Obrazowanie kontrastowe w zarodkach myszy za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości

Ogólnym celem tej procedury jest wstrzyknięcie mikropęcherzyków do izolowanych, żywych zarodków myszy w celu przeprowadzenia obrazowania ultradźwiękowego z zastosowaniem kontrastu. Realizuje się to poprzez uprzednie pobranie żywych zarodków w stadium E 16.5 lub E 17.5 z ciężarnej myszy.

Po przygotowaniu mikrobąbelków celujących, są one wstrzykiwane do żywego embrionu poprzez naczyniową sieć łożyskową. Ostatnim etapem jest obrazowanie mikrobąbelków przy użyciu ultradźwięków. W końcowej fazie obrazowanie ultradźwiękowe z użyciem kontrastu może zostać wykorzystane do pomiaru parametrów perfuzji naczyniowej oraz oceny wiązania mikrobąbelków celujących w embrionach.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą miały trudności z etapami manipulacji zarodkami i ich wstrzykiwania, dopóki nie nabiorą wystarczającej wprawy w stosowaniu odpowiedniego nacisku igły i pincety, niezbędnego do pomyślnego przeprowadzenia eksperymentu. Procedurę zaprezentuje Brian Nixon, student praktyk z naszego laboratorium. Aby zrekonstytuować fiolki z docelowym reagentem, należy rozcieńczyć 20 µg roztworu przeciwciał do końcowej objętości 1 mL soli fizjologicznej. Fiolki należy przechowywać w lodzie. Następnie należy napełnić strzykawkę 1 mL soli fizjologicznej.

Usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza. Należy przymocować igłę 21 G i powoli wstrzyknąć roztwór do fiolki z mikropęcherzykami. Powoli odciągnąć tłok, usuwając jeden mililitr powietrza, a następnie wyciągnąć igłę.

Delikatnie wymieszaj zawartość probówki i pozostaw ją w lodzie na pięć minut. Po upływie pięciu minut nabierz do nowej strzykawki rozcieńczenie przeciwciała i dodaj je do odpowiedniej probówki. Po wymieszaniu delikatnie doprowadź objętość mieszaniny do dwóch mililitrów.

Pozostawić na 10 minut w lodzie. Aby zrekonstytuować fiolki bez docelowych przeciwciał, napełnić strzykawkę jednym mililitrem soli fizjologicznej, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza.

Przymocuj igłę o rozmiarze 21 G i powoli wstrzyknij roztwór do nowej fiolki z mikropęcherzykami. Powoli wycofaj tłok, pobierając jeden mililitr powietrza, a następnie wyjmij igłę. Delikatnie wymieszaj i odstaw na pięć minut.

Po dodaniu kolejnego 1 ml soli fizjologicznej w celu zwiększenia objętości do 2 ml, delikatnie wymieszaj i pozostaw na 10 minut na lodzie. Po delikatnym wymieszaniu zawartości wybranej fiolki z mikropęcherzykami, za pomocą strzykawki 1 ml z igłą 21 G, pobierz około 50 µL roztworu. Następnie wstrzyknij mikropęcherzyki do pustej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml.

Następnie pipetujemy 10 µL próbki roztworu zapasu mikropęcherzyków do 10 mL rozcieńczalnika. Po delikatnym wymieszaniu należy zastosować liczenie w analizatorze Coultera, aby ocenić stężenie i rozkład wielkości populacji mikropęcherzyków. Należy wykonać co najmniej trzy pomiary objętością 50 µL dla każdej próbki z fiolki.

Przy użyciu apertury o średnicy 30 mikrometrów. Krok ten jest wykonywany równolegle z wstrzykiwaniem mikropęcherzyków do embrionów. Podczas gdy chirurg wstrzykuje preparat do embrionów, asystent przygotowuje kolejną iniekcję, aby zapewnić, że chirurg nie posiada wiedzy na temat rodzaju wstrzykiwanego pęcherzyka.

Oblicz objętość roztworu zapasowego mikropęcherzyków niezbędną do uzyskania stężenia końcowego 100 milionów mikropęcherzyków na mililitr w objętości 400 µL. Odmierz odpowiednią objętość soli fizjologicznej do pustej probówki do mikrowirówki. Po delikatnym wymieszaniu wybranej fiolki z mikropęcherzykami, za pomocą strzykawki o pojemności 1 mL z igłą 21G pobierz nadmiarową objętość roztworu.

Następnie wstrzyknij mikropęcherzyki do pustej probówki do mikrocentryfugi. Dalej, odmierz pipetą odpowiednią objętość roztworu stokowego mikropęcherzyków i dodaj do aliquoty soli fizjologicznej. Wymieszaj, delikatnie mieszając końcówką pipety.

Następnie należy użyć igły o rozmiarze 21 G, aby pobrać rozcieńczony roztwór mikropęcherzyków do czystej strzykawki. Po wyjęciu igły należy usunąć z strzykawki wszelkie pęcherzyki powietrza, a następnie przymocować końcówkę Luer oraz prowadnicę. Roztwór należy powoli przetłoczyć do końca prowadnicy, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.

Na koniec włożyć strzykawkę do pompy infuzyjnej ustawionej na podawanie mikropęcherzyków z szybkością 20 µL na minutę. Dla całkowitej objętości 20 µL do końca rurki przymocować wypaloną igłę szklaną. Przesunąć pompę w pobliże stanowiska do iniekcji.

Za pomocą łyżki perforowanej losowo wybierz i wyjmij jeden embrion z chłodzonej szalki z podłożem. Umieść embrion w naczyniu do sekcji, znajdującym się na platformie ultradźwiękowej pod stereomikroskopem. Następnie zlokalizuj stronę embrionu, która wydaje się najmniej unaczyniona.

Oto obszar o niskiej unaczynieniu, zazwyczaj przylegający do regionu głowy. Następnie za pomocą precyzyjnych pęset należy naciąć lub rozerwać tylko tyle woreczka żółtkowego i błon owodniowych, ile jest konieczne do usunięcia zarodka z wnętrza, i nie więcej. Następnie delikatnie oddzielić woreczek od otaczającego zarodek obszaru.

Następnie ułóż embrion na boku, tak aby łożysko i naczynia pępowinowe znajdowały się z przodu. Ustabilizuj naczynie do sekcji, używając małych kawałków plasteliny i czterech szpilek entomologicznych do przymocowania pęcherzyka żółtkowego oraz krawędzi łożyska, unikając głównych naczyń krwionośnych; użyj strzykawki z podgrzanym do 45 °C roztworem.

Przemywaj zarodek roztworem PBS, aż zauważysz przepływ krwi do zarodka. Tętnicę pępowinową rozpoznaje się po pulsującej, jasnoczerwonej krwi. Żyła pępowinowa i powiązana z nią sieć naczyniowa zawierają krew o ciemniejszym kolorze i zazwyczaj nakładają się na naczynia tętnicy pępowinowej po stronie łożyska.

W tym momencie należy ustawić naczynie tak, aby możliwe było wygodne przeprowadzenie iniekcji. Po ożywieniu zarodka należy go przykryć, pomijając łożysko. Używając podgrzanego żelu ultradźwiękowego oraz precyzyjnej pęsety, delikatnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z okolic zarodka i w trakcie całej procedury uzupełniaj poziom podgrzanego PBS w naczyniu.

Należy monitorować poziom roztworu w strzykawkach z PBS i żelem oraz w razie potrzeby dodawać zapasowe strzykawki do zlewki grzejnej. Następnie zamocować szklaną igłę w dużej kulce plasteliny na brzegu naczynia do sekcji i zanurzyć końcówkę igły w PBS. Wybrać żyłę na powierzchni chorionu placka łożyskowego, znajdującą się w rozsądnej odległości od głównej gałęzi.

Następnie użyć nożyczek, aby przyciąć końcówkę igły tak, by odpowiadała rozmiarowi naczynia, odcinając końcówkę pod lekkim kątem. Użyć krawędzi nożyczek sprężynowych, aby usunąć wszelkie poszarpane krawędzie szkła.

Następnie, używając pompy strzykawkowej, powoli wstrzykuj roztwór mikropęcherzyków z prędkością 20 µL na minutę do szklanej igły, aż całe powietrze zostanie usunięte z końcówki igły, a mikropęcherzyki zaczną swobodnie wpływać do PBS. Zatrzymaj pompę i ustaw ją na objętość wstrzyknięcia wynoszącą 20 µL. Nie dopuść do przedostania się powietrza do igły iniekcyjnej, aby uniknąć wstrzyknięcia powietrza do układu naczyniowego zarodka.

Ostrożnie wprowadź końcówkę szklanej igły do wybranej żyły w łożysku i upewnij się, że jest ona unieruchomiona. Odsunie głowicę stereomikroskopu i ustaw przetwornik ultradźwiękowy tak, aby zarodek znajdował się równomiernie pomiędzy ogniskowymi 6 i 10 milimetrów. Następnie uruchom obrazowanie i rozpocznij bolusową iniekcję mikropęcherzyków; po minucie, gdy wstrzyknięcie zostanie zakończone, uruchom stoper dla etapu akwizycji danych.

Ten obraz ultrasonograficzny w trybie B przedstawia wyjęty na zewnątrz zarodek w stadium E 17.5 bezpośrednio przed wstrzyknięciem ukierunkowanych mikropęcherzyków. Ten nieliniowy obraz kontrastowy USG pokazuje zarodek przed wstrzyknięciem mikropęcherzyków, gdy widoczne są jedynie silnie odbijające powierzchnie, takie jak kości, przy minimalnym sygnale z tkanek miękkich. Wstrzyknięcie mikropęcherzyków wzmacnia kontrast w całym organizmie zwierzęcia, w tym w żyle głównej dolnej, sercu i mózgu.

Wykres natężenia mikropęcherzyków w funkcji czasu w obrębie pojedynczego obszaru zainteresowania w mózgu embrionalnym pozwala na identyfikację różnych parametrów perfuzji, w tym maksymalnego wzmocnienia lub szybkości wypłukiwania (pe wash in rate) określonej przez nachylenie oraz czasu do osiągnięcia szczytu (TTP). Średnie stosunki mocy kontrastu dla mikropęcherzyków celowanych w endoglinę były znacząco wyższe niż te zebrane dla kontrolnych mikropęcherzyków niecelowanych. Ponadto stwierdzono, że wiązanie mikropęcherzyków celowanych w endoglinę było znacząco wyższe w embrionach ogly plus plus w porównaniu do embrionów ogly plus minus.

Po opanowaniu metody, każdy embrion może zostać poddany iniekcji i obrazowaniu w ciągu 15 minut, pod warunkiem prawidłowego wykonania techniki.