Analiza autofagii u Penicillium chrysogenum przy użyciu podkładek głodowych w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną

Celem niniejszej procedury jest indukcja i obserwacja autofagii w grzybie nitkowatym. Jest to realizowane poprzez uprzednie zaszczepienie niewielkich objętości pożywki zawierającej składniki odżywcze zarodnikami lub małymi fragmentami grzybni. W drugim kroku, w zagłębieniach szklanych szkiełek mikroskopowych, przygotowuje się podkładki do głodzenia, a następnie szczepionkę przenosi się na te podkładki.

W ostatnim kroku podłoża do głodzenia są inkubowane w wilgotnej komorze w celu indukcji autofagii. Ostatecznie proces autofagii można śledzić, monitorując za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej translokację wybranych fluorescencyjnych białek markerowych do wakuol. Metoda ta może pomóc w badaniu kluczowych zagadnień z zakresu biologii komórki, takich jak identyfikacja nowych związków modulujących proces autofagii.

Aby przygotować się do eksperymentu z głodzeniem, jeśli badany szczep P cresa genum jest hodowany na zielnym ryżu, najpierw należy umieścić dwa do trzech ziaren ryżu pokrytych grzybnią w probówce do wirówki o pojemności 1,5 µL, a następnie wypełnić probówkę 500 µL pożywki wzrostowej GG (ekstrakt drożdżowy z glukozą). Następnie probówkę należy wstrząsnąć na vortexie przez 30 sekund, aby zarodniki oddzieliły się od ryżu, i inkubować przez jeden dzień w temperaturze pokojowej. Następnego dnia zawiesinę zarodników należy rozcieńczyć w sterylnej wodzie z kranu do stężenia 1:50 i dobrze wymieszać. Jeśli p cryogen jest hodowany na agarze.

Za pomocą końcówki do pipety przenieś małe fragmenty grzybni do probówki do mikrowirówki o objętości 1,5 ml zawierającej 400 µl sterylnej wody z kranu i około 100 mg szklanych kulek. Następnie mieszaj próbkę w wirówce typu vortex przez dwie minuty, aby grzybnia uległa fragmentacji. Aby hodować genum PCE na podłożu głodowym, najpierw rozgrzej płytkę grzejną do temperatury około 60 °C.

Następnie rozpuść dwa gramy aros w 100 mililitrach wody z kranu w mikrofalówce, aż uzyskany roztwór stanie się całkowicie przejrzysty, a następnie schłodź aros do około 60 °C. Napełnij jedną probówkę typu microcentrifuge o pojemności 1,5 mililitra na każdą próbkę 400 mikrolitrami sterylnej wody z kranu lub roztworu związku. Następnie ogrzewaj probówki i szkiełka przedmiotowe na płycie grzejnej przez co najmniej 60 sekund.

Przenieś 400 µL aros o temperaturze 60 °C do wszystkich probówek, tak aby całkowita objętość w każdej z nich wyniosła 800 µL, a następnie krótko wymieszaj probówki w wortexie i umieść je ponownie na płycie grzejnej, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu. Następnie pipetuj 140 µL odpowiedniego roztworu aros do wgłębienia każdego szkiełka mikroskopowego. Uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza, natychmiast przykryj aros szkiełkami nakrywkowymi, a następnie pozostaw szkiełka na około cztery minuty.

W temperaturze pokojowej, po zastygnięciu podkładek agarowych, należy ostrożnie zdjąć koperka za pomocą kciuka lub palca wskazującego, a następnie umieścić szkiełka przedmiotowe wraz z podkładkami w komorze wilgotnościowej. Następnie nanieś pipetą 5 µL wcześniej przygotowanego P er genum na środek podkładki do głodzenia i owiń komorę wilgotnościową plastikową torbą, aby zapewnić dodatkową ochronę przed wysychaniem, dbając o to, by nie przesuwać zbyt mocno pojemnika i nie zakłócać kultur. Następnie przechowuj inokulaty w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 h przed analizą próbek.

Następnego dnia przenieść preparaty na suchy ręcznik papierowy, a następnie nanieść 50 µL wody na każdą podstawkę do głodzenia. Użyć szkiełka nakrywkowego, aby odcisnąć nadmiar wody i usunąć go świeżym ręcznikiem papierowym. Następnie dla każdego preparatu użyć obiektywu 20x, aby uzyskać ogólny obraz wzrostu grzybni.

Aby ocenić lokalizację GFP w Hy-Fi, otwórz obrazy przy użyciu obiektywu 63 x lub 100 x. Na koniec, po każdym oglądaniu, umieszczaj preparaty z powrotem w komorze wilgotnej aż do kolejnego etapu eksperymentu.

Na tych zdjęciach szczep G-F-P-S-K-L-P Creo Genum został wykorzystany do oceny degradacji peroksysomów po 20 godzinach inkubacji. GFP nie zaobserwowano w wakuolach, a organelle te nie były powiększone. Jednak po 40 godzinach wzrostu w niektórych strzępkach można było zwizualizować WAKUOLE znakowane GFP, co wskazuje na aktywację autofagii, przy jednoczesnym zaobserwowaniu fluorescencji GFP oraz powiększonych wakuol po 60 godzinach.

W tym eksperymencie jako kontrolę negatywną wykorzystano mutant p caressa Genum delta 80 G one. Należy zauważyć brak powiększenia wakuol oraz brak GFP, nawet po 60 godzinach wzrostu, co było obserwowane w przypadku nieleczonego szczepu G-F-P-S-K-L; jako kontrolę pozytywną zastosowano rapamycynę, lek stymulujący autofagię. Wakuole znakowane GFP stały się widoczne po 40 godzinach wzrostu, a w przypadku Hy-Fi do 60 godziny zostały całkowicie wypełnione ogromnymi wakuolami zawierającymi GFP.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak analizować autofagię w grzybach mentis.