaniu komórek. Takie podejście wymaga zestawu przeciwciał, które mogą być niedostępne dla interesującego białka.
Alternatywną strategią jest inżynieria znaczników epitopów, takich jak myc lub hemaglutynina (HA) w różnych miejscach w całym białku, a następnie określenie immunoreaktywności przed i po przepuszczalności błony. Oprócz znaczników immunogennych, znaczniki enzymatyczne (w tym fosfataza alkaliczna, β-galaktozydaza lub β-laktamaza) i modyfikacje chemiczne, takie jak skanowanie cysteiny, zostały wykorzystane do określenia topologii białek błonowych7,8. Dodatkowa metoda stosowana do mapowania topologicznego białek błony plazmatycznej opiera się na nieco innym podejściu do znaczników epitopów. W tej metodzie sekwencją znaczników jest sekwencja konsensusu glikozylacji sprzężonej z N NXS / T. Ponieważ glikozylacja zachodzi tylko wtedy, gdy taka sekwencja jest obecna w świetle szlaku biosyntezy, obecność znacznika w przedziale luminalnym w porównaniu z cytozolowym można łatwo zaobserwować jako przesunięcie masy w żelach SDS-PAGE. Takie podejście zostało zastosowane do wieloprzęsłowego kanału jonowego CFTR9. Chociaż wszystkie te podejścia zostały wykorzystane, jasne jest, że wszystkie wymagają znacznych inwestycji w biologię molekularną, aby wygenerować i zsekwencjonować różnorodne konstrukty.
Określenie informacji topologicznej dotyczącej białek transbłonowych znajdujących się w organellach wewnątrzkomórkowych okazało się trudniejsze. Zastosowanie technologii opartych na fluorescencji sprawiło jednak, że określenie topologii membrany stało się znacznie prostsze. Technika dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) opiera się na interakcji między dwoma niefluorescencyjnymi fragmentami białka fluorescencyjnego, przywracając właściwości fluorescencyjne tego białka10. Chociaż początkowo opisano to do określania interakcji białko-białko in vivo10, podejście to zostało również wykorzystane do określenia topologii białek błonowych w komórkach roślinnych11. Jednak podejście to jest również czasochłonne, ponieważ wymaga wytwarzania nie tylko białek fuzyjnych z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, ale także różnych białek fuzyjnych ukierunkowanych na światło cytozolu lub organelli, a także wymaga wiedzy na temat tego, w których błonach wewnątrzkomórkowych znajduje się interesujące białko.
Alternatywne, prostsze podejście do określania topologii białek błonowych zostało opisane12. Test ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP) wymaga wytworzenia białka fuzyjnego między GFP a genem będącym przedmiotem zainteresowania. Podejście to opiera się na względnej dostępności nieswoistych proteaz dla ugrupowania GFP; w zależności od tego, czy GFP jest chroniony przed proteolizą przez przebywanie w świetle organelli wewnątrzkomórkowych, czy też jest narażony na proteolizę poprzez obecność w cytozolu. Tak więc, jeśli ugrupowanie GFP na białku będącym przedmiotem zainteresowania jest skierowane w stronę cytoplazmy, zostanie wystawione na aktywność proteazy i utracony sygnał fluorescencyjny. I odwrotnie, jeśli ugrupowanie GFP na białku będącym przedmiotem zainteresowania napotka środowisko "chronione" przed proteazą (takie jak światło Golgiego), wówczas sygnał fluorescencyjny będzie się utrzymywał.
Aby umożliwić proteazy przedostanie się do komórki, ale nie wejść do wewnątrzkomórkowych przedziałów błony, stosuje się lek wiążący cholesterol, digitoninę. Cholesterol jest dominującym sterolem u kręgowców i jest specyficznie wzbogacony w błonę plazmatyczną w stosunku do przedziałów wewnątrzkomórkowych. Toksyna glikozydowa, digitonina, jest ekstrahowana z rośliny Digitalis purpurea. Digitonina ma powinowactwo do błon bogatych w cholesterol, gdzie prowadzi do selektywnej przepuszczalności błon14,16 (ryc. 1). Oprócz umożliwienia wyjścia małych składników cytozolowych, przepuszczalność digitoniny umożliwia również wejście cząsteczek egzogennych, takich jak proteinaza K lub trypsyna. Protokół FPP wykorzystuje fakt, że błona plazmatyczna zawiera do 80% cholesterolu komórkowego17, podczas gdy inne organelle, takie jak ER, Golgi, endosomy, mitochondria, które mają bardzo niską zawartość cholesterolu, pozostają nienaruszone14. Selektywne włączanie cholesterolu do błony komórkowej zaobserwowano w wielu komórkach eukariotycznych, co pozwala na zastosowanie zależnej od digitoniny przepuszczalności błony plazmatycznej u tak różnych gatunków eukariotycznych, jak S. cerevisiae dla człowieka14,18. Test FPP zapewnia prosty, szybki i dość solidny sposób określania (a) czy białko jest związane z błoną/związane lub swobodnie dyfuzyjne w cytozolu oraz (b) która domena białka błonowego jest zwrócona w stronę światła cytozolu lub organelli. Jeśli białko błonowe ma wiele orientacji, sygnał będzie pochodził z formy dominującej, a formy mniejsze nie zostaną wykryte. Chociaż mogą istnieć pewne obawy, że dodanie ugrupowania GFP do interesującego białka może wpłynąć na jego funkcję i / lub lokalizację subkomórkową, w rzeczywistości jest to bardziej teoretyczne niż rzeczywiste. Rzeczywiście, wiele badań wyraźnie wykazało, że znacznik GFP nie zmienia właściwości białka19,20.

<table><tbody><tr><td>Digitonina</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Cav1-GFP</td><td>Addgene</td><td>44433</td><td></td></tr><tr><td>pAcGFP-1 Golgi</td><td>Clontech</td><td>632464</td><td></td></tr><tr><td>Polylysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe</td><td>Dako</td><td>Zobacz materiał cS704</td><td></td></tr></tbody></table>

określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (fpp)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Prawidłowa topologia i orientacja integralnych białek błonowych są niezbędne dla ich prawidłowego funkcjonowania, jednak takie informacje nie zostały ustalone dla wielu białek błonowych. Przedstawiono prostą technikę zwaną ochroną proteazy fluorescencyjnej (FPP), która pozwala na określenie topologii białek błonowych w żywych komórkach. Technika ta ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami określania topologii białek, ponieważ nie wymaga dostępności wielu przeciwciał przeciwko różnym domenom białka błonowego, nie wymaga dużych ilości białka i może być wykonywana na żywych komórkach. Metoda FPP wykorzystuje ograniczone przestrzennie działanie proteaz na degradację białek błonowych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w celu określenia ich topologii i orientacji błonowej. To proste podejście ma zastosowanie do wielu różnych typów komórek i może być wykorzystane do określenia orientacji białek błonowych w różnych organellach subkomórkowych, takich jak mitochondria, Golgi, retikulum endoplazmatyczne i składniki systemu endosomalnego/recyklingowego. Białka błonowe, znakowane na N-końcach lub C-końcach za pomocą fuzji GFP, ulegają ekspresji w komórce będącej przedmiotem zainteresowania, która podlega selektywnej przepuszczalności przy użyciu detergentu digitoniny. Digitonina ma zdolność przenikania błony komórkowej, pozostawiając nienaruszone organelle wewnątrzkomórkowe. Ugrupowania GFP wystawione na działanie cytozolu mogą ulegać selektywnej degradacji poprzez zastosowanie proteazy, podczas gdy ugrupowania GFP obecne w świetle organelli są chronione przed proteazą i pozostają nienaruszone. Test FPP jest prosty, a wyniki można uzyskać szybko.

Permeabilizacja błony plazmatycznej
Efektywność permeabilizacji błony plazmatycznej ocenia się poprzez zastosowanie rozpuszczalnych białek fluorescencyjnych (np. GFP, DsRed) (Krok 4). Białka te, po ekspresji w komórkach, swobodnie dyfundują w cytosolu i zostają utracone po permeabilizacji błony plazmatycznej przy użyciu digitoniny (Rysunek 2). Całkowity zanik sygnału fluorescencyjnego powinien nastąpić w ciągu 10-60 s od aplikacji digitoniny. Potwierdzenie, ż...

Tutaj prezentujemy protokół do określenia orientacji i topologii integralnych białek błonowych w żywych komórkach. Ten prosty protokół opiera się na selektywnej wrażliwości chimer na proteazę między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP.

Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Ogólnym celem tej procedury jest określenie topologii integralnych białek błonowych. Osiąga się to poprzez ekspresję białka fuzyjnego, składającego się z zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) połączonego z końcem aminowym lub karboksylowym białka błonowego będącego przedmiotem zainteresowania. W celach kontrolnych w komórkach można eksponować rozpuszczalne białka fluorescencyjne, takie jak RFP.Następnie błona plazmatyczna zostaje poddana selektywnej permeabilizacji. Dzięki zastosowaniu detergentu dig, rozpuszczalne białka fluorescencyjne opuszczą komórkę, podczas gdy białka fluorescencyjne związane z błoną zostaną w niej zatrzymane. Ostatnim krokiem jest zastosowanie proteazy do permeabilizowanych komórek oraz oznaczenie utrzymania lub utraty sygnału fluorescencyjnego.Ostatecznie zmiany intensywności fluorescencji obserwowane za pomocą obrazowania mikroskopem fluorescencyjnym są wykorzystywane do wykazania topologii i orientacji białek błonowych integralnych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mapowanie epitopów, jest fakt, że procedura ta nie wymaga dużej ilości specjalistycznego sprzętu ani różnorodnych odczynników, które mogą być trudnodostępne. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii białek błonowych, takie jak to, które domeny białka błonowego integralnego mogą znajdować się w cytosolu, a które w świetle organelli, takich jak retikulum endoplazmatyczne lub endosomy.Rozpocznij tę procedurę od generowania i walidacji białka fluorescencyjnego KY zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie wprowadź białko fluorescencyjne KY do ludzkich komórek embrionalnej nerki lub komórek HEK 2 93, stosując dowolną standardową, wysokowydajną i niskotoksyczną metodę transfekcji, w tym technologie oparte na lipidach, wirusach lub elektroporacji, aby uzyskać ekspresję przejściową lub stabilną; komórki należy następnie wysiać na szkiełka podstawowe pokryte polilizyną. Hoduj komórki przez okres od 5 do 48 godzin w odpowiedniej pożywce tkankowej w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych z dostępem do dwutlenku węgla.Monitoruj ekspresję białka fuzyjnego GFP w komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej epifluorescencyjnej; wewnętrzny sygnał fluorescencyjny GFP zazwyczaj osiąga maksimum w ciągu 24 do 72 godzin po transfekcji. Do dalszych badań wykorzystaj komórki w momencie, gdy sygnał fluorescencyjny osiągnie poziom maksymalny. Ekspresję białka można również monitorować za pomocą analizy immunoblottingowej, stosując przeciwciała skierowane przeciwko białku docelowemu lub domenie GFP.W celu rozpoczęcia należy przygotować grawitacyjny system perfuzji do traktowania komórek. Przygotować strzykawki o pojemności 50 mililitrów na roztwory, wyposażone w rurki polietylenowe połączone z niezależnymi zbiornikami oraz z rozdzielaczem z pojedynczym wylotem do kąpieli. Umieścić pipetę ssącą w celu utrzymania stałej objętości kąpieli oraz zapewnienia wymiany roztworów poprzez ręczne przełączanie między zbiornikami perfuzyjnymi w celu permeabilizacji błony plazmatycznej.Najpierw usuń pożywkę hodowlaną z komórek. Przemyj komórki trzykrotnie, przez jedną minutę każdego razu. Umieść szkiełka podstawowe w buforze KHM na stole mikroskopu fluorescencyjnego i wykonaj pierwsze zdjęcie, które będzie stanowiło kontrolny obraz nieprzepuszczalny w celu selektywnej permeabilizacji błony plazmatycznej.Dodaj digitonin w buforze KHM do komórek, a następnie perfunduj komórki buforem z dodatkiem digitoniny z prędkością 5 ml/min przez 10 do 60 sekund. Potwierdzenie odpowiedniej permeabilizacji błony plazmatycznej można łatwo przeprowadzić poprzez ekspresję rozpuszczalnej cząsteczki GFP lub RFP, która po permeabilizacji błony swobodnie dyfunduje z komórki. Następnie potwierdź, że interesująca chimera białka GFP jest zintegrowana z błoną, sprawdzając retencję sygnału fluorescencyjnego w komórce po potraktowaniu digitoniną i permeabilizacji błony plazmatycznej.Następnie należy wyeksponować fluorescencyjne białko specyficzne dla organelli, np. białko mitochondrialne, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Określ optymalne warunki ekspresji w taki sam sposób jak poprzednio. Potwierdź, że dawka i stężenie są odpowiednie dla zastosowanego typu komórek, upewniając się, że morfologia wewnątrzkomórkowych organelli pozostaje niezmieniona podczas długotrwałej ekspozycji.Aby rozpocząć proces. Po przemyciu komórek w buforze KHM, nanieś proteazę bezpośrednio na komórki. Przeprowadź perfuzję komórek przy przepływie 5 ml/min, wykorzystując grawitacyjny system perfuzyjny do ciągłego obmywania preparatu.Następnie należy ustalić, czy sygnał fluorescencyjny utrzymuje się, czy ulega degradacji. Należy zebrać obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów, korzystając z funkcji przechwytywania obrazu wideo w mikroskopie fluorescencyjnym sterowanym komputerowo. Następnie należy ilościowo określić intensywność sygnału fluorescencyjnego w zależności od warunków inkubacji.Wyznacz średnią intensywność pikseli w obszarze zainteresowania (ROI) obejmującym pojedynczą komórkę. Spadek początkowej intensywności sygnału o ponad 90% w czasie od 30 do 60 s jest zgodny z proteolityczną degradacją białka GFP ky. Całkowite zaniknięcie rozpuszczalnego sygnału fluorescencyjnego powinno nastąpić w ciągu 10 do 60 s od aplikacji digitoxinu.Potwierdzenie, że badane białko jest powiązane z organellami wewnątrzkomórkowymi, uzyskuje się poprzez odnotowanie utrzymania sygnału fluorescencyjnego po trawieniu i permeabilizacji. Karboksylowy koniec zakotwiczonej w błonie kinazy LTK 2 połączono z GFP i wyeksponowano przejściowo fluorescencyjne LTK 2. Sygnał GFP został szybko utracony po dodaniu proteinazy K, co wskazuje, że koniec karboksylowy LTK 2 znajduje się w cytozolu.Cavi i GFP to białko błony plazmatycznej z fragmentem GFP przyłączonym do domeny cytozolowej. Podobnie jak w przypadku LTK two, sygnał z cavi i GFP jest niewrażliwy na digitoninę, ale wrażliwy na późniejsze dodanie proteazy. DS red mito koduje czerwoną białkową fluorescencję połączoną z sekwencją kierującą do mitochondriów z cytochromu C oksydazy po permeabilizacji digitoniną, a także po dodaniu proteinazy K. Fluorescencja związana z DS red mito pozostaje stabilna. Jest to zgodne z faktem, że Fluor four znajduje się w mitochondriach, gdzie nie jest on wystawiony na działanie cytozolu.W przypadku, gdy część fluorescencyjna przyłączona do białka błonowego jest skierowana na zewnątrz komórki, jak w białku prionowym zakotwiczonym przez GPI i połączonym z żółtym białkiem fluorescencyjnym. Traktowanie proteinazą powinno szybko wygasić sygnał fluorescencji bez konieczności wcześniejszego zwiększania przepuszczalności błony komórkowej, zgodnie z oczekiwaniami. Po traktowaniu proteinazą pozakomórkowy sygnał fluorescencji szybko zanikł w komórkach wykazujących ekspresję tego konstruktu.Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć lepsze zrozumienie sposobu określania topologii badanego białka błonowego.

determining-membrane-protein-topology-using-fluorescence-protease

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oznaczanie topologii białek błonowych przy użyciu fluorescencyjnej ochrony przed proteazami (FPP)

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii z wykrywaniem fluorescencji i wykluczenia wielkości w celu sprawdzenia stabilności białka błonowego z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w Escherichia coli po solubilizacji detergentu. Białka wykazujące symetryczny pik w profilu wykluczenia wielkości z niewielką ilością wolnego GFP lub bez wolnej GFP wskazują na oczyszczone białka z minimalną degradacją i agregacją, które można następnie wybrać do analizy struktura-funkcja.

Chromatografia wykluczająca wielkość z detekcją fluorescencji: technika identyfikacji integralności fluorescencyjnych białek błonowych po rozpuszczaniu detergentu

Opisano podejście biochemiczne do identyfikacji in vivo interakcji białko-białko (PPI) białek błonowych. Metoda łączy w sobie sieciowanie białek, oczyszczanie powinowactwa i spektrometrię mas i można ją dostosować do prawie każdego typu komórki lub organizmu. Dzięki takiemu podejściu możliwa staje się nawet identyfikacja przejściowych IPP.

Membrane-SPINE: narzędzie biochemiczne do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia analizy ilościowej poziomu asocjacji plazmato-błonowej dla fluorescencyjnie oznakowanego białka związanego obwodowo. Metoda opiera się na obliczeniowej dekompozycji błonowej i cytoplazmatycznej składowej sygnału obserwowanej w komórkach znakowanych markerem fluorescencyjnym błony plazmatycznej.

Oznaczanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Test wycieku fluorescencji to prosta metoda, która umożliwia badanie interakcji peptyd/błona, aby zrozumieć ich udział w kilku procesach biologicznych, a zwłaszcza zdolność peptydów penetrujących komórki do zakłócania dwuwarstwowych fosfolipidów podczas bezpośredniego procesu translokacji komórkowej.

Test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę

Niniejszy protokół opisuje procedurę przeprowadzenia chromatografii wykluczenia rozmiaru fluorescencyjnego (FSEC) białek błonowych w celu oceny ich jakości na potrzeby dalszej analizy funkcjonalnej i strukturalnej. Przedstawiono reprezentatywne wyniki FSEC zebrane dla kilku receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) w warunkach rozpuszczalnych w detergentach i bezdetergentowych.

Szybka ocena jakości białka błonowego za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiaru fluorescencyjnego

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę ochrony proteazy fluorescencyjnej do określania topologii białek błonowych w żywych komórkach. Technika wykorzystuje chimery GFP i selektywną trawienność proteazową.

Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Przeglądaj więcej filmów