Name: Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Odkryj metodę wysokoprzepustowego badania przesiewowego chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie poprzez region 3' UTR. Ta technika umożliwia identyfikację związków wpływających na stabilność mRNA w liniach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Włoskiej Fundacji Neuroblastoma za pełne wsparcie finansowe dla tego projektu.

UWAGA: Wydajność takich systemów testowych zależy od dostępnego sprzętu laboratoryjnego HTS. Protokół ten jest ułatwiony przez robota Tecan Freedom EVO 200, który wykonuje obsługę cieczy w formacie 96-dołkowym. Możliwa jest również miniaturyzacja do formatu 384-dołkowego. Zrobotyzowany system obsługi cieczy jest umieszczony pod okapem z przepływem laminarnym w celu utrzymania warunków aseptycznych podczas wszystkich etapów eksperymentu. Jeśli nie jest dostępna automatyzacja obsługi cieczy, protokół można łatwo dostosować do formatu o niskiej przepustowości.
Główny przegląd
1. Dzień 1: Przygotowanie i nasiona komórek
UWAGA: Komórki nasienne osiągają 80% zbieżności w momencie oznaczania aktywności lucyferazy, tj. 48 godzin po wysiewie.
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić trypsynizowane komórki nerwiaka zarodkowego CHP134-mycn3UTR do stężenia 2 × 105 komórek/ml w RPMI zawierającym 10% FBS i 1% L-glutaminy. Dla 27 płytek należy przygotować co najmniej 250 ml zawiesiny komórek, biorąc pod uwagę sposób obchodzenia się z płynami, korytka objętości martwe i powtarzające się etapy pipetowania. Wlej zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika i umieść ją na biurku robota.</li>
	<li>Umieść na biurku robota 99 białych płytek z płaskim dnem z kodami kreskowymi oraz pudełko ze sterylnymi końcówkami do pipet o pojemności 200 μl. Wymieszaj zawiesinę komórek przez pipetowanie przed każdym etapem dozowania, aby uniknąć osiadania komórek pod wpływem grawitacji. Dozuj 75 μl komórek do każdego dołka z 9 płytkami, aby uzyskać końcową gęstość 1,5 × 104 komórek na dołek.</li>
	<li>Przykryj płytki pokrywkami i pozostaw je na zewnątrz inkubatora na 30 minut, aby komórki mogły osiąść na dnie studzienki. Zminimalizuje to efekty krawędziowe.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.2 i 1.3 dwukrotnie, aby przygotować łączną liczbę 27 płytek.</li>
	<li>Umieścić płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i inkubować przez 24 godziny.</li>
</ol>
2. Dzień 2: Leczenie komórek związkami bibliotecznymi
UWAGA: Biblioteka małych cząsteczek Spectrum Collection składa się z 2 000 związków ułożonych w 8 rzędach i 10 kolumnach na 25 96-dołkowych płytkach o stężeniu 10 mM w DMSO. Studzienki w pierwszej i ostatniej kolumnie pozostają puste dla kontroli. Testy przesiewowe związków są zwykle wykonywane przy stężeniu związku 1–10 μM8. Opisany tutaj protokół przesiewowy ustala 2 μM jako stężenie robocze i 24 godziny jako punkt końcowy testu.
<ol>
	<li>Rozmrozić 9 złożonych płytek bibliotecznych w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj dwie koryta ze sterylnymi roztworami PBS i PBS-0,5% DMSO i umieść je na biurku robota. Dla każdej płytki bibliotecznej należy przygotować i oznaczyć odpowiednio jedną płytkę rozcieńczającą — 96-dołkową płytkę z polipropylenu z dnem w kształcie litery U o objętości roboczej co najmniej 400 μl. Napełnić każdą studzienkę w kolumnach od 2 do 11 płytek rozcieńczających 398 μl sterylnego PBS za pomocą stałych końcówek płynu. Wypełnić kolumny 1 i 12 50 μl sterylnego PBS z 0,5% DMSO w celu odtworzenia stężenia nośnika w studzienkach kontrolnych (0,02%).</li>
	<li>Na pulpicie robota umieść dwie płytki biblioteczne, odpowiednio oznaczone płytki rozcieńczające, dwa pudełka ze sterylnymi końcówkami do pipet o pojemności 50 μl i płytki z sześcioma komórkami. Odsłoń płytki komórek.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 2 μl roztworu podstawowego o stężeniu 10 mM z jednej z dwóch płytek bibliotecznych na odpowiedniej płytce rozcieńczającej i dobrze wymieszać. Spowoduje to stężenie związków pośrednich wynoszące 50 μM. Używając tego samego zestawu końcówek, dozuj 3 μl rozcieńczenia 50 μM na 3 białe 96-dołkowe płytki z kodami kreskowymi z komórkami. Ten schemat rozcieńczania daje stężenie robocze 2 μM każdego badanego związku. 
	UWAGA: Aby uniknąć niepotrzebnych manipulacji z końcówkami, od początku używaj pełnego zestawu 96 końcówek, mimo że tabliczki biblioteczne zawierają tylko 80 związków. Jest to możliwe, ponieważ pierwsza i ostatnia kolumna tablic bibliotecznych jest pusta.</li>
	<li>Wymień końcówki pipet i powtórz krok 2.4 dla drugiej płytki bibliotecznej.</li>
	<li>Przykryj płytki komórkowe i włóż je z powrotem do inkubatora na 24 godziny.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.3-2.6 jeszcze dwa razy dla pozostałych płyt bibliotecznych.</li>
</ol>
3. Dzień 3: Wykonaj test lucyferazy
UWAGA: Przed wykonaniem testu lucyferazy, można go zwielokrotnić testem żywotności komórek opartym na redukcji resazuryny, aby uzyskać wskaźnik żywotności komórki z każdego dołka9. Multipleksowanie testów lucyferazy i żywotności powoduje zmniejszenie sygnału lucyferazy, który jednak można zignorować, jeśli komórki zapewniają wystarczająco wysoki poziom aktywności lucyferazy. Aktywność lucyferazy można wykryć za pomocą różnych komercyjnych i domowych odczynników do oznaczania lucyferazy10,11 ze stabilnym sygnałem luminescencyjnym.
<ol>
	<li>Zrównoważyć odtworzony odczynnik lucyferazy do temperatury pokojowej. Upewnij się, że objętość jest wystarczająca dla wszystkich oznaczonych płytek. Na 27 płytek wymagane będzie 170 ml odczynnika lucyferazy, biorąc pod uwagę obchodzenie się z cieczami, minimalną objętość martwą i powtarzające się etapy pipetowania. Wlej odczynnik lucyferazy do zbiornika i umieść go na biurku robota.</li>
	<li>Wyjmij 9 płytek z komórkami z inkubatora, umieść je na biurku robota, odkryj i poczekaj, aż osiągną temperaturę pokojową. Dodać 50 μl odczynnika lucyferazy na dołek płytka po płytce. Pomiędzy płytkami wprowadź opóźnienie równe czasowi odczytu luminescencji jednej płytki. Zapewni to, że wszystkie płytki zostaną zmierzone w równych odstępach czasu od dodania odczynnika.</li>
	<li>Po 30 minutach inkubacji umieścić pierwszą płytkę w luminometrze i zmierzyć luminescencję po krótkim etapie potrząsania. Powtórz tę czynność dla wszystkich talerzy. Zapisz kod kreskowy każdej płyty i powiąż go z odpowiednim plikiem danych, aby uniknąć błędów wynikających z dużej liczby obsługiwanych płyt.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2-3.3 dwukrotnie dla pozostałych 18 płytek z komórkami.</li>
	<li>Zebrać pozostały odczynnik lucyferazy i przechowywać go w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4. Dzień 4: Analiza danych
<ol>
	<li>Przetwarzanie danych doświadczalnych przy użyciu normalizacji wszystkich próbek do średniej z kontroli poddanych działaniu nośnika na płytce. Dla każdego związku bibliotecznego oblicz średnią wartość x̅ i SD w trzech powtórzeniach.</li>
	<li>Wybierz trafienia regulujące w górę i w dół, ustawiając próg x̅ ± k × SD, gdzie średnia wartość x̅ i SD są obliczane dla wszystkich przetworzonych wartości testu, a k jest zdefiniowaną stałą.</li>
	<li>Wybierz dowolny próg odcięcia < 20% kontroli poddanych działaniu nośnika, gdy zmniejszenie sygnału lucyferazy jest najprawdopodobniej związane z toksycznością związku. Odrzucenie trafień poniżej tego progu znacznie zmniejszy liczbę trafień fałszywie dodatnich w kontrkontroli. 
	UWAGA: Zamiast normalizacji opartej na kontroli, dane eksperymentalne mogą być przetwarzane przy użyciu wyniku Z lub jego solidnego analogowego wynikuB 12. Ponadto dostępne są alternatywne podejścia statystyczne do wyboru trafień12.</li>
</ol>
5. Kontr-kontrola
UWAGA: Związki zidentyfikowane w głównym badaniu przesiewowym (oznaczone jako 'trafienia') są potwierdzane i oceniane pod kątem specyficzności przez kontr-screening.
<ol>
	<li>Wybierz wybrane trafienia z podwielokrotności przechowywanych w pojedynczych probówkach z kodami kreskowymi 2D i utwórz nowe "tablice trafień", zapisując odpowiedni układ. Nie zapomnij zostawić wolnych miejsc dla sterujących. 
	UWAGA: W przypadku braku wydajnego systemu selekcji wiśniowej, można równolegle przetestować zarówno komórki kontrolne, jak i 3' zawierające UTR w pierwotnym badaniu przesiewowym. W takim przypadku specyficzna selekcja związków o działaniu zależnym tylko od wprowadzonego 3' UTR będzie możliwa po pierwotnym badaniu przesiewowym, eliminując konieczność przeprowadzania kontrprzesiewowego. Jednak równoległe badania przesiewowe w dwóch liniach komórkowych podwoją koszty testu.</li>
	<li>Postępując zgodnie z protokołem pierwotnego badania przesiewowego (sekcja "Dzień 1: Przygotowanie i komórki nasienne"), dla każdej "płytki trafionej" przygotuj trzy 96-dołkowe płytki każdej stabilnej komórki CHP134-mycn3UTR i CHP134-CTRL.</li>
	<li>Postępując zgodnie z protokołem pierwotnego badania przesiewowego (sekcja "Dzień 2: Traktuj komórki związkami bibliotecznymi"), użyj każdej płytki trafionej do leczenia trzech płytek CHP134-mycn3UTR i trzech CHP134-CTRL przy stężeniu roboczym 2 μM. 
	UWAGA: Podczas gdy opisany tutaj ekran przeciwkrytyczny jest wykonywany w trzech egzemplarzach przy pojedynczej dawce 2 μM, korzystne może być zastąpienie standardowych powtórzeń i przetestowanie trafień w 3 stężeniach jako 10-krotne rozcieńczenia w zakresie od 2 μM do 20 nM. Zastosowanie tego podejścia pozwoliłoby nie tylko na potwierdzenie danych z pierwotnego badania przesiewowego, ale także na uzyskanie wstępnych danych dotyczących dawka-odpowiedź na pierwotne trafienia, minimalizując odsetek wyników fałszywie dodatnich. W takim przypadku należy zastosować inny potok analizy w celu przetworzenia danych eksperymentalnych i potwierdzenia trafień.</li>
	<li>Postępując zgodnie z protokołem pierwotnego badania przesiewowego (sekcja "Dzień 3: Wykonaj test lucyferazy"), zmierz aktywność lucyferazy na wszystkich płytkach CHP134-mycn3UTR i CHP134-CTRL.</li>
	<li>Postępując zgodnie z protokołem wstępnego badania przesiewowego (sekcja "Dzień 4: Analiza danych"), należy znormalizować dane eksperymentalne z odwiertów poddanych działaniu substancji do średniej z kontroli poddanych działaniu nośnika na płytce i obliczyć średnią i SD w powtórzeniach. Dla każdego badanego związku oblicz krotną zmianę aktywności lucyferazy w komórkach CHP134-mycn3UTR w porównaniu z CHP134-CTRL. Wybierz dowolne odcięcia zmiany zagięcia wynoszące >1,5 i wartości p istotności <0,01, 
	UWAGA: W opisanych ustawieniach testu parametrem determinującym swoistość trafienia jest znacząca krotna zmiana aktywności lucyferazy w komórkach CHP134-mycn3UTR w porównaniu z CHP134-CTRL. W razie potrzeby można również ocenić toksyczność związku, przeprowadzając jednocześnie test żywotności komórek na wybranych związkach. Może to być szczególnie korzystne, jeśli pierwotne trafienia są poddawane analizie przeciwstawnej w analizie odpowiedzi na dawkę. W przypadku pojedynczej dawki nasze doświadczenie wskazuje na silną korelację zmniejszonej aktywności lucyferazy ze zmniejszoną żywotnością komórek6. W związku z tym zmniejszona aktywność lucyferazy w komórkach docelowych, jak również w komórkach kontrolnych, może być uważana za wskaźnik toksyczności związku w badanym stężeniu.</li>
</ol>

<ol><li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (1), 220(2012).</li>
<li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li>
<li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+3%E2%80%99+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).</li>
<li>Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cell-Based+High-Throughput+Screen+Addressing+3%E2%80%99+UTR-Dependent+Regulation+of+the+MYCN+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene.</a> Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).</li>
<li>Cheung, N. -K. V., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma%3A+developmental+biology%2C+cancer+genomics+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).</li>
<li>Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Principles of early drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li>
<li>Herbst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexing+a+high-throughput+liability+assay+to+leverage+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Techn%22%5BJournal%5D)">Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies.</a> Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).</li>
<li>van Olst, E. S. iebring-, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affordable+luciferase+reporter+assay+for+cell-based+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening.</a> J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).</li>
<li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li>
<li>Hitti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+ribosomal+protein+promoter-based+reporter+system+for+selective+assessment+of+RNA+stability+and+post-transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control.</a> RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).</li>
<li>Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+regulatory+elements+in+conserved+3%E2%80%99+UTRs+of+human+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts.</a> Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J. Vis. Exp. (87), (2014).</li>
<li>Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3%E2%80%99+untranslated+region+of+messenger+RNA%3A+A+molecular+%E2%80%9Chotspot%E2%80%9D+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology.</a> Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).</li>
<li>Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+methods+to+monitor+the+modulation+of+mRNA+stability%3A+a+novel+approach+to+drug+discovery+and+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention.</a> J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).</li>
<li>Pascale, A., Govoni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+post-transcriptional+mechanisms%3A+is+their+deregulation+a+common+link+for+diseases%3F+Focus+on+ELAV-like+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).</li>
<li>Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+pre-mRNA+processing+and+altered+architecture+of+3%E2%80%99+untranslated+regions+contribute+to+the+development+of+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).</li>
<li>Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+GEMS--a+novel+platform+technology+targeting+post-transcriptional+control+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms.</a> Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).</li>
<li>Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+post-transcriptional+control+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting post-transcriptional control for drug discovery.</a> RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten opisuje test genu reporterowego oparty na komórce, mający na celu identyfikację modulatorów, które celują w procesy potranskrypcyjne zależne od 3' UTR. Obejmuje on podstawowe badanie przesiewowe i badanie przesiewowe, a w razie potrzeby może mu towarzyszyć test cytotoksyczności. Wynikiem wstępnego badania przesiewowego jest szereg cennych związków kandydujących, których odtwarzalność i swoistość są dalej weryfikowane w ramach kontrbadania.
Identyfikacja pierwotnych trafień opiera ...

Przez długi okres uważano, że regulacja ekspresji genów odgrywa główną, jeśli nie wyłączną rolę w kontrolowaniu produkcji białek. Coraz więcej dowodów wskazuje jednak, że regulacja potranskrypcyjna przyczynia się w takim samym stopniu, jeśli nie większym, niż regulacja transkrypcji do określenia obfitości białek komórkowych1,2. Potranskrypcyjna kontrola ekspresji genów jest znacznie bardziej złożona i skomplikowana, niż początkowo sądzono. W rzeczywistości okazało się, że wszystkie różne etapy kontroli potranskrypcyjnej są regulowane, w tym przetwarzanie mRNA, lokalizacja, obrót, translacja3, a także nowo opisana odwracalna metylacja RNA4. Spośród wielu procesów regulacji potranskrypcyjnej, na które potencjalnie może mieć wpływ, opisany poniżej test koncentruje się na tych, które obejmują nieulegający translacji region mRNA 3' (3' UTR). 3' UTR szeroko wpływa na los mRNA, głównie poprzez specyficzną interakcję białek wiążących RNA i niekodujących RNA z jego sekwencjami regulatorowymi i/lub strukturami drugorzędowymi5. Dlatego małe cząsteczki, które zmieniają te interakcje lub zakłócają szlaki transdukcji sygnału, zmienią równowagę, która reguluje obfitość białek. To podejście terapeutyczne ma szczególne znaczenie w przypadku patologii u ludzi, w przypadku których istnieją dowody wskazujące, że geny istotne dla choroby podlegają regulacji potranskrypcyjnej, co w związku z tym stanowi potencjalny cel interwencji farmakologicznej. W związku z tym systemy pozwalające na badania przesiewowe modulatorów poziomu mRNA poprzez interferencję z mechanizmami kontroli potranskrypcyjnej w formacie wysokoprzepustowym mogą stać się cennymi narzędziami w identyfikacji potencjalnych nowych metod leczenia.
Opisany test genu reporterowego oparty na komórce pozwala na identyfikację związków zdolnych do modulowania losu mRNA za pomocą mechanizmów zależnych od jego 3' UTR. Składa się z kilku głównych elementów (rysunek 1) i wymaga kilku wstępnych kroków w celu walidacji wykonalności testu. Po pierwsze, konstrukt reporterowy jest zaprojektowany tak, aby zawierał 3' UTR z genu będącego przedmiotem zainteresowania. 3' UTR jest połączony z końcem genu reporterowego, takiego jak lucyferazy świetlika (ryc. 1). Wszelkie zmiany w potranskrypcyjnych mechanizmach kontrolnych wywieranych przez wstawiony 3' UTR zmienią stabilność i / lub wydajność translacji tego chimerycznego transkryptu, powodując różne poziomy lucyferazy. Dlatego zmiany w aktywności lucyferazy służą jako pośrednia miara zaburzonej regulacji potranskrypcyjnej genu będącego przedmiotem zainteresowania. Drugim składnikiem systemu jest kontrolny konstrukt reporterowy, identyczny plazmid ekspresyjny, który wyraża ten sam gen reporterowy, ale nie zawiera żadnego 3' UTR. Dwa plazmidy reporterowe można zaprojektować w laboratorium przy użyciu konwencjonalnych protokołów biologii molekularnej lub zakupić ze źródeł komercyjnych.
Wybór odpowiedniej linii komórkowej jest krytyczny dla konstrukcji testu. To, która linia komórkowa jest optymalnym modelem, zależy od wielu czynników, począwszy od wymagań klinicznych, takich jak maksymalne podobieństwo do patologii, a skończywszy na kwestiach praktycznych, takich jak dostępność, transfekcyjność i charakterystyka wzrostu. Co ważne, przed przystąpieniem do leczenia należy upewnić się, że fuzja 3' UTR z genem reporterowym ma oczekiwany wpływ na poziom chimerycznego transkryptu. Brak znaczącej różnicy w sygnale lucyferazy z konstruktów reporterowych 3' UTR i kontrolnych przejściowo transfekowanych w wybranych komórkach wskazywałby, że UTR 3' nie działa w tym modelu komórkowym, co skłania do poszukiwania alternatywnych. W przypadku formatu wysokoprzepustowego, konstrukty reporterowe 3' UTR i kontrolnej lucyferazy powinny być stabilnie zintegrowane z wybraną linią komórkową. Stosowanie stabilnie zintegrowanej nad przejściowo transfekowaną linią komórkową jest preferowane z kilku powodów. Pozwoli to poszerzyć wybór modelu komórkowego obejmującego trudne do transfekcji linie komórkowe, zmniejszyć zmienność danych wynikającą z wahań wydajności transfekcji, obniżyć koszty. Co więcej, po przejściowej transfekcji komórki są bardzo często przeciążone plazmidem DNA, co prowadzi do nasycenia systemu. W tych warunkach dalszy wzrost ekspresji reporterowej może być wyzwaniem, co skutkuje zmniejszoną wrażliwością na potencjalne związki regulujące w górę.
Na koniec, gdy wszystkie składniki testu są już ustawione, przed przejściem na format wysokoprzepustowy bardzo ważne jest określenie wykonalności testu, tj. czy aktywność lucyferazy może być rzeczywiście regulowana w górę i w dół za pomocą wstawionego 3' UTR. Najlepszymi kontrolami byłyby małe cząsteczki, o których mówi się, że modulują stabilność lub translatowalność mRNA przez 3' UTR będący przedmiotem zainteresowania. Jeśli ich posiadanie nie jest możliwe, akceptowane są zastępcze kontrole imitujące pożądany efekt. Mogą to być miRNA lub białka wiążące RNA, o których wiadomo, że wywierają swoje działanie poprzez wiązanie się z interesującym nas 3' UTR. Ocena takich kontroli przed pierwotnym badaniem przesiewowym nie tylko wskazuje na funkcjonalność opracowanego testu, ale także pozwala na oszacowanie jego zakresu dynamicznego, czułości i wydajności w formacie wysokoprzepustowym.
Korzystając z opisanego protokołu, przesiewaliśmy bibliotekę składającą się z 2 000 związków6. Nerwiak zarodkowy, najczęstszy pozaczaszkowy guz lity wieku niemowlęcego, został wykorzystany jako model biologiczny, a 3' UTR onkogenu MYCN, którego amplifikacja silnie przewiduje niekorzystny wynik nerwiaka zarodkowego, jako gen docelowy7. Rysunek 2 przedstawia układ eksperymentalny. Przesiewanie podzielono na trzy cykle, przy czym wielkość partii wynosiła 27 płyt przesiewanych w jednym przebiegu. Partia 27 płyt zawierała płyty biblioteczne Spectrum Collection nr 1-n.8+n.25 (pierwszy nakład), nr 9-n.16+n.25 (drugi nakład) i nr 16-n.24+n.25 (trzeci nakład), przy czym każda płyta została przesiana w trzech egzemplarzach. W ten sposób jedna tabliczka biblioteczna (nr 25) została oznaczona we wszystkich trzech seriach, co umożliwiło porównanie między seriami. Poniższy protokół opisuje pojedynczą serię 9 tablic bibliotecznych przetestowanych w trzech egzemplarzach.

<table><tbody><tr><td>Płytka hodowlana 96-dołkowa Biała</td><td>PerkinElmer</td><td>6005688</td><td></td></tr><tr><td>StorPlate 96-dołkowa U dno (płytka rozcieńczająca)</td><td>PerkinElmer</td><td>6008190</td><td></td></tr><tr><td>100 ml jednorazowe koryto na odczynniki</td><td>Tecan</td><td>10 613 048</td><td></td></tr><tr><td>300 ml jednorazowy zbiornik robotyczny</td><td>VWR</td><td>PB12001301</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki robota DITI 50&nbsp; &mu; l Sterylne</td><td>końcówki do robotów 30038607</td><td></td><td></td>Tecan</tr><tr><td>DITI 200&nbsp; &mu; l Sterylna</td> matryca <td>30038617</td><td></td><td>Tecan</td></tr><tr><td>1,4 ml z kodem kreskowym 2D z płaskim dnem Thermo</td><td>Scientific</td><td>3711</td><td></td></tr><tr><td>ONE-Glo Lucyferazy System testowy&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6120</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-918F</td><td></td></tr><tr><td>PBS-1x, bez Ca2+, Mg2+</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200&nbsp; mM</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Kolekcja Spectrum (biblioteka złożona)</td><td>MicroSource Discovery Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Robot Tecan Freedom EVO200&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>N/A Czytnik</td><td></td></tr><tr><td>wielopłytkowy Tecan F200&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Zarówno regulacja transkrypcyjna, jak i potranskrypcyjna mają ogromny wpływ na ekspresję genów. Jednak powszechnie stosowane testy przesiewowe oparte na komórkach koncentrują się na regulacji transkrypcji, mając zasadniczo na celu identyfikację cząsteczek ukierunkowanych na promotor. W rezultacie, mechanizmy potranskrypcyjne są w dużej mierze odkrywane dzięki ukierunkowanemu opracowywaniu leków na ekspresję genów. Tutaj opisujemy test komórkowy mający na celu zbadanie roli regionu 3' bez translacji (3' UTR) w modulacji losu jego mRNA i identyfikacji związków zdolnych do jego modyfikacji. Test opiera się na wykorzystaniu konstruktu reporterowego lucyferazy zawierającego 3' UTR interesującego genu, stabilnie zintegrowanego z linią komórkową istotną dla choroby. Protokół jest podzielony na dwie części, przy czym początkowo skupiono się na pierwotnym badaniu przesiewowym mającym na celu identyfikację cząsteczek wpływających na aktywność lucyferazy po 24 godzinach leczenia. Druga część protokołu opisuje kontr-badania przesiewowe niezbędne do rozróżnienia związków modulujących aktywność lucyferazy specyficznie poprzez 3' UTR. Oprócz szczegółowego protokołu i reprezentatywnych wyników, przedstawiamy ważne kwestie dotyczące rozwoju testu i walidacji trafienia (trafień) na celu endogennym. Opisany test genu reporterowego opartego na komórce pozwoli naukowcom zidentyfikować cząsteczki modulujące poziom białka za pomocą mechanizmów potranskrypcyjnych zależnych od 3' UTR.

Stosując opisane podejście, przeskanowaliśmy bibliotekę 2 000 związków w poszukiwaniu potencjalnych modulatorów mechanizmów kontroli posttranskrypcyjnej realizowanych przez 3’ UTR genu MYCN. Rycina 3 przedstawia wyniki przesiewania pierwotnego na przykładzie pojedynczej płytki bibliotecznej. Sygnał lucyferazy, przedstawiony jako procent kontroli traktowanej nośnikiem, uzyskano poprzez pomiar aktywności lucyferazy w trzech powtórzeniach na płytkach z komórkami CHP134-mycn3UTR traktowanymi związka...

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Niniejszy eksperyment służy do przesiewania bibliotek chemicznych w celu znalezienia związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej za pośrednictwem 3' niekodującej regionu (UTR) transkryptów. W pierwszej kolejności należy zidentyfikować interesujący 3' UTR w docelowym genie. Następnie należy sklonować ten 3' UTR do kontrolnego plazmidu reporterowego El lucyferazy, aby stworzyć chimeryczny transkrypt 3' UTR El lucyferazy.Następnie należy stabilnie zintegrować oba plazmidy w linii komórkowej istotnej dla danej choroby, wysiać komórki niosące chimeryczny transkrypt w płytkach 96-dołkowych, inkubować je z biblioteką związków przez 24 godziny, a następnie zidentyfikować cząsteczki wpływające na aktywność lucyferazy.Wyselekcjonuj odpowiednie cząsteczki do dalszego przesiewu walidacyjnego, a następnie potraktuj zarówno komórki kontrolne, jak i komórki niosące chimeryczny transkrypt 3' UTR lucyferazy wybranym podzbiorem biblioteki. Wyniki pozwolą rozróżnić, czy efekt działania związku jest zapośredniczony przez nietransladowaną region 3', czy przez inne sekwencje wektora. Różni to tę metodę od większości testów przesiewowych opartych na reporterach.W przypadku testów koncentrujących się na regulacji transkrypcji, te raportowane testy komórkowe skupiają się na identyfikacji związków, które modulują poziomy transkryptów mRNA poprzez region 3' UTR. Zbierz stabilnie transfektowane komórki neuroblastoma za pomocą trypsynizacji. Rozcieńcz komórki do stężenia 2 × 10⁵ komórek/ml.W pożywce RPMI zawierającej 10%FBS i 1%L-glutaminy dla 27 płytek. Przygotować co najmniej 250 mililitrów zawiesiny komórkowej, uwzględniając straty przy dozowaniu cieczy, objętości martwe koryt oraz wielokrotne etapy pipetowania. Następnie przelać zawiesinę komórkową do sterylnego zbiornika i umieścić go na blacie robota.Umieść na blacie robota dziewięć białych płaskodنnych płytek 96-dołkowych z kodami kreskowymi oraz pudełko sterylnych końcówek do pipet o pojemności 200 µL. Wymieszaj zawiesinę komórkową, a następnie dozuj 75 µL komórek do każdego dołka w dziewięciu płytkach.Przykryć płytki i pozwolić komórkom osadzić się na dnie studni przez 30 minut, aby zminimalizować efekt brzegowy. Następnie umieścić wszystkie dziewięć płytek w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5% CO2 i inkubować przez 24 godziny. W analogiczny sposób postępować z pozostałymi płytkami, przetwarzając je w seriach po dziewięć sztuk.Rozmrozić płytki z biblioteką związków w temperaturze pokojowej. Napełnić jedną korytko sterylnym PBS, a drugie roztworem 0,5% DMSO w PBS, a następnie umieścić je na blacie robota. Dla każdej płytki z biblioteki:Przygotować i odpowiednio oznakować. Jedna płytka do rozcieńczeń. Teraz wypełnić każdy dołek w kolumnach od 2 do 11 płytek do rozcieńczeń 398 µL sterylnego PBS.Następnie wypełnij kolumny 1 i 12 50 µL 0,5% DMSO w sterylnym PBS. Następnie załaduj dwie płytki do rozcieńczeń, dwie płytki biblioteczne, dwa pudełka z 50 µL sterylnymi końcówkami oraz sześć płytek wielodołkowych na blat robota.Następnie odsłoń płytki z komórkami, pipetuj 2 µL roztworu stokowego 10 mM z jednej z dwóch płytek bibliotecznych do odpowiadającej im płytki z rozcieńczeniami i dokładnie wymieszaj. Używając tego samego zestawu końcówek, przenieś 3 µL rozcieńczenia 50 µM do trzech białych płytek 96-dołkowych z kodami kreskowymi zawierających komórki.Wymień cały zestaw końcówek i powtórz indukcję komórek dla drugiej płytki biblioteki. Przykryj hodowle i inkubuj przez 24 godziny. Następnie powtórz proces rozcieńczania związków i indukcji komórek dla pozostałych płytek biblioteki.Doprowadzić zrekonstytuowany odczynnik lucyferazy odpowiedniego rodzaju do temperatury pokojowej. Umieścić zbiornik na lucyferazę na blacie robota i nalać do niego odczynnik. Wyjąć z inkubatora dziewięć płytek z indukowanymi kulturami.Umieść je na blacie robota, odsłoń i doprowadź do temperatury pokojowej. Następnie dodaj 50 µL odczynnika lucyferazy do każdej studniki pomiędzy płytkami. Wprowadź opóźnienie równe czasowi odczytu luminescencji jednej płytki.Po 30 minutowej inkubacji w pierwszej kolejności należy zapisać kod kreskowy płytki, aby powiązać ją z odpowiednim plikiem danych. Następnie pierwszą płytkę należy umieścić w luminometrze i zmierzyć luminescencję.Po krótkim wstrząsaniu powtórz pomiary luminescencji dla wszystkich płytek z indukcjami. Następnie zbierz pozostały odczynnik Lucifer race i przechowuj go w temperaturze -20 °C. Po przetworzeniu danych eksperymentalnych z przesiewania pierwotnego, wybierz trafienia w celu potwierdzenia swoistości związków poprzez przesiewanie kontrolne cherry.Wybrano wyselekcjonowane hity i przygotowano układ nowej płytki przesiewowej, uwzględniając pozycje dla kontroli. Następnie z aliquot przechowywanych w pojedynczych probówkach z kodem kreskowym 2D przygotowano nowe płytki HIIT. Dalsze postępowanie przebiega zgodnie z tym samym protokołem stosowanym podczas przesiewania.Przygotować 3 płytki 96-dołkowe dla każdej stabilnej linii komórkowej na każdą płytkę hi. Następnego dnia poddać komórki działaniu związków z biblioteki. Wykorzystać każdą płytkę hi do potraktowania trzech płytek CHP 1 34 micken, trzech płytek z 3' UTR oraz trzech płytek z komórkami kontrolnymi w stężeniu roboczym 2 µM przez 24 godziny.Zmierz aktywność lucyferazy we wszystkich płytkach CHP 1 34, w trzech zestawach nieprzetłumaczonych i kontrolnych. Podobnie jak w przypadku analizy danych w badaniu przesiewowym pierwotnym, znormalizuj dane eksperymentalne z dołków poddanych działaniu preparatów do średniej z kontroli traktowanych nośnikiem na danej płytce. Następnie oblicz średnią i odchylenie standardowe z powtórzeń dla każdego testowanego związku.Krotność zmiany aktywności lucyferazy w CHP 1 34 McIn 3' UTR w porównaniu do CHP 1 34. Dla komórek kontrolnych wybrano arbitralne progi krotności zmiany powyżej 1,5 oraz wartości istotności P poniżej 0,01. W tym eksperymencie przesiewowo zbadano bibliotekę 2000 związków pod kątem potencjalnych modulatorów mechanizmów kontroli potranskrypcyjnej wywieranych przez 3' UTR mic i onkogenu; wyniki sygnałów lucyferazy z jednej z 25 reprezentatywnych płytek biblioteki przedstawiono jako procent w stosunku do grupy traktowanej nośnikiem.Kontrole wykazują, że większość związków nie wywołała widocznego efektu na 3' UTR. Wyłoniono związki typu „hits”, dla których obliczono średnią wartość oraz odchylenie standardowe dla wszystkich wartości testu; związki redukujące aktywność lucyferazy poniżej 20% najprawdopodobniej wskazują na wyraźną toksyczność komórkową danego związku. Wykres ten przedstawia reprezentatywne wyniki przesiewu przeciwnego dla czterech wybranych związków oznaczonych jako W, X, Y i Z. Oba związki, W i X, powodują zwiększoną ekspresję lucyferazy z reportera 3' UTR onkogenu, co wskazują różnica w krotności zmiany oraz test T. Należy zauważyć, że choć efekty obu związków W i X są ściśle zależne od 3' UTR, związek W nie wykazuje istotnego wpływu na żywotność komórek.Podczas gdy związek X wykazuje pewną aktywność cytotoksyczną, na co wskazuje znormalizowany sygnał lucyferazy w komórkach kontrolnych CHP 1 34, ani związek Y, ani związek Z w stężeniu dwóch mikromolarnych nie wykazują efektu zależnego od 3' UTR w odniesieniu do poziomów lucyferazy. Obniżona aktywność lucyferazy wykryta w badaniach wstępnych po zastosowaniu związku Y jest raczej następstwem cytotoksyczności. W przypadku związku Z zwiększona aktywność lucyferazy wynika z nieswoistej względem 3' UTR aktywacji promotora wirusowego.Ponieważ w obu zestawach, kontrolnym i nietłumaczonym, obserwuje się równoważną nadekspresję, w tym wysokoprzepustowym teście należy pamiętać, że walidacja głównego sygnału w komórkach kontrolnych jest kluczowa dla odróżnienia związków, które działają rzeczywiście poprzez 3' niekodującą region (3'UTR), od związków działających poprzez promotor.

high-throughput-screening-for-chemical-modulators-post

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przesiewowe badanie przepływowe chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Przedstawiono metody opracowania i walidacji ilościowego testu fluorescencyjnego do pomiaru aktywności kanałów potasowych prostujących do wewnątrz (Kir) w celu wysokoprzepustowego przesiewu związków.

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w celu poszukiwania małocząsteczkowych modulatorów potasowych kanałów prostujących do wewnątrz

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Uporczywa aktywacja hamujących receptorów sprzężonych z białkiem G powoduje uwrażliwienie na sygnalizację cyklazy adenylowej. Aby zidentyfikować podstawowe szlaki molekularne, konieczne jest bezstronne podejście; jednak strategia ta wymaga opracowania skalowalnego testu uczulającego na cAMP opartego na komórkach. W niniejszym artykule opisujemy test uczulający do badań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA.

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

Tutaj opisujemy metodologię przeprowadzania ukierunkowanego badania przesiewowego "ubikwitom" siRNA w celu zidentyfikowania nowych regulatorów ubikwityny i podobnych do ubikwityny odpowiedzi komórkowej na niedotlenienie, w której pośredniczy HIF1A. Można to dostosować do dowolnej ścieżki biologicznej, gdzie dostępny jest solidny odczyt aktywności reporterowej.

Badania przesiewowe siRNA w celu identyfikacji ubikwityny i regulatorów systemów podobnych do ubikwityny szlaków biologicznych w hodowanych komórkach ssaków

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Tutaj prezentujemy ilościowy i skalowalny protokół do przeprowadzania ukierunkowanych badań przesiewowych małych cząsteczek dla regulatorów kinaz naiwnie zaszczepionego przejścia pluripotencjalnego.

Prosta metoda identyfikacji kinaz, które regulują pluripotencję embrionalnych komórek macierzystych za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych inhibitorów

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

Odkryj metodę wysokoprzepustowego badania przesiewowego chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie poprzez region 3' UTR. Ta technika umożliwia identyfikację związków wpływających na stabilność mRNA w liniach komórkowych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Przeglądaj więcej filmów