Technika barwienia różnicowego w czasie w połączeniu z pełnym obustronnym denerwacją skrzelową w celu badania jonocytów u ryb

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie proliferacji cytów ramiennych w skrzelach złotych rybek, pozbawionych unerwienia zewnętrznego. Osiąga się to poprzez najpierw umieszczenie ryb w kąpieli barwnikowej specyficznej dla mitochondrów, aby zabarwić istniejące wcześniej mitochondria, bogate cyty ramienne. Drugim krokiem jest wykonanie pełnego obustronnego odnerwienia skrzeli.

Następnie ryby są poddawane eutanazji. Skrzela są zbierane. Cyty są znakowane za pomocą przeciwciała przeciwko sodowo-potasowemu w TPA.

Ostatnim krokiem jest zobrazowanie i policzenie wcześniej istniejących i nowo zróżnicowanych cytów. Ostatecznie tym razem technika barwienia różnicowego z obustronnym odnerwieniem gildiowym służy do pokazania proliferacji i dystrybucji cytów skrzelowych u złotych rybek bez żadnego wkładu nerwowego z ośrodkowego układu nerwowego. Tak więc główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do zrozumienia dynamicznego wychwytu jonów i zbadania redystrybucji cytów w nabłonku przewodu pokarmowego ryb.

Najpierw przygotuj jeden milimolowy czerwony roztwór podstawowy mitral tracker, rozpuszczając 50 mikrogramów w 94 mikrolitrach dimetylosulfotlenku i chroń przed światłem. Następnie przygotuj od trzech do sześciu ciemnych pudełek o maksymalnej objętości 600 mililitrów. Napełnij każde pudełko 400 mililitrami wody systemowej i umieść w każdym kamień napowietrzający, aby zapewnić źródło tlenu.

Umieść złote rybki o wadze od 30 do 40 gramów w pudełkach. Po 30 minutach dodaj roztwór do śledzenia uchylnego, aby uzyskać pełne stężenie 0,1 mikromolowego barwnika i 0,01% DMSO. Kąp rybę przez cztery godziny.

Po czterech godzinach włącz dopływ wody do pudełek i pozwól barwnikowi się wypłukać. Jeśli są to zwierzęta kontrolne, odzyskaj ryby na trzy do pięciu dni, a następnie przejdź do immunohistochemii, w przeciwnym razie przejdź do pełnej procedury dwustronnej denerwacji. Najpierw znieczul rybę, umieszczając ją w napowietrzonej kąpieli benzokainowej.

Po ustaniu oddychania umieść rybę na stole operacyjnym i włóż rurkę do jamy policzkowej Aby przepłukać skrzela napowietrzonym roztworem znieczulającym, ustaw rybę tak, aby głowa była lekko pochylona w dół, aby umożliwić lepszy dostęp do obszaru za czwartym łukiem skrzelowym. Delikatnie podnieś wieczko za pomocą prostych kleszczyków o standardowym wzorze, a następnie umieść retraktory tkanek między wieczkiem a wnętrzem głowy. Ostrożnie otwórz retraktory tkanek, aby wieczko trzymało się z dala od głowy i utrzymywało skrzela odsłonięte.

Oprzyj uchwyty zwijacza obok głowy, aby zapewnić dostęp do wszystkich czterech łuków skrzelowych. Sprawdź, czy roztwór znieczulający iryguje skrzela i umieść zakrzywione lub proste kleszcze o standardowym wzorze między czwartym łukiem skrzelowym a tyłem głowy. Delikatnie otwórz kleszcze, aby wytworzyć napięcie w więzadle.

Przymocowanie czwartego łuku skrzelowego do głowy za pomocą pary kleszczy numer pięć. Utwórz otwór o długości od dwóch do trzech milimetrów, przekłuwając nabłonek, łącząc grzbietowy koniec łuków skrzelowych z jamą małżowiny usznej. Uważaj, aby nie wchodzić zbyt głęboko, ponieważ istnieje ryzyko uszkodzenia głównego naczynia krwionośnego.

Następnie przytrzymaj mały wacik z kleszczami numer pięć i użyj go, aby ostrożnie rozszerzyć nacięcie, aby odsłonić dziewiąty i dziesiąty nerw. Uwolnij nerwy z tkanki łącznej za pomocą kleszczy numer pięć. Ponownie, uważając, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych.

Po odsłonięciu i zidentyfikowaniu nerwów użyj zakrzywionych nożyczek sprężynowych, aby ostrożnie przeciąć nerwy, przytrzymując nacięcie. Otwórz za pomocą prostych kleszczy o standardowym kształcie. Po przecięciu nerwów delikatnie cofnij zakrzywione kleszcze i usuń tkankę.

Szwy zwijające nie są wymagane, ponieważ nacięcie powinno zamknąć się samoistnie w ciągu 24 do 48 godzin. Po powtórzeniu procedury po drugiej stronie głowy zmień irygację skrzeli ze znieczulenia na świeżą napowietrzoną wodę i pozwól rybie dojść do siebie po znieczuleniu. Po wznowieniu ruchów małżowiny usznej należy przenieść ryby do zbiorników doświadczalnych, aby zregenerowały się przez co najmniej 24 godziny.

Na koniec wykonaj pozorowaną procedurę na oddzielnym zestawie ryb, przebijając nabłonek za czwartym łukiem skrzelowym bez przecinania nerwów przed eutanazją ryby. Umieść trzy do czterech mililitrów 4% PFA w fiolce scyntylacyjnej. Użyć jednej fiolki na łuk skrzelowy.

Ponadto weź małą łódkę serwatkową i napełnij ją jednym XPBS. Zostanie to wykorzystane do umycia tkanki po jej wycięciu. Trzymaj wszystkie roztwory na lodzie.

Po eutanazji ryby za pomocą przedawkowania benzokainy użyj kleszczy, aby podnieść trwałą ondulację po jednej stronie głowy i zakrzywionych nożyczek, aby odciąć każdy koniec kosza skrzelowego ramienia. Następnie użyj kleszczy, aby ostrożnie podnieść skrzela przez Rackers i wyjąć je z jamy usznej. Natychmiast umyj skrzela w lodowatym XPBS, aby usunąć nadmiar benzenu i krwi, a następnie umieść wycięte skrzela w fiolce wypełnionej 4% PFA, po utrwaleniu utrwal wszystkie wycięte skrzela w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zmyj X-S-P-F-A w jednym XPBS i umieść chusteczkę w dwumililitrowej tubie wypełnionej 1,5 mililitra 1%Tritton x. Umieść probówki z kulami na wytrząsarce na sześć godzin w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przepuścić tkankę, przygotuj rozcieńczenie od jednego do 250 każdego przeciwciała pierwszorzędowego, dodając cztery mikrolitry przeciwciał pierwszorzędowych NKA i ZN 12 do 992 mikrolitrów jednego XPBS.

Upewnij się, że oba pierwszorzędowe przeciwciała zostały wyhodowane u tego samego gospodarza. Odessać roztwór Triton X i bez uprzedniego mycia tkanki oraz roztworu przeciwciała pierwotnego i inkubować na wytrząsarce przez sześć godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć przeciwciało pierwszorzędowe trzy razy przez trzy minuty każde.

Korzystanie z jednego XPBS. Przygotować przeciwciało drugorzędowe w rozcieńczeniu od jednego do 200, mieszając pięć mikrolitrów podstawowego przeciwciała drugorzędowego z 995 mikrolitrami jednego XPBS. Po zaessaniu PBS z ostatniego przemycia nanieść przeciwciało drugorzędowe i inkubować przez sześć godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na shakerze.

Na koniec usuń nadmiar przeciwciał wtórnych, myjąc tkankę trzy razy przez pięć minut każdy, tak jak poprzednio, po przepłukaniu zamontuj tkankę, najpierw umieszczając skrzela w 200-mikrolitrowej kropli jednego XPBS na płaskim szkiełku mikroskopowym. Aby upewnić się, że tkanka nie wysycha. Oddziel skrzela hemi Brinks zakrzywionymi mikronożyczkami.

Następnie umieść kroplę jednego XPBS i kroplę nośnika montażowego w zagłębieniu wklęsłego suwaka. Umieść oddzielone wióry hemi we wklęsłym szkiełku z przednią krawędzią filamentu skierowaną do góry i przykryj szkiełkiem nakrywkowym, przetrzyj krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Aby zapobiec przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego i przemieszczaniu tkanki, przed obrazowaniem należy pozwolić tkance osiąść na dnie wklęsłego szkiełka przez 10 do 15 minut.

Dla każdego łuku skrzelowego wybierz losowo sześć włókien skrzelowych do obrazowania, tworząc sześć obrazów na łuk skrzelowy. Użyj konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej, aby zobrazować tkankę, pobierając od jednego do trzech mikrometrowych wycinków optycznych na poniższych obrazach, cyty wskazane grotami strzałek wybarwiono przeciwciałem alfa pięć, a nerwy wskazane strzałkami wybarwiono przeciwciałem ZN 12. Ten konfokalny obraz włókna skrzelowego od ryby kontrolnej pokazuje unerwienie zewnętrzne z rozległymi rozgałęzieniami blaszki centralnego pęczka nerwowego, prawdopodobnie pochodzącego z dziewiątego i dziesiątego nerwu, jak widać na obrazie wstawki.

Niektóre ze wskazanych cytów są również unerwione. To zdjęcie pokazuje włókno skrzelowe dwa dni po pełnym obustronnym odnerwieniu. Nastąpiło zmniejszenie pęczka nerwu centralnego, podczas gdy unerwienie laminarne wydawało się w dużej mierze nienaruszone.

W tym przypadku włókno skrzelowe pokazane pięć dni po pełnym obustronnym odnerwieniu pokazuje, że unerwienie zewnętrzne jest obecnie w dużej mierze nieobecne. Analiza jakościowa sugeruje, że pełne obustronne odnerwienie powoduje degradację zewnętrznego unerwienia skrzeli przy jednoczesnym utrzymaniu nerwów z ciałami komórkowymi we włóknie skrzelowym, tworząc sieć nerwów przez włókno i do kulawy. Procedura ta może być połączona z innymi metodami, takimi jak pomiar strumieni jonów, przy użyciu jonów radioaktywnych, takich jak sód 22, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania badawcze.