Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Ogólnym celem tej procedury jest ominięcie ograniczeń pośredniej immunofluorescencji w celu zbadania nerwowych komórek progenitorowych. Gdy odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne. Początkowo wstrzykuje się analog tymidyny w celu oznaczenia dzielących się komórek, po czym tkanka jest zbierana, przetwarzana i krojona na krioskrawki.

Następnie przeprowadza się sekwencyjną immunofluorescencję mnogą, aby rozpocząć. Stosuje się nieznakowane przeciwciało pierwszorzędowe, które jest następnie wiązane przez fluorescencyjnie znakowane przeciwciało drugorzędowe. Następnie otwarte perykopy na pierwszym przeciwciałie drugorzędowym są blokowane surowicą z gatunku przeciwciała pierwszorzędowego, a wszystkie immunoglobuliny, które mogłyby być rozpoznane przez drugie przeciwciało drugorzędowe, są pokryte niesprzężonymi fragmentami fab.

Pozwala to na potraktowanie tkanki drugim przeciwciałem pierwszorzędowym, które może być znakowane innym przeciwciałem drugorzędowym. Ostatecznie obrazy skrawków są wykorzystywane do badania rozwoju i regulacji nerwowych komórek progenitorowych w odpowiedzi na określone bodźce i ich udziału w określonych funkcjach mózgu. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak jednoczesna immunofluorescencja wielokrotna, jest to, że pozwala ona uniknąć problemów wynikających zwykle z konieczności stosowania przeciwciał pierwotnych wytwarzanych u tego samego gatunku gospodarza.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neurogenezy dorosłych, takie jak proliferacja podzbiorów progenitorów hipokampa w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne lub farmakologiczne, patologie mózgu lub starzenie się. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, będą miały trudności, ponieważ wielokrotne znakowanie pierwszorzędowymi przeciwciałami z tego samego gatunku gospodarza może prowadzić do niepożądanych działań krzyżowych przeciwciał bez odpowiedniego blokowania. Najpierw zważ zwierzęta, które mają być wstrzyknięte i przygotuj świeży roztwór podstawowy analogu tymidyny o stężeniu 10 miligramów na mililitr do wstrzyknięcia.

Gdy roztwór jest gotowy, przygotować dawkę dostosowaną do masy ciała w strzykawce z drobną igłą o rozmiarze 30. Następnie przytrzymaj mysz za kark i wstrzyknij analog tymidyny dootrzewnowo w żądanym punkcie czasowym, głęboko znieczulij mysz i trans cardio. Wypełnij go 10 mililitrami lodowatego PBS, a następnie 40 mililitrami świeżego, lodowatego roztworu formaldehydu.

Następnie wypreparuj mózg i umocuj go w tym samym utrwalaczu po fiksacji. Inkubuj zebrane mózgi przez 24 godziny w 10% sacharozie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś mózgi do 30% sacharozy i inkubuj przez kolejne 48 godzin.

Gdy mózgi są gotowe do krioochrony, zamroź je w ujemnym 25 stopniach Celsjusza izop pentanu. Później użyj kriostatu, aby wyciąć 40-mikronowe odcinki koronalne w celu długotrwałego przechowywania. Przenieś skrawki do roztworu niezamarzającego i utrzymuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Zacznij od przeniesienia skrawków z roztworu niezamarzającego do TBS za pomocą cienkiej szczotki. Dokładnie spłucz sekcje, zaczynając od nocnego prania w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie pięciu 10-minutowych prań w temperaturze pokojowej. Wszystkie te inkubacje powinny być wykonywane z ciągłym, delikatnym mieszaniem.

Jeśli jednym z antygenów będących przedmiotem zainteresowania jest analog tymidyny, w tym momencie należy przeprowadzić etap denaturacji kwasu solnego, a następnie etap neutralizacji w buforze wiertniczym. Kontynuuj przepuszczalność i blokowanie niespecyficznych miejsc wiązania przeciwciał w TBS plus. Pozostaw tę inkubację na godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubuj w pierwszym pierwszorzędowym przeciwciałie rozcieńczonym w TBS plus przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia.

Umyj sekcje trzy razy w TBS i raz w TBST. Pozwól każdej kąpieli trwać 10 minut. Następnie inkubować w pierwszym przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z fluorochromem przez trzy godziny w temperaturze pokojowej.

Od teraz chroń sekcje przed działaniem światła. Po kolejnej serii przemywania przenieś skrawki do 10% roztworu surowicy gatunku gospodarza, z którego wytworzono dwa podstawowe przeciwciała. Inkubować skrawki w tym roztworze przez trzy godziny, aby nasycić otwarte perykopy pierwszym przeciwciałem drugorzędowym.

Później spłucz trzy razy w TBS i raz w TBST, aby usunąć serum. Następnie przygotuj roztwór TBS plus z 50 mikrogramami na mililitr niesprzężonych monowalentnych fragmentów fab skierowanych przeciwko gatunkom gospodarza przeciwciała pierwszorzędowego. Obejmuje to epitopy, które w przeciwnym razie mogłyby zostać rozpoznane przez drugie przeciwciało drugorzędowe.

Przenieś skrawki do tego roztworu i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji przepłukać skrawki co najmniej trzy razy w TBS i raz w TBST. Podczas przenoszenia przetrzyj wkładki siatkowe zawierające sekcje na ręczniku papierowym, aby usunąć resztki fab.

Teraz inkubuj skrawki drugiego przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po kolejnej serii płukania nałóż drugie przeciwciało wtórne na trzy godziny w temperaturze pokojowej. Na koniec umyj sekcje trzy razy w TBS i przystąp do montażu sekcji żelatyny.

Wysuszyć szkiełka i nakryć je na powietrzu za pomocą nośnika montażowego ANTIFA. Fluorescencyjne znakowane skrawki za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Zrób stosy obrazów w losowych miejscach na całej długości zakrętu zębatego przy 400-krotnym powiększeniu.

Przeanalizuj co najmniej 50 losowo wybranych komórek zainteresowania na półkulę w celu wspólnego znakowania różnych markerów. Aby obliczyć liczby bezwzględne dla określonych populacji komórek nowonarodzonych, pomnóż procenty komórek znakowanych co przez całkowitą liczbę nowo narodzonych komórek oszacowaną na podstawie analizy barwienia DAB. Opisane metody wykorzystano do ilościowego określenia i scharakteryzowania noworodków w hipokampie postnatalnym i dorosłym z niedoborem neurogenezy.

Model myszy z dwoma nokautami, barwienie DAB na podstawie różnych markerów proliferacji, takich jak KI 67 lub BRDU, konsekwentnie ujawniało różnice w liczbie komórek noworodków między myszami typu dzikiego i nokautowego. Nowonarodzone komórki znakowane BRDU mogą być fenotypowane za pomocą konwencjonalnego protokołu wielokrotnej immunofluorescencji polegającego na jednoczesnym zastosowaniu pierwszorzędowych przeciwciał przeciwko gnieździe B-R-D-U-G-F-A-P w GFP i podwójnej courtynie. Pozwoliło to na pomyślną identyfikację nowonarodzonych komórek progenitorowych typu pierwszego, typu drugiego A, typu drugiego B i typu trzeciego w obrębie jednej próbki.

Alternatywnie, przy dłuższych odstępach czasu między wstrzyknięciem BRDU a uśmierceniem zwierzęcia, ostateczna liczba nowonarodzonych neuronów może być analizowana przez jednoczesne barwienie immunologiczne BRDU new n. Protokół sekwencyjnego znakowania immunologicznego działał doskonale, jeśli sekcje były najpierw inkubowane jednocześnie z króliczymi przeciwciałami anty KI 67, kozimi anty GFP i świnki morskiej przeciwko podwójnemu kordonowi, a po drugie, z króliczymi przeciwciałami anty GFAP, ale nie odwrotnie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować do czterech różnych antygenów w pojedynczej sekcji tkanki przy użyciu pierwotnych przeciwciał podniesionych w tym samym gospodarzu.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o uwzględnieniu odpowiednich kontroli, aby wyeliminować możliwość wystąpienia przeciwciał, reaktywności krzyżowej lub wyników fałszywie dodatnich. Należy pamiętać, że sekwencja inkubacji przeciwciał pierwotnych może silnie wpływać na wynik protokołu.