Name: Izolacja pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych jelita grubego z tkanek chirurgicznych i hodowla ich bezpośrednio na miękkich, elastycznych podłożach do cytometrii trakcyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Naucz się izolować pierwotne ludzkie komórki nowotworowe jelita grubego z tkanek chirurgicznych i hodować je na miękkich, elastycznych podłożach do analizy cytometrii trakcyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany przez National Science Foundation ECCS grant 10-02165, oraz Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y.A. został sfinansowany na UIUC przez NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer 'Midwest Cancer Nanotechnology Training Center' Grant R25 CA154015A. Immnunostaining i obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej przeprowadzono w Instytucie Biologii Genomowej (IGB), UIUC. M.Y.A. potwierdza rozmowy z B. J. Williamsem z UIUC na temat eksperymentów izolacyjnych. M.Y.A. dziękuje C. Nemehowi i Abdulowi Bhuiya z UIUC za pomoc w przygotowaniu schematów i listy materiałów.

Opisany poniżej protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach UIUC.
1. Pobieranie i trawienie próbki tkanki chirurgicznej
<ol>
	<li>Pobrać próbkę tkanki nowotworowej zaraz po resekcji jelita grubego (ryc. 1A i 1B). Zbierz również tkankę z sąsiedniego zdrowego miejsca.</li>
	<li>Natychmiast przenieść tkankę do fiolki o pojemności 15 ml zawierającej 12 ml roztworu HBSS. Przechowywać fiolkę na lodzie w izolowanym pudełku piankowym.</li>
	<li>W ciągu 45 minut należy przetransportować fiolkę zawierającą tkankę do kaptura do hodowli tkankowej w celu dalszego przetwarzania. Fiolkę należy przechowywać na bloku lodu wewnątrz kaptura.</li>
	<li>Wlać dostarczoną chusteczkę do 6-dołkowej płytki zawierającej 6-7 ml roztworu HBSS za pomocą pipety. 
	Uwaga: Ilość tkanki w studzience nie jest krytyczna na tym etapie płukania.</li>
	<li>Trzymaj płytkę z 6 dołkami na bloku lodu. Opłucz tkankę w roztworze HBSS dwukrotnie.</li>
	<li>Pokrój tkankę czysto na oddzielone sekcje sterylnymi nożyczkami. Zmiel tkankę na mniejsze odcinki nie większe niż 1-2 mm3 cala za pomocą sterylnego ostrza skalpela.</li>
	<li>Zważyć oznakowaną fiolkę z 0,1% trypsyną (zawierającą 1 ml 0,1% roztworu trypsyny) przed przeniesieniem tkanki. Przenieś tkankę ~ 20 mg do każdej z fiolek z 0,1% trypsyną za pomocą pipety.</li>
	<li>Staraj się zminimalizować przenoszenie HBSS do fiolki z trypsyną, aby uniknąć dalszego rozcieńczania trypsyny.</li>
	<li>Zważyć fiolki z trypsyną po przeniesieniu tkanki; udokumentować różnicę jako masę tkanki.</li>
	<li>Wlej ~ 20 mg tkanki i 1 ml trypsyny do każdego dołka 24-dołkowej płytki.</li>
	<li>Umieść 24-dołkową płytkę na shakerze w lodówce w temperaturze 4 °C na 16-20 godzin. W tym okresie oczekiwania lub wcześniej należy przygotować podłoża w żelu poliakrylamidowym i funkcjonalizować je białkami ECM, jak opisano w punkcie 3.</li>
</ol>
2. Enzymatyczna dysocjacja próbki tkanki na zawiesinę pojedynczej komórki i hodowla izolowanych komórek na funkcjonalnych elastycznych podłożach ECM i sztywnych naczyniach polistyrenowych
<ol>
	<li>Po 16-20 godzinach inkubacji w studzience trypsyny w temperaturze 4 °C na wytrząsarce, przenieść tkankę z trypsyny o temperaturze 4 °C do fiolki z kompletną pożywką wzrostową o temperaturze 4 °C (zawierającej 2-3 ml kompletnej pożywki wzrostowej) za pomocą pipety. Zapewnić minimalny transfer trypsyny do pożywki wzrostowej. 
	Uwaga: Kompletny preparat pożywki wzrostowej jest następujący: pożywka bazowa RPMI 1640 uzupełniona surowicą końską do końcowego stężenia 10% i penicyliną-streptomycyną do 1% całkowitego roztworu.</li>
	<li>Umieścić fiolkę z tkanką zawierającą pożywkę w ciepłej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 12-15 minut.</li>
	<li>Przenieść tkankę do 15 ml fiolki zawierającej roztwór HBSS za pomocą pipety, delikatnie wstrząsnąć.</li>
	<li>Powtórz czynności 2.3.</li>
	<li>Usunąć tkankę z roztworu HBSS i przenieść do 0,1% roztworu kolagenazy (w HBSS) fiolki zawierającej 1 ml roztworu. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C i 5% środowisku CO2 w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych. W okresie oczekiwania należy rozgrzać pożywkę wzrostową w fiolce o pojemności 15 ml w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Wyciągnij wszystkie fragmenty tkanek do pipety, minimalizując przenoszenie kolagenazy. Wyrzuć tylko fragmenty tkanek do wstępnie podgrzanych fiolek z pożywką hodowlaną.</li>
	<li>Umieść filtr studzienkowy o wielkości 40 μm w każdym dołku płytki 6-dołkowej. Zwilżyć filtr 1 ml pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Rozcierać tkankę w pożywce za pomocą szklanej pipety o pojemności 10 ml kilka razy, aż do całkowitego rozdzielenia tkanki.</li>
	<li>Końcówkę pipety należy trzymać jak najbliżej dna fiolki.</li>
	<li>Umieść roztwór na filtrze, aby usunąć zanieczyszczenia i niezdysocjowane części.</li>
	<li>Odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórek w pożywce o sile 150 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Następnie usunąć sklarowany osad i ponownie zawiesić osad komórkowy z 2 ml świeżej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru (jeśli jest to wymagane). Wysiewaj izolowane komórki pierwotne na żelach funkcjonalizowanych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) i naczyniach polistyrenowych o pożądanym stężeniu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie i funkcjonalizacja żeli poliakrylamidowych (PA) o różnej sztywności i podłoży polistyrenowych
Uwaga: W celu wizualnej demonstracji Sekcji 3, widzowie/czytelnicy są odsyłani do niedawnego artykułu17 Journal of Visualized Experiments (JoVE).
<ol>
	<li>Przyjmując opublikowane protokoły18, 19, aktywuj chemicznie szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm2, aby zapewnić kowalencyjne wiązanie hydrożelu.
	<ol>
		<li>Najpierw należy traktować szkiełka nakrywkowe 3-aminopropylotrymetoksysilanem (ATS) przez 7 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Całkowicie usunąć ATS za pomocą wody DI, spłukać i potraktować szkiełka nakrywkowe 0,5% roztworem aldehydu glutarowego (rozcieńczonego w PBS z 70% roztworu podstawowego aldehydu glutarowego) przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otrzymać roztwory żelu o natężeniu 2 kPa, mieszając 5% m/v roztworu akrylamidu i 0,05% roztworu N,N'-metylenobisakryloamidu (bis) w 10 mM soli fizjologicznejbuforowanej przez HEPES 20. Użyj 8% w/v akrylamidu i 0,13% roztworu N,N'-metylenobisakryloamidu (bis) w 10 mM soli fizjologicznej buforowanej HEPES dla żelu10 kPa 20.
	<ol>
		<li>W obu przypadkach należy użyć nadsiarczanu amonu w stosunku 1:200 (10% w/v) i 1:2,000 N,N,N',N'--tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) jako inicjatora i katalizatora procesu polimeryzacji, odpowiednio.</li>
		<li>Dodać również 100 μl kulek fluorescencyjnych do roztworu żelu o natężeniu 2 kPa jako markery powiernicze 21, 22.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść kroplę 20 μl prepolimerowego roztworu żelu PA na szkiełku nakrywkowym aktywowanym o średnicy 12mm2. Umieść na kropli kolejne 12 mm2 zwykłe szklane szkiełko nakrywkowe. Upewnij się, że kropla rozprzestrzenia się między szkiełkami nakrywkowymi ze względu na kapilarność. Odwróć kanapkę dla żeli o natężeniu 2 kPa, aby upewnić się, że większość kulek znajdzie się w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej.</li>
	<li>Utwardzaj żel PA przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zdejmij górne szkiełko nakrywkowe za pomocą maszynki do golenia z jedną krawędzią. 
	Uwaga: Podczas obierania odklejanie postępuje od jednej krawędzi kanapki. Żel pozostaje przylegający do aktywowanego szkiełka podstawowego.</li>
	<li>Przed użyciem należy przechowywać żele w roztworze PBS.</li>
	<li>Funkcjonalizować żele PA i szkło cząsteczkami ECM, ludzką fibronektyną w stężeniu 50 μg/ml zgodnie z opublikowanymi metodami 23.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, inkubować podłoża z 2 ml czystego hydratu hydratyny O/N.</li>
		<li>Usuń hydrat hydrazyny i dokładnie spłucz podłoża wodą demineralizowaną.</li>
		<li>Podłoża myć 5% kwasem octowym przez 30 min.</li>
		<li>Usuń kwas octowy i dokładnie spłucz podłoża wodą demineralizowaną.</li>
		<li>Podłoża należy przechowywać zanurzone w wodzie DI przez 30 minut.</li>
		<li>Inkubować substraty z utlenioną fibronektyną przez 35 minut w stężeniu 50 μg/ml.</li>
		<li>Płukać podłoża PBS na wytrząsarce przy niskich obrotach przez 10 minut.</li>
		<li>Inkubować wszystkie substraty w temperaturze 37 °C w 2-3 ml pożywki hodowlanej przez 30 minut przed posiewem komórek. 
		Uwaga: Komórki płytkowe w sposób słabo zaludniony (1,000-3,000 komórek/cm2). Każde szkiełko pokryte żelem musi być umieszczone na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Pozwól komórkom całkowicie przylegać przed jakąkolwiek mikroskopią (co najmniej O/N).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Testy mikroskopii sił trakcyjnych i immunofluorescencyjnej
<ol>
	<li>Test mikroskopii sił trakcyjnych
	<ol>
		<li>Ogrzej 0,25% roztwór trypsyny-EDTA / 10% SDS w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentów trakcyjnych.</li>
		<li>Usuwać po jednym żelu z inkubatora do hodowli komórkowych na raz i umieszczać na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego (powiększenie 32x).</li>
		<li>Znajdź pojedynczą komórkę w polu widzenia. Zdejmij pokrywkę szalki Petriego.</li>
		<li>Wykonaj obraz komórki z kontrastem fazowym (np. Rysunek 3).</li>
		<li>Przełącz tryb obrazowania na fluorescencyjny i wybierz odpowiedni filtr. W tym czasie nie przesuwaj stolika mikroskopu ani próbki.</li>
		<li>Zrób zdjęcie kulek fluorescencyjnych przemieszczonych przez trakcję komórkową (Rysunek 4C).</li>
		<li>Dodać 1 ml roztworu trypsyny/SDS na szalkę Petriego, aby odłączyć komórkę od żelu. W tym czasie nie przesuwaj stolika mikroskopu ani próbki. Wykonaj również obraz kontrolny komórki, aby zapewnić całkowite usunięcie z żelu.</li>
		<li>Wykonaj obraz referencyjny (siła zerowa) koralików po usunięciu komórki.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 4.1.2-4.1.8 dla wszystkich pozostałych żeli.</li>
		<li>Utwórz stos obrazów za pomocą ImageJ z dwóch obrazów uzyskanych w krokach 4.1.6 i 4.1.8 dla każdego przypadku. Aby wygenerować stos obrazów, użyj następującej sekwencji poleceń w ImageJ po otwarciu obrazów: Image → Stacks → Images to stack.</li>
		<li>Aby uzyskać pole przemieszczenia i przyczepność, użyj wtyczek ImageJ zgodnie z opublikowanymi metodami 21, 22. Uzyskaj kody i szczegółowe samouczki dla tych wtyczek, korzystając z poniższego linku: <a href="https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins">https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins</a>.
		<ol>
			<li>Wyrównaj obrazy w stosie za pomocą wtyczki "Template Matching". Użyj następującej sekwencji poleceń w ImageJ po otwarciu stosu obrazów wygenerowanego w kroku 4.1.10: Wtyczki → Template Matching → Align Slices in Stack → OK. W konsekwencji zapisz stos obrazów. Użyj tego nowego stosu obrazów w poniższych krokach.</li>
			<li>Uzyskaj pole przemieszczenia za pomocą wtyczki PIV (prędkość obrazu cząstek) (rysunek 4D). Użyj następującej sekwencji poleceń po otwarciu stosu obrazów zapisanego w kroku 4.1.11.1: Wtyczki → PIV → Iteracyjny PIV (podstawowy) → OK → Zaakceptuj ten PIV i wyprowadź → Ok. Zapisz dane wyjściowe PIV w tym samym katalogu, co w oryginalnym stosie obrazów. Użyj tego jako danych wejściowych w następnym kroku.</li>
			<li>Na koniec użyj wtyczki FTTC (cytometria trakcyjna z transformacją Fouriera), aby uzyskać mapę trakcji (rysunek 4E). Użyj następującej sekwencji poleceń: Wtyczki → FTTC → Wstaw właściwości materiału, tj. moduł Younga i stosunek Poissona żelu PA → OK → Wybierz plik wyjściowy PIV zapisany w kroku 4.1.11.2 → OK. Zapisz wyniki FTTC w tym samym katalogu, co w stosie obrazów i danych wyjściowych PIV.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testy mikroskopii immunofluorescencyjnej
	<ol>
		<li>Przenieś substraty, które mają być wybarwione immunologicznie, do okapu laminarnego i usuń pożywkę hodowlaną.</li>
		<li>Przepłukać podłoża PBS i utrwalić komórki 4% paraformaldehydem w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj podłoża PBS 3 razy (za każdym razem 5 minut). W związku z tym inkubować podłoża z 500 μl wzmacniacza sygnału przez 30 minut i płukać PBS.</li>
		<li>Inkubować komórki z przeciwciałem monoklonalnym anty-winkuliną w rozcieńczeniu 1:250 w PBS przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć podłoża PBS 3 razy (za każdym razem 5 minut).</li>
		<li>Inkubować próbki z przeciwciałem drugorzędowym Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG w rozcieńczeniu 1:200 w PBS w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przemywać podłoża PBS 3 razy (za każdym razem 5 minut).</li>
		<li>Aby uwidocznić strukturę F-aktyny, inkubuj komórki z koniugatami falloidyny TRITC w stężeniu 50 μg/ml przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj podłoża PBS 3 razy (za każdym razem 5 minut).</li>
		<li>Zobrazuj próbki za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (rysunek 5A-5D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+cancer+be+reversed+by+engineering+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).</li>
<li>Kumar, S., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics%2C+malignancy%2C+metastasis%3A+the+force+journey+of+a+tumor+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil.+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+%EF%AC%82exibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate ﬂexibility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).</li>
<li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+adaptation+and+stiffness+matching+to+soft+elastic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates.</a> Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).</li>
<li>Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+flexibility+regulates+growth+and+apoptosis+of+normal+but+not+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+force+affects+expression+of+an+in+vitro+metastasis-like+phenotype+in+HCT-8+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells.</a> Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).</li>
<li>Ali, M. Y., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+Stiffness+Mediated+Metastasis+Like+Phenotype+of+Colon+Cancer+Cells+is+Independent+of+Cell+to+Gel+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion.</a> Cell. Mol. Bioeng. , (2014).</li>
<li>Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+cellular+phenotype+by+soft+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels.</a> Soft Matter. , (2014).</li>
<li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572(2012).</li>
<li>Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+correlation+of+mechanical+forces+and+metastatic+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity.</a> Phys. Biol. 8 (1), (2011).</li>
<li>Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+profiling+of+primary+versus+immortalized+human+RPE+cells+identifies+expression+patterns+associated+with+cytoskeletal+remodeling+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival.</a> J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).</li>
<li>Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+established+tumourigenic+primary+human+colon+cancer+cell+lines+are+sensitive+to+TRAIL-induced+apoptosis+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo.</a> Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).</li>
<li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (91), (2014).</li>
<li>Wang, Y. L., Pelham, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+flexible%2C+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li>
<li>Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+micro-patterning+proteins+and+cells+on+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels.</a> Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+hydrogel+substrates+with+tunable+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).</li>
<li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell%E2%80%93cell+junction+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li>
<li>Chopra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+integrin-mediated+mechanotransduction+by+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).</li>
<li>Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamide+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
<li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12905(2010).</li>
<li>Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+rigidity+of+the+extracellular+matrix+regulates+the+structure%2C+motility%2C+and+proliferation+of+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells.</a> Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).</li>
<li>Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-propelled+biohybrid+swimmer+at+low+Reynolds+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Stres trakcyjny komórkowy pojawił się ostatnio jako potencjalny biofizyczny wskaźnik stanu przerzutowego13. Jednak do tej pory w literaturze nie ma eksperymentalnych danych trakcyjnych z pierwotnymi komórkami nowotworowymi. Nie zgłoszono również jeszcze bezpośredniego hodowania izolowanych pierwotnych komórek jelita grubego na żelach poliakrylamidowych o różnej sztywności. W związku z tym ustalamy zoptymalizowane warunki hodowli pierwotnych komórek okrężnicy na żelach i polistyrenie (ryc. 2). ...

W ostatnich latach stało się coraz bardziej oczywiste, że mikrośrodowisko mechaniczne, oprócz czynników biochemicznych, odgrywa ważną rolę w regulacji funkcjonalności komórek. Komórki mogą wyczuwać i reagować na sztywność podłoża, do którego są przylegają (jak w hodowli 2D) lub są otoczone (jak w hodowli 3D) 3-7. W ten sposób komórki mogą modulować swoje różnicowanie3, morfologię4, migrację/ruchliwość5, właściwości biofizyczne6, wzrost7 i inne procesy.
Komórki nowotworowe również reagują na sztywność matrycy 2D i 3D za pomocą skoordynowanej, hierarchicznej mechanochemicznej kombinacji receptorów adhezyjnych i związanych z nimi białek błonowych transdukcji sygnału, architektury cytoszkieletu i silników molekularnych1, 2. Na przykład komórki nabłonka sutka (MEC) tworzą normalną miąższ groniasty, gdy są hodowane na substratach 150 Pa, co jest podobne do sztywności zdrowej tkanki sutka. Co ciekawe, wykazują one cechy rozwijającego się guza, zarówno strukturalne, jak i transkrypcyjne, gdy są hodowane na sztywniejszych podłożach (> 5000 Pa), które naśladują sztywność zrębu guza8. Ponadto inny eksperyment pokazuje, że nowotworowi piersi towarzyszy sieciowanie kolagenu i usztywnienie ECM9. Ostatnie eksperymenty pokazują, że ludzkie komórki raka jelita grubego (HCT-8) wykazują przerzuty, takie jak fenotyp (MLP), gdy są hodowane na substratach 2D o fizjologicznie istotnej sztywności (20-47 kPa), ale nie na bardzo sztywnych (3,6 GPa) substratach10-12. Komórki te najpierw tworzą skupiska komórek przypominające nowotwór, a następnie dysocjują od siebie, zaczynając od peryferii. Gdy zachodzi ta zmiana morfologiczna nabłonkowa do zaokrąglonej (przejście E do R), proliferują się, zmniejszają adhezję komórka-komórka i komórka-ECM i stają się migrujące. Komórki HCT-8 hodowane na bardzo twardych podłożach polistyrenowych nie wykazują tych złośliwych cech. W związku z tym wysunięto hipotezę, że komórki HCT-8 stają się przerzutowe pod wpływem odpowiedniego mikrośrodowiska. Warto zauważyć, że eksperymenty te są przeprowadzane na unieśmiertelnionych liniach komórek rakowych lub komórkach pierwotnych pochodzących z myszy, a nie na pierwotnych ludzkich komórkach rakowych.
Niedawne badanie sugeruje, że zwiększony stres trakcyjny komórkowy może być wykorzystany jako potencjalna biofizyczna sygnatura dla komórek przerzutowych13. Badanie polega na pomiarze siły pociągowej dla różnych linii komórek nowotworowych u ludzi na żelach poliakrylamidowych. Stwierdzono, że przerzutowe komórki rakowe mogą wywierać znacznie większy stres trakcyjny w porównaniu z komórkami bez przerzutów we wszystkich przypadkach13. Jednak wyniki te są bezpośrednio sprzeczne z wcześniej opublikowanymi odkryciami dotyczącymi linii komórkowych raka piersi pochodzących z myszy14. Ponadto niedawne badanie podkreśla niezwykłe różnice między unieśmiertelnionymi i pierwotnymi komórkami ludzkimi w ich profilowaniu białek przebudowy cytoszkieletu i ekspresji białek przetrwania komórek15. Dlatego ważne jest, aby ponownie przyjrzeć się wielu testom biofizycznym, w tym trakcji dla pierwotnych ludzkich komórek rakowych. To odpowie na pytanie, czy komórki pierwotne podsumowują unieśmiertelniony trend trakcji linii komórek rakowych.
Opisany tutaj protokół jest zoptymalizowany do izolacji pierwotnych komórek ludzkiego jelita grubego (zarówno zdrowych, jak i nowotworowych) oraz do hodowli ich na miękkich podłożach (hydrożele poliakrylamidowe), jak również na szalkach Petriego. Protokół opiera się na trawieniu, a następnie enzymatycznej dysocjacji próbki tkanki chirurgicznej na zawiesinę pojedynczej komórki16. Według naszej wiedzy jest to pierwsza demonstracja hodowli izolowanego pierwotnego guza jelita grubego i normalnych komórek bezpośrednio na miękkich podłożach hydrożelowych z osadzonymi mikrogranulkami fluorescencyjnymi do cytometrii trakcyjnej. Przezroczyste podłoża żelowe umożliwiają również barwienie immunologiczne. Test ten ujawnił różnice w organizacji F-aktyny i ogniskowych adhezjach w pierwotnych ludzkich komórkach okrężnicy w miarę zmian sztywności substratu. Ta platforma hodowli komórkowych otwiera możliwość zbadania różnych właściwości biofizycznych pierwotnych komórek ludzkich, takich jak sztywność komórek i trakcja, jako parametrów prognostyki raka.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reodczynniki</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Technologie życia</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Worthington</td><td>LS003736</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>3- Aminopropylotrymetoksysilan (ATS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>01201-5</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>N-metylenobisakryloamid (bis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka fibronektyna</td><td>BD</td><td>biologia 354008</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat hydrazyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18412</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>RT15710</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz sygnału</td><td>Technologie życia</td><td>I36933</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało anty winkulinowe&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozia anty-mysia IgG</td><td>Life technologie</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>TRITC koniugaty falloidyny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>0,1 i mikro; m koraliki fluroscent</td><td>Life technologies</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA</td><td>Technologie życia</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><mocny>Materiały</mocny></td></tr><tr><td>12 mm2 szklane szkiełka nakrywkowe</td><td>Corning</td><td>2865-12</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych jelita grubego z tkanek chirurgicznych i hodowla ich bezpośrednio na miękkich, elastycznych podłożach do cytometrii trakcyjnej

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Komórki nowotworowe reagują na mechaniczną sztywność matrycy w złożony sposób, używając skoordynowanego, hierarchicznego systemu mechanochemicznego składającego się z receptorów adhezyjnych i związanych z nimi białek błonowych transdukcji sygnału, architektury cytoszkieletu i silników molekularnych1, 2. Mechanowrażliwość różnych komórek nowotworowych in vitro jest badana głównie na unieśmiertelnionych liniach komórkowych lub komórkach pierwotnych pochodzących od myszy, a nie na pierwotnych ludzkich komórkach rakowych. W związku z tym niewiele wiadomo na temat mechanowrażliwości pierwotnych komórek ludzkiego raka jelita grubego in vitro. W tym miejscu opracowano zoptymalizowany protokół, który opisuje izolację pierwotnych ludzkich komórek jelita grubego ze zdrowych i nowotworowych próbek tkanek ludzkich chirurgicznych. Wyizolowane komórki jelita grubego są następnie z powodzeniem hodowane na miękkich (sztywność 2 kPa) i sztywnych (sztywność 10 kPa) hydrożelach poliakrylamidowych oraz sztywnych podłożach polistyrenowych (sztywność ~3,6 GPa) funkcjonalizowanych macierzą zewnątrzkomórkową (w tym przypadku fibronektyną). Mikrogranulki fluorescencyjne są zatopione w miękkich żelach w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej, a test trakcyjny jest wykonywany w celu oceny naprężeń kurczliwości komórkowej za pomocą bezpłatnego oprogramowania o otwartym dostępie. Ponadto mikroskopia immunofluorescencyjna na podłożach o różnej sztywności dostarcza użytecznych informacji na temat pierwotnej morfologii komórek, organizacji cytoszkieletu i zrostów ogniskowych zawierających winkulinę w funkcji sztywności substratu.

Opisany powyżej protokół został z powodzeniem zastosowany dla wielu próbek tkanek (n=12) pobranych od czterech różnych pacjentów zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej komisji etyki. Rysunek 1A przedstawia reprezentatywny guz jelita grubego bezpośrednio po operacji, z którego pobrano przekroje tkankowe do hodowli komórkowych. Typowy przekrój tkanki w roztworze HBSS po przeniesieniu do dygestorium laminarnego w celu dalszego przetwarzania pokazano na Rysunku 1B. Schemat trawienia i enzymat...

Opisano protokół ekstrakcji pierwotnych komórek ludzkich z chirurgicznego guza jelita grubego i normalnych tkanek. Wyizolowane komórki są następnie hodowane na miękkich elastycznych podłożach (hydrożele poliakrylamidowe) funkcjonalizowanych przez białko macierzy zewnątrzkomórkowej i osadzonych w fluorescencyjnych mikrogranulkach. Cytometria trakcyjna jest wykonywana w celu oceny komórkowych naprężeń skurczowych.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych jelita grubego z tkanek chirurgicznych i hodowla ich bezpośrednio na miękkich, elastycznych podłożach do cytometrii trakcyjnej

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja pierwotnych komórek z chirurgicznego wycinka nowotworu jelita grubego człowieka, a także z tkanki prawidłowej, oraz ich bezpośrednia hodowla na podłożach o różnej elastyczności w celu przeprowadzenia analizy. Realizuje się to poprzez wstępne pobranie tkanki chirurgicznej z nowotworu jelita grubego człowieka oraz z obszaru prawidłowego. Następnie enzymatyczna dysocjacja rozdrobnionej tkanki prowadzi do uzyskania licznych pojedynczych komórek.Ostatnim krokiem jest hodowla wyizolowanych komórek na miękkich hydrożelach poliakrylamidowych z zatopionymi nanometrycznymi kuleczkami fluorescencyjnymi oraz na szalkach polistyrenowych. W końcowym etapie przeprowadza się cytometrię trakcyjną w celu uzyskania przestrzennej mapy sił trakcyjnych komórek oraz mikroskopię immunofluorescencyjną w celu wizualizacji organizacji cytoszkieletu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniej hodowli wyizolowanych pierwotnych komórek okrężnicy człowieka z tkanek chirurgicznych na podłożach o różnej sztywności w celu przeprowadzenia analiz cytometrii trakcyjnej i mikroskopii immunofluorescencyjnej.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytanie, czy kurczliwość komórek guza pierwotnego może służyć jako potencjalny marker rokowania w chorobie nowotworowej. W pierwszej kolejności należy pobrać próbkę tkanki nowotworowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie, używając pipety, należy przenieść tkankę do płytki sześciodołkowej zawierającej od 6 do 7 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS).Płytkę sześciodołkową należy trzymać na bloku lodu, a tkankę przepłukać dwukrotnie roztworem HBSS. Następnie, za pomocą sterylnych nożyczek, należy precyzyjnie pociąć tkankę na oddzielne fragmenty. Przy użyciu sterylnego ostrza skalpela posiekać tkankę na mniejsze części o rozmiarze nie przekraczającym 1-2 mm³.Zważ oznakowaną fiolkę zawierającą 1 ml 0,1% roztworu trypsyny przed przeniesieniem tkanki. Następnie za pomocą pipety przenieś około 20 mg tkanki do każdej z fiolek z trypsyną. Zważ fiolki po przeniesieniu tkanki i odnotuj różnicę jako masę tkanki.Następnie należy wsypać około 20 milligrams tkanki i wlać jeden milliliter trypsyny do każdego dołka płytki 24-dołkowej. Płytkę 24-dołkową należy umieścić na wytrząsarce w temperaturze four degrees Celsius na okres od 16 do 20 hours. Po 16 do 20 hours inkubacji w trypsynie, za pomocą pipety należy przenieść tkankę do dwóch do trzech milliliters pełnej pożywki wzrostowej w temperaturze four degrees Celsius.Umieść fiolkę w ciepłej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C na 12 do 15 minut. Następnie przenieś tkankę do fiolki o pojemności 15 ml zawierającej roztwór HBSS. Używając pipety i delikatnie wstrząsając, powtórz ten krok po raz drugi.Następnie należy wyjąć tkankę z roztworu HBSS i przenieść ją do probówki zawierającej 1 ml 0,1% roztworu kolagenazy. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37°C i w atmosferze 5% CO2 w nawilżanym inkubatorze do hodowli komórkowych. W czasie oczekiwania podgrzać pożywkę wzrostową w probówkach o pojemności 15 ml do 37°C. Następnie zebrać wszystkie fragmenty tkanki za pomocą końcówki pipety, minimalizując ilość kolagenazy, i przenieść wyłącznie fragmenty tkanki do uprzednio podgrzanej hodowli.Fiolki z pożywką. Następnie do każdego dołka płytki sześciodołkowej należy włożyć filtr o porach 40 µm i zwilżyć go 1 mL pożywki do hodowli komórkowej.Wielokrotnie potraktuj tkankę w medium za pomocą szklanej pipety o pojemności 10 ml, aż do całkowitej dysocjacji tkanki. Utrzymuj końcówkę pipety jak najbliżej dna probówki. Następnie nanieś roztwór na filtr, aby usunąć zanieczyszczenia i niezdysocjowane fragmenty.Odwiruj przefiltrowaną zawiesinę komórkową w medium z prędkością 150 ×g przez pięć minut. W temperaturze pokojowej odlej nadsącz, a następnie resuspenduj osad komórkowy w dwóch mililitrach świeżego medium hodowlanego. Wysiej wyizolowane komórki pierwotne na żele funkcjonalizowane macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) oraz na szalki polistyrenowe z pożądanym stężeniem.Aby przeprowadzić analizę za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych, najpierw podgrzej 0,25% trips w roztworze EDTA 10% SDS do 37 °C w kąpieli wodnej przez 10 minut. Przed rozpoczęciem eksperymentów dotyczących trakcji wyjmuj po jednym żelu z inkubatora do hodowli komórkowej i umieszczaj go na stoliku mikroskopu. Po odnalezieniu pojedynczej komórki w polu widzenia zdejmij pokrywkę szalki Petriego i wykonaj obraz komórki w kontraście fazowym.Następnie przełącz tryb obrazowania na fluorescencyjny i wybierz odpowiedni filtr. W tym czasie nie przesuwaj stolika mikroskopu ani próbki. Następnie wykonaj zdjęcie kuleczek fluorescencyjnych przemieszczonych przez trakcję komórkową.Teraz dodaj jeden mililitr roztworu trypsyny w SDS do szalki Petriego, aby odłączyć komórkę od żelu. Wykonaj zdjęcie referencyjne kulek. Po usunięciu komórki przenieś podłoża przeznaczone do immunobarwienia do komory z laminarnym przepływem powietrza i usuń pożywkę hodowlaną. Następnie wypłucz podłoża solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS) i utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj podłoża PBS przez pięć minut łącznie trzy razy.Następnie inkubować podłoża z 500 µL wzmacniacza sygnału przez 30 minut, a następnie wypłukać buforem PBS. Dalej inkubować komórki z przeciwciałem monoklonalnym anty-vanolin w rozcieńczeniu 1:250 w PBS przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć podłoża buforem PBS przez pięć minut, powtarzając tę czynność łącznie trzy razy.Próbki inkubować z przeciwciałem wtórnym LOR 4 88 (kozie anty-mysie IgG) w rozcieńczeniu 1:200 w PBS w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie podłoża ponownie przemyć PBS przez pięć minut, łącznie trzy razy. W celu wizualizacji struktury f-aktyny, komórki inkubować z koniugatami tetraetylodiaminy w stężeniu 50 µL/mL przez 45 minut w temperaturze pokojowej.Następnie ponownie przemyć podłoża w ten sam sposób co wcześniej. Na koniec przystąpić do obrazowania próbek za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego; mikrografie w kontraście fazowym ilustrują reprezentatywną morfologię pierwotnych ludzkich komórek raka jelita grubego oraz komórek prawidłowych. W zależności od sztywności podłoża widać, że pierwotne komórki jelita grubego rozprzestrzeniają się bardziej na szalkach polistyrenowych w porównaniu do żeli poliakrylamidowych.Testy trakcji są przeprowadzane na miękkich żelach o sztywności 2 kPa powlekanych ECM, po potwierdzeniu inwazyjnego gruczolakoraka w badaniu patomorfologicznym z barwieniem hematoksyliną i eozyną. Przedstawiono tutaj migawkę nanometrycznych kuleczek fluorescencyjnych zatopionych w żelu, uzyskany z obrazów kuleczek przesuniętych oraz referencyjnych. Pola przesunięć są wyznaczane przy użyciu wtyczki Particle Image Velocimetry w programie ImageJ.Przedstawiono reprezentatywne pole przemieszczenia kuleczek generowane przez inwazyjne komórki nowotworowe jelita grubego w żelu o sztywności 2 kPa wraz z uzyskanym naprężeniem trakcyjnym. Obliczenia wykonano przy użyciu wtyczki ImageJ Fourier Transform Traction Cytometry odpowiadającej polu przemieszczenia. Pokazano tutaj aktynę F oraz zawierające cullinę adhezje ogniskowe pierwotnych ludzkich komórek jelita grubego na miękkich żelach 2 kPa oraz sztywnych podłożach polistyrenowych.W komórkach mniej rozprzestrzenionych na miękkich żelach nie stwierdzono obecności włókien aktynowych. Ponadto na miękkich żelach występują punktowe adhezje ogniskowe zawierające kullinę. Przeciwnie, komórki pierwotne wykazują dobrze rozprzestrzenioną morfologię, wyraźnie zdefiniowaną aktynę i włókna stresowe oraz dyskretne, wydłużone adhezje ogniskowe na sztywnych podłożach polistyrenowych.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak pomiar sztywności komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować komórki okrężnicy z tkanki chirurgicznej poprzez dysocjację enzymatyczną, a następnie hodować je bezpośrednio na hydrożelach poliakrylamidowych w celu oceny kurczliwości komórek.

isolation-primary-human-colon-tumor-cells-from-surgical-tissues

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek nowotworu jelita grubego z tkanek chirurgicznych i hodowla ich bezpośrednio na miękkich, elastycznych podłożach do cytometrii sił ciągnących

Ten film opisuje test mikroskopii siły pociągowej. Test określa trakcję komórkową ludzkich komórek raka jelita grubego na macierzy zewnątrzkomórkowej obecnej na miękkim elastycznym hydrożelu z osadzonymi kulkami fluorescencyjnymi. Wynikowe przemieszczenie kulek fluorescencyjnych mierzy się za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Test cytometrii trakcyjnej: metoda ilościowego określania siły trakcyjnej wywieranej przez komórki rakowe na ECM

Ten film opisuje technikę badania cytoszkieletu i ogniskowych zrostów w pierwotnych komórkach ludzkiego raka jelita grubego, aby zrozumieć jego zmiany w zależności od sztywności podłoża. Ta hodowla komórek rakowych na miękkich i twardych podłożach umożliwia różne dalsze pomiary biofizyczne w celu prognozowania raka.

Test organizacji cytoszkieletu i adhezji ogniskowej: metoda oparta na immunofluorescencji do badania adhezji komórek i rozprzestrzeniania się na podłożach

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnego organoidu guza jelita grubego u myszy. Metoda ta wykorzystuje tę cechę, że komórki nowotworowe jelita grubego przeżywają i rosną w organoidy w pożywkach zawierających ograniczone czynniki wzrostu, podczas gdy normalny nabłonek okrężnicy nie.

Metody in vitro Hodowla organoidowa pierwotnych guzów jelita grubego myszy

Miofibroblast jest wpływową komórką zrębu przewodu pokarmowego, która reguluje ważne procesy fizjologiczne zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym. Opisujemy technikę, która pozwala na izolację pierwotnych miofibroblastów zarówno z mysjej, jak i ludzkiej tkanki okrężnicy, którą można wykorzystać do eksperymentów in vitro.

Izolacja pierwotnych miofibroblastów z tkanki okrężnicy myszy i człowieka

Profilowanie molekularne laserowo mikrowypreparowanych komórek i zrębu z syntetycznych, tkankowo modyfikowanych modeli raka jelita grubego stanowi nowatorskie i podatne na manipulację podejście do charakterystyki i analizy charakterystycznej biologii na styku komórek nowotworowych na froncie inwazyjnym i komórek zrębu związanych z rakiem.

Profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Poniższy protokół skupia się na ustanowieniu pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich (STS) pochodzącego od pacjenta. Model ten może pomóc nam lepiej zrozumieć podłoże molekularne i profil farmakologiczny tych rzadkich nowotworów złośliwych i może stanowić punkt wyjścia do dalszych badań mających na celu poprawę leczenia STS.

Ustanowienie pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta

Komórki śródbłonka guza są ważnymi determinantami mikrośrodowiska guza i przebiegu choroby. W tym miejscu opisano protokół izolacji czystych i żywotnych komórek śródbłonka z ludzkiego raka jelita grubego i normalnej okrężnicy, który ma być stosowany w testach narkotykowych i badaniach nad patogenezą.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka z normalnego raka jelita grubego i raka jelita grubego - ulepszony protokół

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

Protokół opisuje metodę tworzenia modelu organoidowego raka jelita grubego (CRC) pochodzącego od pacjenta, współhodowanego z limfocytami naciekającymi nowotwór (TIL) w celu zbadania ich interakcji i potencjału terapeutycznego. Model ten stanowi platformę przedkliniczną do badania odpowiedzi immunologicznych w mikrośrodowisku guza oraz do przewidywania skuteczności terapii opartej na TIL w spersonalizowanym leczeniu raka jelita grubego.

Ustanowienie systemu kohodowli organoidów i limfocytów naciekających nowotwór jelita grubego pochodzących od pacjentów

Naucz się izolować pierwotne ludzkie komórki nowotworowe jelita grubego z tkanek chirurgicznych i hodować je na miękkich, elastycznych podłożach do analizy cytometrii trakcyjnej.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych jelita grubego z tkanek chirurgicznych i hodowla ich bezpośrednio na miękkich, elastycznych podłożach do cytometrii trakcyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych jelita grubego z tkanek chirurgicznych i hodowla ich bezpośrednio na miękkich, elastycznych podłożach do cytometrii trakcyjnej

Przeglądaj więcej filmów