Podwójne znakowanie komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych w zarodkach kurczaków za pomocą szczepienia cewy nerwowej^{piskląt GFP} i wstrzyknięcia barwnika karbocyjaniny DiI

Ogólnym celem tej procedury jest zabarwienie i uwidocznienie tkanki nerwowej pochodzącej ze skorupy nerwowej i związanego z nią układu naczyniowego podczas rozwoju embrionalnego. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie cewy nerwowej z zarodka gospodarza typu dzikiego. Równoważny region cewy nerwowej jest wycinany X z dopasowanego do stadium transgenicznego zarodka kurczaka GFP, enzymatycznie, trawionego i szczepionego do żywiciela typu dzikiego.

W ten sposób powstaje chimeryczny zarodek. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego do układu krwionośnego chimerycznych zarodków w celu uwidocznienia rozwijającego się układu naczyniowego. Następnie pobiera się zarodki i przeprowadza się preparację interesujących nas tkanek.

Na koniec próbki są obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu uwidocznienia zarówno jelitowego układu nerwowego znakowanego GFP, jak i sieci naczyniowych znakowanych DAI. Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak klasyczna technika szczepienia piskląt przepiórczych, polegają na tym, że kurczak i tkanki GFP są bardzo jasne, a GFP cytoplazmatyczne umożliwia wizualizację projekcji komórkowych w sieciach neuronowych. Ponadto metody etykietowania GFP i DAI są kompatybilne z obrazowaniem na żywo.

Aby rozpocząć przygotowanie miejsca pracy oraz wszystkich narzędzi i odczynników potrzebnych do zabiegu, pierwszym krokiem jest stworzenie okienka w skorupce jajka, aby umożliwić dostęp do zarodka. Po usunięciu od dwóch do trzech mililitrów albuminy zarodek powinien być widoczny przez okienko. Następnie wstrzykuje się atrament indyjski, aby pomóc w wizualizacji zarodka.

W tym celu należy przebić mikropipetę przez błonę żółtka poza obwód urządzenia do wystrzeliwania. Ostrożnie ustaw jego końcówkę bezpośrednio pod zarodkiem. Po umieszczeniu na miejscu wprowadź atrament pod zarodek, w rurkę ustną.

Należy uważać, aby nie wprowadzać żadnych pęcherzyków powietrza, które mogłyby prowadzić do zanieczyszczenia. Ostrożnie wyjmij szklaną mikropipetę. Następnie za pomocą specjalnie wykonanego mikroskalpela zamontowanego na uchwycie igły należy wykonać bardzo małe rozdarcie w błonie IGN w miejscu, w którym zostanie wykonana mikrooperacja.

Aby usunąć interesujący nas obszar cewy nerwowej, użyj mikroskalpela, aby naciąć całą cewę nerwową, zaczynając od jednego lub dwóch roztoczy, a kończąc na sześciu lub siódmych. Następnie przeciąć obustronnie między cewą nerwową a somitami, aby oddzielić cewę nerwową od otaczających tkanek. Uważaj, aby nie uszkodzić somitów.

Kiedy będziesz gotowy, bardzo delikatnie oddziel cewę nerwową od leżącej pod spodem nie pępowiny, która powinna pozostać nienaruszona. Udane wycięcie cewy nerwowej pozostawi wszystkie otaczające tkanki w stanie nienaruszonym. Usuń i wyrzuć rurkę neuronową akcyzy.

Zarodek gospodarza jest teraz gotowy do przyjęcia cewy nerwowej dawcy. Po zidentyfikowaniu zarodka zgodnego z GFP, usuń go z komórki jajowej, wykonując cztery nacięcia nożyczkami sprężynowymi, utwórz kształt prostokąta wokół zarodka, a następnie delikatnie podnieś go za pomocą dumonta. Numer pięć, pęseta.

Umieść zarodek w kwadracie. Szkiełko zegarka z podstawą z polimeru sogar. Delikatnie potrząśnij zarodkiem, aby usunąć przyczepione żółtko.

Usuń błonę VII i przypnij zarodek do polimerowej podstawy za pomocą szpilek ze stali nierdzewnej. Następnie wykonaj cztery nacięcia w kształcie prostokąta wokół cewy nerwowej i otaczających ją somitów w tym samym obszarze, który został usunięty z zarodka gospodarza. Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś rurkę nerwową, a tym samym tkanki roztoczy do szkła zegarkowego zawierającego 2% pankreatyny w PBS w celu trawienia enzymatycznego.

Po 10 minutach w temperaturze pokojowej użyj nierdzewnych szpilek z minucji zamontowanych na uchwycie, aby ręcznie oddzielić cewę nerwową od wszystkich sąsiednich tkanek. Po wyizolowaniu przenieś powiązaną cewę nerwową do innego szkła zegarkowego na lodzie, aby wypłukać nadmiar pankreatyny i zatrzymać trawienie enzymatyczne. Po pięciu minutach wypreparowana cewa nerwowa jest gotowa do przeszczepu.

Orto miejscowo do gospodarza pisklęcia. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia procedury szczepienia, ostrożnie przenieś wypreparowaną rurkę nerwową ze szkła zegarka do zarodka gospodarza. Ustaw cewę nerwową we właściwej orientacji i delikatnie wepchnij ex explan przylegający do wyciętego obszaru.

W razie potrzeby użyj mikroskalpela, aby przyciąć ex explan do dokładnego rozmiaru wyciętego obszaru. Po ustawieniu się we właściwej pozycji usuń PBS i inny płyn, aby pomóc dawcy i tkankom gospodarza przylegać i ustanowić przeszczep. Pomyślną integrację przeszczepionej cewy nerwowej GFP z gospodarzem kurczaka typu dzikiego można ocenić pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Uszczelnij całe okno przezroczystą taśmą o szerokości 24 milimetrów, aby zapobiec odwodnieniu i zanieczyszczeniu. Oznacz chimeryczny zarodek i zwróć jajo do inkubatora w celu dalszego rozwoju w pożądanym eksperymentalnym punkcie czasowym, wyjmij jajo z inkubatora i usuń przezroczystą taśmę, aby uzyskać dostęp do zarodka. Po wyświetleniu zlokalizuj dostępną żyłę na żółtku, upewniając się, że przepływ krwi jest skierowany w stronę zarodka.

Wybierz punkt rozgałęzienia na jednej z żył IGN jako miejsce wstrzyknięcia. Za pomocą pęsety usuń błonę viti powyżej wybranego punktu wstrzyknięcia, rozrywając w przeciwnych kierunkach. Następnie dostosuj średnicę wyciągniętej szklanej igły do wielkości żyły.

Brzydź się igłą z pięcioma do 10 mikrolitrami roztworu Dai. Szybko włóż igłę do żyły i równomiernie dmuchnij rurką ustną, aby dai mógł powoli dołączyć do przepływu krwi bez tworzenia skrzepu. Powodzenie wstrzyknięcia Dai można ocenić, oglądając zarodek pod mikroskopem fluorescencyjnym, co jest oczywiste bezpośrednio po wstrzyknięciu.

Aby zachować jak najwięcej dii, nabierz zarodek na perforowaną łyżkę i przetnij naczynia krwionośne i tkanki łączne, aby uwolnić zarodek od żółtka. Usuń wszelkie luźne błony i wypreparuj interesujące Cię narządy. Należy bardzo uważać, aby nie uciskać tkanki, co może prowadzić do dyfuzji suchego oka.

Natychmiast utrwalić tkanki w 4% paraldehydzie na jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej i postępować zgodnie ze standardowymi procedurami badania całego montażu lub kriosekcji. Te trójwymiarowe rekonstrukcje konfokalnego stosu obrazów w okolicy żołądka pokazują GFP dodatnie jelitowe komórki grzebienia nerwowego, di barwiony układ naczyniowy i wyłoniony obraz obu sieci. Reprezentatywne skrawki histologiczne w okolicy żołądka wykazują również dodatnie komórki grzebienia nerwowego jelitowego GFP, układ naczyniowy zabarwiony DII i wyłoniony obraz.

Rekonstrukcje trójwymiarowe można tu wykorzystać do produkcji filmów z obrotem o 360 stopni. Trójwymiarowe rekonstrukcje w okolicy jelita ślepego pokazują GFP dodatni przód grzebienia nerwowego jelitowego na zielono i barwiony barwnikiem układ naczyniowy na czerwono. Ten panel pokazuje tutaj połączenie obu sieci.

Konfokalny stos obrazów wykorzystano do stworzenia filmu przedstawiającego front migracji komórek grzebienia nerwowego jelita i związane z nim unaczynienie. Technika ta pozwala nam badać mechanizmy leżące u podstaw unerwienia i unaczynienia narządów podczas rozwoju, umożliwiając silne znakowanie fluorescencyjne komórek nerwowych i naczyń krwionośnych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że wymaga ona doskonałej koordynacji końcowej pod mikroskopem.

Ogólnie rzecz biorąc, zarówno przeszczep cewy nerwowej, jak i wstrzyknięcie barwnika wymagają dużo praktyki, aby odnieść sukces.