Obrazowanie kontrastowe w zarodkach myszy za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości
March 4th, 2015
Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania ultradźwiękowych mikropęcherzykowych środków kontrastowych do żywych, izolowanych mysich zarodków w późnym stadium ciąży. Metoda ta umożliwia badanie parametrów perfuzji i naczyniowych markerów molekularnych w obrębie zarodka za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości ze wzmocnieniem kontrastowym.
Ogólnym celem tej procedury jest wstrzyknięcie mikropęcherzyków do izolowanych żywych zarodków myszy. Do obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw żywych zarodków E 16,5 lub E 17,5 od ciężarnej myszy.
Po przygotowaniu docelowych mikropęcherzyków, mikropęcherzyki są wstrzykiwane do żywego zarodka przez łożyskową sieć naczyniową. Ostatnim krokiem jest zobrazowanie mikropęcherzyków za pomocą obrazowania ultradźwiękowego. Ostatecznie obrazowanie ultrasonograficzne z kontrastem może być wykorzystane do pomiaru parametrów perfuzji naczyniowej i oceny docelowego wiązania mikropęcherzyków w zarodkach.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą zmagać się z obchodzeniem się z zarodkami i wstrzykiwaniem części protokołu, dopóki nie będą miały wystarczającej praktyki w stosowaniu nacisków igły i kleszczy wymaganych do udanego eksperymentu demonstrującego procedurę będzie Brian Nixon, student współpracujący z naszego laboratorium Aby odtworzyć docelowe gotowe fiolki, zacznij od rozcieńczenia 20 mikrogramów roztworu przeciwciała do końcowej objętości jednego mililitra soli fizjologicznej. Przechowywać fiolki na lodzie. Następnie napełnij strzykawkę jednym mililitrem soli fizjologicznej.
Usuwanie wszystkich pęcherzyków powietrza. Założyć igłę o rozmiarze 21 i powoli wstrzykiwać roztwór do fiolki z mikropęcherzykami. Powoli wyjąć tłok, usuwając jeden mililitr powietrza, a następnie wyjąć igłę.
Delikatnie wymieszać fiolkę i odstawić na lód na pięć minut. Po pięciu minutach napełnić nową strzykawkę rozcieńczeniem przeciwciał i dodać je do odpowiedniej fiolki. Po wymieszaniu delikatnie pozwól mieszaninie wynieść teraz dwa mililitry.
Odstaw na 10 minut na lód. Aby rozpuścić fiolki, które nie są docelowe, należy napełnić strzykawkę jednym mililitrem soli fizjologicznej. Usuwanie wszystkich pęcherzyków powietrza.
Założyć igłę o rozmiarze 21 i powoli wstrzykiwać roztwór do nowej fiolki z mikropęcherzykami. Powoli wyjąć tłok, usuwając jeden mililitr powietrza, a następnie wyjąć igłę. Delikatnie wymieszaj i odstaw na pięć minut.
Po dodaniu dodatkowego jednego mililitra soli fizjologicznej, aby zwiększyć objętość do dwóch mililitrów, delikatnie wymieszaj i odstaw na 10 minut na lód. Po delikatnym wymieszaniu żądanej fiolki z mikropęcherzykami, użyj igły o rozmiarze 21 G na strzykawce o pojemności jednego mililitra, aby pobrać około 50 mikrolitrów roztworu. Następnie wstrzyknij mikropęcherzyki do pustej dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej.
Następnie odpipetować 10 mikrolitrową próbkę roztworu podstawowego mikropęcherzyków do 10 mililitrów rozcieńczalnika. Po delikatnym wymieszaniu użyj liczenia redlic, aby ocenić stężenie i rozkład wielkości populacji mikropęcherzyków. Policz co najmniej trzy pomiary po 50 mikrolitrów na próbkę z fiolki.
Korzystanie z apertury 30 mikrometrów. Ten etap jest wykonywany równolegle z wstrzykiwaniem mikropęcherzyków do zarodków. Podczas gdy chirurg wstrzykuje zarodki, asystent przygotowuje następny zastrzyk, aby upewnić się, że chirurg jest ślepy na rodzaj wstrzykiwanej bańki.
Określ objętość roztworu bąbelkowego wymaganą do wytworzenia końcowego stężenia 100 milionów mikropęcherzyków na mililitr w objętości 400 mikrolitrów. Porcjować odpowiednią objętość soli fizjologicznej do pustej probówki z mikrowirówką. Po delikatnym wymieszaniu wybranej fiolki z mikropęcherzykami, użyj jednomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 21, aby pobrać nadmiar objętości roztworu.
Następnie wstrzyknij mikropęcherzyki do pustej probówki z mikrowirówką. Następnie odpipetować odpowiednią objętość roztworu podstawowego mikropęcherzyków i dodać do kwadra soli fizjologicznej Ali. Wymieszać, delikatnie mieszając końcówką pipety.
Następnie za pomocą igły o rozmiarze 21 wciągnij rozcieńczony roztwór mikropęcherzyków do czystej strzykawki. Po wyjęciu igły usuń wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki i przymocuj przynętę oraz rurkę. Powoli dociśnij roztwór do końca rurki, uważając, aby nie wytworzyć żadnych pęcherzyków powietrza.
Na koniec włożyć strzykawkę do pompy infuzyjnej strzykawki ustawionej do dozowania mikropęcherzyków z szybkością 20 mikrolitrów na minutę. Aby uzyskać całkowitą objętość 20 mikrolitrów, przymocuj ciągniętą szklaną igłę do końca rurki. Przesunąć pompę w pobliże etapu wtrysku.
Użyj perforowanej łyżki, aby losowo wybrać i usunąć jeden zarodek z naczynia ze schłodzonym podłożem. Umieść zarodek w naczyniu separacyjnym znajdującym się na stoliku ultrasonograficznym pod stereoskopem. Następnie zlokalizuj stronę zarodka, która wydaje się najmniej unaczyniona.
Oto obszar o niskim unaczynieniu, zwykle przylegający do obszaru głowy. Następnie użyj cienkich kleszczy, aby przeciąć lub rozerwać tylko tyle woreczka żółtkowego i błon owodniowych, aby móc usunąć zarodek od wewnątrz, ale nie więcej. Następnie delikatnie manewruj workiem wokół zarodka.
Następnie umieść zarodek na boku, tak aby łożysko i naczynia pępowinowe znajdowały się z przodu. Ustabilizuj naczynie separacyjne za pomocą małych kawałków plasteliny za pomocą czterech szpilek do owadów przygwożdżonych do worka z żółtkiem i krawędzi łożyska, unikając większych naczyń za pomocą strzykawki zawierającej wstęp. 45 stopni Celsjusza.
PBS myje zarodek, aż będzie można zobaczyć krew wpływającą do zarodka. Tętnicę pępowinową identyfikuje się po pulsującej jaskrawoczerwonej krwi. Żyła pępowinowa i związana z nią sieć naczyniowa mają ciemniejszą krew i zwykle nakładają się na te z tętnicy pępowinowej po stronie łożyska.
W tym momencie należy ustawić naczynie tak, aby można było wygodnie wykonać wstrzyknięcie. Gdy zarodek się ożywi, przykryj go, ale nie łożysko. Za pomocą ciepłego żelu do ultradźwięków użyj cienkich kleszczyków, aby delikatnie usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z okolic zarodka i uzupełnij naczynie wstępnie ciepłym PBS przez cały zabieg.
Zwracać uwagę na poziom roztworu w strzykawkach PBS i strzykawkach z żelem, a w razie potrzeby dodać zapasowe strzykawki do zlewki grzewczej. Następnie zamontuj szklaną igłę na dużej kuli plasteliny na krawędzi naczynia do wycinki i włóż koniec igły do PBS. Wybierz żyłę na powierzchni kosmówki krążka łożyskowego tak daleko od głównej gałęzi, jak to możliwe.
Następnie użyj nożyczek, aby przyciąć końcówkę igły, aby dopasować ją do rozmiaru naczynia. Cięcie końcówki pod niewielkim kątem. Użyj krawędzi nożyczek sprężynowych, aby usunąć wszelkie postrzępione krawędzie szkła.
Teraz, za pomocą pompy strzykawkowej, powoli wstrzykuj roztwór mikropęcherzyków w ilości 20 mikrolitrów na minutę do szklanej igły, aż całe powietrze zostanie usunięte z końcówki igły i będzie można zobaczyć, jak mikropęcherzyki swobodnie przepływają do PBS. Zatrzymaj pompę i zresetuj ją do objętości wtrysku 20 mikrolitrów. Nie należy dopuścić do przedostania się powietrza do igły do wstrzykiwań, aby uniknąć wstrzyknięcia powietrza do układu naczyniowego zarodka.
Delikatnie włóż szklaną końcówkę igły do wybranej żyły w łożysku i upewnij się, że jest ona nieruchoma. Odchyl głowicę stereoskopu i ustaw przetwornik ultrasonograficzny tak, aby zarodek znajdował się równomiernie między ogniskami na głębokości od sześciu do 10 milimetrów. Następnie rozpocznij obrazowanie i rozpocznij wstrzykiwanie mikropęcherzyków w bolusie po minucie po zakończeniu wstrzyknięcia, uruchom stoper dla kroku zbierania danych.
Ten obraz ultrasonograficzny w trybie B pokazuje zewnętrzniony zarodek E 17,5 bezpośrednio przed wstrzyknięciem docelowych mikropęcherzyków. Ten nieliniowy kontrastowy obraz ultrasonograficzny pokazuje zarodek przed wstrzyknięciem mikropęcherzyków, kiedy widoczne są tylko silnie odbijające interfejsy, takie jak kość, przy minimalnym sygnale z tkanek miękkich. Wstrzyknięcie mikropęcherzyków zwiększa kontrast w całym zwierzęciu, w tym w żyle głównej dolnej, sercu i mózgu.
Wykres intensywności mikropęcherzyków w funkcji czasu w pojedynczym obszarze zainteresowania w embrionalnym mózgu pozwala na identyfikację różnych parametrów perfuzji, w tym wzmocnienia piku lub szybkości wymywania pe pokazanej przez nachylenie i czas do osiągnięcia piku lub TTP. Średnie współczynniki mocy kontrastu z mikropęcherzyków ukierunkowanych na endoglin były znacznie wyższe niż te zebrane do kontroli w mikropęcherzykach niedocelowych. Ponadto stwierdzono, że wiązanie mikropęcherzyków ukierunkowane na endoglin było znacznie większe w zarodkach ogly plus plus w porównaniu z zarodkami ogly plus minus.
Po opanowaniu, każdy zarodek może zostać wstrzyknięty i zobrazowany w ciągu 15 minut, jeśli technika jest wykonywana prawidłowo.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół wstrzyknięcia kontrastowych mikrobąbelek ultradźwiękowych do żyjących, odizolowanych zaawansowanych embrionów mysich. Metoda ta umożliwia badanie molekularnych markerów naczyniowych i parametrów perfuzji za pomocą kontrastowego obrazowania ultradźwiękowego o wysokiej częstotliwości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia rozwojowa
- Techniki obrazowania
Tło
- Mikrobąbelki są używane jako środki kontrastowe w obrazowaniu ultradźwiękowym.
- Badanie parametrów naczyniowych w embrionach może dostarczyć wglądu w procesy rozwojowe.
- Wysokoczęstotliwościowe obrazowanie ultradźwiękowe pozwala na szczegółową wizualizację dystrybucji mikrobąbelek.
- Ta technika może poprawić nasze zrozumienie wazkularyzacji embrionalnej.
Cel badania
- Opracowanie metody wstrzykiwania mikrobąbelek do embrionów mysich.
- Umożliwienie kontrastowego obrazowania struktur naczyniowych.
- Ocenienie parametrów perfuzji i wiązania mikrobąbelek w embrionach.
Stosowane metody
- Pobieranie żyjących embrionów E 16.5 lub E 17.5 od ciężarnych myszy.
- Przygotowywanie mikrobąbelek docelowych do wstrzyknięcia.
- Wstrzykiwanie mikrobąbelek przez sieć naczyń łożyskowych.
- Wizualizacja mikrobąbelek za pomocą technik ultradźwiękowych.
Główne wyniki
- Udane wstrzyknięcie mikrobąbelek do odizolowanych embrionów.
- Wizualizacja dystrybucji mikrobąbelek za pomocą obrazowania ultradźwiękowego.
- Pomiar parametrów perfuzji naczyniowej w embrionach.
- Ocena ukierunkowanego wiązania mikrobąbelek do struktur naczyniowych.
Wnioski
- Protokół umożliwia efektywne obrazowanie wazkularyzacji embrionalnej.
- Kontrastowe obrazowanie ultradźwiękowe może dostarczyć cennych danych na temat rozwoju embrionalnego.
- Ta metoda może ułatwić dalsze badania nad dynamiką naczyniową embrionalną.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of vascular perfusion and molecular targeting in late-gestation mouse embryos, providing a preclinical model for de-risking vascular target validation and biomarker discovery. By allowing reproducible microbubble injection and high-frequency ultrasound imaging, it supports mechanistic studies of angiogenic pathways and endothelial targets relevant to cardiovascular and oncology drug development. The approach enhances predictive confidence in early-stage target engagement studies by delivering quantifiable, endpoint-resolved data on microbubble binding and hemodynamic parameters.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular targets such as VEGFR2 and αvβ3 integrin through quantitative measurement of targeted microbubble binding in living embryos.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for assessing target specificity and binding kinetics using endoglin as a model angiogenic biomarker.
- Strategic Value: Supports target de-risking by delivering statistically significant differences in binding between targeted and control microbubbles across genetic models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate, time to peak) that serve as functional readouts for vascular activity and drug response.
- Operational Value: Standardizes embryo preparation and injection procedures to ensure consistent imaging conditions and reduce variability in perfusion measurements.
- Strategic Value: Enables assay-ready vascular models for screening compounds that modulate angiogenesis or vascular permeability in a physiologically relevant context.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of vascular development and disease models by allowing longitudinal assessment of perfusion and molecular binding in genetically defined embryos.
- Operational Value: Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing translatable hemodynamic and molecular imaging endpoints.
- Strategic Value: Aids in risk-adjusted decision-making by identifying targets with demonstrable, quantifiable engagement in a disease-relevant embryonic system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical assessment, offering a bridge between molecular target engagement and functional vascular phenotypes in a whole-organism context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of angiogenic targets by enabling direct visualization and quantification of microbubble binding to endothelial biomarkers in vivo.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative ultrasound contrast signals that allow comparison of perfusion changes across experimental conditions.
- Analytics: Provides endpoint-resolved measurements (peak enhancement, slope, time to peak) that enable statistical comparison of vascular function and molecular targeting efficiency.
- Translational Research: Connects molecular binding data to functional perfusion outcomes, supporting biomarker validation in developmental and disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for vascular imaging that can be adapted across multiple embryonic stages and genetic backgrounds for longitudinal studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in vascular target validation by combining molecular specificity with functional perfusion readouts.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized embryo handling, injection timing, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing early, quantifiable evidence of target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-aware prioritization of vascular targets based on binding specificity and functional impact in a physiologically intact system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical embryo handling, vascular cannulation, and high-frequency ultrasound operation.
- Depends on access to contrast-capable ultrasound systems operating at frequencies sufficient for embryonic resolution (typically >30 MHz).
- Necessitates standardized microbubble preparation and quality control to ensure consistent size, concentration, and targeting efficiency.
- Requires adaptation of injection parameters (volume, rate, vessel selection) based on embryonic stage and vascular accessibility.
- Limited to ex vivo embryo culture conditions, which may constrain longitudinal imaging beyond gestational day 17.5 without additional physiological support.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Reconstitution of Target Ready Vials
2:17
Reconstitution of Untargeted Vials
2:59
Coulter Counting
3:45
Preparing Microbubbles for Injection
5:37
Injection of Microbubbles into Embryos
9:02
Results: Ultrasound Imaging of Mouse Embryos with Microbubbles
10:18
Conclusion
