Metoda wyboru aptamerów przełączających strukturę zastosowana do kolorymetrycznego testu nanocząstek złota
28 lutego 2015
Dostępny jest protokół do wyboru aptamerów przełączających strukturę dla małych cząsteczek w oparciu o przestrajalną metodę selekcji kulek magnetycznych z regulacją. Aptamery wybrane ze względu na właściwości przełączania struktur są korzystne w testach, które wymagają zmiany konformacyjnej w celu zasygnalizowania obecności celu, takich jak opisany test nanocząstek złota.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie apti przełączających strukturę do integracji jako elementów rozpoznających na platformach detekcyjnych, które działają poprzez sygnalizowanie zmiany potwierdzenia aptameru po powiązaniu celu. Osiąga się to poprzez dodanie biotynylowanej sondy wychwytującej i uzupełniającej biblioteki DNA do kulek magnetycznych pokrytych paciorkowcem w celu unieruchomienia biblioteki DNA na powierzchni kulki. Następnie do roztworu przykłada się magnes, aby oddzielić sekwencje wiążące od sekwencji niewiążących pozostałych na koralikach.
Zachowane sekwencje są następnie oczyszczane i amplifikowane do następnej rundy selekcji. Po kilku rundach selekcji do procesu dodawany jest krok selekcji negatywnej. Po kilku rundach selekcji, wybrany aptr wykazuje zmianę strukturalną po związaniu celu w oparciu o test wykrywania celu nanocząstek złota.
Przewagą tej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak komórka X oparta na roztworze, jest to, że nie musimy unieruchamiać celu do solidnej podpory. Tak więc implikacje tej techniki dotyczą oceny ryzyka stanu fizjologicznego danej osoby, a wynika to z faktu, że kortyzol jest wskaźnikiem stresu, co może prowadzić do oceny problemów zdrowotnych. Do tego protokołu należy zawsze używać świeżo przygotowanych roztworów DNA, szczególnie dla celu i kontroli.
Przygotowanie DNA wymaga szczególnej uwagi. Przenieś 100 mikrolitrową porcję biblioteki DNA do probówki termocyklera i podgrzewaj ją w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut w termomikserze. Następnie przenieś probówkę do lodu, aż będzie potrzebna, zanim użyjesz tego DNA, określ jego dokładne stężenie na spektrofotometrze.
Następnie przygotuj kulki magnetyczne, kulki magnetyczne zakodowane w wir strept i przenieś 400 mikrolitrów do nowej mikroprobówki wirówkowej. Umieść tę rurkę na magnesie na dwie minuty i usuń supernatant, a następnie umyj kulki. Dodaj 400 mikrolitrów buforu wiążącego i zwiruj je, aby zakończyć pranie.
Użyj magnesu, aby oddzielić koraliki i wyrzuć supernatant. Powtórz ten proces prania trzy razy. Następnie unieruchom sondę przechwytującą na kulkach magnetycznych.
Zacznij od zawieszenia kulek i 400 mikrolitrów buforu wiążącego z sondą wychwytującą 50 mikromolów. Następnie inkubuj kulki przez 10 minut, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej. Aby usunąć sondę swobodnego wychwytywania, umyj kulki jeszcze trzy razy, tak jak poprzednio, używając 400 mikrolitrów buforu wiążącego na pranie.
Po trzech praniach dodaj kolejne 400 mikrolitrów buforu i zbierz 100 mikrolitrów roztworu kulek na pozostałe etapy, oszczędzając resztę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pozostałą część można wykorzystać na kolejne rundy selekcji przez okres do trzech tygodni. Gdy potrzebnych jest więcej koralików, można je przygotować z dłuższymi sondami, aby zwiększyć rygorystyczność w tym schemacie wyboru.
Na przykład po 13. rundzie zastosowano dłuższe sondy, w którym to momencie osiągnięto znaczne wzbogacenie przy użyciu innych rygorystycznych przepisów. W przypadku stosowania kulek pobranych z magazynu, należy rozpocząć od dwukrotnego przemycia porcji roboczej, używając 200 mikrolitrów buforu wiążącego na pranie. W przeciwnym razie świeżo wykonane koraliki są już czyste.
Teraz dodaj 100 mikrolitrów snap cool DNA do kulek i inkubuj je przez pół godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Po inkubacji odizolować kulki przed odrzuceniem supernatantu. Oblicz stężenie zawarte w DNA, aby określić, ile DNA wiąże się z kulkami.
Następnie umyj koraliki trzykrotnie 200 mikrolitrami bufora wiążącego. Pozwól buforowi wiążącemu myć kulki delikatnym mieszaniem przez pięć minut za każdym razem. Następnie przygotuj cząsteczkę docelową w buforze wiążącym o stężeniu 100 mikromolów i ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach tego preparatu, cząsteczki docelowej.
W tym przypadku kortyzol jest zazwyczaj silnie skoncentrowany w pierwszej rundzie selekcji. Inkubuj koraliki z tarczą przez pół godziny, delikatnie mieszając w warunkach otoczenia. Po inkubacji należy zachować snat zawierający docelowe sekwencje, do których nawiązano.
Po co drugiej rundzie wzbogacania pobiera się próbkę z końcowego supernatantu w celu monitorowania procesu. Usunąć kortyzol z supernatantu za pomocą dializy. Można to pominąć, jeśli cząsteczka docelowa nie zakłóca pomiaru absorbancji DNA przy 260 nanometrach po każdej rundzie, amplifikować docelowe wiązanie DNA przez PCR, używając pobranego supernatantu z etapu selekcji pozytywnej jako matrycy.
Wstępnie zawsze przeprowadzaj mały test PCR, aby określić optymalną liczbę amplifikacji. Weź 10 mikrolitrów próbek po każdym cyklu i porównaj próbki z drabiną 25 par zasad. W tym przypadku biblioteka powinna działać przy 85 parach zasad nad wzmocnionymi produktami, które są widoczne po 10 cyklu, więc należy użyć mniejszej liczby cykli.
Wynik ten może się różnić w zależności od rundy, więc zawsze konieczne jest przeprowadzenie testu. Następnie wykonaj PCR na dużą skalę, używając wybranej liczby cykli przy użyciu ośmiu probówek paskowych. Amplifikuj od sześciu do ośmiu mililitrów mieszaniny reakcyjnej, aby uzyskać wymaganą ilość amplikonu do następnej rundy selekcji, która wynosi od jednego do 2,5 nanomola DNA.
Dokładnie sprawdź próbkę produktów PCR za pomocą żelu. Następnie przekształć większość produktów w jednoniciowe DNA za pomocą niemagnetycznych kulek pokrytych paciorkowcami. Załaduj 300 mikrolitrów koralików do małej kolumny zablokowanej przez fritz.
Następnie za pomocą strzykawki z blokadą przynęty delikatnie umyj koraliki pięcioma mililitrami bufora wiążącego. Podczas zmiany roztworu do przemywania kolumny, należy wyjąć strzykawkę z kolumny i usunąć tłok ze strzykawki. Zapobiega to niepotrzebnemu naruszaniu koralików.
Utwórz i umyj wystarczającą liczbę kolumn kulkowych na jeden mililitr produktu PCR na kolumnę. Przepuścić produkt PCR przez kolumny, delikatnie dociskając. Produkty DNA zostaną zatrzymane przez koraliki przyczepione przez ich nici antysensowne.
Następnie umyj kolumny związane DNA pięcioma mililitrami buforu wiążącego, aby usunąć wszystkie składniki PCR, pozostawiając tylko DNA z puli wiążącej do dehybrydyzacji DNA z kolumny, dodaj 0,5 mililitra 0,2 molowego wodorotlenku sodu. Następnie odsolić jednoniciowe DNA w eit za pomocą kolumny odsalającej przygotowanej z wody wolnej od nukleaz. Wyrzuć początkowe 0,5 mililitra przepływu.
Następnie przepuść jeden mililitr wody wolnej od nukleaz przez kolumnę, aby zebrać odsolone DNA. Zmierz absorbancję pobranego DNA i przygotuj go do następnej rundy selekcji. Jak opisano w protokole tekstowym, zebrane jednoniciowe DNA jest teraz dodawane z powrotem do świeżo przygotowanej porcji koralików przygotowanych za pomocą sondy wychwytującej.
Druga runda selekcji jest podobna do pierwszej, z zastosowaniem niższego stężenia kortyzolu. Jednakże, począwszy od trzeciej rundy, włącz etap selekcji negatywnej przed selekcją pozytywną. W pierwszej rundzie selekcji negatywnej dodaj 200 mikrolitrów jednego mikromolowego progesteronu w buforze wiążącym z kulkami.
Jest strukturalnie podobny, ale różni się od kortyzolu. W kolejnych rundach zwiększaj stężenie progesteronu po delikatnym potrząsaniu mieszaniną przez pół godziny w temperaturze pokojowej. Wyrzuć supinat i umyj kulki dwa razy za pomocą 200 mikrolitrów buforu wiążącego.
Następnie przejdź do selekcji pozytywnej. Jak opisano wcześniej, w miarę postępu rund, stężenie substratu zmieniało się, aby wpłynąć na rygorystyczność procesu selekcji. Szczegóły są omówione w protokole tekstowym.
Następnie postępuj zgodnie z protokołem tekstowym, aby wykonać test nanocząstek złota w celu wykrycia kortyzolu. Ten szybki i prosty odczyt metryki kolorów opiera się na zmianie strukturalnej aptameru po związaniu celu. W ten sposób zapewnia metrykę do oceny zdolności metody do selekcji aber o właściwościach przełączania struktur.
Kolejną zaletą testu nanocząstek złota jest to, że wzmacnia on sygnał w taki sposób, że aptamer powinowactwa mikromolowego wspólny dla małych cząsteczek może być wykryty na poziomach o rzędy wielkości niższych niż stała dysocjacji. Do wyizolowania aber specyficznych dla kortyzolu zastosowano następujący protokół selekcji. Zastosowano monitorowanie dializy i wzbogacania, aby wykazać zwiększoną elucję cząsteczki docelowej po późniejszych etapach selekcji.
Spadek elucji zaobserwowano, gdy w końcowych etapach zastosowano mniej cząsteczki docelowej i dłuższe sondy wychwytujące. Sekwencjonowanie nowej generacji wykorzystano do analizy wymykającego się DNA po kilku różnych rundach. Na początku szóstej rundy selekcji, niewielki odsetek sekwencji zwiększył liczbę kopii, która po 13 rundach została sklasyfikowana w 20 pojemnikach.
Znacznie większy odsetek aberów był w dużej liczbie kopii. Następnie, zaostrzając proces selekcji. W rundach 14 i 15 prawie połowa wybranych aber znajdowała się w pierwszym rzędzie częstotliwości numerowania kopii.
W tym momencie było około 3000 unikalnych sekwencji w 30 000 biegów. Wybrany AP inkubowano z nanocząstkami złota, a następnie dodano do nich substraty docelowe lub kontrolne dla porównania. Ten test wykazał, że AP miał większą specyficzność dla kortyzolu niż kwasu kolkowego lub dla Podczas próby tej procedury.
Ważne jest, aby kontrolować rygorystyczność selekcji w każdej rundzie, a także zoptymalizować liczbę cykli PCR. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wybrać AP przełączający strukturę i wykonać test wykrywania nanocząstek złota.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół doboru aptamerów przełączających strukturę dla małych cząsteczek docelowych z wykorzystaniem metody selekcji na kuleczkach magnetycznych. Wybrane aptamery wykazują zmiany konformacyjne po związaniu celu, co jest korzystne w testach detekcyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia molekularna
- Chemia analityczna
Wstęp
- Aptamery to krótkie, jednoniciowe cząsteczki DNA lub RNA, które mogą wiązać się ze specyficznymi celami.
- Aptamery przełączające strukturę zmieniają konformację po związaniu z celem, co zwiększa możliwości detekcji.
- Testy z wykorzystaniem nanocząsteczek złota wykorzystują te zmiany konformacyjne do sygnalizacji.
- Metoda ta pozwala na wykrywanie małych cząsteczek bez konieczności unieruchamiania celu.
Cel badania
- Opracowanie protokołu wyboru aptamerów przełączających strukturę.
- Udoskonalenie metod detekcji małych cząsteczek, takich jak kortyzol.
- Ocena stanów fizjologicznych na podstawie wskaźników stresu.
Zastosowane metody
- Wraz z kuleczkami magnetycznymi stosuje się biotynilowane sondy wychwytujące oraz komplementarną bibliotekę DNA.
- Do oddzielenia sekwencji wiążących od niewiążących wykorzystuje się separację magnetyczną.
- Przeprowadza się wielokrotne rundy selekcji i amplifikacji w celu wzbogacenia pożądanych aptamerów.
- Do wykazania funkcjonalności aptamerów wykorzystuje się analizy z użyciem nanocząsteczek złota.
Główne wyniki
- Skuteczny dobór aptamerów wykazujących zmiany strukturalne po związaniu z celem.
- Wykazana skuteczność w wykrywaniu kortyzolu jako wskaźnika stresu.
- Protokół umożliwia stosowanie świeżo przygotowanych roztworów DNA w celu uzyskania optymalnych wyników.
- Wzbogacanie aptamerów ulega poprawie przy zastosowaniu dłuższych sond i zwiększonej rygorystyczności.
Wnioski
- Protokół dostarcza niezawodnej metody selekcji aptamerów przełączających strukturę.
- Aptamery te mogą zwiększyć czułość testów wykrywających małe cząsteczki.
- Opisane podejście znajduje potencjalne zastosowanie w ocenie stanu zdrowia w kontekście stresu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda umożliwia selekcję aptamerów przełączających strukturę dla małych cząsteczek docelowych bez konieczności unieruchamiania celu, co wspiera rozwój biosensorów dla biomarkerów fizjologicznych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez wzbogacanie aptamerów, które ulegają zmianie konformacyjnej po wiązaniu, co redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich wynikających z niespecyficznych oddziaływań z kuleczkami. Zapewnia ona wielokrotnego użytku schemat odkrywania do opracowywania testów we wczesnej fazie poszukiwania leków, szczególnie dla celów takich jak kortyzol, gdzie szybki odczyt kolorymetryczny jest cenny w testach zdecentralizowanych. Nacisk protokołu na selekcję negatywną oraz wydłużenie sondy poprawia rygorystyczność, pomagając w identyfikacji wiodących kandydatów poprzez minimalizowanie sekwencji tła i wzbogacanie binderów o wysokim powinowactwie.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez selekcję aptamerów ulegających zmianie konformacyjnej indukowanej przez cel, co zapewnia funkcjonalne potwierdzenie specyficzności wiązania.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność unieruchamiania celu, upraszczając proces i ograniczając liczbę artefaktów wynikających z oddziaływań powierzchniowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez wzbogacanie sekwencji wykazujących dowodną zmianę strukturalną, co zwiększa pewność w kwestii oddziaływania z celem.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generowanie aptamerów kompatybilnych z testami opartymi na nanocząsteczkach złota, co umożliwia ilościowy, kolorymetryczny odczyt w badaniach wysokoprzepustowych.
- Wartość operacyjna: Uzyskiwanie standaryzowanych pul wiążących poprzez powtarzalną selekcję i amplifikację, co poprawia odtwarzalność testu pomiędzy poszczególnymi seriami pomiarowymi.
- Skalowalność: Zwiększenie długości sondy wychwytującej po wzbogaceniu podnosi rygorystyczność procesu, co pozwala na ponowne wykorzystanie platformy selekcyjnej dla wielu różnych celów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wybrane aptamery wykazują zdolność detekcji w buforze, co stanowi podstawę do rozszerzenia badań na płyny fizjologiczne, takie jak ślina lub pot.
- Zgodność z biomarkerami: Detekcja kortyzolu jest zgodna z monitorowaniem biomarkerów związanych ze stresem, co jest istotne przy ocenie stanu fizjologicznego w przedklinicznych badaniach bezpieczeństwa.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Monitorowanie wzbogacenia poprzez elucję i sekwencjonowanie pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o specyficzność aptamerów i częstotliwość liczby kopii.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, umożliwiając przejście od selekcji aptamerów do opracowania testów funkcjonalnych służących do detekcji małych cząsteczek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez izolację aptamerów odzwierciedlających zmiany strukturalne indukowane przez cel, co pozwala na wyjaśnienie mechanizmu wiązania i specyficzności.
- Screening: Dostarcza aptamery gotowe do analizy o potwierdzonej wydajności w formatach kolorymetrycznych, umożliwiając niezawodną ocenę związków lub ligandów.
- Analityka: Zapewnia wyniki ilościowe poprzez przesunięcie sygnału nanocząsteczek złota, co pozwala na porównanie warunków wiązania i postępów wzbogacania.
- Badania translacyjne: Łączy z przepływami pracy przedklinicznymi poprzez dane dowodowe oparte na buforach, co pozwala na przyszłe dostosowanie do złożonych macierzy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Selekcja za pomocą kulek magnetycznych z modyfikowalną długością sondy tworzy platformę wielokrotnego użytku dla wielu małych cząsteczek będących celem, co redukuje nakład pracy przy ponownym opracowaniu metody.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez selekcję aptamerów o weryfikowalnej zmianie konformacyjnej, co redukuje niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki etapom selekcji negatywnej oraz określonym protokołom płukania, minimalizując zmienność między partiami.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność decyzji go/no-go poprzez umożliwienie wczesnej oceny funkcjonalności aptamerów, ograniczając inwestycje w niewykonalne kandydaty.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki śledzeniu wzbogacenia i danym sekwencyjnym, umożliwiając dalsze prace w oparciu o dominację liczby kopii i specyficzność.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie manipulacji kwasami nukleinowymi, separacji za pomocą kulek magnetycznych oraz optymalizacji PCR w celu uniknięcia błędu amplifikacji.
- Metoda jest zależna od sprzętu do separacji magnetycznej, termocyklerów oraz spektrofotometrii w celu ilościowego oznaczenia i kontroli jakości DNA.
- Konieczna jest standaryzacja warunków buforu wiążącego oraz związków do selekcji negatywnej (np. progesteronu) pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja do płynów fizjologicznych może wymagać optymalizacji stężenia soli i temperatury w celu utrzymania stabilności aptamerów i wiązania z celem.
- Ograniczenie praktyczne: wydajność partycjonowania jest ograniczona przez konieczność utrzymania temperatury topnienia w pobliżu temperatury pokojowej, co wymusza przeprowadzenie wielu rund selekcji w celu redukcji tła.
