Testy amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do specyficznego dla gatunku wykrywania emerii, które infekują kurczaki

Ogólnym celem tej procedury jest zdiagnozowanie występowania pasożytów z gatunku I myea w stadzie kurczaków lub kurcząt. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie odczynników do amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli lub reakcji lampowej. Następnie przygotowuje się całkowite genomowe DNA z jednego lub więcej miejsc jelitowych pośmiertnie.

Następnie genomowe DNA dodaje się do mieszanki wzorcowej lampy i inkubuje. Na koniec oceniany jest wynik badania lampy. Ostatecznie LAMP jest wykorzystywany do określania występowania określonych gatunków I miria w celu poprawy zarządzania stadem oraz jako narzędzie do diagnozowania chorób.

Tak więc główną zaletą tej techniki w porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak mikroskopia morfologiczna czy PCR, jest to, że jest mniej subiektywna i nie wymaga drogiego zaplecza laboratoryjnego. Zastosowanie tego podejścia może poprawić zdrowie i dobrostan kurczaków poprzez poprawę diagnostyki infekcji Arian. Aby przygotować szablon do lampy Erea ase, należy wybrać odcinek jelita, który ma być badany.

Skorzystaj z tej tabeli jako przewodnika po wyborze miejsca pobierania próbek i gatunkach eria, które najprawdopodobniej będą obecne. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ każdy gatunek, który zakaża kurczaki, jest definiowany przez obszar jelitowy, na który atakuje za pomocą sterylnych nożyczek lub skalpela. Wyciąć pięć centymetrów lub więcej odcinków jelita wybranych do badania na obecność erii.

Przeciąć próbkę wzdłużnie. Usuń większość treści jelitowej i użyj krawędzi sterylnego szklanego mikroskopu. Przesuń lub wysterylizuj ostrze nożyczek, aby zeskrobać komórki z warstwy błony śluzowej.

Umieść zeskrobany materiał w sterylnej 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej z zakrętką zawierającej 100 mikrolitrów sterylnego TE o wadze 10%, ale z kubaturą żywicy X 100 i mocno przykręć na górze. Potrząsać próbkami energicznie przez jedną minutę, a następnie inkubować we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Po ugotowaniu pozostaw każdą próbkę do ostygnięcia w temperaturze otoczenia przez jedną do dwóch minut.

Odwirować próbki w temperaturze 10 000 razy G przez jedną minutę przed pobraniem dwóch mikrolitrów supernatantu na test lampowy, który ma być użyty jako matryca do przygotowania zapasów starterów do lamp I miria odpowiednich dla 100 testów. Rozpuść każdy liofilizowany starter lampy I miria, dodając wodę molekularną do stężenia 100 pipet mikromolowych 60 mikrolitrów wody molekularnej do oddzielnej 0,5 mililitrowej probówki mikrowirówki z klapką dla każdego gatunku iria, który ma być testowany. Korzystanie z woluminu pokazanego w tej tabeli.

Dodaj do wody startery, F-I-P-B-I-P-F, trzy B, trzy LF i LB właściwe dla docelowych gatunków eria. Stworzenie serii siedmiu specyficznych dla gatunku mieszanek podkładowych. Na krótko odwróć roztwory podkładu, aby je wymieszać, zpulsuj mikro fuge i zamroź, aż będą potrzebne.

Korzystając z objętości wymienionych w tej tabeli i wytycznych zawartych w protokole tekstowym, przygotuj wzorcową mieszaninę reakcji lampy dla każdego gatunku iria, który ma być testowany, aby przeprowadzić pipetę do testu lampowego 23 mikrolitry specyficznej dla gatunku mieszanki głównej lampy polimerazy B-S-G-D-N-A do 0,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Dodać dwa mikrolitry wcześniej przygotowanej matrycy DNA, uzyskując końcową objętość reakcji 25 mikrolitrów jako kontrolę pozytywną. Dodaj dwa mikrolitry genomowego DNA specyficznego dla gatunku eria do jednej reakcji.

Dodaj dwa mikrolitry wody molekularnej do reakcji jako kontroli ujemnej, inkubując łaźnię wodną lub blok grzewczy w temperaturze 62 stopni Celsjusza przez 30 minut. Opcjonalnie dezaktywuj polimerazę B-S-T-D-N-A poprzez podgrzanie do 80 stopni Celsjusza przez 10 minut. Jeśli reakcja nie zostanie odczytana natychmiast po zakończeniu inkubacji w świetle wewnętrznym, oceń kolor każdej reakcji na oko.

Wyniki ujemne będą miały kolor od różowego do fioletowego i pojawią się wyniki pozytywne. Błękit nieba opcjonalnie. Aby potwierdzić wynik testu lampy, wymieszaj pięć mikrolitrów produktu reakcji lampy z jednym mikrolitrem buforu ładującego żel DNA i uruchom na prestainowym 2% żelu ARO.

Użyj drabiny DNA o wielkości cząsteczki o jednej zabójczej podstawie, aby określić test wielkości fragmentu trzy. Ptaki zebrane z amerykańskiej fermy brojlerów w ramach programu nadzoru Uzyskano trzy zestawy próbek jelitowych, jak pokazano tutaj. Ukierunkowane zastosowanie testów lampowych specyficznych dla gatunku i priorytetyzacja preferowanych miejsc jelitowych dla każdej I mirii.

Gatunki pozwoliły na wizualną identyfikację infekcji irianem u wszystkich ptaków badanych przy użyciu błękitu hydroksylowego jako wskaźnika. Kolor uzyskany w wyniku negatywnej reakcji lampy podczas stosowania hydroksy może wahać się od fioletowego do różowego, ale zawsze różni się od niebieskiego uzyskanego przez wynik pozytywny. Potwierdzenie za pomocą elektroforezy żelowej aose dostarczyło porównywalnych wyników, jak pokazano tutaj.

Przygotowanie DNA z jednej pobranej próbki na ptaka reprezentującej materiał pobrany z każdego z określonych miejsc jelitowych i przetestowany wszystkimi siedmioma testami lampowymi dało taki sam wynik, jak w przypadku gdy każde miejsce jelita było przetwarzane oddzielnie Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu 45 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo zgodnie z tą procedurą. Można również wykonać inne techniki, takie jak ocena zmian chorobowych, w celu oceny ogólnego stanu zdrowia jelit.