Stymulacja optyczna komórek neuronalnych wspomagana złotem nanoprętami

Ten protokół opisuje, jak wykorzystać przejściowe ogrzewanie związane z optyczną absorpcją nanoprętów złota do stymulowania różnicowania i wewnątrzkomórkowej aktywności wapnia w komórkach neuronalnych. Wyniki te potencjalnie otwierają nowe zastosowania w protezach neuronalnych i podstawowych badaniach w neurobiologii.

Ogólnym celem tej procedury jest stymulacja komórek neuronalnych hodowanych za pomocą złotych nano prętów za pomocą diody laserowej bliskiej podczerwieni. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie nanocząstek złota o odpowiedniej gęstości optycznej. Drugim krokiem jest hodowla komórek neuronalnych i dodanie do nich nanocząstek.

Kolejnym etapem jest naświetlanie laserowe. Ostatnim krokiem jest weryfikacja różnicowania komórek poprzez ekspresję beta trzy do tubuliny. Ostatecznie mikroskopia konfokalna służy do pokazania wewnątrzkomórkowej przejściowości wapnia.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy szukaliśmy sposobu na stymulację potencjału czynnościowego w pojedynczych neuronach w populacji komórek. Procedurę zademonstruje Jamie May oraz studenci studiów licencjackich z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść weterynarza z roztworem złotego nanopręta w spektrofotometrze UV widzialnym

Zmierz początkową gęstość optyczną, rejestrując wartości absorpcji od 300 nanometrów do 1000 nanometrów z rozdzielczością od 0,5 do dwóch nanometrów. Przygotować jednomililitrowy roztwór podstawowy, rozcieńczając początkową próbkę złota anoro do gęstości optycznej jednej wirówki. Jeden mililitr roztworu złotego nanopręta dwa razy, aby usunąć nadmiar chemiczny.

Następnie usuń supernatanty i ponownie zawieś złote nano pręty w wodzie dejonizowanej. Aby przygotować się do użycia w hodowli komórkowej, należy sonikować roztwór złota Anoro przez pięć minut, a następnie sterylizować go światłem UV przez 30 minut. W tej procedurze należy przygotować 500 mililitrów sterylnego dmem na pożywkę do hodowli komórkowych.

Następnie hoduj komórki neuronalne NG 1 0 8 15 w 10 mililitrach pożywki do hodowli komórkowej w kolbie T 75, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wilgotnej atmosferze. Gdy komórki zlewają się w 70 do 80%, zmień pożywkę na ciepłą, świeżą pożywkę. Następnie mechanicznie odłącz komórki, delikatnie uderzając w dno kolby konfluentnej.

Odwirować zawiesinę komórkową przez pięć minut w temperaturze 600 G i ponownie zawiesić paletę komórek w dwóch mililitrach ciepłej pożywki do różnicowania komórek. Następnie zobacz komórki na 96-dołkowej płytce z 200 mikrolitrami pożywki do różnicowania komórek. Inkubować próbkę przez jeden dzień w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia dodaj roztwór złotego nanopręta i inkubuj go przez dodatkowe 24 godziny. W tej procedurze sprzęgnij laser ze światłowodem jednomodowym i zakończ go złączem FC. Zmierz moc wyjściową lasera za pomocą standardowego miernika mocy w trzecim dniu inkubacji nanoprętów.

Przymocuj złącze FC do studzienki, napromieniuj próbkę i kontrolę w temperaturze pokojowej przez jedną minutę ciągłą falą o różnych mocach lasera w piątym dniu, usuń pożywkę różnicującą komórki z próbki i przymocuj ją roztworem formaldehydu o objętości 3,7% na objętość przez 10 minut. Następnie przepuszczalność komórek z 0,1% objętości na objętość Triton X 100 przez 20 minut. Następnie dodać 3% wagowo na objętość BSA do próbki przez 60 minut.

Aby zablokować niereaktywne miejsca wiązania białek, oznacz próbkę tubuliną anty beta 3 przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia inkubować komórki przez 90 minut w ciemności z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym. Następnie znakuj jądra komórkowe DAP E przez 10 minut.

Następnie zobrazuj próbkę za pomocą epifluorescencji lub mikroskopii konfokalnej przy użyciu obiektywu o powiększeniu co najmniej 20 razy. Wybierz filtry mikroskopowe zgodnie z przeciwciałem drugorzędowym i wybierz filtr DAPI, aby uwidocznić jądra komórkowe. Na tym etapie należy przygotować 20% wagowo na objętość roztworu podstawowego onu F1 27, rozpuszczając dwa gramy substancji rozpuszczonej w 10 mililitrach DMSO.

Podgrzej roztwór onu F1 27 w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby zwiększyć rozpuszczalność. W trzecim dniu inkubacji anaro przygotuj zbilansowany roztwór soli. Następnie usuń pożywkę różnicującą komórki i zastąp ją roztworem BSS.

Uzupełniony pięcioma mikromolami grypy, 4:00 rano w DMSO i 0,1% wagowo na objętość roztworu podstawowego oniczny F1 27. Następnie połącz laser ze światłowodem jednomodowym i rozetnij końcówkę. Przy użyciu standardowej techniki.

Obserwuj powstałą końcówkę pod mikroskopem optycznym, aby upewnić się, że końcówka jest płaska i prostopadła do osi światłowodu. Następnie zmierz moc wyjściową lasera za pomocą standardowego miernika mocy. Następnie włóż światłowód doprowadzający światło do uchwytu światłowodu i przymocuj go do mikropozycjonera.

Następnie podłącz oscyloskop do generatora sygnału. Do monitorowania modulacji optycznej. Użyj sygnału binarnego o zmiennych częstotliwościach i długościach impulsów.

Następnie podłącz laser i użyj sygnału modulacji jako wejścia TTL dla mikroskopu. Użyj lasera argonowo-jonowego, aby wzbudzić zinternalizowany barwnik grypy o 4:00 rano i zsynchronizowany laser dde. W celu wzbudzenia nanoprętów endocytozy umieść komórki pod odwróconym mikroskopem konfokalnym i umieść światłowód dostarczający światło z dala od komórki docelowej w trybie oświetlenia transmisyjnego.

Następnie oblicz promień wiązki w celu. Wykonaj obrazowanie próbki i kontrolę w temperaturze pokojowej przy użyciu obiektywu 40 x i zbierz skany szeregów czasowych w rozdzielczości 256 na 256 pikseli na klatkę w trybie rundy w obie strony. Następnie wykonaj zapis bez wzbudzenia laserowego DIO, aby zidentyfikować wszelkie podstawowe zakłócenia lasera jonowego argonu, pokazany tutaj jest obraz epifluorescencyjny zróżnicowanych komórek roala NG 1, 0, 8, 15 hodowanych samodzielnie i naświetlanych mocą lasera 7,5 wata do kwadratu.

A to jest obraz komórek hodowanych za pomocą złotych nano prętów naświetlanych laserem o mocy 1,25 wata kwadratowego centymetra. Oto przykład zróżnicowanych komórek neuronalnych NG 1 0 8 15 załadowanych wskaźnikiem wapnia grypy o 4:00 rano. Obraz został wykonany przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego z obiektywem zanurzeniowym z olejkiem 40x.

Rysunek ten przedstawia reprezentatywne próbki zmian wapnia indukowanych laserem w funkcji czasu. W NG 1 0 8 15 komórki neuronalne hodowane w warunkach wolnych od surowicy przez trzy dni z nano prętami polistyrenu sulfonianu, złotymi nano prętami i bez nano prętów. F max powyżej F zero wskazuje na wzrost maksymalnej fluorescencji wykrytej w komórkach neuronalnych NG 1 0 8 15 Po jego rozwoju.

Technika ta utorowała drogę do przyszłego zastosowania w symulacji komórek neuronalnych w optyce.