Name: Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę sekwencyjnej wielokrotnej immunofluorescencji do badania neurogenezy hipokampa u dorosłych myszy. Protokół umożliwia wykrywanie wielu antygenów przy użyciu przeciwciał z tego samego gatunku gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują S. Tauschowi za doskonałą pomoc techniczną. Prace były wspierane przez BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) oraz DFG (FOR1738).

UWAGA: Wszystkie procedury z udziałem żywych zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dyrektywy WE 86/609/EEC dotyczącej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz zostały zatwierdzone przez lokalny komitet etyczny (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
1. Dostrzykławe wstrzykiwanie analogów tymydyny
<ol>
	<li>Zważ zwierzęta w dniu poprzedzającym iniekcję. Oblicz ilość analogu tymidyny wymaganą do wszystkich iniekcji zaplanowanych na następny dzień, a także indywidualne, dostosowane do masy ciała objętości iniekcji z roztworu zapasowego o stężeniu 10 mg/ml.</li>
	<li>Przygotuj roztwór zapasowy tymidyny o stężeniu 10 mg/ml. (UWAGA! Analogi tymidyny są toksyczne. Należy przestrzegać szczegółowych kart charakterystyki materiałów (MSDS) dostarczonych przez dostawców, tj., nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki oraz pracować w dygestorium).
	<ol>
		<li>Wyjmij analog tymidyny z zamrażarki i doprowadź go do temperatury pokojowej (RT), ok. 21 °C. Odważ 10 mg i dodaj jałową sól fizjologiczną (dla BrdU i CldU) lub 0,04 N NaOH (w jałowej soli fizjologicznej; dla IdU), a następnie wymieszaj w wortexie. Umieść próbkę na co najmniej 10 - 15 min w kąpieli wodnej o temperaturze 50 °C i mieszaj w wortexie co 2 - 3 min, aż proszek się rozpuści. 
		UWAGA: Roztworów można używać do 24 h przy przechowywaniu w RT oraz przez kilka tygodni w temperaturze -20 °C. Należy chronić roztwory przed światłem (przykryć folią aluminiową). Zawsze sprawdzać obecność osadów i w razie potrzeby rozpuścić je ponownie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymaj mysz za kark i wstrzyknij dopaszytelną do masy ciała objętość roztworu zapasowego (w RT) drogą dosytrytonalną, używając precyzyjnej strzykawki dozującej z igłą 30 G. 
	UWAGA: W przypadku konieczności sekwencyjnego podania CldU i IdU temu samemu zwierzęciu, należy rozważyć wstrzyknięcie stężeń ekwimolarnych (np., 42,5 mg/kg CldU i 57,5 mg/kg IdU, co odpowiada 50 mg/kg BrdU). W związku z tym należy odpowiednio dostosować objętości iniekcji roztworów zapasowych o stężeniu 10 mg/ml.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanki
<ol>
	<li>W dniu poprzedzającym perfuzję przygotować 4% formaldehyd w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Głęboko znieczulone myszy (3,5% izofluranu) poddać perfuzji transkardialnej przez lewą komorę serca, stosując 10 ml lodowatego PBS, a następnie 40 ml lodowatego formaldehydu (przepływ 5 ml/min). Wypreparować mózg i poddać postfiksacji w tym samym utrwalaczu przez 24 h w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Mózgi przenosić sukcesywnie do 10% sacharozy (24 h w 4°C), a następnie do 30% sacharozy (aż do momentu opadnięcia mózgu na dno, ok. 48 h). W celu zamrożenia kryoprotektowane mózgi powoli zanurzyć w izopentanie o temperaturze -25 °C, aż do czasu, gdy z tkanki przestaną wydostawać się pęcherzyki powietrza. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Wyciąć przekroje koronalne o grubości 40 µm przy użyciu mikrotomu kriostatycznego (temperatura bloku od -25 do -16 °C). Przenosić sekcje sekwencyjnie do roztworu przeciwzamrożeniowego w dołkach 24-dołkowej płytki hodowlanej (patrz Rysunek 1). Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
<img alt="Układ płytki 96-dołkowej, schemat przeniesienia cieczy w eksperymencie laboratoryjnym, diagram ilustrujący metodę." src="/files/ftp_upload/52551/52551fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczne przedstawienie przenoszenia skrawków z mikrotomu do płytki 24-dołkowej. Zacznij od pola A1 i umieszczaj kolejne skrawki w rzędzie A; po A6 przejdź do następnego rzędu B i tak dalej. Po dotarciu do D6 wróć do A1 i kontynuuj. Taki układ skrawków umożliwia kwantyfikację każdego ntego przekroju całego mózgu. W celu kwantyfikacji nowo powstałych komórek należy pobrać co 6ty przekrój mózgu (odpowiednik zawartości jednej kolumny), a dla fenotypowania immunofluorescencyjnego co 12ty przekrój (odpowiednik zawartości 2 naprzemiennych rzędów jednej kolumny).
3. Immunobarwienie
UWAGA: Przekroje są przetwarzane w formie swobodnie pływającej, zazwyczaj w płytkach 6-dołkowych wyposażonych w płytkę nośną i wkładki siatkowe. Wyjątek stanowią blokowanie, inkubacje z przeciwciałami oraz reakcja ABC, które są przeprowadzane w płytkach 12- lub 24-dołkowych bez wkładek siatkowych (wystarczy od 0,5 do 1 ml na dołek, w zależności od liczby przekrojów do zabarwienia). Podczas tych etapów należy przenosić przekroje za pomocą cienkiego pędzla (płucząc go przy każdym nowym roztworze). Wszystkie inkubacje przeprowadzane są przy ciągłym mieszaniu (maks. 150 rpm).
<ol>
	<li>Immunohistochemia (metoda ABC)
	<ol>
		<li>Przenieść skrawki z płynu przeciwzamrażającego do TBS i dokładnie wypłukać (raz przez noc w 4 °C, 5 razy w temperaturze pokojowej przez 10 min każdy), aby całkowicie usunąć płyn przeciwzamrażający.</li>
		<li>Inkubować przez 30 min w 1,5% H2O2 w TBS-T, aby zneutralizować endogenną aktywność peroksydazy. Zwrócić uwagę na powstawanie pęcherzyków i w razie potrzeby ponownie zanurzyć skrawki. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy.</li>
		<li>Opcjonalnie: W tym czasie wstępnie podgrzać inkubator i 2 N HCl do 37 °C. Inkubować skrawki przez 30 min w 37 °C w 2 N HCl w celu denaturacji DNA. Delikatnie oddzielić skrawki za pomocą pędzla.</li>
		<li>Opcjonalnie: Neutralizować skrawki przez 10 min w 0,1 M buforze boranowym pH 8,5 w temperaturze pokojowej. Podczas przenoszenia krótko osuszyć wkładki siatkowe zawierające skrawki ręcznikiem papierowym, aby usunąć pozostałości HCl. Płukać 2 razy w TBS przez 15 min każdy.</li>
		<li>Inkubować w TBSplus w celu permeabilizacji tkanki i blokowania nieswoistych miejsc wiązania przeciwciał przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować w przeciwciałach pierwszorzędowych rozcieńczonych w TBSplus przez noc w 4 °C. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy.</li>
		<li>Inkubować w biotynylowanych przeciwciałach wtórnych rozcieńczonych w TBSplus przez 3 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy. W międzyczasie...</li>
		<li>Przygotować kompleks ABC zgodnie z protokołem producenta (1% A + 1% B w TBS-T). Odstawić na 30 min w temperaturze pokojowej przed użyciem. Inkubować skrawki w odczynniku AB przez 1 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy.</li>
		<li>Przygotować 50 ml 0,5 mg/ml DAB w TBS-T na płytkę 6- lub 12-dołkową, podzielić na dwie połowy i pipetować odpowiednio 4 ml lub 2 ml na dołek. Przenieść skrawki do roztworu DAB (UWAGA! DAB jest toksyczny. Należy przestrzegać specyficznych wytycznych MSDS dostarczonych przez dostawcę, np. nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki, pracować pod wyciągiem chemicznym).</li>
		<li>Dodać 0,5 ml 1% H2O2 do pozostałych 25 ml roztworu DAB, wymieszać i pipetować do każdego dołka objętości odpowiadające tym podanym wyżej, aby rozpocząć reakcję peroksydazy. Inkubować przez 12 min. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy.</li>
		<li>Zamontować skrawki na szkiełkach w żelatynie, wysuszyć na powietrzu przez noc. Przykryć szkiełkiem przy użyciu trwałego medium montażowego.</li>
		<li>Opcjonalnie: Wykonać przeciwbarwienie przed nałożeniem szkiełka (patrz sekcja 3.5). 
		UWAGA: Jeśli stosunek sygnału do szumu jest niski z powodu wysokiego tła, powtórzyć zabieg z H2O2 po inkubacji z odczynnikiem AB (krok 3.1.8).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wielokrotna immunofluorescencja
	<ol>
		<li>Pojedyncza lub jednoczesna wielokrotna immunofluorescencja
		<ol>
			<li>Przenieść skrawki z płynu przeciwzamrażającego do TBS i dokładnie wypłukać (raz przez noc w 4 °C, 5 razy w temperaturze pokojowej przez 10 min każdy), aby całkowicie usunąć płyn przeciwzamrażający.</li>
			<li>Opcjonalnie: zgodnie z krokami 3.1.3 - 3.1.4.</li>
			<li>Inkubować w TBSplus w celu permeabilizacji tkanki i blokowania nieswoistych miejsc wiązania przeciwciał przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Inkubować w koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych (np. szczur α-BrdU, świnia morska α-DCX, koza α-GFP) rozcieńczonych w TBSplus przez noc w 4 °C. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy.</li>
			<li>Inkubować w koktajlu przeciwciał wtórnych koniugowanych z fluorochromem (np. Rhodamine Red α-szczur, Alexa-647 α-świnia morska, Alexa-488 α-koza; wszystkie pochodzące od osła) rozcieńczonych w TBSplus przez 3 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C. Od tego momentu chronić skrawki przed światłem. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy.</li>
			<li>Zamontować skrawki na szkiełkach w żelatynie, wysuszyć na powietrzu przez noc. Przykryć szkiełkiem przy użyciu wodnego medium montażowego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sekwencyjna wielokrotna immunofluorescencja z przeciwciałami pierwszorzędowymi od tego samego gatunku gospodarza
		<ol>
			<li>Zgodnie z krokami 3.2.1.1 - 3.2.1.3.</li>
			<li>Inkubować w pierwszym przeciwciale pierwszorzędowym (np. królik α-antygen A) przez noc w 4 °C. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.</li>
			<li>Inkubować w pierwszym przeciwciale wtórnym koniugowanym z fluorochromem (np. osioł α-królik koniugowany z Rhodamine Red) przez 3 h w temperaturze pokojowej. Od tego momentu chronić skrawki przed światłem. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.</li>
			<li>Inkubować w 10% normalnym surowicy od tego samego gospodarza, co przeciwciała pierwszorzędowe (np. surowica królika) przez 3 h w temperaturze pokojowej, aby nasycić wolne paratopy pierwszego przeciwciała wtórnego. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.</li>
			<li>Inkubować w TBSplus z 50 µg/ml niekoniugowanych monowalentnych fragmentów Fab skierowanych przeciwko gospodarzowi przeciwciał pierwszorzędowych (np. α-królicze IgG (H+L)) w celu zablokowania epitopów, które mogłyby zostać rozpoznane przez drugie przeciwciało wtórne, przez noc w 4 °C.</li>
			<li>Płukać co najmniej 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy. Podczas przenoszenia krótko osuszyć wkładki siatkowe zawierające skrawki ręcznikiem papierowym, aby usunąć wszelkie pozostałości fragmentów Fab.</li>
			<li>Inkubować w drugim przeciwciale pierwszorzędowym (np. królik α-antygen B) przez noc w 4 °C. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.</li>
			<li>Inkubować w drugim przeciwciale wtórnym koniugowanym z fluorochromem (np. osioł α-królik koniugowany z Alexa-488) przez 3 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy, zamontować i przykryć szkiełkiem jak opisano powyżej. 
			UWAGA: Aby znakować antygeny przeciwciałami od różnych gatunków gospodarzy, należy dodać je w kroku 3.2.2.2 oraz odpowiednie przeciwciała wtórne w kroku 3.2.2.3.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Jedno z przeciwciał wtórnych od tego samego gatunku co jedno z przeciwciał pierwszorzędowych 
		UWAGA: Protokół ten jest odpowiedni dla potrójnego barwienia przeciwko BrdU lub Ki67 wraz z GFAP, nestin-GFP i DCX.
		<ol>
			<li>Ściśle przestrzegać kroków protokołu 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Do tego momentu używać wyłącznie surowicy osła w TBSplus.</li>
			<li>Inkubować w TBSplus zawierającym 3% surowicy koziej przez 1 h w temperaturze pokojowej. Blokuje to wolne paratopy w przeciwciale wtórnym α-koza. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.</li>
			<li>Inkubować w koza α-królik koniugowany z AMCA rozcieńczonym w TBSplus przez 3 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C. Płukać trzy razy w TBS przez 15 min każdy, zamontować i przykryć szkiełkiem jak opisano powyżej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Współbarwienie CldU i IdU
		<ol>
			<li>Płukać, denaturować i neutralizować skrawki zgodnie z opisem w sekcji 3.2.1 (kroki 3.2.1.1 - 3.2.1.2).</li>
			<li>Inkubować z 20 µg/ml niekoniugowanych fragmentów Fab α-mysie IgG (H+L) w TBSplus przez 1 h w temperaturze pokojowej. Płukać 4 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.</li>
			<li>Inkubować w koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych zawierającym szczur α-BrdU (1:400; oczyszczone IgG2) i mysz α-BrdU (1:350) rozcieńczonych w TBSplus przez noc w 4 °C. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.</li>
			<li>Inkubować w koktajlu przeciwciał wtórnych zawierającym biotynylowany osioł α-szczur (1:500) oraz fragmenty Fab osioł α-mysz koniugowane z FITC (1:100). Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy.</li>
			<li>Inkubować w Streptawidynie koniugowanej z Rhodamine Red przez 2 h w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy w TBS przez 15 min każdy, zamontować i przykryć szkiełkiem jak opisano powyżej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wzmocnienie sygnału fluorescencji u myszy nestin-GFP
		<ol>
			<li>Dodać koza α-GFP do koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych.</li>
			<li>Dodać przeciwciało wtórne koniugowane z fluorochromem o właściwościach spektralnych podobnych do GFP (takich jak osioł α-koza koniugowany z Alexa 488) do koktajlu przeciwciał wtórnych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uwalnianie epitopów
	<ol>
		<li>Przeprowadzić uwalnianie epitopów po wypłukaniu płynu przeciwzamrażającego. Wstępnie podgrzać parowar z płytkami 6- lub 12-dołkowymi zawierającymi 0,1 M bufor cytrynianowy pH 6,0 do 95 - 99 °C (około 25 min).</li>
		<li>Przenieść skrawki do gorącego buforu cytrynianowego i parować przez 30 min (przykryć płytki folią aluminiową, ponieważ plastikowe pokrywki nie są odporne na wysoką temperaturę).</li>
		<li>Natychmiast umieścić płytki w łaźni lodowej w celu schłodzenia. Pomaga to chronić morfologię tkanki, co jest szczególnie istotne przy pracy ze skrawkami mózgu zwierząt postnatalnych.</li>
		<li>Płukać 3 razy w TBS przez 10 min każdy, aby wypłukać i zneutralizować cytrynian, a następnie kontynuować barwienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeciwciała mysie na tkance mysiej
	<ol>
		<li>Dodać 20 µg/ml monowalentnych fragmentów Fab α-mysie IgG (H+L; ten sam gatunek gospodarza co przeciwciało wtórne) do pierwszego etapu blokowania (np. krok 3.1.5 lub 3.2.1.3).</li>
		<li>Płukać 4 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 min każdy, a następnie kontynuować odpowiedni protokół.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeciwbarwienie fioletem krezylu
	<ol>
		<li>Wstępnie podgrzać roztwór fioletu krezylu do 60 °C (w szklanym słoiku). Inkubować szkiełka w gorącym roztworze przez 3 min.</li>
		<li>Płukać w wodzie destylowanej i odwadniać 2 razy po 1 min w 70%, 96% i 100% izopropanolu.</li>
		<li>Przejrzyścieć przez 5 - 6 min w ksylenie lub zamienniku ksylenu i przykryć szkiełkiem za pomocą kompatybilnego trwałego medium montażowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Policz komórki noworodkowe barwione peroksydazą w każdym 6tym przekroju wzdłuż całego zasięgu rostrokaudalnego zakrętu zębatego. Wykorzystaj mikroskop świetlny przy powiększeniu 400X.</li>
	<li>Pomnóż otrzymaną liczbę komórek przez interwał przekrojów, aby uzyskać szacunkową całkowitą liczbę komórek noworodkowych.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie sekcji znakowanych fluorescencyjnie za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowego wyposażonego w odpowiednie lasery i systemy filtrów. Pobierz stosy obrazów w losowych pozycjach wzdłuż całego zasięgu zakrętu zębatego przy powiększeniu 400X i przeanalizuj co najmniej 50 losowo wybranych komórek zainteresowania na każdą półkulę pod kątem współoznakowania innymi markerami.</li>
	<li>Pomnóż otrzymane wartości procentowe komórek współoznakowanych (%/100) przez całkowitą liczbę komórek noworodkowych, aby obliczyć bezwzględną liczbę konkretnych populacji komórek noworodkowych.</li>
</ol>

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).</li>
<li>Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+integration+and+plasticity+of+new+neurons+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus.</a> J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).</li>
<li>Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+period+for+enhanced+synaptic+plasticity+in+newly+generated+neurons+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain.</a> Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).</li>
<li>Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+is+adult+hippocampal+neurogenesis+necessary+for+learning%3F+evidence+from+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research.</a> Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).</li>
<li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+and+new+memories%3A+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).</li>
<li>Encinas, J. M., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+quantitating+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain.</a> Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).</li>
<li>Burns, K. A., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+doses+of+bromo-+and+iododeoxyuridine+produce+near-saturation+labeling+of+adult+proliferative+populations+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus.</a> Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).</li>
<li>Cameron, H. A., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+produces+a+large+pool+of+new+granule+cells+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus.</a> J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).</li>
<li>Vega, C. J., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+proliferative+history+in+tissue+revealed+by+temporal+halogenated+thymidine+analog+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination.</a> Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Brown, D. C., Gatter, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki67+protein%3A+the+immaculate+deception%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Ki67 protein: the immaculate deception.</a> Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).</li>
<li>Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+using+nestin+promoter-GFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice.</a> Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).</li>
<li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+hippocampal+neurons+in+adult+mice+living+in+an+enriched+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment.</a> Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).</li>
<li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+D2+is+an+FSH-responsive+gene+involved+in+gonadal+cell+proliferation+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis.</a> Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).</li>
<li>Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+kinetics+of+dentate+gyrus+neurogenesis+in+the+absence+of+cyclin+D2%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2.</a> BMC Neurosci. 13, 46(2012).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis%3A+paradigms%2C+pitfalls%2C+limitations%2C+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).</li>
<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+immunocytochemistry%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li>
<li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+%28CldU+and+IdU%29+in+primary+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).</li>
<li>Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+epitope+retrieval+in+diagnostic+immunohistochemistry%3A+a+concise+review+with+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Immunohistochem.+Mol+Morphol%22%5BJournal%5D)">Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations.</a> Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Kwantyfikacja i identyfikacja subpopulacji nowo narodzonych komórek jest centralnym zagadnieniem w badaniach nad neurogenezą u dorosłych. Połączenie markerów proliferacji i przeciwciał przeciwko białkom ulegającym ekspresji na określonych etapach neurogenezy u dorosłych pozwala na immunohistochemiczne wykrycie tych subpopulacji. Niektóre przeciwciała lub kombinacje przeciwciał wymagają określonych warunków barwienia.
Znakowanie dzielących się komórek syntetycznymi analogami tymidyny jest nadal...

Dwa regiony mózgu konstytutywnie generują nowe neurony przez całe życie, strefa podkomorowa komór bocznych i strefa subziarnista (SGZ) zakrętu zębatego hipokampa (DG). Nowo narodzone neurony wywodzą się z nerwowych komórek progenitorowych i przechodzą przez różne etapy rozwoju morfologicznego i fizjologicznego, zanim osiągną dojrzałość1,2. Z wolno dzielącej się promienistej komórki macierzystej podobnej do gleju (typ 1) powstają kolejne etapy tranzytu, wzmacniające pośrednie komórki progenitorowe. Bardziej niezróżnicowane podtypy (typ 2a i typ 2b) mają nieregularny kształt z krótkimi, stycznymi wyrostkami. Generują neuroblasty (typ 3), które stopniowo opuszczają cykl komórkowy, aby stać się niedojrzałymi neuronami (z dendrytami rozciągniętymi w kierunku warstwy molekularnej) i ostatecznie integrują się z siecią hipokampa jako dojrzałe komórki ziarniste. Ze względu na swoje szczególne cechy fizjologiczne, komórki te zapewniają obwodom zwiększoną plastyczność3, co sugeruje wyjątkową rolę w funkcjonowaniu hipokampa. W rzeczywistości badania z ostatniej dekady dostarczyły istotnych dowodów na to, że neurogeneza dorosłych przyczynia się do pamięci przestrzennej, separacji wzorców i zachowań emocjonalnych.
Neurogeneza dorosłych może być badana przy użyciu różnych metod. Analogi tymidyny włączają się do DNA podczas fazy S cyklu komórkowego i umożliwiają datowanie urodzenia, kwantyfikację i analizę losu nowo narodzonych komórek6-8. Sekwencyjne stosowanie różnych analogów tymidyny (np. CldU, EdU lub IdU) można wykorzystać do badania obrotu komórkowego lub populacji komórek urodzonych w różnych punktach czasowych w trakcie eksperymentu9. Alternatywnym, endogennym markerem proliferacji komórek jest Ki67. Ulega ekspresji w dzielących się komórkach podczas wszystkich faz cyklu komórkowego (G1, S, G2, M) z wyjątkiem fazy spoczynku (G0) i początku G1 10,11. Do analizy fenotypu populacji komórek noworodka w dorosłym zakręcie zębatym można użyć kilku markerów molekularnych specyficznych dla danego etapu, takich jak GFAP, nestyna, DCX i NeuN1,6. GFAP jest markerem dojrzałych astrocytów, ale ulega również ekspresji w promienistych komórkach glejowych w dorosłym przodomózgowiu. Nestyna jest włóknem pośrednim specyficznym dla promienistych komórek glejowych i wczesnych pośrednich komórek progenitorowych. DCX jest białkiem związanym z mikrotubulami, ulegającym ekspresji w pośrednich przodkach, neuroblastach i niedojrzałych neuronach. Na podstawie (ko)ekspresji tych trzech markerów i cech morfologicznych znakowanych komórek można zidentyfikować cztery odrębne podtypy komórek progenitorowych: typ 1 (GFAP+, nestin+, DCX-), typ 2a (GFAP-, nestin+, DCX-), typ 2b (GFAP-, nestin+, DCX+) i typ 3 (GFAP-,nestin-, DCX+)1. Znakowanie DCX razem z NeuN, który ulega ekspresji w neuronach postmitotycznych, umożliwia różnicowanie niedojrzałych (DCX+, NeuN+) i dojrzałych (DCX-, NeuN+) neuronów ziarnistych.
Wyżej wymienione markery są często używane do immunofluorescencyjnego znakowania i późniejszej mikroskopii konfokalnej do analizy liczby i tożsamości nowo narodzonych komórek. Zazwyczaj wymaga to przeciwciał od różnych gatunków gospodarzy, aby zapobiec niepożądanej reaktywności krzyżowej przeciwciał. Jednak większość pierwotnych przeciwciał nadających się do badań neurogenezy jest hodowana u królików lub myszy (np. mysz α-BrdU, mysz α-NeuN, królik α-Ki67, królik α-GFAP). Prowadzi to do poważnych ograniczeń w liczbie i kombinacji antygenów, które można ocenić w jednym wycinku. To z kolei nie tylko zwiększa wysiłek związany z barwieniem, ponieważ konieczne jest wykonanie wielu barwień, ale może również zagrozić wiarygodności wyników. Ponadto niektóre antygeny są podatne na maskowanie epitopów wywołane wiązaniem formaliny (np. Ki67, nestyna). Opisujemy tutaj modyfikacje klasycznych protokołów pojedynczego i wielokrotnego znakowania immunologicznego (np. Pobieranie epitopów, wielokrotne sekwencyjne barwienie immunologiczne, użycie myszy transgenicznych nestin-GFP12), które przezwyciężają wiele z tych problemów. W szczególności sekwencyjny protokół wielokrotnej immunofluorescencji umożliwia barwienie przeciwko maksymalnie czterem różnym antygenom, nawet jeśli część przeciwciał pochodzi od tego samego gospodarza. Umożliwia to jednoczesne wykrywanie komórek progenitorowych typu 1, typu 2a, typu 2b i typu 3, a także ich aktywności proliferacyjnej w obrębie jednego przekroju.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Podawanie analogu tymidyny</td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-deoksyurydyna, BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285</td><td>toksyczna (mutagenna, teratogenna)</td></tr><tr><td>5-Chloro-2&prime;-deoksyurydyna, CldU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6891</td><td>toksyczna (mutagenna, teratogenna)</td></tr><tr><td>5-Chloro-2&prime;-deoksyurydyna, CldU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2105478</td><td>toksyczny (mutagenny, teratogenny)</td></tr><tr><td>5-Jodo-2&prime;-deoksyurydyna, IdU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100357</td><td>toksyczny (mutagenny, teratogenny)</td></tr><tr><td colspan="4">Przygotowanie tkanki</td></tr><tr><td>Isoflurane-Actavis</td><td>Piramal Healthcare</td><td>700211</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd w proszku (PFA)</td><td>Riedel-De H&auml; en</td><td>16005</td><td>toksyczna, łatwopalna</td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna PD5206</td><td>Heidolph Instruments</td><td>523-52060-00</td><td></td></tr><tr><td>Rurki laboratoryjne Masterflex Tygon, &Oslash; 0,8 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>06409-13</td><td></td></tr><tr><td>Igła do karmienia, prosta, 21 G, 1,75 mm końcówka oliwkowa, 40 mm</td><td>Agnthos</td><td>1036</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom do zamrażania Microm HM 400</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunohistochemia</td></tr> <tr><td>Parowiec Tefal vitacuisine</td><td>Tefal</td><td>VS 4001</td><td></td></tr><tr><td>Netwell 24 mm wkładki z siatki poliestrowej</td><td>Corning</td><td>3479</td><td>wstępnie załadowane w 6-dołkowe płytki hodowlane</td></tr><tr><td>Wkładki membranowe z siatki poliestrowej Netwell 15 mm</td><td>Corning</td><td>3477</td><td>wstępnie załadowany w 12-dołkowe płytki hodowlane</td></tr><tr><td>Plastikowy zestaw nośny 6-dołkowy Netwell</td><td>Corning</td><td>3521</td><td>do wkładów membranowych z siatki poliestrowej 24 mm Plastikowy</td></tr><tr><td>zestaw nośny Netwell 12-dołkowy Corning</td><td></td><td>3520</td><td>do wkładów membranowych z siatki poliestrowej 15 mm</td></tr><tr><td>Zestaw Vectastain Elite ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAB (hydrat tetrachlorowodorku 3,3&-diaminobenzydyny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5637</td><td>rakotwórczy, światłoczuły</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Przeciwciała pierwotne</td></tr><tr><td>Rabbit IgG1 &alpha;-Ki67</td><td>Novocastra/ Leica Biosystems</td><td>NCL-L-Ki67MM1</td><td>DAB 1:400/IF 1:100; wymaga pobrania epitopu</td></tr><tr><td>Królik &alpha;-GFAP, AS-3-GF</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>173 002</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Kozia IgG (H+L) &alfa;-GFP</td><td>Przeciwciała Acris</td><td>R1091P</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Mysie IgG1 &alfa;-nestin</td><td>Abcam</td><td>ab6142</td><td>1:200; wymaga pobrania epitopu</td></tr><tr><td>IgG świnki morskiej (H+L) &alpha;-Doublecortin</td><td>Merck Millipore</td><td>AB2253</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Szczur IgG2a &alpha;- BrdU (wodobrzusze)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030CX</td><td>do wykrywania BrdU; DAB 1:500/IF 1:400</td></tr><tr><td>Szczur IgG2a &alpha;-BrdU (oczyszczony)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030&nbsp; &nbsp;</td><td>do wykrywania CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400</td></tr><tr><td>Mysz IgG1 &alpha;-NeuN</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>mysz IgG1&#954; &#945;-BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>Do wykrywania IdU; DAB 1:500/IF 1:350</td></tr><tr><td colspan="4">Przeciwciała drugorzędowe</td></tr><tr><td>Osioł &alfa;-świnka morska IgG (H+L)-Biotyna</td><td>Dianova</td><td>711-065-152</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Osioł &alfa;-szczur IgG (H+L)-Biotyna</td><td>Dianova</td><td>712-065-150</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Osioł &alfa;-mysz IgG (H+L)-Biotyna</td><td>Dianova</td><td>715-065-151</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Koza &alfa;-szczur IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11006</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Osioł &alfa;-koza IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11055</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Osioł &alfa;-mysz IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td><td>Dianova</td><td>715-097-003</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Osioł &alfa;-mysz IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>715-605-151</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Osioł &alfa;-świnka morska IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>706-605-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Osioł &alfa;-szczur IgG (H+L)-Rhodamina Red-X</td><td>Dianova</td><td>712-295-150</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Osioł &alfa;-królik IgG (H+L)-Rodamina Red-X</td><td>Dianova</td><td>711-295-152</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Osioł &alfa;-świnka morska IgG (H+L)-Rhodamina Red-X</td><td>Dianova</td><td>706-296-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Streptawidyna-rodamina Red-X</td><td>Dianova</td><td>016-290-084</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Koza &alfa;-królik IgG (H+L)-AMCA</td><td>Dianova</td><td>111-155-144</td><td>1:250, działa tylko z królikiem &alpha;-GFAP</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sondy molekularne</td><td>H3570</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>DAPI</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td colspan="4">Blokowanie </td></tr><tr><td>Fab-fragment osioł &alfa-mysz IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>715-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Fab-fragment osioł &alfa;-królik IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>711-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica królika</td><td>Dianova</td><td>011-000-010</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Dianova</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Histology</td></tr>fiolet <tr><td>krezylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Neo-Clear</td><td>Merck Millipore</td><td>109843</td><td>nietoksyczny substytut ksylenu</td></tr><tr><td>Neo-Mount</td><td>Merck Millipore</td><td>109016</td><td>trwałe podłoże montażowe</td></tr><tr><td colspan="4">mikroskopia</td></tr><tr><td>Axioskop 2</td><td>Carl Zeiss Mikroskopia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>Carl Zeiss Mikroskopia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Neurogeneza dorosłych to wysoce regulowany, wieloetapowy proces, w którym nowe neurony są generowane z aktywowanej nerwowej komórki macierzystej poprzez coraz bardziej zaangażowane pośrednie podtypy progenitorowe. Każdy z tych podtypów wyraża zestaw specyficznych markerów molekularnych, które wraz z określonymi kryteriami morfologicznymi można wykorzystać do ich identyfikacji. Zazwyczaj stosuje się techniki immunofluorescencyjne obejmujące przeciwciała specyficzne dla podtypu w połączeniu z egzo- lub endogennymi markerami proliferacji. Opisujemy tutaj metody znakowania immunologicznego do wykrywania i kwantyfikacji wszystkich etapów neurogenezy hipokampa u dorosłych. Obejmują one zastosowanie analogów tymidyny, perfuzję przezsercową, przetwarzanie tkanek, odzyskiwanie epitopów pod wpływem ciepła, immunohistochemię ABC, wielokrotną immunofluorescencję pośrednią, mikroskopię konfokalną i kwantyfikację komórek. Ponadto przedstawiamy sekwencyjny protokół immunofluorescencji mnogiej, który pozwala uniknąć problemów wynikających zwykle z konieczności stosowania przeciwciał pierwotnych wyhodowanych u tego samego gatunku gospodarza. Pozwala na dokładną identyfikację wszystkich podtypów progenitorów hipokampa wraz z markerem proliferacji w obrębie jednej sekcji. Techniki te są potężnym narzędziem do badania równoległej regulacji różnych podtypów progenitorów, ich udziału w patologiach mózgu i ich roli w określonych funkcjach mózgu.

Opisane powyżej metody zastosowano w celu ilościowego oznaczenia i charakterystyki nowo powstałych komórek w hipokampie w okresie ponatalnym oraz u osobników dorosłych. W tym celu wykorzystano myszy typu dzikiego oraz myszy z wyłączonym genem cykliny D2 (Ccnd2KO), wykazujące niedobór neurogenezy, utrzymywane w warunkach znanych z wpływu na tempo neurogenezy (t.j. środowisko wzbogacone, EE)13,14. Immunohistochemiczne barwienie DAB przeciwko markerom Ki67, BrdU, CldU lub IdU konsekwentnie wykaz...

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obejście ograniczeń pośredniej immunofluorescencji w celu badania komórek progenitorowych neuronów w sytuacjach, gdy niedostępne są odpowiednie przeciwciała pierwotne pochodzące od różnych gatunków gospodarzy. W pierwszej kolejności wstrzykuje się analog tymidyny, aby oznakować dzielące się komórki, po czym pobiera się tkankę, przetwarza ją i wykonuje skrawki kriotomiczne.Następnie rozpoczyna się sekwencyjną wielokrotną immunofluorescencję. Nakłada się nieznakowane przeciwciało pierwszorzędowe, które następnie zostaje związane przez znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe. W kolejnym kroku wolne miejsca wiążące pierwszego przeciwciała drugorzędowego blokuje się surowicą z gatunku, z którego pochodzi przeciwciało pierwszorzędowe, a wszystkie immunoglobuliny, które mogłyby zostać rozpoznane przez drugie przeciwciało drugorzędowe, pokrywa się niekonjugowanymi fragmentami fab.Umożliwia to potraktowanie tkanki drugim przeciwciałem pierwszorzędowym, które może zostać znakowane innym przeciwciałem wtórnym. Ostatecznie obrazy tych przekrojów są wykorzystywane do badania rozwoju i regulacji komórek progenitorowych neuronów w odpowiedzi na konkretne bodźce oraz ich udział w określonych funkcjach mózgu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak jednoczesna wielokrotna immunofluorescencja, jest to, że pozwala ona uniknąć problemów zazwyczaj wynikających z konieczności stosowania przeciwciał pierwszorzędowych wytworzonych u tego samego gatunku gospodarza.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurogenezy u osobników dorosłych, takie jak proliferacja podzbiorów prekursorów hipokampa w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne lub farmakologiczne, patologie mózgu lub starzenie się. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ wielokrotne znakowanie przeciwciałami pierwotnymi pochodzącymi z tego samego gatunku gospodarza może prowadzić do niepożądanych reakcji krzyżowych przeciwciał w przypadku niewłaściwego blokowania. W pierwszej kolejności zważ zwierzęta przeznaczone do iniekcji i przygotuj świeży roztwór zapasowy analogu tymidyny o stężeniu 10 mg/mL do wstrzyknięcia.Po przygotowaniu roztworu, odmierz dawkę dostosowaną do masy ciała do precyzyjnej strzykawki z igłą o rozmiarze 30 G. Następnie unieruchom mysz, chwytając ją za kark, i w odpowiednim punkcie czasowym wykonaj doszpikowy wtrysk analogu tymidyny. Głęboko znieczul mysz i przeprowadź perfuzję przezsercową, stosując 10 ml lodowatego PBS, a następnie 40 ml świeżego, lodowatego roztworu formaldehydu.Następnie wypreparuj mózg i pień mózgu, a potem utrwal je w tym samym utrwalaczu zgodnie z procedurą fiksacji. Inkubuj zebrane mózgi przez 24 godziny w 10% sacharozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś mózgi do 30% sacharozy i inkubuj przez kolejne 48 godzin.Gdy mózgi będą przygotowane do krioprotekcji, zamrozić je w izopentanie w temperaturze -25 °C. Następnie, przy użyciu kriotomu, wykonać koronalne przekroje o grubości 40 µm do długoterminowego przechowywania. Przenieść przekroje do roztworu przeciwzamrożeniowego i przechowywać je w temperaturze -20 °C.Rozpocznij od przeniesienia skrawków z roztworu przeciwzamrożeniowego do buforu TBS za pomocą cienkiego pędzla. Dokładnie wypłucz skrawki, zaczynając od płukania przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie wykonaj pięć 10-minutowych płukań w temperaturze pokojowej. Wszystkie te inkubacje należy przeprowadzać przy ciągłym, delikatnym mieszaniu.Jeśli jednym z badanych antygenów jest analog tymidyny, na tym etapie należy przeprowadzić etap denaturacji kwasem solnym, a następnie etap neutralizacji w buforze borowym. Następnie należy przeprowadzić permeabilizację oraz blokowanie nieswoistych miejsc wiązania przeciwciał w buforze TBS plus. Inkubację tę należy prowadzić przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować w pierwszym przeciwciele pierwotnym rozcieńczonym w TBS plus przez noc w temperaturze 4 °C następnego dnia.Przemyj przekroje trzy razy w TBS i raz w TBST. Każde płukanie powinno trwać 10 minut. Następnie inkubuj w pierwszym przeciwciele wtórnym sprzężonym z fluorochromem przez trzy godziny w temperaturze pokojowej.Od tego momentu należy chronić skrawki przed ekspozycją na światło. Po kolejnej serii płukań przenieść skrawki do 10% roztworu surowicy gatunku gospodarza, z którego uzyskano oba przeciwciała pierwszorzędowe. Inkubować skrawki w tym roztworze przez trzy godziny, aby nasycić wolne miejsca wiązania dla pierwszego przeciwciała wtórnego.Następnie wypłucz próbki trzykrotnie w TBS i raz w TBST, aby usunąć surowicę. Potem przygotuj roztwór TBS z dodatkiem 50 µg/mL niekonjugowanych monowalentnych fragmentów Fab skierowanych przeciwko gatunkowi gospodarza przeciwciała pierwszorzędowego. Pozwala to na zablokowanie epitopów, które w przeciwnym razie mogłyby zostać rozpoznane przez drugie przeciwciało wtórne.Przenieś skrawki do tego roztworu i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C. Po inkubacji przemyj skrawki co najmniej trzy razy w TBS i raz w TBST. Podczas przenoszenia delikatnie osusz wkładki z siatką zawierające skrawki za pomocą ręcznika papierowego, aby usunąć pozostałości fab.Następnie inkubuj skrawki z drugim przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po kolejnej serii płukań nałóż drugie przeciwciało wtórne na trzy godziny w temperaturze pokojowej. Na koniec przemyj skrawki trzykrotnie w TBS i przystąp do montowania skrawków w żelatynie.Osusz preparaty powietrzem i zamknij je za pomocą medium montażowego ANTIFA. Przeanalizuj sekcje znakowane fluorescencyjnie przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Wykonaj stosy obrazów w losowych miejscach wzdłuż całego obszaru zakrętu zębatego przy 400-krotnym powiększeniu.Przeanalizuj co najmniej 50 losowo wybranych komórek zainteresowania na każdą półkulę pod kątem ko-znakowania różnych markerów. Aby obliczyć liczby bezwzględne dla konkretnych populacji nowo powstałych komórek, pomnóż procenty komórek ko-znakowanych przez całkowitą liczbę nowo powstałych komórek oszacowaną na podstawie analizy barwienia DAB. Opisane metody zostały wykorzystane do kwantyfikacji i charakterystyki nowo powstałych komórek w hipokampie postnatalnym i dorosłym u linii z deficytem neurogenezy.W modelu mysim z knockoutem genu D dwa, barwienie DAB przeciwko różnym markerom proliferacji, takim jak KI 67 lub BRDU, konsekwentnie wykazywało różnice w liczbie nowo powstałych komórek między myszami typu dzikiego a myszami z knockoutem. Nowo powstałe komórki znakowane BRDU można było sfeno-typować za pomocą konwencjonalnego protokołu wielokrotnej immunofluorescencji, polegającego na jednoczesnym zastosowaniu przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko B-R-D-U-G-F-A-P nest w GFP oraz double courtin. Pozwoliło to na skuteczną identyfikację nowo powstałych komórek progenitorowych typu jednego, typu dwa A, typu dwa B i typu trzy w obrębie jednego preparatu.Alternatywnie, przy dłuższych odstępach czasu między wstrzyknięciem BRDU a uśmierceniem zwierzęcia, końcową liczbę nowo powstałych neuronów można przeanalizować poprzez jednoczesne barwienie immunohistochemiczne na BRDU. Protokół sekwencyjnego znakowania immunologicznego działał bezbłędnie, jeśli skrawki inkubowano najpierw jednocześnie z przeciwciałami króliczymi anty-KI 67, kozimi anty-GFP i świnkowymi anty-double cordon, a następnie z przeciwciałem króliczym anty-GFAP, lecz nie w odwrotnej kolejności. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wizualizować do czterech różnych antygenów w jednym skrawku tkanki, stosując przeciwciała pierwotne wytworzone u tego samego gospodarza.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu odpowiednich kontroli w celu wyeliminowania możliwości reaktywności krzyżowej przeciwciał lub wyników fałszywie dodatnich. Należy mieć na uwadze, że kolejność inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych może mieć silny wpływ na wynik protokołu.

immunohistochemistry-multiple-labeling-with-antibodies-from-same-host

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami z tego samego gatunku gatunku żywiciela w celu badania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Wideo ilustruje metodę barwienia immunofluorescencyjnego używaną do badania neurogenezy w dorosłym hipokampie. Początkowo wycinek mózgu myszy jest poddawany leczeniu pierwotnymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko białkom markerowym związanym z neurogenezą w neuronalnych komórkach progenitorowych. Następnie jest znakowany przeciwciałami drugorzędowymi oznaczonymi fluoroforami. Sekcja mózgu jest następnie obserwowana pod mikroskopem konfokalnym w celu rozróżnienia różnych podtypów komórek...

Technika barwienia immunofluorescencyjnego do wykrywania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Ten film demonstruje procedurę barwienia nowo rozmnożonych nerwowych komórek macierzystych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą inkorporacji EdU, a następnie immunofluorescencji w celu wizualizacji określonych białek, zwiększając zrozumienie dynamiki i proliferacji komórek.

Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji rozproszyłych nerwowych komórek macierzystych w wycinkach mózgu myszy

Lokalizacja i dystrybucja białek dostarcza ważnych informacji dla zrozumienia ich funkcji komórkowych. Doskonała rozdzielczość przestrzenna mikroskopii elektronowej (EM) może być wykorzystana do określenia subkomórkowej lokalizacji danego antygenu po immunohistochemii. W przypadku tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) zachowanie integralności strukturalnej przy jednoczesnym zachowaniu antygenowości było szczególnie trudne w badaniach EM. Tutaj przyjmujemy procedurę, która została...

Znakowanie białek synaptycznych po zatopieniu Immunogold w kulturach warstw hipokampa

Podczas neurogenezy dorosłego hipokampa, wyraźny zestaw markerów genetycznych ulega ekspresji, gdy spokojna nerwowa komórka macierzysta sekwencyjnie rozwija się i rozwija w funkcjonalnie zintegrowany neuron w obwodzie. Korzystając z indukowanego ciepłem odzyskiwania antygenu, typy komórek progenitorowych, które w innym przypadku są trudne do wykrycia, są identyfikowane z większą skutecznością.

Odzyskiwanie antygenu wywołane ciepłem: skuteczna metoda wykrywania i identyfikacji typów komórek progenitorowych podczas neurogenezy dorosłego hipokampa

Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.

Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Opisujemy protokół immunohistochemiczny do badania profilu aktywacji neuronów hipokampa po ekspozycji na zadanie uczenia przestrzennego w modelu mysim charakteryzującym się deficytami poznawczymi pochodzenia neurorozwojowego. Protokół ten może być stosowany zarówno do genetycznych, jak i farmakologicznych modeli myszy charakteryzujących się deficytami poznawczymi.

Immunohistochemiczna wizualizacja aktywności neuronów hipokampa po uczeniu przestrzennym w mysim modelu zaburzeń neurorozwojowych

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Ten artykuł przedstawia cztery najpopularniejsze techniki wizualizacji komórek BrdU dodatnich do pomiaru neurogenezy u dorosłych szczurów. Praca ta zawiera instrukcje dotyczące przygotowania odczynników, podawania analogu tymidyny, perfuzji przezsercowej, przygotowania tkanek, reakcji immunohistochemicznej peroksydazy, immunofluorescencji, wzmocnienia sygnału, barwienia przeciwstawnego, obrazowania mikroskopowego i analizy komórek.

Techniki immunohistochemiczne do analizy proliferacji komórkowej i neurogenezy u szczurów przy użyciu analogu tymidyny BrdU

Tutaj protokół opisuje, jak przeprowadzić podwójne znakowanie immunofluorescencji przy użyciu pierwotnych przeciwciał wyhodowanych u tego samego gatunku w celu zbadania interakcji gospodarz-patogen. W tym protokole może również zawierać trzecie przeciwciało od innego gospodarza. Takie podejście można zastosować w każdym typie komórek i patogenach.

Podwójne znakowanie immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał tego samego gatunku do badania interakcji gospodarz-patogen

Przedstawiona tutaj jest metoda sekwencjonowania pojedynczych jąder wyizolowanych z mysiego zakrętu zębatego, która wyklucza większość neuronów poprzez sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FAN). Takie podejście pozwala na uzyskanie wysokiej jakości profili ekspresji i ułatwia badanie większości innych typów komórek reprezentowanych w niszy, w tym rzadkich populacji, takich jak nerwowe komórki macierzyste.

Aktywowane fluorescencją sortowanie jąder ujemnych neuronów w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych jąder w celu zbadania niszy neurogennej hipokampa

Poznaj metodę sekwencyjnej wielokrotnej immunofluorescencji do badania neurogenezy hipokampa u dorosłych myszy. Protokół umożliwia wykrywanie wielu antygenów przy użyciu przeciwciał z tego samego gatunku gospodarza.

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych (Wideo) | JoVE Journal

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Przeglądaj więcej filmów