Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie
March 3rd, 2015
Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.
W tym eksperymencie przesiewane są biblioteki chemiczne pod kątem związków, które modulują mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej za pośrednictwem trzech głównych nieulegających translacji regionów transkryptów. Po pierwsze, zidentyfikuj trzy główne nieulegające translacji regiony zainteresowania w docelowym genie. Sklonuj te trzy pierwsze UTR do plazmidu reporterowego kontroli El lucyferazy, aby utworzyć chimeryczny transkrypt El lucyferazy trzy pierwsze UTR.
Potem stabilnie. Zintegruj dwa plazmidy w linię komórkową istotną dla choroby, zasiej komórki przenoszące chimeryczny transkrypt w 96. Płytki studzienne traktują je biblioteką związków przez 24 godziny, a następnie identyfikują cząsteczki, które wpływają na aktywność lucyferazy.
Wybierz wybrane cząsteczki do dalszego badania przesiewowego walidacji, a następnie potraktuj zarówno komórki kontrolne, jak i komórki przenoszące chimeryczny transkrypt lucyferazy trzech głównych UTR za pomocą wyselekcjonowanego podzbioru biblioteki. Wyniki będą się różnić, czy wpływ związku jest pośredniczony przez trzy główne nieulegające translacji regiony, czy przez inne sekwencje wektorowe. W przeciwieństwie do większości esejów przesiewowych opartych na reporterach.
Testy, które koncentrują się na regulacji transkrypcji, te testy oparte na komórkach raportu koncentrują się na identyfikacji związków, które modulują poziomy transkryptu mRNA za pośrednictwem trzech regionów głównych i translowanych. Zbierz stabilnie transfekowane komórki nerwiaka zarodkowego za pomocą trypsyny azjatyckiej. Rozcieńczyć komórki do stężenia dwa razy od 10 do piątych komórek na mililitr.
W RPMI zawierający 10% FBS i 1% L-glutaminy na 27 płytek. Przygotować co najmniej 250 mililitrów zawiesiny komórek, biorąc pod uwagę obchodzenie się z płynami, minimalne objętości martwe i powtarzające się etapy pipetowania. Następnie wlej zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika i umieść ją na biurku robota.
Załaduj dziewięć białych płaskich kodów kreskowych. Na dnie 96-dołkowe płytki i pudełko z 200 sterylnymi końcówkami do pipet o pojemności 200 mikrolitrów na biurku robota. Wymieszaj zawiesinę komórek, a następnie dozuj 75 mikrolitrów komórek do każdej studzienki z dziewięcioma płytkami.
Przykryj płytki i pozwól komórkom osiąść na dnie studzienki przez 30 minut, aby zminimalizować wpływ krawędzi. Następnie umieść wszystkie dziewięć płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i inkubuj przez 24 godziny. Podobnie postępuj z pozostałymi płytami po dziewięć na raz.
Rozmrozić złożone płytki biblioteczne w temperaturze pokojowej. Napełnij jedno koryto sterylnym PBS, a drugie 0,5% DMSO w roztworze PBS i umieść je na biurku robota. Dla każdej tabliczki bibliotecznej.
Przygotuj się i odpowiednio oznacz. Jedna płytka rozcieńczająca. Teraz napełnij każdą studzienkę kolumn, od dwóch do 11 płytek rozcieńczających, 398 mikrolitrami sterylnego PBS.
Następnie napełnij kolumny pierwszą i 12 50 mikrolitrami 0,5% DMSO w sterylnym PBS. Następnie naładować dwie płytki rozcieńczające. Dwie płytki biblioteczne, dwa pudełka ze sterylnymi końcówkami o pojemności 50 mikrolitrów i płytki z sześcioma komórkami na biurku robota.
Teraz odkryj płytki komórkowe, odpipetuj dwa mikrolitry 10-milimolowego roztworu podstawowego z jednej z dwóch płytek bibliotecznych na odpowiedniej płytce rozcieńczającej i dobrze wymieszaj. Korzystając z tego samego zestawu końcówek. Przenieść trzy mikrolitry rozcieńczenia 50 mikromolowego na trzy białe 96-dołkowe płytki z kodami kreskowymi zawierające komórki.
Wymień pełny zestaw końcówek i powtórz indukcje komórek dla drugiej płytki bibliotecznej. Przykryj kultury i inkubuj przez 24 godziny. Następnie powtórzyć proces rozcieńczania związku i indukcji komórek dla pozostałych płytek bibliotecznych.
Zrównoważyć odtworzony odczynnik lucyferazy do temperatury pokojowej. Umieść zbiornik lucyferazy na biurku robota i wlej do niego odczynnik. Wyjąć z inkubatora dziewięć płytek z indukowanymi kulturami.
Umieść je na biurku robota, odkryj i wyrównaj do temperatury pokojowej. Następnie dodaj 50 mikrolitrów odczynnika lucyferazy na studzienkę między płytkimi. Wprowadź opóźnienie równe czasowi odczytu luminescencji jednej płytki.
Po 30 minutowej inkubacji. Najpierw zapisz kod kreskowy tabliczki, aby skojarzyć go z odpowiednim plikiem danych. Następnie umieść pierwszą płytkę w luminometrze i zmierz luminescencję.
Po krótkim potrząsaniu powtórz odczyty luminescencji dla wszystkich płytek indukcyjnych. Następnie zbierz pozostały odczynnik Lucyfer i przechowuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po przetworzeniu danych eksperymentalnych z pierwotnego badania przesiewowego należy wybrać trafienia, aby potwierdzić specyficzność związku za pomocą wiśni przesiewającej przeciw.
Wybierz wybrane trafienia i utwórz układ nowej płyty pomostowej, w tym pozycje elementów sterujących. Następnie z porcji przechowywanych w pojedynczych probówkach z kodami kreskowymi 2D utwórz nowe płytki HIIT. Postępowanie zgodnie z tym samym protokołem dotyczy kontroli przesiewowej.
Przygotować 3 96-dołkowe płytki z każdej stabilnej linii komórkowej na każdą płytkę hi. Następnego dnia potraktuj komórki związkami bibliotecznymi. Użyć każdej płytki hi do traktowania trzech płytek CHP 1 34 micken, trzech podstawowych UTR i trzech płytek z komórkami kontrolnymi o stężeniu roboczym dwóch mikromolowych w ciągu 24 godzin.
Zmierz aktywność lucyferazy we wszystkich 34 płytkach CHP 1, trzech podstawowych zestawach nietranslacyjnych i kontrolnych. Podobnie jak w przypadku analizy danych w pierwotnym badaniu przesiewowym, należy znormalizować dane eksperymentalne z podgrzewanych studzienek do średniej z kontrolnych poddanych działaniu nośnika na płytce. Następnie należy obliczyć średnią i odchylenie standardowe dla kontrprób dla każdego badanego związku obliczeniowego.
Krotna zmiana aktywności lucyferazy w CHP 1 34 McIn trzy pierwsze UTR w porównaniu z CHP 1 34. Komórki kontrolne wybierają dowolne odcięcia pełnej zmiany większe niż 1,5 i wartości istotności P mniejsze niż 0,01. W eksperymencie tym przeprowadzono badania przesiewowe biblioteki związków z 2000 r. pod kątem potencjalnych modulatorów potranskrypcyjnych mechanizmów kontrolnych wywieranych przez trzy główne UTR mikrofonu i onkogenu, wyniki sygnałów lucyferazy z jednej z 25 reprezentatywnych płytek bibliotecznych wyświetlanych jako procent leczonego nośnika.
Kontrole pokazują, że większość związków nie wywoływała żadnego widocznego wpływu na trzy główne UTR. Trafienia zostały wybrane, w których średnia wartość i odchylenie standardowe zostały obliczone na wszystkich wartościach testu: związki zmniejszające aktywność lucyferazy poniżej 20% najprawdopodobniej wskazują na wyraźną toksyczność komórkową związku. Ten wykres przedstawia reprezentatywne wyniki dla badań przesiewowych czterech wybranych związków oznaczonych WX, Y i Z. Oba związki W i X powodują zwiększoną ekspresję lucyferazy z onkogenu trzy prime UTR reporter, na co wskazuje różnica w krotności i test T. Należy zauważyć, że chociaż efekty obu związków W i X są naprawdę zależne od trzech pierwszych związków UTR, związek W nie ma znaczącego wpływu na żywotność komórek.
Podczas gdy związek X wykazuje pewną aktywność cytotoksyczną, na co wskazuje znormalizowany sygnał lucyferazy w komórkach kontrolnych CHP 1 34, ani związek Y ani związek Z przy stężeniu dwóch mikromolowych nie wykazują wpływu na poziomy lucyferazy w trzech głównych UTR. Zmniejszona aktywność lucyferazy wykryta w pierwotnym badaniu przesiewowym po leczeniu związkiem Y jest raczej konsekwencją cytotoksyczności. W przypadku związku Z zwiększona aktywność lucyferazy wynika z nieswoistej pod względem trzech głównych aktywacji UTR promotora wirusa.
Ponieważ równoważną regulację w górę obserwuje się zarówno w zestawach kontrolnych, jak i nieulegających translacji, w tym teście o wysokiej przepustowości należy pamiętać, że walidacja ciepła pierwotnego w komórkach kontrolnych ma kluczowe znaczenie dla rozróżnienia związków, które działają naprawdę przez trzy główne regiony nieulegające translacji, od tych związków, które działają za pośrednictwem promotora.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje test reporterowy oparty na komórkach, zaprojektowany w celu przesiewania bibliotek chemicznych pod kątem związków, które moduliują mechanizmy kontroli post-transkrypcyjnej poprzez 3’ nieprzetłumaczony region (UTR) transkryptów. Metodologia obejmuje sklonowanie 3’ UTR do plazmidu reporterowego kontrolnego luciferazy i jego integrację z odpowiednią linią komórkową.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Ekspresja genów
- Farmakologia
Tło
- Mechanizmy kontroli post-transkrypcyjnej odgrywają kluczową rolę w regulacji genów.
- 3’ UTR jest kluczowym regionem wpływającym na stabilność mRNA i translację.
- Przesiewanie bibliotek chemicznych może identyfikować nowe związki wpływające na te mechanizmy.
- Testy reporterowe są cennym narzędziem do badania regulacji genów.
Cel badania
- Opracowanie solidnego testu do przesiewania związków wpływających na regulację post-transkrypcyjną.
- Wykorzystanie 3’ UTR jako celu dla modulacji ekspresji genów.
- Zwiększenie zrozumienia chemicznych wpływów na regulację genów.
Zastosowane metody
- Identyfikacja 3’ UTR o interesującym celu w docelowym genie.
- Klonowanie 3’ UTR do plazmidu reporterowego kontrolnego luciferazy.
- Stała integracja plazmidów z linią komórkową istotną dla choroby.
- Zasiewanie komórek w płytkach 96-dołkowych i leczenie biblioteką związków.
Główne wyniki
- Identyfikacja związków znacząco wpływających na aktywność luciferazy.
- Demonstracja skuteczności testu w przesiewaniu bibliotek chemicznych.
- Wgląd w modulację mechanizmów kontroli post-transkrypcyjnej.
- Potencjalne zastosowania w odkrywaniu leków i badaniach nad regulacją genów.
Wnioski
- Opracowany test jest cennym narzędziem do przesiewania związków.
- Dostarcza wglądu w rolę 3’ UTR w regulacji genów.
- To podejście może ułatwić odkrycie nowych środków terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This assay addresses a critical gap in early drug discovery by enabling the identification of compounds that modulate gene expression through post-transcriptional mechanisms, a regulatory layer often overlooked in transcriptional-focused screens. By linking 3’ UTR activity to luciferase readouts in disease-relevant cells, it provides a mechanistic de-risking step for target validation, helping prioritize compounds with specific modes of action before downstream investment. The approach supports predictive confidence in lead identification by distinguishing UTR-mediated effects from promoter-driven or cytotoxic artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving post-transcriptional regulation by linking 3’ UTR activity to compound treatment.
- Operational Value: Uses a luciferase reporter system to quantitatively assess mRNA fate modulation via the 3’ UTR in a stable, disease-relevant cellular context.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by isolating compounds that specifically affect mRNA stability or translation through defined UTR sequences.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces normalized luminescence readouts that enable dose-dependent assessment of compound effects on 3’ UTR-mediated gene regulation.
- Operational Value: Employs a counter-screening strategy to discriminate true 3’ UTR modulators from compounds acting via promoter elements or general cytotoxicity.
- Scientific Value: Generates fold-change and statistical thresholds (e.g., >1.5 fold change, p<0.01) to define hit criteria for follow-up validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant cell lines (e.g., neuroblastoma) to ensure biological context aligns with pathophysiological mechanisms of interest.
- Operational Value: Requires stable integration of the 3’ UTR-luciferase construct, enabling consistent, long-term assay performance across screening campaigns.
- Scientific Value: Facilitates translational continuity by validating hits against endogenous target expression, connecting reporter activity to native gene regulation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation and lead identification by providing mechanistic insight into post-transcriptional gene regulation before significant investment in lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of UTR-dependent gene regulation by measuring luciferase activity as a proxy for mRNA stability and translation.
- Screening: Enables high-throughput evaluation of chemical libraries with built-in counterscreening to reduce false positives from non-specific effects.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized luminescence data with statistical cutoffs to prioritize compounds for secondary validation.
- Translational Research: Connects reporter-based findings to endogenous gene expression, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform where different 3’ UTRs can be swapped to screen for regulators of multiple disease-relevant genes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by confirming compound effects are mediated through the 3’ UTR rather than transcriptional or cytotoxic mechanisms.
- Operational Value: Promotes assay reproducibility through stable cell line integration and standardized liquid handling protocols for compound delivery and detection.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering out promiscuous or toxic compounds early, reducing failure rates in later-stage preclinical studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hits based on mechanism-specific activity, supporting better go/no-go decisions in target-focused programs.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise to clone and validate the 3’ UTR-luciferase reporter construct.
- Depends on access to high-throughput liquid handling robots and luminometers for automated compound delivery and detection.
- Necessitates cross-team standardization between assay developers, screening technologists, and data analysts to ensure consistent hit calling.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different cell lines or UTR sequences, including validation of stable integration and signal window.
- Includes practical limitations such as the need to distinguish true UTR effects from artifacts via counter-screening in control cells lacking the 3’ UTR insert.
