Name: Wyciszanie genów za pośrednictwem chitozanu/interferujących nanocząstek RNA w larwach komarów wektorów chorób (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Poznaj metodę wyciszania genów w larwach komarów wektorów chorób za pomocą nanocząstek chitozanu/interferującego RNA. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów w układzie węchowym i innych tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie z Kansas Agricultural Experiment Station i K-State Arthropod Genomics Center dla KYZ wsparło oryginalny rozwój wyciszania genów za pośrednictwem chitozanu/dsRNA u A. gambiae19. Opisana tutaj praca A. gambiae była częściowo wspierana przez R01-AI095842 z NIH/NIAID do KM. Rozwój wyciszania genów za pośrednictwem chitozanu / siRNA u A. aegypti20,21 był wspierany przez NIH / NIAID Award R01-AI081795 dla MDS. Za treść tego badania wyłączną odpowiedzialność ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

1. Gatunki komarów i hodowla
<ol>
	<li>Utrzymać szczepy A. gambiae G3 i A. aegypti Liverpool IB12 (użyte w reprezentatywnych badaniach poniżej) lub inne szczepy będące przedmiotem zainteresowania zgodnie ze standardową praktyką laboratoryjną lub zgodnie z opisem wcześniej23,24.</li>
</ol>
2. Projektowanie i produkcja dsRNA i siRNA
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery do konstruowania długich matryc dsRNA specyficznych dla interesującego genu. Użyj narzędzia E-RNAi25. Wytworzyć dsRNA zgodnie z wybraną metodą lub zgodnie z wcześniejszym opisem19.
	<ol>
		<li>W celu kontroli ujemnej należy zsyntetyzować dsRNA19 odpowiadający sekwencji białka zielonej fluorescencji (GFP), β-galaktozydazy (β-gal) lub innego genu nieulegającego ekspresji u komarów. W razie potrzeby, dsRNA19 wykorzystany do wygenerowania reprezentatywnych wyników podsumowanych poniżej może być użyty jako kontrola pozytywna. Przechowywać dsRNA rozpuszczone w wodzie wolnej od RNAzy w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, zaprojektuj siRNA specyficzne dla genu zgodnie ze standardową praktyką laboratoryjną lub zgodnie z opisem wcześniej10. Zamieszaj sekwencję powalonego siRNA, aby zaprojektować siRNA kontroli negatywnej, które nie odpowiada żadnemu genowi komara. Kup niestandardowe siRNA, które są dostępne u wielu renomowanych dostawców.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby, siRNA20,21wykorzystane do uzyskania reprezentatywnych wyników podsumowanych poniżej mogą być użyte jako kontrole pozytywne. Przechowywać siRNA rozpuszczone w wodzie wolnej od RNAzy w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie chitozanu/interferujących nanocząstek RNA
<ol>
	<li>Zebrać gotowe RT 100 mM siarczanu sodu (100 mM Na2SO4 w dejonizowanymH2O) i 0,1 M octanu sodu (0,1 M NaC2H3O2–0,1 M kwasu octowego, pH 4,5 w dejonizowanymH2O).</li>
	<li>Rozpuścić chitozan (≥75% deacetylowany) w 0,1 M buforze octanu sodu w celu uzyskania 0,02% (w/v) roztworu roboczego i przed użyciem utrzymywać roztwór w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozpuścić dsRNA lub siRNA w 50 μl dejonizowanegoH2Oi dodać go do 100 mM buforu siarczanu sodu, aby uzyskać 100 μl roztworu 32 μg dsRNA/siRNA na 100 μl 50 mM siarczanu sodu.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu chitozanu do roztworu dsRNA/siRNA, a następnie podgrzewać mieszaninę w łaźni wodnej w temperaturze 55 °C przez 1 min. Ustawić kontrolę, dodając 100 μl 50 mM siarczanu sodu do 100 μl roztworu chitozanu i postępować zgodnie z tą samą procedurą.</li>
	<li>Roztwory należy natychmiast mieszać przez 30 sekund za pomocą szybkiego wirowania w temperaturze pokojowej, aby ułatwić tworzenie się nanocząstek.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę przy 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, po upływie tego czasu powinna być widoczna osadka. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Suszyć granulki na powietrzu przez ≈10 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem do przygotowania pokarmu dla komarów.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie dsRNA/siRNA w supernatancie, używając supernatantu z kontroli (patrz 3.5) jako ślepej próby w celu obliczenia całkowitej ilości dsRNA/siRNA, która pozostała w supernatancie. Użyj różnicy między początkowymi ilościami dsRNA/siRNA a ilościami pozostałymi w supernatantach, aby obliczyć procent dsRNA/siRNA uwięzionych w nanocząstkach. Ta wydajność ładowania wynosi zwykle ponad 90%.</li>
	<li>Powtórz tę samą procedurę, jeśli potrzebnych jest więcej nanocząstek. Wysuszone nanocząstki należy natychmiast wykorzystać. Wpływ przechowywania cząstek w chłodni przed użyciem nie został oceniony.</li>
</ol>
4. Przygotowanie pokarmu dla komarów zawierającego chitozan/interferujące nanocząstki RNA
<ol>
	<li>Przygotować 1 ml 2% roztworu agarozy (w/v) w wodzie dejonizowanej, rozpuść agarozę i przed użyciem trzymaj stopiony roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C.</li>
	<li>Wymieszaj płatki pokarmu dla ryb (47% białka surowego, min. tłuszcz surowy 10%, maks. włókno surowe 3%) i suche drożdże w stosunku 2:1 (w/w). Zmiel mieszaninę na małe cząstki za pomocą moździerza i tłuczka (przechodzącego przez standardowe sito testowe nr 50 USA). Zmieloną żywność, która powinna mieć brązowawy kolor, należy natychmiast użyć lub przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
	<li>W probówce o pojemności 1,5 ml wymieszaj wykałaczką 6 mg zmielonego pokarmu z wysuszonymi nanocząstkami z sekcji 3.7.</li>
	<li>Dodać 30 μl 2% wstępnie stopionego roztworu żelu agarozowego do mieszaniny żywności i nanocząstek; natychmiast i dokładnie wymieszać za pomocą wykałaczki lub końcówki do pipetowania.</li>
	<li>Użyj żelu zawierającego pokarm i nanocząsteczki, aby natychmiast nakarmić larwy komarów. Alternatywnie, po całkowitym zestaleniu się żelu w temperaturze pokojowej, należy go przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć następnego dnia lub w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.</li>
</ol>
5. Karmienie larw komarów pokarmem zawierającym chitozan/interferujące nanocząstki RNA
<ol>
	<li>Karmienie larw komarów A. gambiae:
	<ol>
		<li>Usuń pojedynczą granulkę żelu z tubki o pojemności 1,5 ml za pomocą wykałaczki i pokrój ją na 6 równych plasterków za pomocą czystej żyletki lub wykałaczki.</li>
		<li>Przenieść 20 larw trzeciego stadium rozwojowego na 500 ml szalki Petriego zawierającej 100 ml wody dejonizowanej.</li>
		<li>Karm larwy komarów, dodając jeden plasterek granulki żelu (drobno posiekanej na mniejsze kawałki) na szalkę Petriego raz dziennie przez cztery dni. Pamiętaj, aby obserwować larwy żerujące na granulce, które następnego dnia powinny być znacznie zmniejszone lub całkowicie nieobecne. Po pewnym czasie komary rozwiną się w larwy późnego czwartego stadium rozwojowego.</li>
		<li>Zapisz wszelkie widoczne zmiany fenotypowe podczas eksperymentu. Zbadaj poziomy transkryptu i inne zmiany fenotypowe, jak omówiono w sekcji 6, pod koniec czterodniowego okresu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Karmienie larw komarów A. aegypti:
	<ol>
		<li>Pokrój granulkę żelu na 6 równych plasterków za pomocą czystej żyletki lub wykałaczki.</li>
		<li>Umieść 50 zsynchronizowanych z wiekiem 24 godziny po wykluciu się z jaj larw pierwszego stadium rozwojowego na szalce Petriego w ≈40 ml wody dejonizowanej.</li>
		<li>Karm larwy jednym plasterkiem na szalkę Petriego przez 4 godziny dziennie, a następnie przenieś larwy z powrotem do regularnej diety larwalnej składającej się w proporcji 2:1 z mielonych płatków pokarmu dla ryb i suchych drożdży przez resztę dnia. Powtarzaj procedurę codziennie we wszystkich czterech stadiach larwalnych.</li>
		<li>Zbadaj poziomy transkryptu i inne zmiany fenotypowe, jak omówiono w sekcji 6, w pożądanych punktach czasowych rozwoju.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Potwierdzenie nokautowaluacji genu
<ol>
	<li>Względna kwantyfikacja transkryptu metodą qRT-PCR u larw A. aegypti i A. gambiae.
	<ol>
		<li>Wykonaj i przeanalizuj testy qRT-PCR z trzema kontrpróbami biologicznymi na co najmniej 10 zbiorczych larwach kontrolnych i eksperymentalnych, jak opisano11,19,20 lub zgodnie ze standardową procedurą laboratoryjną. Reprezentatywne wyniki znajdują się poniżej.</li>
		<li>W celu analizy określonego typu tkanki/części ciała (tj. mózgu lub anteny), należy wykonać qRT-PCR zgodnie z opisem w 6.1.1 po sekcji w celu odzyskania tkanki będącej przedmiotem zainteresowania (na przykład patrz Mysore i wsp.Rozdział 21).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdzenie knockdown przez hybrydyzację in situ 
	<ol>
		<li>Zsyntetyzuj antysensowne i kontrolne rybosondy znakowane digoksygeniną zgodnie ze standardową praktyką laboratoryjną lub zgodnie z opisem26. </li>
		<li>Wykonaj hybrydyzację in situ zgodnie z Haugen i wsp. 27 Protokół potwierdzenia knockdown, jak opisano wcześniej11,20 i omówiono w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdzenie knockdownu za pomocą immunohistochemii
	<ol>
		<li>Jeśli dostępne są przeciwciała przeciwko produktowi białkowemu docelowego genu, należy przeprowadzić immunohistochemię, jak opisano wcześniej28, co ułatwia identyfikację osób z największymi poziomami knockdownu do analizy fenotypu20, jak pokazano w sekcji reprezentatywnych wyników poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Malaria. , World Health Organization. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/topics/malaria/en">http://www.who.int/topics/malaria/en</a> (2014).</li>
<li>Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a> (2014).</li>
<li>Knipling, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+insects+of+public+health+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Genetic control of insects of public health importance.</a> Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).</li>
<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female-specific+flightless+phenotype+for+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Female-specific flightless phenotype for mosquito control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).</li>
<li>Wise de Valdez, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elimination+of+dengue+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic elimination of dengue vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).</li>
<li>Harris, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+suppression+of+a+field+mosquito+population+by+sustained+release+of+engineered+male+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+dsRNA+for+RNAi+in+insects%3A+an+overview+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+science%22%5BJournal%5D)">Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions.</a> Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limitation+and+possible+solutions+of+RNAi-based+technology+for+insect+pest+control%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+science%22%5BJournal%5D)">limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control.</a> Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).</li>
<li>Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+genes+in+Aedes+aegypti+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).</li>
<li>Clemons, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+gene+targeting+in+Aedes+aegypti+embryos+reveals+that+frazzled+regulates+vector+mosquito+CNS+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development.</a> PLoS One. 6 (1), e16730(2011).</li>
<li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin-1a+is+required+for+Aedes+aegypti+embryonic+nerve+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development.</a> PLoS One. 6 (6), e21694(2011).</li>
<li>Nguyen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+characterization+of+salivary+gland+development+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti.</a> EvoDevo. 4 (1), 9(2013).</li>
<li>Sarro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+commissureless2+function+during+dipteran+insect+nerve+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).</li>
<li>Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+double-stranded+RNA+in+larvae+of+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%3A+implications+for+pest+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control.</a> J Insect Sci. 13, 69(2013).</li>
<li>Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rehydration+driven+RNAi%3A+a+novel+approach+for+effectively+delivering+dsRNA+to+mosquito+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medical+entomology%22%5BJournal%5D)">Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae.</a> Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).</li>
<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+insect+physiology%22%5BJournal%5D)">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li>
<li>Coy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+adult+Aedes+aegypti+mosquitoes+through+oral+delivery+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Entomol%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA.</a> J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%2Fdouble-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+%28Anopheles+gambiae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).</li>
<li>Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Aedes+aegypti+olfactory+system+development+through+chitosan%2FsiRNA+nanoparticle+targeting+of+semaphorin-1a%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+neglected+tropical+diseases%22%5BJournal%5D)">Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a.</a> PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215(2013).</li>
<li>Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%2FsiRNA+nanoparticle+targeting+demonstrates+a+requirement+for+single-minded+during+larval+and+pupal+olfactory+system+development+of+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti.</a> BMC developmental biology. 14 (1), 9(2014).</li>
<li>Dass, C. R., Choong, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan-mediated+orally+delivered+nucleic+acids%3A+a+gutful+of+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+drug+targeting%22%5BJournal%5D)">Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy.</a> Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).</li>
<li>An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+regulatory+unit+that+controls+melanization+and+affects+longevity+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes.</a> Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).</li>
<li>Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClemons%2C+A+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22">Cold Spring Harb Protoc</a>. 2010 (10), (2010).</li>
<li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-RNAi%3A+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).</li>
<li>Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatel%2C+NH+%22A+laboratory+guide+to+RNA%3A+Isolation%2C+Analysis%2C+and+Synthesis%22">A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis</a>. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).</li>
<li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugen%2C+M+%22Whole-mount+in+situ+hybridization+for+analysis+of+gene+expression+during+Aedes+aegypti+development%22">Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development</a>. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).</li>
<li>Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis+of+protein+expression+during+Aedes+aegypti+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).</li>
<li>Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+diel+and+circadian+gene+expression+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+Aedes+aegypti+using+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs.</a> Methods. 69 (1), 38-45 (2014).</li>
<li>Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+bacterially+expressed+VP28dsRNA+to+protect+Penaeus+monodon+from+white+spot+syndrome+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus.</a> Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).</li>
<li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nanoparticle+delivered+dsRNA+toward+genetic+control+of+insect+pests%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests).</a> Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).</li>
<li>Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+with+polyvalent+siRNA-nanoparticle+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).</li>
<li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+RNAi+in+humans+from+systemically+administered+siRNA+via+targeted+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles.</a> Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).</li>
<li>Molinaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine+and+chitosan+carriers+for+the+delivery+of+RNA+interference+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+delivery%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors.</a> Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).</li>
<li>Singha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+in+small-interfering+RNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acid+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Polymers in small-interfering RNA delivery.</a> Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana w niniejszym dokumencie metodologia chitozan/interferujące nanocząstki RNA została wykorzystana do skutecznego celowania w geny podczas rozwoju larwalnego u A. gambiae (ryc. 2, 3) i A. aegypti (ryc. 4, 5, 6, tabele 1, 2). Nanocząstki chitozanu można przygotować z długimi dsRNA lub siRNA, które są z powodzeniem stosowane u komarów, o czym świadczą reprezentatywne wyniki opisane w niniejszym dokumencie. Synteza dsRNA jest tańsza n...

Żywiące się krwią komary wektorowe z rodzajów Anopheline i Aedine przenoszą czynniki chorobotwórcze odpowiedzialne za kilka najgorszych plag ludzkości. Szacuje się, że 3,4 miliarda ludzi jest zagrożonych zachorowaniem na malarię, która jest odpowiedzialna za ponad pół miliona zgonów rocznie na całym świecie. Malaria wynika z zakażenia pasożytami Plasmodiumsp., które są przenoszone na ludzi poprzez ukąszenia zakażonych komarów z rodzaju Anopheles, w tym głównego afrykańskiego wektora Anopheles gambiae (<a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">http://www.who.int/topics/malaria/en/</a>, 2014)1. Aedes aegypti jest głównym wektorem komarów dla wirusa dengi, który powoduje gorączkę denga, niespecyficzną chorobę gorączkową, która jest najbardziej rozpowszechnioną i znaczącą chorobą arbowirusową na świecie. Wirus dengi stanowi obecnie zagrożenie dla >2,5 miliarda ludzi w tropikach, z roczną częstością występowania około 50 milionów przypadków, co skutkuje ~24 000 zgonów rocznie (<a href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a>, 2014)2. Pomimo niszczycielskiego globalnego wpływu chorób przenoszonych przez komary na zdrowie ludzkie, brakuje skutecznych środków zapobiegania i leczenia tych chorób. Zwalczanie komarów jest obecnie najlepszą metodą zapobiegania chorobom.
Potencjał do kontrolowania chorób przenoszonych przez stawonogi poprzez manipulację genetyczną owadów-wektorów jest uznawany od ponad czterech dekad3. Transgeniczne szczepy A. aegypti, zaprojektowane tak, aby miały preparowalny, specyficzny dla samic fenotyp nielota, sprawiły ostatnio, że potencjał stosowania strategii kontroli wektorów transgenicznych stał się rzeczywistością4-6. Postępy te zmusiły naukowców do zidentyfikowania nowych celów genetycznych do kontroli wektorów i dodatkowych sposobów manipulowania funkcją genów u komarów-wektorów. Zmiana ekspresji genów podczas rozwoju, jak to miało miejsce w przypadku samic komarów nielotnych4, może przyczynić się do wyjaśnienia nowych strategii kontroli wektorów. Jednak w dużej mierze ze względu na wyzwania techniczne, funkcje bardzo niewielu genów zostały scharakteryzowane podczas rozwoju A. gambiae, A. aegypti lub innych gatunków komarów.
Od czasu odkrycia u C. elegans7, interferencja RNA (RNAi), która jest zachowana u zwierząt, roślin i mikroorganizmów, jest szeroko stosowana do funkcjonalnych badań genetycznych w wielu różnych organizmach, w tym u owadów8,9. Szlak RNAi jest inicjowany przez Dicer, który rozszczepia długie dsRNA na krótkie siRNA o długości 20-25 nukleotydów, które działają jako specyficzne dla sekwencji interferujące RNA. siRNA wyciszają geny, które są komplementarne w sekwencji, promując obrót transkryptów, rozszczepienie i zakłócenie translacji9. Długie cząsteczki dsRNA (zwykle 300-600 pz) lub niestandardowe siRNA ukierunkowane na określoną sekwencję mogą być używane w laboratorium badawczym do wyciszania dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Zarządzając, kiedy dostarczane jest interferujące RNA, naukowcy mogą kontrolować czas, w którym rozpoczyna się wyciszanie genów. Ta zaleta jest przydatna, ponieważ można ją wykorzystać do przezwyciężenia wyzwań, takich jak śmiertelność rozwojowa lub bezpłodność, które mogą utrudniać produkcję i utrzymanie szczepów zawierających dziedziczne mutacje, co jest kosztownym i pracochłonnym procesem, który nie jest jeszcze dostępny dla wszystkich gatunków owadów. Chociaż stopień wyciszenia genów przez RNAi może się różnić w zależności od genu, tkanki i zwierzęcia, RNAi jest szeroko stosowany do funkcjonalnej analizy genów u komarów i innych owadów8,9.
U komarów zastosowano trzy interferujące strategie dostarczania RNA: mikroiniekcja, moczenie/miejscowe stosowanie i spożycie. Szczegółowa historia i porównanie zastosowania tych trzech technik u owadów znajdują się w Yu i wsp. 8. Z powodzeniem zastosowaliśmy mikroiniekcję10 jako sposób dostarczania siRNA do docelowych genów rozwojowych w zarodkach, larwach i poczwarkach A. aegypti 11-14. Jednak ta pracochłonna strategia dostarczania wymaga zarówno konfiguracji do mikroiniekcji, jak i wprawnej ręki. Co więcej, mikroiniekcja jest stresująca dla organizmu, co jest czynnikiem zakłócającym, szczególnie gdy oceniane są fenotypy behawioralne. Wreszcie, dostarczanie mikroiniekcji nie może być rozszerzone na pole w celu kontroli wektorowej. Alternatywnie, moczenie organizmu w interferującym roztworze RNA stało się również popularnym sposobem wywoływania wyciszania genów, ponieważ jest wygodne i wymaga niewielkiego sprzętu lub pracy. Moczenie było stosowane głównie w badaniach na liniach komórkowych owadów8, ale w niedawnym badaniu nokaut osiągnięto u larw A. aegypti zanurzonych w roztworze dsRNA15, który zwierzęta wydawały się spożywać. Jednak w przypadku badań obejmujących analizę wielu grup eksperymentalnych lub fenotypów, moczenie jest dość kosztowne. Lopez-Martinez i wsp.16 opisało RNAi sterowane rehydratacją, nowatorskie podejście do zakłócającego dostarczania RNA, które polega na odwodnieniu w roztworze soli fizjologicznej i ponownym nawodnieniu pojedynczą kroplą wody zawierającej interferujący RNA. Takie podejście obniża koszty związane z zanurzeniem całego zwierzęcia, ale jest droższe niż mikroiniekcja i może być ograniczone w stosowaniu do gatunków, które tolerują wysokie ciśnienie osmotyczne. Co więcej, trudno jest wyobrazić sobie, w jaki sposób metodologia zanurzenia lub zanurzenia w odwodnieniu/nawodnieniu mogłaby zostać zaadaptowana do kontroli wektorów w terenie. Z tych powodów, w przypadku badań postembrionalnych, dostarczanie interferującego RNA wraz ze spożytym pokarmem jest realną alternatywną strategią.
Chociaż strategie oparte na spożyciu nie działają u wszystkich gatunków owadów, być może przede wszystkim u Drosophila melanogaster, doustne dostarczanie interferującego RNA zmieszanego z jedzeniem przyczyniło się do wyciszenia genów u różnych owadów8,17, w tym u dorosłych A. aegypti 18. Opisaliśmy RNAi za pośrednictwem nanocząstek chitozanu w larwach A. gambiae 19 i z powodzeniem zastosowaliśmy to podejście do redukcji ekspresji genów u larw A. aegypti 20,21. W tym miejscu szczegółowo opisano metodologię tej procedury RNAi, która polega na uwięzieniu interferującego RNA przez polimer chitozan. Nanocząstki chitozanu / interferującego RNA powstają w wyniku samoorganizacji polikacji z interferującym RNA poprzez siły elektrostatyczne między dodatnimi ładunkami grup aminowych w chitozanie a ładunkami ujemnymi przenoszonymi przez grupy fosforanowe na szkielecie interferującego RNA19. Opisana procedura jest kompatybilna zarówno z długimi cząsteczkami dsRNA (zwanymi dalej dsRNA), jak i dwuniciowymi siRNA (zwanymi dalej siRNA). Po syntezie nanocząstki chitozanu/interferującego RNA są mieszane z pokarmem dla larw i dostarczane larwom poprzez spożycie doustne. Metodologia ta jest stosunkowo niedroga, wymaga niewielkiego sprzętu i pracy19 oraz ułatwia wysokoprzepustową analizę wielu fenotypów, w tym analizę zachowań20,21. Ta metodologia, którą można zaadaptować do badań wyciszania genów u innych owadów, w tym innych wektorów chorób i owadzich szkodników rolniczych, może potencjalnie zostać wykorzystana do wyciszania genów u wielu innych gatunków zwierząt. Co więcej, chitozan, niedrogi, nietoksyczny i biodegradowalny polimer22, może być potencjalnie wykorzystany w terenie do zwalczania komarów specyficznych dla danego gatunku.

<table><tbody><tr><td>Pipeta 0,02 ml</td><td>Rainin</td><td>PR20</td><td>do resuspension interferującego RNA</td></tr><tr><td>0,2 ml</td> pipeta <td>Rainin</td><td>PR200</td><td>do reinsorpcji interferującego RNA i przygotowania interferującego RNA/nanocząstek</td></tr><tr><td>Probówka z podziałką 0,5 ml&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-120</td><td>do porcjowania rezawieszonego interferującego RNA</td></tr><tr><td>1 ml pipeta</td><td>Rainin</td><td>PR1000</td><td>do ponownego zawieszenia interferującego RNA i przygotowania interferującego RNA/nanocząstek</td></tr><tr><td>1,5 ml rurka miarowa&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-046</td><td>do przygotowania interferujących RNA/nanocząstek</td></tr><tr><td>1M Octan Sodu, pH 4,5</td><td>TEKnova</td><td>S0299</td><td>do przygotowania buforu octanu sodu</td></tr><tr><td>Kwas octowy, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade</td><td>BDH</td><td>VWR BDH3092-500MLP</td><td>do przygotowania buforu octanu sodu</td></tr><tr><td>Agaroza Genetic Technology Grade</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>800668</td><td>do powlekania przygotowanych interferujących RNA/nanocząstek</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf AG</td><td>5415D</td><td>do osadzania interferujących RNA/nanocząstek</td></tr><tr><td>Chitozan, z muszli krewetek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646-25G</td><td>do łączenia z interferującym RNA w celu przygotowania interferujących RNA/nanocząstek</td></tr><tr><td>Suche drożdże</td><td>Universal Food Corp</td><td>NA</td><td>do przygotowania pokarmu dla larw komarów z interferującym RNA/ nanocząstki</td></tr><tr><td>Narzędzie E-RNAi</td><td>Niemieckie Centrum Badań nad Rakiem</td><td>NA</td><td>do projektowania dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</td></tr> <tr><td>pokarm dla złotych rybek</td><td>Wardley</td><td>Goldfish FLAKE FOOD</td><td>do przygotowania pokarmu dla larw komarów z interferującymi RNA/nanocząstkami</td></tr><tr><td>Podgrzewana kąpiel wodna</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221048</td><td>do podgrzewania interferującego RNA/nanocząstek w temperaturze 55oC</td></tr><tr><td>Lód</td><td>nie dotyczy</td><td>, nie dotyczy</td><td>rozmrażania interferującego RNA i otrzymywania interferujących RNA/nanocząstek</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-591-44</td><td>do przechowywania lodu używanego podczas zabiegu</td></tr><tr><td>sproszkowana wątroba</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>900396</td><td>karmić larwy komarów po interferującej obróbce RNA/nanocząstek</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Różni dostawcy</td><td>nie mają zastosowania</td><td>do przygotowania 2% roztworu agarozy</td></tr><tr><td>Petrydisz (100 x 15 mm)</td><td>Fischer Scientific</td><td>875713</td><td>interferencyjna komora karmienia RNA/nanocząstek dla larw</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Mettler</td><td>Toledo S220</td><td>do przygotowania</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-640</td><td>do podziału interferującego RNA/nanocząsteczki do karmienia</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Thermo Scientific/Dharmacon</td><td>zwyczaj</td><td>do przygotowania siRNA/nanocząstek</td></tr><tr><td>Siarczan sodu, bezwodny (Na2SO4)</td><td>BDH/dystrybuowany przez VWR</td><td>VWR BDH0302-500G</td><td>w celu przygotowania 50 mM roztworu siarczanu sodu, w którym będzie znajdował się interferujący RNA ponownie zawieszony</td></tr><tr><td>termometr</td><td>VWR</td><td>61066-046</td><td>do pomiaru temperatury łaźni wodnej</td></tr><tr><td>Wykałaczki</td><td>VWR</td><td>470146-908</td><td>do mieszania podczas zakłócania RNA/nanocząstek Przygotowywanie żywności i krojenie granulek żelu</td></tr><tr><td>Zamrażarka o ultraniskiej</td> temperaturze <td>Różni dostawcy</td><td>nie mają zastosowania</td><td>do przechowywania interferujących podwielokrotności RNA i interferujących RNA/nanocząstek w temperaturze -80oC</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-216-108</td><td>do przygotowania chitozanu/interferującego RNA</td></tr><tr><td>Papier</td><td>wagowy Fischer Scientific</td><td>NC9798735</td><td>do podziału interferującego RNA/nanocząstek do karmienia</td></tr></tbody></table>

wyciszanie genów za pośrednictwem chitozanu/interferujących nanocząstek rna w larwach komarów wektorów chorób

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Wektorowe komary zadają więcej ludzkiego cierpienia niż jakikolwiek inny organizm - i zabijają ponad milion ludzi rocznie. Projekty dotyczące genomu komarów ułatwiły badania nad nowymi aspektami biologii komarów, w tym funkcjonalne badania genetyczne nad głównym wektorem malarii afrykańskiej Anopheles gambiae oraz wektorem dengi i żółtej febry Aedes aegypti. Wyciszanie genów za pośrednictwem interferencji RNA (RNAi-) zostało wykorzystane do celowania w geny będące przedmiotem zainteresowania u obu tych gatunków komarów wektorów chorób. W tym miejscu opisujemy procedurę przygotowania nanocząstek chitozanu/interferującego RNA, które są łączone z pokarmem i spożywane przez larwy. Ta technicznie prosta, wysokoprzepustowa i stosunkowo niedroga metodologia, która jest kompatybilna z długimi cząsteczkami dwuniciowego RNA (dsRNA) lub małymi interferującymi cząsteczkami RNA (siRNA), została wykorzystana do skutecznego knockknocku wielu różnych genów u larw A. gambiae i A. aegypti. Po karmieniu larw knockdown, który jest weryfikowany za pomocą qRT-PCR lub hybrydyzacji in situ, może utrzymywać się co najmniej do późnego stadium poczwarki. Metodyka ta może mieć zastosowanie do wielu różnych gatunków komarów i innych owadów, w tym agrofagów rolniczych, a także innych organizmów niebędących organizmami modelowymi. Oprócz jego użyteczności w laboratorium badawczym, w przyszłości chitozan, niedrogi, nietoksyczny i biodegradowalny polimer, może być potencjalnie wykorzystywany w terenie.

A. gambiae: 
Nanocząstki chitozan/dsRNA powstają w wyniku oddziaływań elektrostatycznych między grupami aminowymi chitozanu a grupami fosforanowymi dsRNA. Efektywność wbudowywania dsRNA w nanocząstki zazwyczaj przekracza 90%, co mierzono na podstawie ubytku dsRNA z roztworu. Obrazy z mikroskopii sił atomowych wykazują, że średnica cząstek chitozan-dsRNA wynosi średnio 140 nm, w zakresie od 100-200 nm (Rysunek 1).
<p class="jove_content" fo:keep-to...

Tutaj opisujemy procedurę hamowania funkcji genów u komarów wektorów chorób za pomocą chitozanu/interferujących nanocząsteczek RNA, które są połykane przez larwy.

Wyciszanie genów za pośrednictwem chitozanu/interferujących nanocząstek RNA w larwach komarów wektorów chorób

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprojektowanie i wykorzystanie nanocząsteczek RNA interferującego z tussyną do badań nad wyciszaniem genów u larw komarów. Cel ten realizowany jest poprzez przygotowanie nanocząsteczek RNA interferującego z tussyną poprzez połączenie chityny i RNA interferującego, a następnie poddanie ich ogrzewaniu, wirowaniu w wirówce wortexowej i centryfugowaniu. Kolejnym celem jest wymieszanie nanocząsteczek z pokarmem dla larw oraz agarem w celu przygotowania żelowych peletów zawierających pokarm i nanocząsteczki.Pokarm z nanocząsteczkami jest podawany larwom komarów, a następnie obserwuje się larwy żywiące się tym granulatem, co kończy się weryfikacją wyciszenia genów za pomocą ilościowej reakcji polimerazy w łańcuchu w czasie rzeczywistym lub w wariancie C za pomocą testów hybrydyzacji. Można wówczas zbadać fenotypy utraty funkcji.Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad komarami jako wektorami. Przykładowo, wykorzystaliśmy ją do badania funkcji genów podczas rozwoju układu węchowego, jelita środkowego w mózgu oraz innych tkanek istotnych z punktu widzenia wektorów. Głównymi zaletami tej techniki są wysoka przepustowość, stosunkowo niskie koszty oraz mniejszy stres dla organizmu w porównaniu do dostarczania interferującego RNA poprzez mikroiniekcję, która wymaga większych umiejętności i nie może być zastosowana w warunkach terenowych.Wraz ze stypendystką podoktorską Avą Maur, technik Ping Lee zaprezentuje procedurę. Aby rozpocząć, należy rozpuścić tussyn w 0,1 M buforze octanu sodu, aby przygotować 0,02% roztwór roboczy. Przed użyciem roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Następnie rozpuścić dwuniciowy RNA lub mały interferujący RNA, które w dalszej części tekstu określane są jako interferujący RNA, w 50 µl wody dejonizowanej.Przygotuj 100 µL roztworu zawierającego 32 µg kwasu nukleinowego w 100 µL 50 mM siarczanu sodu. Następnie dodaj 100 µL roztworu tussyny do roztworu interferującego RNA. Podgrzewaj mieszaninę w łaźni wodnej w temperaturze 55 °C przez jedną minutę.Przygotuj kontrolę, dodając 100 µL 50 mM siarczanu sodu do 100 µL roztworu Tustina, a następnie przeprowadź tę samą procedurę po podgrzaniu. Natychmiast wymieszaj roztwory przez 30 sekund, wirując w miksodze z wysoką prędkością w temperaturze pokojowej, aby ułatwić tworzenie nanocząstek. Odwiruj mieszaninę przy 13 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, po czym powinien stać się widoczny osad. Przenieś nadsącz do nowej probówki o pojemności 1,5 mL i pozostaw osad do wysuszenia na powietrzu przez około 10 minut w temperaturze pokojowej przed jego użyciem.Aby przygotować pokarm dla komarów z wykorzystaniem spektrofotometrii UV, zmierz stężenie interferującego RNA w SNAT, używając supernatantu S z kontroli jako próbki ślepej, aby obliczyć całkowitą ilość interferującego RNA pozostałego w snat. Wykorzystaj różnicę między początkową ilością interferującego RNA a ilościami pozostałymi w supernatantach, aby obliczyć procent interferującego RNA uwięzionego w nanocząsteczkach. Wydajność załadunku ta zazwyczaj przekracza 90%. Powtórz tę procedurę, jeśli potrzebna jest większa ilość nanocząsteczek.Osuszone nanocząsteczki należy wykorzystać niezwłocznie, ponieważ wpływ przechowywania cząsteczek w niskiej temperaturze przed użyciem nie został oceniony. Aby przygotować pożywkę dla komarów, należy najpierw sporządzić 2% roztwór agro w wodzie dejonizowanej i rozpuścić agro. Roztopiony roztwór agro należy przechowywać w kąpieli wodnej o temperaturze 55 °C przed użyciem.Następnie wymieszaj płatki pokarmu dla ryb i suche drożdże w stosunku jeden do dwóch. Rozetrzyj mieszaninę w moździerzu do uzyskania małych cząsteczek. Rozdrobniony pokarm ma brązowawy kolor.W probówce o pojemności 1,5 ml wymieszać 6 mg zmielonego pokarmu z suchymi nanocząsteczkami za pomocą wykałaczki. Następnie do mieszaniny pokarmu i nanocząsteczek dodać 30 µL 2% roztworu żelu agros uprzednio roztopionego. Natychmiast i dokładnie wymieszać za pomocą wykałaczki lub końcówki pipety.Żel zawierający pokarm i nanocząsteczki jest teraz gotowy do podania larwom komara Anopheles gambiae. Wyjmij pojedynczą kuleczkę żelu z probówki 1,5 ml za pomocą wykałaczki i podziel ją na cztery równe części, używając czystego ostrza żyletki lub wykałaczki. Następnie przenieś larwy trzeciego stadium do szalki Petriego zawierającej 100 ml wody dejonizowanej.Karm larwy komarów, dodając jeden plasterek pelletu żelowego. Ostatecznie posiekaj go na małe kawałki do każdej szalki Petriego. Raz dziennie przez cztery dni obserwuj larwy żerujące na pelletcie, którego rozmiar powinien ulec znacznemu zmniejszeniu lub który powinien całkowicie zniknąć do następnego dnia.Komary rozwiną się do późnego czwartego stadium larwalnego. Należy zapisywać wszelkie widoczne zmiany fenotypowe podczas eksperymentu. Po zakończeniu czterodniowego okresu karmienia larw komarów GTI 80 należy zbadać poziomy transkrypcji oraz inne zmiany fenotypowe, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przeciąć pellet żelu na cztery równe części, używając czystego ostrza żyletki lub wykałaczki, jak poprzednio. Następnie umieścić 50 h zsynchronizowanych larw w stadium pierwszego gwiazdy, 24 godziny po wykluciu z jaj, w szalce Petriego.W około 40 mililitrach wodyy dejonizowanej. Karmić larwy jednym plastrem na jedną szalkę Petriego przez cztery godziny dziennie. Plastry powinny być ponownie drobno posiekane na mniejsze kawałki.Następnie przenieś larwy z powrotem na standardową dietę larwalną składającą się z płatków karmy dla ryb i suchych drożdży w stosunku dwa do jednego przez resztę dnia. Powtarzaj tę procedurę codziennie przez cztery stadia larwalne. Zbadaj poziomy transkrypcji oraz inne zmiany fenotypowe, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, w wybranym czasie rozwoju.Przedstawione punkty wskazują na larwy czwartego stadium An. gambiae karmione kontrolnie, które wyglądają normalnie, zgodnie z oczekiwaniami. Jednakże macierz peritroficzna jest uszkodzona u larw karmionych RNA interferencyjnym przeciwko chitynie, celującym w syntazę chityny 1, co potwierdza obecność błękitu dekstrynowego, który przeniknął do jam gastrycznych. Obserwowana jest prawidłowa ekspresja Orco, obligatoryjnego koreceptora zapachowego, w czułkach larw czwartego stadium Ae. aegypti karmionych kontrolnie.W przeciwieństwie do zwierząt z grupy kontrolnej, u osobników karmionych RNA interferencyjnym celującym w gen single-minded stwierdzono brak ekspresji Orco. Zwierzęta z wyciszonym genem single-minded wykazują zaburzenia w zachowaniu śledzenia zapachów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać nanocząsteczki RNA interferencyjnego do wyciszania genów podczas rozwoju komarów z rodzaju Aedes.Technika ta, która potencjalnie może zostać rozszerzona na badania nad dorosłymi komarami lub innymi nowymi organizmami modelowymi, utorowała badaczom drogę do zgłębiania funkcji genów zidentyfikowanych w projektach genomu komarów będących wektorami chorób.

chitosaninterfering-rna-nanoparticle-mediated-gene-silencing-disease

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wyciszenie genów pośredniczone przez nanocząstki chitozanu/RNA interferencyjnego w larwach komarów będących wektorami chorób

Metody genetyki odwrotnej okazały się niezwykle użyteczne w określaniu, które geny odpowiadają za odporność komarów na patogeny przenoszone przez wektory. Niniejszy protokół wideo przedstawia metodę stosowaną w laboratorium Dimopoulosa do wstrzykiwania dsRNA komarom Anopheles gambiae, będącym nosicielami pasożyta malarii. Przedstawiono technikę przygotowania zestawu do iniekcji oraz proces wstrzykiwania dsRNA do klatki piersiowej owada.

Protokół analiz RNAi u dorosłych komarów (A. gambiae)

W niniejszym protokole łączymy wyciszanie genów za pomocą RNAi z testem diurezy in vivo, aby zbadać wpływ wyciszenia wybranych genów na wydalanie płynów przez komary.

Wyciszenie genów za pomocą RNAi oraz test diurezy in vivo u dorosłych samic komarów Aedes aegypti

Interferencja RNA (RNAi) jest niezwykle cennym narzędziem do odkrywania funkcji genów. Jednak zdolność do celowania w geny za pomocą RNAi w stadiach przeddorosłych jest ograniczona w przypadku głównego wektora malarii u ludzi Anopheles gambiae. Opisujemy protokół RNAi w celu zmniejszenia funkcji genu poprzez bezpośrednią iniekcję podczas rozwoju poczwarki.

Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

Informujemy o użyciu sztucznej strategii ekspresji małego RNA w celu opracowania niewadliwego systemu dostarczania rekombinowanego densowirusa Aedes aegypti (AaeDV) in vivo. Opisano szczegółową procedurę budowy, pakowania i analizy ilościowej wektorów rAaeDV, a także infekcji larwalnej.

Zastosowanie rekombinowanego densowirusa komarów jako wektora dostarczania genów do analizy funkcjonalnej genów w larwach komarów

Ten manuskrypt demonstruje wyczerpanie ekspresji genów w jelicie środkowym karalucha niemieckiego poprzez doustne spożycie dwuniciowego RNA zamkniętego w liposomach.

Praktyczne zastosowanie interferencji RNA: doustne dostarczanie dwuniciowego RNA w nośnikach liposomów dla karaluchów

Ten artykuł demonstruje nowe techniki opracowane do doustnego dostarczania dwuniciowego RNA (dsRNA) przez tkanki naczyniowe roślin w celu interferencji RNA (RNAi) u owadów żywiących się sokiem łyka.

Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym

Ten protokół opisuje metodologię mikroiniekcji, którą ustandaryzowaliśmy i stosowaliśmy przez kilka lat, aby dostarczyć określone ilości kwasów nukleinowych bezpośrednio do hemolimfy komarów i much domowych. Protokół ten skutkuje minimalną śmiertelnością po wstrzyknięciach i umożliwia pomiary płodności skorelowane z dawką.

Powtarzalny test biologiczny mikroiniekcji dsRNA i składania jaj u komarów i much domowych

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Prezentowany tutaj jest protokół dostarczania nanocząsteczek chitozan/dsRNA larwom jedwabników Bombyx mori w celu wywołania wyciszenia genów poprzez spożycie.

Interferencja RNA larw w jedwabniku Bombyx mori poprzez dostarczanie nanocząstek chitozanu/dsRNA

Opis metody wyciszania genów indukowanego wirusem (VIGS) w celu obniżenia ekspresji genów u Nicotiana benthamiana oraz pomidora.

Wyciszanie genów indukowane wirusem (VIGS) u Nicotiana benthamiana i pomidora

Poznaj metodę wyciszania genów w larwach komarów wektorów chorób za pomocą nanocząstek chitozanu/interferującego RNA. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów w układzie węchowym i innych tkankach.

Wyciszanie genów za pośrednictwem chitozanu/interferujących nanocząstek RNA w larwach komarów wektorów chorób

Przeglądaj więcej filmów