Name: Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Naucz się izolować RNA z określonych populacji komórek mózgu myszy za pomocą szybkiego znakowania immunologicznego i mikrodysekcji laserowej. Ta metoda zachowuje integralność RNA i przestrzennej rozdzielczości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez grant z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC otrzymuje stypendium od Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB jest finansowany ze stypendium Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ), a ML jest FRSQ Chercheur-Boursier.

UWAGA: Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Kanadyjskim Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet Ochrony Zwierząt Université Laval.
1. Przygotowanie próbki
UWAGA: W tym przykładzie użyliśmy mózgów myszy w 1. dniu po urodzeniu.
<ol>
	<li>Użyj znieczulenia hipotermicznego w kruszonym lodzie przez 3 do 4 minut dla szczeniąt, a następnie jak najszybciej wypreparuj mózgi w lodowatym podłożu L15. Wykonaj ten krok w ciągu 2 minut.</li>
	<li>Przenieś wypreparowane mózgi do formy do zatapiania (por. wykaz materiałów) i wypełnij zamrożonymi pożywkami do zatapiania tkanek, zwracając uwagę na orientację próbki w pożądanej pozycji. Próbki należy natychmiast zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Wykonać ten krok w ciągu 30 sek. 
	UWAGA: Próbki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy bez uszczerbku dla jakości RNA.</li>
</ol>
2. Podział na sekcje
<ol>
	<li>Szkiełka szklane powlekane membraną (por. wykaz materiałów) należy potraktować powierzchniowym roztworem do odkażania RNAzy, aby wyeliminować wszelkie ślady RNAz. Umyj szkiełka w wodzie DEPC i pozostaw do wyschnięcia. Alternatywnie piecz szkiełka przez noc w temperaturze 200 °C.</li>
	<li>Zamrożone próbki należy przenieść do kriostatu uprzednio oczyszczonego powierzchniowym roztworem do odkażania RNAzą. Ustawić temperaturę komory kriostatu na -20 °C i pokroić próbki w plastry o grubości 10 μm. Zbierz skrawki tkanek na szkiełkach pokrytych membraną i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut przed barwieniem. Alternatywnie szkiełka można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu zabarwienia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworów barwiących
<ol>
	<li>Przygotuj wszystkie roztwory tuż przed rozpoczęciem eksperymentu i użyj inhibitora RNAzy we wszystkich roztworach barwiących (z wyjątkiem roztworów do mycia), aby zapobiec degradacji RNA.</li>
	<li>Przygotować roztwór buforowy. Stosować ten sam bufor we wszystkich roztworach (składających się z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez RNAz, uzupełnionej 1% BSA, 0,2% trytonu i 2% inhibitora RNAzy). Na każde szkiełko należy przygotować 400 μl roztworu buforowego (200 μl dla przeciwciał pierwszorzędowych i 200 μl dla przeciwciał drugorzędowych).</li>
	<li>Przygotować roztwór utrwalający: użyć 70% etanolu przechowywanego w temperaturze -20 °C. Procedurę utrwalania tkanek należy ograniczyć do minimum, aby uniknąć drastycznego zmniejszenia wydajności ekstrakcji RNA. 
	UWAGA: Alternatywnie należy użyć 95% roztworu etanolu uzupełnionego 5% kwasem octowym przechowywanym w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczając przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze buforowym. Do znakowania neuronów dopaminergicznych należy użyć przeciwciała skierowanego przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH, enzym ograniczający szybkość produkcji dopaminy). Użyj wysokiego stężenia przeciwciał, aby skompensować szybki czas inkubacji. Stosować przeciwciało TH w rozcieńczeniu 1:25, 
	UWAGA: W normalnym protokole immunofluorescencji przeciwciało to daje silny sygnał podczas inkubacji przez noc w rozcieńczeniu 1:1,000. W tym protokole jest stosowany 40 razy bardziej skoncentrowany ze względu na krótki czas inkubacji. Ze względu na wysokie stężenie przeciwciał stosowanych w tej metodzie, należy równolegle przeprowadzić standardowe barwienie immunologiczne w celu sprawdzenia ewentualnego wzrostu znakowania nieswoistego.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając przeciwciało drugorzędowe w roztworze buforowym. Stosować biotynylowane przeciwciało drugorzędowe w stężeniu 1:100, 
	UWAGA: W tym przykładzie użyliśmy biotynylowanego przeciwciała anty-króliczego.</li>
	<li>Przygotować roztwór kompleksu awidyna-biotyna (ABC) do wykrywania biotynylowanych przeciwciał drugorzędowych. Przygotować roztwór ABC, dodając związek A i związek B w stężeniu 1:100 rozcieńczony w PBS DEPC uzupełnionym 2% inhibitorem RNAzy. Przygotuj kompleks Avidin-Biotin 30 minut przed dodaniem go do szkiełek.</li>
</ol>
4. Barwienie
<ol>
	<li>Rozmrażaj jedną lub dwie szkiełka jednorazowo od -80 °C, szybko wyrzucając je w powietrze (lub użyj dmuchawy). Otocz sekcje hydrofobowym pisakiem barierowym i pozostaw do wyschnięcia na kilka sekund.
	<ol>
		<li>Umieścić szkiełka w zimnym roztworze utrwalającym nie dłużej niż 5 minut w temperaturze -20 °C. Wstrząsnąć raz na powietrzu, aby usunąć nadmiar roztworu utrwalającego, a następnie szybko zanurzyć szkiełka w DEPC PBS 6-8 razy w celu umycia.</li>
		<li>Przesuwaj slajdy, aby usunąć nadmiar PBS DEPC. Upewnij się, że etap rozmrażania szkiełek nie przekracza 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić szkiełka na czystej tacy (wstępnie potraktowanej powierzchniowym roztworem do odkażania RNAzy w celu wyeliminowania wszelkich śladów RNAz) i umieścić 200 μl pierwszorzędowego roztworu przeciwciała na każdym szkiełku (króliczym anty-TH) na 10 minut w temperaturze pokojowej. Zanurz szybko szkiełka w DEPC PBS 3 razy w celu umycia i przesuń szkiełka raz, aby usunąć nadmiar DEPC PBS.</li>
	<li>Umieścić 200 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych na każdym szkiełku przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Zanurz szybko szkiełka 3 razy w DEPC PBS w celu umycia i przesuń szkiełka, aby usunąć nadmiar DEPC PBS.</li>
	<li>Umieścić 200 μl roztworu ABC na każdym szkiełku przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Zanurz szybko szkiełka w DEPC PBS 3 razy w celu umycia i przesuń slajdy, aby usunąć nadmiar DEPC PBS.</li>
	<li>Przygotować roztwór DAB (3,3' diaminozydyny) podczas 4 minut inkubacji w roztworze ABC. Użyj odczynników dostarczonych w zestawie (DAB Peroxidase Substrate Kit). Wymieszaj 1 kroplę dostarczonego buforu, 1 kroplę roztworu DAB i 1 kroplę 30% H2O2 w 2,5 ml wody DEPC. Wymieszaj roztwór, odwracając go.</li>
	<li>Weź 196 μl roztworu DAB i dodaj 4 μl (2%) roztworu inhibitora RNAzy tuż przed rozprowadzeniem na szkiełkach. Umieść szkiełka na czystej tacy (wstępnie potraktowanej powierzchniowym roztworem do odkażania RNAzą) i umieść 200 μl roztworu DAB na szkiełkach. 
	UWAGA: Roztwór DAB powinien zareagować w ciągu 1 lub 2 minut.</li>
	<li>Zanurz szybko szkiełka w DEPC PBS 3 razy w celu umycia i umieść szkiełka na kilka sekund w absolutnym etanolu. Wysuszyć szkiełka, wyrzucając je w powietrze (lub użyj dmuchawy). 
	UWAGA: Preparaty mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości lub przetwarzane na LCM.</li>
</ol>
5. Mikrodysekcja przechwytywania laserowego
<ol>
	<li>Rozmrażanie przesuwa się szybko, przesuwając je w powietrzu (lub używając dmuchawy powietrza). Upewnij się, że etap rozmrażania szkiełek nie przekracza 5 minut.</li>
	<li>Przejdź do LCM. Umieść szkiełko pod mikroskopem stroną z próbką skierowaną w stronę nasadki probówki zbiorczej. Wybierz najlepsze powiększenie dla próbki. Dostosuj fokus, aby zobaczyć interesujące Cię komórki.
	<ol>
		<li>Zdefiniuj obszar cięcia i rozpocznij cięcie za pomocą lasera. Zebrać wypreparowane komórki lub kawałek tkanki w nasadce probówki wypełnionej 50 μl buforu do lizy (z zestawu do ekstrakcji RNA). Upewnij się, że krok LCM nie przekracza 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyodrębnij całkowite RNA z izolowanych komórek za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA (por. lista materiałów). Postępuj zgodnie z protokołem producenta.
	<ol>
		<li>Inkubować zebrane komórki przez 30 minut w temperaturze 42 °C w celu lizy komórek. Wstępnie kondycjonować kolumnę oczyszczającą RNA, dodając 250 μl buforu kondycjonującego. Załaduj 50 μl etanolu do zlizowanych komórek. Załadować 100 μl zlizowanych komórek do wstępnie przygotowanej kolumny oczyszczającej. </li>
		<li>Odwirować kolumnę przy 16 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Umyć kolumnę dwukrotnie myjącymi. Eluować w minimalnej zalecanej objętości (11 μl) wody wolnej od RNAzów (nie poddawanej działaniu DEPC, ponieważ może to zakłócać działanie bioanalizatora). Zachowaj 2 μl do sprawdzenia jakości. 
		UWAGA: Wszystkie roztwory i odczynniki znajdują się w zestawie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Synteza cDNA i ilościowy RT-PCR
<ol>
	<li>Odwrotna transkrypcja próbek RNA z laserowo wychwyconych komórek dopaminergicznych na komplementarne DNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy i oligo(dT). Postępuj zgodnie z protokołem producenta (por. lista materiałów).</li>
	<li>Użyj 1 μl cDNA do amplifikacji qRT-PCR za pomocą starterów specyficznych dla genu. Ustawić reakcje PCR w objętości 20 μl z jednoskładnikową mieszanką reakcyjną gorącego startu do ilościowej reakcji PCR zgodnie z zaleceniami producenta. Każdą reakcję przeprowadzić w trzech egzemplarzach.
	<ol>
		<li>Do opisanych tutaj eksperymentów użyj następujących par starterów: Gapdh-F(5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3')/Gapdh-R (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG AA-3') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3') ; Th-F (5'-CAG, TGG, AGG, ATG, TGT, CTC, -3') / Th-R (5'-GAA, AAT, AC, GGG, CAG, ACA, G-3'); Aadc-F (5'- CAT GAG AGC, TTC, TGC, CCT, TC -3')/Aadc-R (5'- GGA, TGT, GGT, CCC, CAG, AG, -3').</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić ilościową amplifikację RT-PCR przy użyciu następujących parametrów szybkich cykli: 95 °C przez 5 minut, a następnie 45 cykli po 10 sekund 95 °C, 10 sekund w temperaturze 60 °C i 10 sekund w temperaturze 72 °C. Przeprowadzić analizę krzywej topnienia przy użyciu domyślnego ustawienia przyrządu w celu określenia tworzenia jednorodnego produktu.</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą wbudowanego oprogramowania.
	<ol>
		<li>Znormalizuj wartości ekspresji markerów DA genów Th i Aadc z ekspresją dwóch genów referencyjnych Gapdh i Rpl13a, aby uzyskać względne poziomy ekspresji, jak opisano wcześniej14.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+orthodenticle+homeobox+2+influences+axonal+projections+and+vulnerability+of+midbrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+%3A+a+journal+of+neurology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons.</a> Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+microdissection+in+translational+research%3A+theory%2C+technical+considerations%2C+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).</li>
<li>Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: methods and applications.</a> Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).</li>
<li>Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+review+of+molecular+diagnostics%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection technology.</a> Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).</li>
<li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in pathology.</a> Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).</li>
<li>Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+molecular+histology+to+study+glial+influence+on+neurodegenerative+disorders.+Focus+on+recent+developed+single+cell+laser+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+histology%22%5BJournal%5D)">The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection.</a> Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).</li>
<li>Liu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+the+tissue+biorepository%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+techniques+%3A+JBT%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in the tissue biorepository.</a> Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).</li>
<li>Baskin, D. G., Bastian, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-laser+capture+microdissection+of+rat+brain+neurons+for+real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR.</a> Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).</li>
<li>Brown, A. L., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+RNA+preservation+for+immunolabeling+and+laser+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection.</a> RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).</li>
<li>Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purity+and+enrichment+of+laser-microdissected+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+research+international%22%5BJournal%5D)">Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons.</a> BioMed research international. 2013, 747938(2013).</li>
<li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IF-LCM%3A+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+international%22%5BJournal%5D)">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li>
<li>Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+rat+midbrain+dopamine+neurons%3A+implications+for+selective+vulnerability+in+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism.</a> Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).</li>
<li>Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Endogenous+Serine%2FThreonine+Protein+Phosphatase+Inhibitor%2C+G-Substrate%2C+Reduces+Vulnerability+in+Models+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease.</a> Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).</li>
<li>Pfaffl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%2C+Quantification+strategies+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22AZ+of+quantitative+PCR%22%5BJournal%5D)">Chapter 3, Quantification strategies in real-time.</a> AZ of quantitative PCR. , International University Line (IUL). La Jolla, CA. (2004).</li>
<li>Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+novel+ultra-short+immunolabeling+method+for+high-quality+mRNA+preservation+in+laser+microdissection+and+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+MolecularDiagnostics%22%5BJournal%5D)">Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction).</a> The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).</li>
<li>Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Tsitologiia%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection for biology and medicine.</a> Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).</li>
<li>Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+forensic+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+legal+medicine%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).</li>
<li>Shapiro, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+proteomic+workflow+for+characterization+of+frozen+clinical+biopsies%3A+laser+capture+microdissection+coupled+with+label-free+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry.</a> Journal of. 77, 433-4340 (2012).</li>
<li>Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+the+genomic+and+proteomic+era%3A+targeting+the+genetic+basis+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+clinical+and+experimental+pathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer.</a> International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najbardziej krytycznym punktem tej metody jest znakowanie interesujących komórek przy jednoczesnym zapobieganiu degradacji RNA. Ponieważ RNAzy są aktywne w roztworach wodnych, skrócenie czasu inkubacji poprawia zachowanie RNA11,15. Wszystkie użyte roztwory muszą być traktowane DEPC w celu inaktywacji RNAz. Wszystkie materiały i powierzchnie muszą być poddane działaniu powierzchniowego roztworu do odkażania RNAzy, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNAzy. Wreszcie, w tych warunkach, dodanie inhibitora RNAzy we wszys...

Mózg składa się z wielu różnych typów neuronów tworzących złożone sieci. Neurony te są zorganizowane w odrębne grupy i podgrupy zgodnie z ich morfologią, połączeniem i wzorcem ekspresji genów1. Opracowanie mikromacierzy, sekwencjonowania nowej generacji i qRT-PCR umożliwiło porównanie profili ekspresji genów w populacjach neuronów w różnych kontekstach biologicznych1,2. Te czułe analizy wymagają precyzyjnej identyfikacji i izolacji typów komórek będących przedmiotem zainteresowania przy zachowaniu integralności RNA2-4. Technika sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) jest szeroko stosowana do izolowania określonych typów komórek na podstawie markerów powierzchniowych komórek i/lub morfologii. FACS wymaga etapu dysocjacji komórek przed sortowaniem, co powoduje całkowitą utratę rozdzielczości przestrzennej5. Wiele subpopulacji neuronalnych różni się od siebie ze względu na ich anatomiczne rozmieszczenie w mózgu. Mikrodysekcja laserowa stosowana na cienkich skrawkach mózgu zapewnia odpowiednią opcję do specyficznej izolacji komórek o wysokiej rozdzielczościprzestrzennej 6-8. Głównym ograniczeniem LCM była potrzeba identyfikacji komórek będących przedmiotem zainteresowania na podstawie kryteriów morfologicznych lub fluorescencyjnych reporterów białkowych genetycznie modyfikowanych w modelach zwierzęcych. Opracowanie nowych technik wykonywania szybkich metod znakowania immunologicznego, które zachowały integralność RNA, w połączeniu z LCM, pozwala obecnie na izolację subpopulacji komórek w celu przeprowadzenia eksperymentów profilowania genów.
To podejście zostało już wcześniej przeprowadzone i krótko opisane w kilku publikacjach1,9-13. Tutaj demonstrujemy szczegółową procedurę uzyskiwania wysokiej jakości RNA z określonego podzbioru komórek w złożonej strukturze tkankowej poprzez połączenie szybkiego znakowania immunologicznego z LCM. Pokazujemy, jak wykonać kluczowe kluczowe kroki, aby uzyskać maksymalny odzysk RNA i uniknąć degradacji RNA, ponieważ może to znacząco wpłynąć na profilowanie ekspresji genów.
W celu zademonstrowania tego protokołu, na celowniku znalazły się neurony dopaminergiczne z jednodniowego śródmózgowia myszy. Neurony dopaminergiczne mogą być znakowane immunologicznie za pomocą przeciwciała skierowanego przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH), enzymowi ograniczającemu szybkość syntezy dopaminy. Po barwieniu immunologicznym TH pojedyncze lub grupy neuronów dopaminergicznych można następnie wyizolować za pomocą LCM. Mikrowypreparowane komórki są zbierane w buforze do lizy, a RNA jest ekstrahowane za pomocą zestawu do izolacji RNA. Jakość i ilość wyekstrahowanego RNA mierzy się za pomocą bioanalizatora5. Następnie można przeprowadzić dalszą analizę ekspresji genów za pomocą: sekwencjonowania RNA, mikromacierzy lub qRT-PCR2,4,6. Na przykład zademonstrowano dwuetapowy qRT-PCR na wychwyconych laserowo izolowanych domenach dopaminergicznych. Względna kwantyfikacja poziomów ekspresji dwóch genów markerów neuronów dopaminergicznych ilustruje selektywność tego protokołu.

<table><tbody><tr><td>Prowadnice powlekane membraną&nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>11505158</td><td>MembranySlides PEN-Membrana 2,0 & mikro; m; 50 sztuk</td></tr><tr><td>Powierzchniowy roztwór do dekontaminacji RNAzy</td><td>Technologie życiowe</td><td>AM9780</td><td>RNaseZap</td></tr><tr><td>Fixative</td><td></td><td></td><td>70% Etanol utrzymywany na poziomie -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Anty-TH&nbsp;</td><td>Pel-Zamrażak</td><td>P40101</td><td>&nbsp; 1:25</td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>wolny od RNAzy</td><td>DEPC PBS + 1% BSA + 0,02% inhibitor</td></tr><tr><td>RNAzy</td> trytonu <td>Promega</td><td>N2615</td><td>Rnasine Plus Rnazy Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td></tr><tr><td>Anty-królik biotynylowany</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC zestaw Standard</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>8&micro; l/ml</td></tr><tr><td>Zestaw substratu peroksydazy DAB&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA</td><td>Technologie życiowe</td><td>KIT0204</td><td>Zestaw do izolacji RNA Arcturus PicoPure</td></tr><tr><td>H2O2 30%</td><td>Sigma</td><td>HC4060</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny</td><td></td><td></td><td></td>etanol</tr><tr><td>System mikropreparacji laserowej</td><td>Mikrosystemy</td><td></td> Leica <td>Model AS-LMD</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22753-14</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td></td><td>Agilent 2100 Bioanalizator</td></tr><tr><td>Forma do zatapiania&nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>14702218311</td><td>6x8mm</td></tr><tr><td>Hydrofobowe pióro barierowe&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Podłoża do zatapiania mrożonych tkanek</td> Chip Bioanalyzer <td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aligent Technologies</td><td>5067-1513</td><td>RNA 6000 Pico LabChip używany z bioanalizatorem Agilent 2100</td></tr><tr><td>Mieszanina reakcyjna gorącego startu do ilościowego PCR</td><td>Roche</td><td>6402712001</td><td>Fast Start Essential DNA Green</td></tr><tr><td>Master Odwrotna transkryptaza</td><td>Życie technologie</td><td>11752-050</td><td>SuperScript III Synteza pierwszej nici SuperMix do qRT-PCR</td></tr></tbody></table>

izolacja rna z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Mikrodysekcja laserowa (LCM) pozwala na izolację określonych komórek z cienkich skrawków tkanek z wysoką rozdzielczością przestrzenną. Skuteczny LCM wymaga precyzyjnej identyfikacji subpopulacji komórek z niejednorodnej tkanki. Identyfikacja komórek będących przedmiotem zainteresowania dla LCM jest zwykle oparta na kryteriach morfologicznych lub na fluorescencyjnych reporterach białkowych. Połączenie LCM i szybkiego znakowania immunologicznego stanowi alternatywny i skuteczny sposób wizualizacji określonych typów komórek i izolowania ich od otaczających tkanek. Wysokiej jakości RNA można następnie wyekstrahować z czystej populacji komórek i dalej przetwarzać do dalszych zastosowań, w tym sekwencjonowania RNA, mikromacierzy lub qRT-PCR. Podejście to było już wcześniej stosowane i pokrótce opisane w kilku publikacjach. Celem tego artykułu jest zilustrowanie, w jaki sposób przeprowadzić szybkie znakowanie immunologiczne populacji komórek przy zachowaniu integralności RNA oraz jak wyizolować te specyficzne komórki za pomocą LCM. W tym artykule zilustrowaliśmy tę wieloetapową procedurę poprzez znakowanie immunologiczne i wychwytywanie komórek dopaminergicznych w tkance mózgowej jednodniowych myszy. Zwracamy uwagę na kluczowe, krytyczne kroki, które zasługują na szczególną uwagę. Protokół ten można dostosować do różnych tkanek i komórek będących przedmiotem zainteresowania. Naukowcy z różnych dziedzin prawdopodobnie skorzystają na demonstracji tego podejścia.

Ta szybka procedura immunoznakowania umożliwia wizualizację interesujących badacza komórek przy jednoczesnym zachowaniu integralności RNA. Rysunek 1 ilustruje etapy przygotowania tkanki przed ekstrakcją RNA. Po kriosekcjonowaniu neurony dopaminergiczne są znakowane za pomocą przeciwciała skierowanego przeciwko tyrozynowej hydroksylazie (znakowane neurony widoczne są w kolorze brązowym). W zależności od postawionego pytania badawczego, można wyizolować pojedyncze komórki lub większe obszary zainteresowani...

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu szybkiego znakowania immunologicznego populacji komórek mózgu myszy wyizolowanych za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM), przy jednoczesnym zachowaniu integralności RNA w próbkach. Osiąga się to poprzez wstępne szybkie zamrażanie wypreparowanej tkanki mózgowej. Następnie mózg jest cięty na cienkie sekcje na szklanych przedmiotach okrywek wolnych od RNA, a następnie poddawany szybkiej immunobarwieniu.Na koniec, za pomocą LCM izoluje się interesującą populację komórek. Ostatecznie szybkie barwienie, a następnie mikrodysekcja laserowa pozwalają na zidentyfikowanie zmian w ekspresji badanego genu w eksperymentalnej próbce komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS), jest zachowanie rozdzielczości przestrzennej, co umożliwia wyodrębnienie konkretnych komórek ES z otaczającej tkanki.Zazwyczaj osoby początkujące w pracy z tą komórką Smitha napotykają trudności, ponieważ procedura ta obejmuje kilka krytycznych kroków wymagających szybkiego działania w celu zachowania integralności RNA w próbkach. Aby przygotować próbki do cięcia, wypreparuj mózgi myszy w pierwszym dniu po urodzeniu w lodowatym medium L 15 w ciągu dwóch minut od uśmiercenia zwierząt. Następnie umieść mózgi w formach do zatapiania w orientacji odpowiedniej do cięcia i wypełnij formy zamrożonym medium do zatapiania tkanek.Następnie bezzwłocznie zamroź preparaty w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze -80°C w ciągu 30 sekund od szybkiego mrożenia. Teraz poddaj szkiełka przedmiotowe powlekane membraną dekontaminacji powierzchniowej z RNA, aby usunąć wszelkie śladowe ilości RNA. Przepłucz je wodą z DEPC i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.Ustaw temperaturę komory kriotomatu na -20 °C i przenieś zamrożoną próbkę do urządzenia. Dla każdej próbki zamocuj zamrożony blok w uchwycie na obiekt i wykonaj skrawki o grubości 10 µm, zbierając przekroje na szkiełkach pokrytych membraną. Po pozostawieniu przekrojów do wyschnięcia przez co najmniej 10 minut, obrysuj tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka do tworzenia barier.Po około 10 sekundach umieść preparaty w świeżo przygotowanym zimnym roztworze fiksacyjnym na nie więcej niż pięć minut w temperaturze -20°C. Następnie przenieś preparaty do czystej kuwety wstępnie potraktowanej roztworem do dekontaminacji powierzchni z RNA. Najpierw potrząśnij preparatami raz, aby usunąć nadmiar fiksatywa, a następnie przemyj je, wykonując od sześciu do ośmiu szybkich zanurzeń w D-E-P-C-P-B-S, energicznie nimi potrząsając.Aby usunąć nadmiar D-E-P-C-P-B-S, należy dodać 200 µL roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdego przekroju. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej należy przemyć preparaty na szkiełkach, trzykrotnie zanurzając je szybko w D-E-P-C-P-B-S, a następnie raz potrząsnąć, aby usunąć nadmiar roztworu myjącego. Następnie próbki należy inkubować w 200 µL roztworu przeciwciała drugorzędowego w temperaturze pokojowej przez sześć minut.Przemyj preparaty w roztworze D-E-P-C-P-B-S w sposób zaprezentowany przed chwilą i inkubuj je w świeżo przygotowanym roztworze BC przez cztery minuty, po kolejnym szybkim przemyciu w D-E-P-C-P-B-S. Wymieszaj 196 µL świeżo przygotowanego DAB z 4 µL inhibitora RNA. Bezpośrednio przed dodaniem roztworu do przekroju, pozwól na rozwój DAB przez jedną do dwóch minut, a następnie przemyj w A-D-E-P-C-P-B-S. Następnie odwodnij przekroje, inkubując je przez kilka sekund w absolutnym etanolu, i otrzep preparaty do wyschnięcia, aby przystąpić do LCM.Następnie nanieś 50 µL buforu lizującego z zestawu do izolacji RNA do zakrętki probówki zbiorczej. Potem umieść pod mikroskopem preparat z próbką skierowaną w stronę zakrętki. Wybierz optymalne powiększenie dla próbki i ustaw ostrość, aby widzieć interesujące komórki.Następnie zdefiniuj obszar cięcia i rozpocznij wycinanie laserem. Po zebraniu wyciśniętego materiału do nakrętki probówki zbiorczej inkubuj zebrane komórki przez 30 minut w temperaturze 42 °C. W tym czasie przygotuj kolumnę do oczyszczania RNA z zestawu do ekstrakcji RNA, aplikując 250 µl buforu kondycjonującego.Następnie nanieś 50 µl etanolu na lizowane komórki na kolumnie i wiruj kolumnę przez dwie minuty przy 16 000 Gs w temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj dwa płukania buforem piorącym. Na koniec eluuj RNA w minimalnej zalecanej objętości 11 µl wody wolnej od RNazy, odstawiając dwa µl w celu sprawdzenia jakości RNA. Ta szybka procedura immunoznakowania umożliwia wizualizację interesujących komórek przy zachowaniu integralności eksperymentalnego RNA.W zależności od eksperymentu, LCM można wykorzystać w sposób zaprezentowany powyżej do izolacji pojedynczych komórek lub większych obszarów zainteresowania. RNA zdegradowane ma znaczący wpływ na jakość dalszych analiz. Dlatego każda próbka jest następnie przetwarzana na platformie bioanalizatora opartego na mikroprzepływach w celu kwantyfikacji i weryfikacji integralności wyizolowanego RNA, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.Na przykład tutaj przedstawiono typowe wyniki analizy bioanalizatorem zarówno dla próbek RNA zdegradowanych, jak i wysokiej jakości. Rzeczywiście, żel cyfrowy i elektroforegramy wykazują znaczenie stosowania inhibitora RNazy w każdym roztworze w celu ochrony RNA; po zastosowaniu tej procedury RNA wysokiej jakości może być dalej przetwarzane w zastosowaniach typu downstream, w tym w sekwencjonowaniu RNA, MICROARRAY lub Q-R-D-P-C-R. Przykładowo, na tych wykresach ustalono, że średnie wzbogacenie ekspresji genów TH i A A DC w próbce mikrosekcyjnej w stosunku do przekrojów środkowego mózgu było ponad 170-krotne.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pracy w szybkim tempie oraz z materiałów wolnych od RNAz. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, jak izolować konkretną populację komórek z dowolnej tkanki.

rna-isolation-from-cell-specific-subpopulations-using-laser-capture

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolowanie RNA z określonych subpopulacji komórek przy użyciu mikrodysekcji z chwytaniem laserowym połączonej z szybką immunomarkacją

Mikroskopia z przechwytywaniem laserowym, znana również jako laserowa mikrodysekcja (LMD), umożliwia użytkownikowi izolację niewielkiej liczby komórek lub tkanek z zamrożonych lub ...

Mikrorozcięcie laserowe z wychwytem (Laser Capture Microdissection) tkanek ssaków

Ten film opisuje technikę uzyskiwania pojedynczej komórki z heterogenicznej populacji komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej. Pojedyncza wyizolowana komórka może być wykorzystana do dalszych badań genomicznych lub badań nad rakiem.

Pobieranie próbek pojedynczych komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej: technika zbierania komórek docelowych z heterogenicznej populacji komórek

Opisujemy, jak korzystać z mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów hipokampa lub pojedynczych neuronów z zamrożonych fragmentów uszkodzonego mózgu szczura do późniejszej analizy ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i/lub mikromacierzy całego genomu.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Ludzkie komórki neuroprogenitorowe (NPC) były rozwijane w warunkach proliferacji. NPC różnicowano w kultury bogate w neurony w obecności kombinacji neurotrofin. Markery neuronalne wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Aby wyizolować czystą populację neuronów, NPC różnicowano na szkiełkach membranowych PEN i przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.

Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Ten protokół wyjaśnia, jak zbierać pojedyncze neurony, mikroglej i astrocyty z centralnego jądra ciała migdałowatego z dużą dokładnością i anatomiczną specyficznością za pomocą mikrodysekcji laserowej. Dodatkowo wyjaśniamy nasze zastosowanie mikroprzepływowego RT-qPCR do pomiaru podzbioru transkryptomu tych komórek.

Połączenie mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR w celu analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek: podejście biologii systemowej do uzależnienia od opioidów

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Laserowe mikrodyparowanie tkanek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej pozwala na precyzyjne pobieranie komórek z interesujących obszarów histologicznych w celu analizy danych multi-omicznych z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi.

Izolacja komórek z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi z próbek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej za pomocą mikrodysekcji laserowej

Ten protokół opisuje użycie mikroMS do sterowanej fluorescencją, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, umożliwiając lepsze profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczura.

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura

Naucz się izolować RNA z określonych populacji komórek mózgu myszy za pomocą szybkiego znakowania immunologicznego i mikrodysekcji laserowej. Ta metoda zachowuje integralność RNA i przestrzennej rozdzielczości.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Przeglądaj więcej filmów