Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu szybkiego znakowania immunologicznego populacji komórek mózgu myszy wyizolowanych za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM), przy jednoczesnym zachowaniu integralności RNA w próbkach. Osiąga się to poprzez wstępne szybkie zamrażanie wypreparowanej tkanki mózgowej. Następnie mózg jest cięty na cienkie sekcje na szklanych przedmiotach okrywek wolnych od RNA, a następnie poddawany szybkiej immunobarwieniu.

Na koniec, za pomocą LCM izoluje się interesującą populację komórek. Ostatecznie szybkie barwienie, a następnie mikrodysekcja laserowa pozwalają na zidentyfikowanie zmian w ekspresji badanego genu w eksperymentalnej próbce komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS), jest zachowanie rozdzielczości przestrzennej, co umożliwia wyodrębnienie konkretnych komórek ES z otaczającej tkanki.

Zazwyczaj osoby początkujące w pracy z tą komórką Smitha napotykają trudności, ponieważ procedura ta obejmuje kilka krytycznych kroków wymagających szybkiego działania w celu zachowania integralności RNA w próbkach. Aby przygotować próbki do cięcia, wypreparuj mózgi myszy w pierwszym dniu po urodzeniu w lodowatym medium L 15 w ciągu dwóch minut od uśmiercenia zwierząt. Następnie umieść mózgi w formach do zatapiania w orientacji odpowiedniej do cięcia i wypełnij formy zamrożonym medium do zatapiania tkanek.

Następnie bezzwłocznie zamroź preparaty w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze -80°C w ciągu 30 sekund od szybkiego mrożenia. Teraz poddaj szkiełka przedmiotowe powlekane membraną dekontaminacji powierzchniowej z RNA, aby usunąć wszelkie śladowe ilości RNA. Przepłucz je wodą z DEPC i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

Ustaw temperaturę komory kriotomatu na -20 °C i przenieś zamrożoną próbkę do urządzenia. Dla każdej próbki zamocuj zamrożony blok w uchwycie na obiekt i wykonaj skrawki o grubości 10 µm, zbierając przekroje na szkiełkach pokrytych membraną. Po pozostawieniu przekrojów do wyschnięcia przez co najmniej 10 minut, obrysuj tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka do tworzenia barier.

Po około 10 sekundach umieść preparaty w świeżo przygotowanym zimnym roztworze fiksacyjnym na nie więcej niż pięć minut w temperaturze -20°C. Następnie przenieś preparaty do czystej kuwety wstępnie potraktowanej roztworem do dekontaminacji powierzchni z RNA. Najpierw potrząśnij preparatami raz, aby usunąć nadmiar fiksatywa, a następnie przemyj je, wykonując od sześciu do ośmiu szybkich zanurzeń w D-E-P-C-P-B-S, energicznie nimi potrząsając.

Aby usunąć nadmiar D-E-P-C-P-B-S, należy dodać 200 µL roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdego przekroju. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej należy przemyć preparaty na szkiełkach, trzykrotnie zanurzając je szybko w D-E-P-C-P-B-S, a następnie raz potrząsnąć, aby usunąć nadmiar roztworu myjącego. Następnie próbki należy inkubować w 200 µL roztworu przeciwciała drugorzędowego w temperaturze pokojowej przez sześć minut.

Przemyj preparaty w roztworze D-E-P-C-P-B-S w sposób zaprezentowany przed chwilą i inkubuj je w świeżo przygotowanym roztworze BC przez cztery minuty, po kolejnym szybkim przemyciu w D-E-P-C-P-B-S. Wymieszaj 196 µL świeżo przygotowanego DAB z 4 µL inhibitora RNA. Bezpośrednio przed dodaniem roztworu do przekroju, pozwól na rozwój DAB przez jedną do dwóch minut, a następnie przemyj w A-D-E-P-C-P-B-S. Następnie odwodnij przekroje, inkubując je przez kilka sekund w absolutnym etanolu, i otrzep preparaty do wyschnięcia, aby przystąpić do LCM.

Następnie nanieś 50 µL buforu lizującego z zestawu do izolacji RNA do zakrętki probówki zbiorczej. Potem umieść pod mikroskopem preparat z próbką skierowaną w stronę zakrętki. Wybierz optymalne powiększenie dla próbki i ustaw ostrość, aby widzieć interesujące komórki.

Następnie zdefiniuj obszar cięcia i rozpocznij wycinanie laserem. Po zebraniu wyciśniętego materiału do nakrętki probówki zbiorczej inkubuj zebrane komórki przez 30 minut w temperaturze 42 °C. W tym czasie przygotuj kolumnę do oczyszczania RNA z zestawu do ekstrakcji RNA, aplikując 250 µl buforu kondycjonującego.

Następnie nanieś 50 µl etanolu na lizowane komórki na kolumnie i wiruj kolumnę przez dwie minuty przy 16 000 Gs w temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj dwa płukania buforem piorącym. Na koniec eluuj RNA w minimalnej zalecanej objętości 11 µl wody wolnej od RNazy, odstawiając dwa µl w celu sprawdzenia jakości RNA. Ta szybka procedura immunoznakowania umożliwia wizualizację interesujących komórek przy zachowaniu integralności eksperymentalnego RNA.

W zależności od eksperymentu, LCM można wykorzystać w sposób zaprezentowany powyżej do izolacji pojedynczych komórek lub większych obszarów zainteresowania. RNA zdegradowane ma znaczący wpływ na jakość dalszych analiz. Dlatego każda próbka jest następnie przetwarzana na platformie bioanalizatora opartego na mikroprzepływach w celu kwantyfikacji i weryfikacji integralności wyizolowanego RNA, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.

Na przykład tutaj przedstawiono typowe wyniki analizy bioanalizatorem zarówno dla próbek RNA zdegradowanych, jak i wysokiej jakości. Rzeczywiście, żel cyfrowy i elektroforegramy wykazują znaczenie stosowania inhibitora RNazy w każdym roztworze w celu ochrony RNA; po zastosowaniu tej procedury RNA wysokiej jakości może być dalej przetwarzane w zastosowaniach typu downstream, w tym w sekwencjonowaniu RNA, MICROARRAY lub Q-R-D-P-C-R. Przykładowo, na tych wykresach ustalono, że średnie wzbogacenie ekspresji genów TH i A A DC w próbce mikrosekcyjnej w stosunku do przekrojów środkowego mózgu było ponad 170-krotne.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pracy w szybkim tempie oraz z materiałów wolnych od RNAz. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, jak izolować konkretną populację komórek z dowolnej tkanki.