Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, jak przeprowadzić szybkie znakowanie immunologiczne populacji komórek mózgowych myszy wyizolowanej przez mikrosekcję wychwytu laserowego lub LCM przy zachowaniu integralności RNA próbek. Osiąga się to poprzez szybkie zamrożenie wypreparowanej tkanki mózgowej. Mózg jest następnie cięty na cienkie sekcje na szklanych szkiełkach mikroskopowych wolnych od RNA i poddawany szybkiemu barwieniu immunologicznemu.

Na koniec badana populacja komórek jest izolowana za pomocą LCM. Ostatecznie, szybkie barwienie, a następnie mikrodysekcja wychwytywania laserowego pozwala na identyfikację zmian w ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania w eksperymentalnej próbce komórki. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak sortowanie komórek aktywowane fluorem, jest to, że dzięki naszej technice rozdzielczość przestrzenna jest utrzymywana, co pozwala na rozpuszczenie określonej komórki ES z otaczającej tkanki.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej komórce Smitha będą krążyć, ponieważ ta procedura obejmuje kilka krytycznych etapów, które wymagają szybkiej pracy w celu utrzymania integralności RNA w próbkach. Aby przygotować próbki do sekcji, należy przeprowadzić sekcję mózgów myszy po urodzeniu w pierwszym dniu w lodowatym podłożu L 15 w ciągu dwóch minut od ofiarowania. Następnie umieść mózgi w formach do zatapiania w odpowiedniej orientacji do cięcia i wypełnij formy zamrożoną tkanką, zatapiając podłoże.

Następnie natychmiast zamroź próbki w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w ciągu 30 sekund od natychmiastowego zamrożenia. Teraz należy potraktować szkiełka szklane pokryte membraną powierzchniową dekontaminacją RNA, aby usunąć wszelkie śladowe ilości RNA. Opłucz je w wodzie DEPC i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu, gdy szkiełka wyschną.

Ustaw temperaturę komory kriostatu na minus 20 stopni Celsjusza i przenieś zamrożoną próbkę do kriostatu. Dla każdej próbki zamontuj zamrożony blok na zacisku próbki i pokrój próbki na grubość 10 mikronów, zbierając skrawki na szkiełka pokryte membraną. Po pozostawieniu skrawków do wyschnięcia przez co najmniej 10 minut, użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby otoczyć tkanki.

Po około 10 sekundach umieść szkiełka w świeżo przygotowanym zimnym roztworze utrwalającym na nie dłużej niż pięć minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Teraz przenieś szkiełka na czystą tacę wstępnie potraktowaną roztworem do dekontaminacji powierzchni RNA. Najpierw potrząśnij szkiełkami raz, aby usunąć nadmiar utrwalacza i umyj je sześcioma do ośmiu szybkimi zanurzeniami W D-E-P-C-P-B-S przesuń szkiełka.

Aby usunąć nadmiar D-E-P-C-P-B-S, dodaj 200 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdej sekcji. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej umyj szkiełka trzema szybkimi zanurzeniami w D-E-P-C-P-B-S i przesuń je raz, aby usunąć nadmiar roztworu myjącego. Następnie po sześciu minutach inkubować próbki w 200 mikrolitrach roztworu przeciwciał drugorzędowych w temperaturze pokojowej.

Umyj szkiełka w D-E-P-C-P-B-S, jak właśnie pokazano, i inkubuj je w świeżo przygotowanym roztworze BC przez cztery minuty, po kolejnym szybkim płukaniu D-E-P-C-P-B-S, wymieszaj 196 mikrolitrów świeżo przygotowanego DAB z czterema mikrolitrami inhibitora RNA. Tuż przed dodaniem roztworu do sekcji pozwól DAB rozwinąć się przez jedną do dwóch minut, a następnie umyj A-D-E-P-C-P-B-S. Następnie odwodnić sekcje za pomocą kilkusekundowej inkubacji w absolutnym etanolu i wysuszyć szkiełka, aby przejść do LCM.

Następnie w 50 mikrolitrach buforu do lizy z zestawu do ekstrakcji RNA do nasadki probówki zbiorczej. Następnie umieść jedno szkiełko pod mikroskopem stroną z próbką skierowaną w stronę nasadki. Wybierz najlepsze powiększenie dla próbki i dostosuj ostrość, aby zobaczyć interesujące Cię komórki.

Następnie zdefiniuj obszar cięcia i rozpocznij cięcie laserem. Zebranie wypreparowanego materiału w probówce zbiorczej zakryj zebrane komórki przez 30 minut w temperaturze 42 stopni Celsjusza. W tym czasie należy wstępnie przygotować kolumnę oczyszczającą RNA z zestawu do ekstrakcji RNA z 250 mikrolitrami buforu kondycjonującego.

Następnie załadować 50 mikrolitrów etanolu do zlizowanych komórek na kolumnie i odwirować kolumnę przez dwie minuty w temperaturze 16 000 G i temperaturze pokojowej, a następnie dwukrotnie przepłukać buforem do płukania. Na koniec wymyj RNA w minimalnej zalecanej objętości 11 mikrolitrów wody wolnej od RNA, odsuwając dwa mikrolitry na bok, aby przetestować jakość RNA. Ta szybka procedura znakowania immunologicznego pozwala na wizualizację komórek będących przedmiotem zainteresowania przy jednoczesnym zachowaniu integralności eksperymentalnego RNA.

W zależności od eksperymentu, LCM może być używany, jak właśnie wykazano, do izolowania pojedynczych komórek lub większych obszarów zainteresowania. Zdegradowany RNA ma znaczący wpływ na jakość dalszej analizy. Każda próbka jest zatem dalej przetwarzana na bioanalizatorze platformowym opartym na mikropłynach X, aby umożliwić kwantyfikację i weryfikację integralności wyizolowanego RNA, jak właśnie pokazano.

Na przykład tutaj typowe wyniki bioanalizatora są zarówno zdegradowane, jak i dobrej jakości. Pokazano próbki RNA. Rzeczywiście, cyfrowy żel i elektroferogramy pokazują znaczenie stosowania inhibitora rase w każdym roztworze w celu ochrony RNA zgodnie z tą procedurą, wysokiej jakości RNA może być dalej przetwarzane do dalszych zastosowań, w tym sekwencjonowania RNA MICROARRAY lub Q-R-D-P-C-R, na przykład na tych wykresach średnie wzbogacenie ekspresji genów TH i A DC w mikropreparowanej próbce w stosunku do odcinków śródmózgowia określono na ponad 170-krotne.

Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, że praca jest bardzo szybka i wolna od RNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować określoną populację komórek z dowolnej tkanki.