Metoda wyboru aptamerów przełączających strukturę zastosowana do kolorymetrycznego testu nanocząstek złota

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie apti przełączających strukturę do integracji jako elementów rozpoznających na platformach detekcyjnych, które działają poprzez sygnalizowanie zmiany potwierdzenia aptameru po powiązaniu celu. Osiąga się to poprzez dodanie biotynylowanej sondy wychwytującej i uzupełniającej biblioteki DNA do kulek magnetycznych pokrytych paciorkowcem w celu unieruchomienia biblioteki DNA na powierzchni kulki. Następnie do roztworu przykłada się magnes, aby oddzielić sekwencje wiążące od sekwencji niewiążących pozostałych na koralikach.

Zachowane sekwencje są następnie oczyszczane i amplifikowane do następnej rundy selekcji. Po kilku rundach selekcji do procesu dodawany jest krok selekcji negatywnej. Po kilku rundach selekcji, wybrany aptr wykazuje zmianę strukturalną po związaniu celu w oparciu o test wykrywania celu nanocząstek złota.

Przewagą tej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak komórka X oparta na roztworze, jest to, że nie musimy unieruchamiać celu do solidnej podpory. Tak więc implikacje tej techniki dotyczą oceny ryzyka stanu fizjologicznego danej osoby, a wynika to z faktu, że kortyzol jest wskaźnikiem stresu, co może prowadzić do oceny problemów zdrowotnych. Do tego protokołu należy zawsze używać świeżo przygotowanych roztworów DNA, szczególnie dla celu i kontroli.

Przygotowanie DNA wymaga szczególnej uwagi. Przenieś 100 mikrolitrową porcję biblioteki DNA do probówki termocyklera i podgrzewaj ją w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut w termomikserze. Następnie przenieś probówkę do lodu, aż będzie potrzebna, zanim użyjesz tego DNA, określ jego dokładne stężenie na spektrofotometrze.

Następnie przygotuj kulki magnetyczne, kulki magnetyczne zakodowane w wir strept i przenieś 400 mikrolitrów do nowej mikroprobówki wirówkowej. Umieść tę rurkę na magnesie na dwie minuty i usuń supernatant, a następnie umyj kulki. Dodaj 400 mikrolitrów buforu wiążącego i zwiruj je, aby zakończyć pranie.

Użyj magnesu, aby oddzielić koraliki i wyrzuć supernatant. Powtórz ten proces prania trzy razy. Następnie unieruchom sondę przechwytującą na kulkach magnetycznych.

Zacznij od zawieszenia kulek i 400 mikrolitrów buforu wiążącego z sondą wychwytującą 50 mikromolów. Następnie inkubuj kulki przez 10 minut, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej. Aby usunąć sondę swobodnego wychwytywania, umyj kulki jeszcze trzy razy, tak jak poprzednio, używając 400 mikrolitrów buforu wiążącego na pranie.

Po trzech praniach dodaj kolejne 400 mikrolitrów buforu i zbierz 100 mikrolitrów roztworu kulek na pozostałe etapy, oszczędzając resztę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pozostałą część można wykorzystać na kolejne rundy selekcji przez okres do trzech tygodni. Gdy potrzebnych jest więcej koralików, można je przygotować z dłuższymi sondami, aby zwiększyć rygorystyczność w tym schemacie wyboru.

Na przykład po 13. rundzie zastosowano dłuższe sondy, w którym to momencie osiągnięto znaczne wzbogacenie przy użyciu innych rygorystycznych przepisów. W przypadku stosowania kulek pobranych z magazynu, należy rozpocząć od dwukrotnego przemycia porcji roboczej, używając 200 mikrolitrów buforu wiążącego na pranie. W przeciwnym razie świeżo wykonane koraliki są już czyste.

Teraz dodaj 100 mikrolitrów snap cool DNA do kulek i inkubuj je przez pół godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Po inkubacji odizolować kulki przed odrzuceniem supernatantu. Oblicz stężenie zawarte w DNA, aby określić, ile DNA wiąże się z kulkami.

Następnie umyj koraliki trzykrotnie 200 mikrolitrami bufora wiążącego. Pozwól buforowi wiążącemu myć kulki delikatnym mieszaniem przez pięć minut za każdym razem. Następnie przygotuj cząsteczkę docelową w buforze wiążącym o stężeniu 100 mikromolów i ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach tego preparatu, cząsteczki docelowej.

W tym przypadku kortyzol jest zazwyczaj silnie skoncentrowany w pierwszej rundzie selekcji. Inkubuj koraliki z tarczą przez pół godziny, delikatnie mieszając w warunkach otoczenia. Po inkubacji należy zachować snat zawierający docelowe sekwencje, do których nawiązano.

Po co drugiej rundzie wzbogacania pobiera się próbkę z końcowego supernatantu w celu monitorowania procesu. Usunąć kortyzol z supernatantu za pomocą dializy. Można to pominąć, jeśli cząsteczka docelowa nie zakłóca pomiaru absorbancji DNA przy 260 nanometrach po każdej rundzie, amplifikować docelowe wiązanie DNA przez PCR, używając pobranego supernatantu z etapu selekcji pozytywnej jako matrycy.

Wstępnie zawsze przeprowadzaj mały test PCR, aby określić optymalną liczbę amplifikacji. Weź 10 mikrolitrów próbek po każdym cyklu i porównaj próbki z drabiną 25 par zasad. W tym przypadku biblioteka powinna działać przy 85 parach zasad nad wzmocnionymi produktami, które są widoczne po 10 cyklu, więc należy użyć mniejszej liczby cykli.

Wynik ten może się różnić w zależności od rundy, więc zawsze konieczne jest przeprowadzenie testu. Następnie wykonaj PCR na dużą skalę, używając wybranej liczby cykli przy użyciu ośmiu probówek paskowych. Amplifikuj od sześciu do ośmiu mililitrów mieszaniny reakcyjnej, aby uzyskać wymaganą ilość amplikonu do następnej rundy selekcji, która wynosi od jednego do 2,5 nanomola DNA.

Dokładnie sprawdź próbkę produktów PCR za pomocą żelu. Następnie przekształć większość produktów w jednoniciowe DNA za pomocą niemagnetycznych kulek pokrytych paciorkowcami. Załaduj 300 mikrolitrów koralików do małej kolumny zablokowanej przez fritz.

Następnie za pomocą strzykawki z blokadą przynęty delikatnie umyj koraliki pięcioma mililitrami bufora wiążącego. Podczas zmiany roztworu do przemywania kolumny, należy wyjąć strzykawkę z kolumny i usunąć tłok ze strzykawki. Zapobiega to niepotrzebnemu naruszaniu koralików.

Utwórz i umyj wystarczającą liczbę kolumn kulkowych na jeden mililitr produktu PCR na kolumnę. Przepuścić produkt PCR przez kolumny, delikatnie dociskając. Produkty DNA zostaną zatrzymane przez koraliki przyczepione przez ich nici antysensowne.

Następnie umyj kolumny związane DNA pięcioma mililitrami buforu wiążącego, aby usunąć wszystkie składniki PCR, pozostawiając tylko DNA z puli wiążącej do dehybrydyzacji DNA z kolumny, dodaj 0,5 mililitra 0,2 molowego wodorotlenku sodu. Następnie odsolić jednoniciowe DNA w eit za pomocą kolumny odsalającej przygotowanej z wody wolnej od nukleaz. Wyrzuć początkowe 0,5 mililitra przepływu.

Następnie przepuść jeden mililitr wody wolnej od nukleaz przez kolumnę, aby zebrać odsolone DNA. Zmierz absorbancję pobranego DNA i przygotuj go do następnej rundy selekcji. Jak opisano w protokole tekstowym, zebrane jednoniciowe DNA jest teraz dodawane z powrotem do świeżo przygotowanej porcji koralików przygotowanych za pomocą sondy wychwytującej.

Druga runda selekcji jest podobna do pierwszej, z zastosowaniem niższego stężenia kortyzolu. Jednakże, począwszy od trzeciej rundy, włącz etap selekcji negatywnej przed selekcją pozytywną. W pierwszej rundzie selekcji negatywnej dodaj 200 mikrolitrów jednego mikromolowego progesteronu w buforze wiążącym z kulkami.

Jest strukturalnie podobny, ale różni się od kortyzolu. W kolejnych rundach zwiększaj stężenie progesteronu po delikatnym potrząsaniu mieszaniną przez pół godziny w temperaturze pokojowej. Wyrzuć supinat i umyj kulki dwa razy za pomocą 200 mikrolitrów buforu wiążącego.

Następnie przejdź do selekcji pozytywnej. Jak opisano wcześniej, w miarę postępu rund, stężenie substratu zmieniało się, aby wpłynąć na rygorystyczność procesu selekcji. Szczegóły są omówione w protokole tekstowym.

Następnie postępuj zgodnie z protokołem tekstowym, aby wykonać test nanocząstek złota w celu wykrycia kortyzolu. Ten szybki i prosty odczyt metryki kolorów opiera się na zmianie strukturalnej aptameru po związaniu celu. W ten sposób zapewnia metrykę do oceny zdolności metody do selekcji aber o właściwościach przełączania struktur.

Kolejną zaletą testu nanocząstek złota jest to, że wzmacnia on sygnał w taki sposób, że aptamer powinowactwa mikromolowego wspólny dla małych cząsteczek może być wykryty na poziomach o rzędy wielkości niższych niż stała dysocjacji. Do wyizolowania aber specyficznych dla kortyzolu zastosowano następujący protokół selekcji. Zastosowano monitorowanie dializy i wzbogacania, aby wykazać zwiększoną elucję cząsteczki docelowej po późniejszych etapach selekcji.

Spadek elucji zaobserwowano, gdy w końcowych etapach zastosowano mniej cząsteczki docelowej i dłuższe sondy wychwytujące. Sekwencjonowanie nowej generacji wykorzystano do analizy wymykającego się DNA po kilku różnych rundach. Na początku szóstej rundy selekcji, niewielki odsetek sekwencji zwiększył liczbę kopii, która po 13 rundach została sklasyfikowana w 20 pojemnikach.

Znacznie większy odsetek aberów był w dużej liczbie kopii. Następnie, zaostrzając proces selekcji. W rundach 14 i 15 prawie połowa wybranych aber znajdowała się w pierwszym rzędzie częstotliwości numerowania kopii.

W tym momencie było około 3000 unikalnych sekwencji w 30 000 biegów. Wybrany AP inkubowano z nanocząstkami złota, a następnie dodano do nich substraty docelowe lub kontrolne dla porównania. Ten test wykazał, że AP miał większą specyficzność dla kortyzolu niż kwasu kolkowego lub dla Podczas próby tej procedury.

Ważne jest, aby kontrolować rygorystyczność selekcji w każdej rundzie, a także zoptymalizować liczbę cykli PCR. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wybrać AP przełączający strukturę i wykonać test wykrywania nanocząstek złota.