Name: Analiza autofagii u Penicillium chrysogenum przy użyciu podkładek głodowych w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Poznaj metodę analizy autofagii u grzybów nicieniowych przy użyciu podkładek głodowych i mikroskopii fluorescencyjnej. Technika umożliwia śledzenie translokacji markerów fluorescencyjnych do wakuoli w Penicillium chrysogenum.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CQS otrzymuje stypendium od LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF). Autor pragnie podziękować Idzie J. van der Klei za szczepy P. chrysogenum użyte w tej pracy oraz Andreasowi S. Reichertowi za dar rapamycyny.

1. Przygotowanie P. chrysogenum do eksperymentów z głodem
<ol>
	<li>Jeśli szczep P. chrysogenum będący przedmiotem zainteresowania jest trzymany na ryżu ("zielony ryż"), umieść 2-3 ziarna ryżu pokryte grzybnią zarodnikującą w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Napełnij go 500 μl YGG (10 g/l KCl, 20 g/l glukozy, 10 g/l drożdżowej bazy azotowej, 5 g/l K2HPO4, 20 g/l ekstraktu drożdżowego).
	<ol>
		<li>Obracaj probówkę przez 30 sekund, aby zarodniki mogły skutecznie oderwać się od ryżu.</li>
		<li>Inkubować probówkę przez 1 dzień w temperaturze pokojowej (np. między 20 a 25 °C).</li>
		<li>Przygotować rozcieńczenie 1:50 tej zawiesiny zarodników w sterylnej wodzie z kranu, dobrze wymieszać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli interesujący szczep P. chrysogenum jest trzymany na płytce agarowej (np. na płytce agarowej YGG), przenieś małe kawałki grzybni do 1,5 ml probówki do mikrowirówki zawierającej 400 μl sterylnej wody z kranu i około 100 mg szklanych kulek za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety.
	<ol>
		<li>Wirować probówkę przez 2 minuty, aby grzybnia uległa rozdrobnieniu. Zawartość tubki należy natychmiast zużyć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Etapy przygotowawcze do uprawy P. chrysogenum na polach głodowych
<ol>
	<li>Włączyć płytę grzewczą i ustawić ją na około 60 °C.</li>
	<li>Rozpuść 2 g agarozy w 100 ml wody z kranu, gotując roztwór w kuchence mikrofalowej. Zadbaj o to, aby ten roztwór był całkowicie klarowny po podgrzaniu. Jeśli tak nie jest, gotuj go ponownie, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Przed użyciem pozostawić roztwór agarozy do ostygnięcia do około 60 °C.</li>
	<li>Napełnij 1,5 ml probówek do mikrowirówek (2-4, w zależności od liczby próbek) 400 μl sterylnej wody z kranu każda (bez dodatku dodatkowych związków) lub 400 μl (dodanie x μl roztworu złożonego w kroku 2.5) i umieść je na płycie grzewczej na co najmniej 1 minutę, aby woda w środku się nagrzała.</li>
	<li>Umieść szkiełka mikroskopowe zawierające centralną wnękę na płycie grzewczej na co najmniej 1 minutę.</li>
	<li>Dodać 400 μl 2 % agarozy do roztworu w 1,5 ml probówkach do mikrowirówek i krótko przetrząsać. Po tym etapie, jeśli jest to pożądane, dodaj dodatkowe związki (np. 1 μM rapamycyny). Jeśli tak się stanie, należy krótko przetrząsnąć wir po odpipetowaniu każdej dodatkowej substancji do probówki. Umieść rurki z powrotem na stole grzewczym, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu. 
	UWAGA: Całkowita objętość w probówce mikrowirówki powinna wynosić 800 μl.</li>
</ol>
3. Przygotowanie preparatów mikroskopowych zawierających podkładki głodowe
<ol>
	<li>Odpipetować 140 μl roztworu agarozy do wnęki szkiełka mikroskopowego (która nadal znajduje się na płycie grzewczej). Jeśli to możliwe, staraj się unikać robienia bąbelków.</li>
	<li>Natychmiast umieścić szkiełko nakrywkowe na roztworze agarozy. 
	UWAGA: Spowoduje to płaską powierzchnię.</li>
	<li>Umieść szkiełko mikroskopowe na stole laboratoryjnym na około 4 minuty, aby podkładka agarozowa zastygła.</li>
	<li>Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe z podkładki agarozowej, zsuwając je za pomocą kciuka lub palca wskazującego (nosić rękawiczki, aby uniknąć zanieczyszczenia!).</li>
	<li>Umieść szkiełko mikroskopowe wraz z podkładką w wilgotnej komorze, aby zapobiec wysuszeniu. Zalecenie: Użyj pustego pudełka na końcówki, w którym nadal znajduje się wkładka do przytrzymywania końcówek do pipet. Dodaj sterylną wodę do pudełka tak, aby dno było przykryte. Umieść szkiełka mikroskopowe na wkładce i zamknij pudełko.</li>
</ol>
4. Zaszczepianie poduszek głodowych P. chrysogenum i inkubacja
<ol>
	<li>Odmierzyć pipetą 5 μl rozcieńczonych zarodników w stosunku 1:50 (jeżeli kultury były hodowane na ryżu) lub 5 μl nierozcieńczonego roztworu zawierającego fragmenty grzybni (jeśli kultury były hodowane na płytce agarowej) na środek podkładki głodowej.</li>
	<li>Zamknij mokrą komorę i zawiń ją w plastikową torbę (służy to jako dodatkowe zabezpieczenie przed wysuszeniem padów głodowych). Uważaj, aby nie przesuwać pudełka zbyt mocno, ponieważ w przeciwnym razie krople inokulacji zostaną zakłócone.</li>
	<li>Przechowywać owinięte pudełko w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 godzin przed analizą próbek.</li>
</ol>
5. Analiza mikroskopowa próbek
<ol>
	<li>Po 20 godzinach inkubacji próbki są gotowe do analizy mikroskopowej; umieścić szkiełko mikroskopowe na suchej bibułce (dno ma tendencję do zamoczenia).</li>
	<li>Odpipetować niewielką ilość wody (ok. 50 μl) na podkładkę głodową. Nałóż szkiełko nakrywkowe na podkładkę i wyciśnij nadmiar wody. Usuń nadmiar wody za pomocą bibuły.</li>
	<li>Umieść szkiełko mikroskopowe na stole obserwacyjnym mikroskopu fluorescencyjnego. Aby uzyskać przegląd wzrostu grzybni, użyj obiektywu 20X. Użyj obiektywów 63X lub 100X do badania lokalizacji GFP w strzępkach. Aby zapobiec stopniowemu wysuszaniu próbki, nie należy analizować próbek dłużej niż 15 minut przed ponownym włożeniem ich do mokrej komory.</li>
	<li>Powtarzać 5,3 w regularnych odstępach czasu (np. po 40 godzinach i 60 godzinach wzrostu). 
	UWAGA: Próbkę można umieścić z powrotem w komorze mokrej. Nie jest konieczne usuwanie szkiełka nakrywkowego, ponieważ nie wpływa to na wzrost grzybni.</li>
</ol>

<ol><li>Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+quality+control%3A+an+integrated+network+of+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).</li>
<li>Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in filamentous fungi.</a> Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).</li>
<li>Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina%3A+a+model+organism+to+study+mechanisms+of+healthy+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing.</a> Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina+target+of+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina target of rapamycin.</a> Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).</li>
<li>Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+ATG8+homologue+Aoatg8+and+role+of+autophagy+in+differentiation+and+germination+in+Aspergillus+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae.</a> Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+cell+death+in+Podospora+autophagy+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants.</a> Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).</li>
<li>Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+fungal+cell+death+is+necessary+for+infection+by+the+rice+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus.</a> Science. 312 (5773), 580-583 (2006).</li>
<li>Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+deficiency+promotes+beta-lactam+production+in+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).</li>
<li>Meijer, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomes+are+required+for+efficient+penicillin+biosynthesis+in+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).</li>
<li>Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding%2C+improving+and+using+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Understanding, improving and using green fluorescent proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).</li>
<li>Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+regulation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">mTOR regulation of autophagy.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).</li>
<li>Hickey, P. C., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+living+cells+of+Aspergillus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Imaging living cells of Aspergillus in vitro.</a> Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Przedstawiona tutaj metoda pozwala na wygodne i powtarzalne badanie autofagii u P. chrysogenum. Na przykład może być stosowany do badań przesiewowych skuteczności różnych związków, niezależnie od tego, czy są one w stanie modulować odpowiedź autofagii tego grzyba, czy nie. Wyniki z rapamycyną pokazują, że hamowanie sygnalizacji TOR prowadzi do wyraźnej indukcji autofagii u P. chrysogenum , co wykazano również w przypadku innych organizmów 11.
Możliwe jest użycie gr...

Grzyby strzępkowe są doskonałymi systemami modelowymi do badania procesów rozwojowych. Oferują one szereg korzyści eksperymentalnych, takich jak tania uprawa, duża liczba potomstwa i dostępność genetyczna. Ten ostatni punkt ma szczególne znaczenie dla konstrukcji transformantów, które pozwalają na zbadanie znaczenia dotychczas niescharakteryzowanych genów dla różnych mechanizmów komórkowych. Grzyby strzępkowe odegrały zasadniczą rolę w wyjaśnieniu kilku elementów i mechanizmów komórkowych szlaków kontroli jakości, takich jak aktywność proteazy w degradacji nieprawidłowych białek, dynamika mitochondriów w celu utrzymania integralności mitochondriów i autofagia w celu usunięcia nadmiaru i/lub dysfunkcyjnych składników komórek oraz w utrzymaniu żywotności komórek w czasach głodu1,2,3.
Istnieje kilka eksperymentalnych technik dostępnych do badania autofagii u grzybów strzępkowych 2: (i) badanie wakuoli, jeśli zawierają gęste ciała autofagiczne, gdy proteazy są hamowane przez transmisyjną mikroskopię elektronową 4, (ii) wizualizacja autofagosomów poprzez monitorowanie ognisk GFP-Atg8 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej 5,6 oraz (iii) wykrywanie zakwaszonych struktur autofagosomalnych za pomocą barwnika fluorescencyjnego monodansyl kadaweryna 7.
Tutaj prezentowana jest nowatorska metoda uprawy Penicillium chrysogenum do badań nad autofagią. Głównym elementem jest "podkładka głodowa", która składa się po prostu z 1% agarozy rozpuszczonej w wysterylizowanej wodzie z kranu. Dodatkowe związki (np. stresory, zmiatacze, modulatory autofagii) można dodawać do podkładki, o ile nie wykazują one autofluorescencji. Podkładka znajduje się w szkiełkach mikroskopowych, które zawierają płytką wgłębienie centralne. Ta podkładka jest zaszczepiana albo zawiesiną zarodników, albo małymi fragmentami grzybni. To ostatnie jest wskazane, jeśli szczep będący przedmiotem zainteresowania nie jest w stanie efektywnie zarodnikować (np. Δatg1 szczepy 8). Szkiełka są umieszczane w mokrych komorach (można je łatwo zbudować, używając pustych pojemników na końcówki do pipet), aby zapobiec wysuszeniu próbki i są inkubowane w temperaturze pokojowej. W tych warunkach P. chrysogenum jest w stanie rosnąć przez kilka dni. Autofagię można zaobserwować mikroskopowo poprzez powiększenie wakuolowe, które jest dodatnim markerem autofagii grzybów. W tym artykule wykorzystano szczep P. chrysogenum (Wisconsin 54-1255), który tworzy zielone białko fluorescencyjne, które jest skierowane do peroksysomów przez jego C-końcową sekwencję "SKL" 9. Dzięki temu możliwe jest monitorowanie degradacji peroksysomów. Możliwe jest również znakowanie innych przedziałów komórki (np. mitochondriów) za pomocą odpowiednich sygnałów lokalizacyjnych i analizowania ich degradacji. Chociaż przedstawiono tu dane z P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL), z pewnością możliwe jest zastosowanie metody "podkładki głodowej" również w odniesieniu do innych grzybów strzępkowych (np. Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus itp.).

<table><tbody><tr><td>Szkiełka mikroskopowe z centralną wnęką</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy</td><td>H884.1</td><td>Po oczyszczeniu można ich używać wielokrotnie.</td></tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy</td><td>A553.1</td><td>Średnica: 0,25 - 0,50 mm</td></tr></tbody></table>

analiza autofagii u penicillium chrysogenum przy użyciu podkładek głodowych w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Badanie systemów kontroli jakości sieci komórkowych stało się bardzo dynamiczną i istotną dziedziną współczesnych badań. Stało się jasne, że komórki posiadają kilka linii obrony przed uszkodzeniem biologicznie istotnych cząsteczek, takich jak kwasy nukleinowe, lipidy i białka. Oprócz dynamiki organelli (fuzja/rozszczepienie/ruchliwość/dziedziczenie) i ściśle kontrolowanej aktywności proteazy, degradacja nadmiarowych, uszkodzonych lub uszkodzonych organelli przez autofagię (komórkowe "samozjadanie") spotkała się z dużym zainteresowaniem społeczności naukowej. Regulacja autofagii jest dość złożona i zależy od czynników genetycznych i środowiskowych, z których wiele nie zostało do tej pory wyjaśnionych. Tutaj przedstawiono nowatorską metodę, która pozwala na wygodne badanie autofagii w grzybie nitkowatym Penicillium chrysogenum. Opiera się na wzroście grzyba na tak zwanych "poduszkach głodowych" w celu stymulacji autofagii w powtarzalny sposób. Próbki są bezpośrednio oznaczane za pomocą mikroskopii i oceniane pod kątem indukcji / postępu autofagii. Przedstawiony tutaj protokół nie jest ograniczony do stosowania z P. chrysogenum i może być łatwo dostosowany do stosowania u innych grzybów strzępkowych.

Aby zademonstrować użyteczność opisanego powyżej protokołu, przeanalizowano degradację peroksysomów w szczepie P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL). W tym szczepie GFP-SKL jest zazwyczaj importowany do peroksysomów 9. W efekcie podczas analizy próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojawiają się liczne kształty sferyczne. W przypadku zachodzenia autofagii wakuole powiększają się. GFP-SKL zostaje włączony do wakuol w procesie autofagii (peksofagii). Ze względu na to, że GFP jest odporny na degrada...

Wygodna i skuteczna metoda badania autofagii u Penicillium chrysogenum za pomocą podkładek głodowych (mieszaniny agarozy i wody z kranu w szkiełku mikroskopowym zawierającym centralną jamę) jest przedstawiona tutaj.

Analiza autofagii u Penicillium chrysogenum przy użyciu podkładek głodowych w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Celem niniejszej procedury jest indukcja i obserwacja autofagii w grzybie nitkowatym. Jest to realizowane poprzez uprzednie zaszczepienie niewielkich objętości pożywki zawierającej składniki odżywcze zarodnikami lub małymi fragmentami grzybni. W drugim kroku, w zagłębieniach szklanych szkiełek mikroskopowych, przygotowuje się podkładki do głodzenia, a następnie szczepionkę przenosi się na te podkładki.W ostatnim kroku podłoża do głodzenia są inkubowane w wilgotnej komorze w celu indukcji autofagii. Ostatecznie proces autofagii można śledzić, monitorując za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej translokację wybranych fluorescencyjnych białek markerowych do wakuol. Metoda ta może pomóc w badaniu kluczowych zagadnień z zakresu biologii komórki, takich jak identyfikacja nowych związków modulujących proces autofagii.Aby przygotować się do eksperymentu z głodzeniem, jeśli badany szczep P cresa genum jest hodowany na zielnym ryżu, najpierw należy umieścić dwa do trzech ziaren ryżu pokrytych grzybnią w probówce do wirówki o pojemności 1,5 µL, a następnie wypełnić probówkę 500 µL pożywki wzrostowej GG (ekstrakt drożdżowy z glukozą). Następnie probówkę należy wstrząsnąć na vortexie przez 30 sekund, aby zarodniki oddzieliły się od ryżu, i inkubować przez jeden dzień w temperaturze pokojowej. Następnego dnia zawiesinę zarodników należy rozcieńczyć w sterylnej wodzie z kranu do stężenia 1:50 i dobrze wymieszać. Jeśli p cryogen jest hodowany na agarze.Za pomocą końcówki do pipety przenieś małe fragmenty grzybni do probówki do mikrowirówki o objętości 1,5 ml zawierającej 400 µl sterylnej wody z kranu i około 100 mg szklanych kulek. Następnie mieszaj próbkę w wirówce typu vortex przez dwie minuty, aby grzybnia uległa fragmentacji. Aby hodować genum PCE na podłożu głodowym, najpierw rozgrzej płytkę grzejną do temperatury około 60 °C.Następnie rozpuść dwa gramy aros w 100 mililitrach wody z kranu w mikrofalówce, aż uzyskany roztwór stanie się całkowicie przejrzysty, a następnie schłodź aros do około 60 °C. Napełnij jedną probówkę typu microcentrifuge o pojemności 1,5 mililitra na każdą próbkę 400 mikrolitrami sterylnej wody z kranu lub roztworu związku. Następnie ogrzewaj probówki i szkiełka przedmiotowe na płycie grzejnej przez co najmniej 60 sekund.Przenieś 400 µL aros o temperaturze 60 °C do wszystkich probówek, tak aby całkowita objętość w każdej z nich wyniosła 800 µL, a następnie krótko wymieszaj probówki w wortexie i umieść je ponownie na płycie grzejnej, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu. Następnie pipetuj 140 µL odpowiedniego roztworu aros do wgłębienia każdego szkiełka mikroskopowego. Uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza, natychmiast przykryj aros szkiełkami nakrywkowymi, a następnie pozostaw szkiełka na około cztery minuty.W temperaturze pokojowej, po zastygnięciu podkładek agarowych, należy ostrożnie zdjąć koperka za pomocą kciuka lub palca wskazującego, a następnie umieścić szkiełka przedmiotowe wraz z podkładkami w komorze wilgotnościowej. Następnie nanieś pipetą 5 µL wcześniej przygotowanego P er genum na środek podkładki do głodzenia i owiń komorę wilgotnościową plastikową torbą, aby zapewnić dodatkową ochronę przed wysychaniem, dbając o to, by nie przesuwać zbyt mocno pojemnika i nie zakłócać kultur. Następnie przechowuj inokulaty w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 h przed analizą próbek.Następnego dnia przenieść preparaty na suchy ręcznik papierowy, a następnie nanieść 50 µL wody na każdą podstawkę do głodzenia. Użyć szkiełka nakrywkowego, aby odcisnąć nadmiar wody i usunąć go świeżym ręcznikiem papierowym. Następnie dla każdego preparatu użyć obiektywu 20x, aby uzyskać ogólny obraz wzrostu grzybni.Aby ocenić lokalizację GFP w Hy-Fi, otwórz obrazy przy użyciu obiektywu 63 x lub 100 x. Na koniec, po każdym oglądaniu, umieszczaj preparaty z powrotem w komorze wilgotnej aż do kolejnego etapu eksperymentu.Na tych zdjęciach szczep G-F-P-S-K-L-P Creo Genum został wykorzystany do oceny degradacji peroksysomów po 20 godzinach inkubacji. GFP nie zaobserwowano w wakuolach, a organelle te nie były powiększone. Jednak po 40 godzinach wzrostu w niektórych strzępkach można było zwizualizować WAKUOLE znakowane GFP, co wskazuje na aktywację autofagii, przy jednoczesnym zaobserwowaniu fluorescencji GFP oraz powiększonych wakuol po 60 godzinach.W tym eksperymencie jako kontrolę negatywną wykorzystano mutant p caressa Genum delta 80 G one. Należy zauważyć brak powiększenia wakuol oraz brak GFP, nawet po 60 godzinach wzrostu, co było obserwowane w przypadku nieleczonego szczepu G-F-P-S-K-L; jako kontrolę pozytywną zastosowano rapamycynę, lek stymulujący autofagię. Wakuole znakowane GFP stały się widoczne po 40 godzinach wzrostu, a w przypadku Hy-Fi do 60 godziny zostały całkowicie wypełnione ogromnymi wakuolami zawierającymi GFP.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak analizować autofagię w grzybach mentis.

analysis-autophagy-penicillium-chrysogenum-using-starvation-pads

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza autofagii w Penicillium chrysogenum przy użyciu poduszczek głodowych w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Autofagia to wszechobecny proces, który umożliwia komórkom degradację i recykling białek i organelli. Stosujemy zaawansowaną mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji i ilościowego określenia niewielkich, ale istotnych zmian fizycznych związanych z indukcją autofagii, w tym powstawania i dystrybucji autofagosomów i lizosomów oraz ich fuzji w autolizosomy.

Ilościowa analiza autofagii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Mikroskopia poklatkowa markerów autofagii znakowanych fluorescencyjnie umożliwia monitorowanie dynamicznej odpowiedzi autofagii z wysoką rozdzielczością czasową. Korzystając ze specyficznych markerów autofagii i organelli w kombinacji 3 różnych kolorów, możemy śledzić wkład białka w tworzenie autofagosomów w solidnym kontekście przestrzennym i czasowym.

Obrazowanie na żywych komórkach wczesnych zdarzeń autofagii: omegasomy i nie tylko

Eksperymentalna sepsa może być wywołana u myszy za pomocą metody podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP). Aktualne protokoły oceny autofagii in vivo w kontekście sepsy wywołanej CLP przedstawiono tutaj: Protokół pomiaru autofagii przy użyciu myszy (GFP)-LC3 oraz protokół pomiaru tworzenia autofagosomów za pomocą mikroskopii elektronowej.

Podwiązanie jelita ślepego i sepsa wywołana nakłuciem jako model do badania autofagii u myszy

Aby przeciwdziałać rozprzestrzenianiu się patogenów, komórki gospodarza reorganizują swój cytoszkielet, aby podzielić bakterie na grupy i wywołać autofagię. Za pomocą zakażenia Shigella komórek hodowli tkankowej identyfikowane i charakteryzowane są determinanty gospodarza i patogenu leżące u podstaw tego procesu. Korzystając z modeli zakażenia Shigella danio pręgowanego, bada się rolę odkrytych cząsteczek i mechanizmów in vivo.

Zastosowanie Shigella flexneri do badania interakcji autofagia-cytoszkielet

Tutaj, wielospektralna cytometria przepływowa z funkcją analityczną, która porównuje jasne obrazy szczegółów 3 markerów autofagii i określa ilościowo ich kolokalizację, wraz z liczeniem plamek LC3, została użyta do pomiaru autofagii w obiektywny, ilościowy i statystycznie solidny sposób.

Ocena strumienia autofagicznego poprzez pomiar kolokalizacji LC3, p62 i LAMP1 za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy do ekstrakcji danych ilościowych z badań biologicznych komórek opartych na obrazowaniu fluorescencyjnym agregacji białek i przepływu autofagicznego w ośrodkowym układzie nerwowym modeli neurodegeneracji Drosophila.

Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół przygotowania wspólnej hodowli komórek kryptokokowych i ameb, która jest badana przy użyciu nieruchomych, fluorescencyjnych obrazów i obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego o wysokiej rozdzielczości. Zilustrowano tutaj, w jaki sposób dane ilościowe mogą uzupełniać takie informacje jakościowe.

Komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą

Obecny protokół opisuje indukcję autofagii w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster poprzez wyczerpanie składników odżywczych i analizuje zmiany w autofagii za pomocą transgenicznych szczepów much.

Analiza autofagii wywołanej głodem w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster

Celem tego protokołu jest określenie poziomów autofagicznych w raku trzustki i komórkach groniastych trzustki poprzez immunofluorescencję LC3 i kwantyfikację kropek LC3.

Ocena poziomów autofagii w dwóch różnych modelach komórek trzustki przy użyciu immunofluorescencji LC3

Tutaj prezentujemy protokół do zoptymalizowanej korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej opartej na endogennym, fluorescencyjnym znakowaniu jako narzędzie do badania lokalizacji rzadkich białek w odniesieniu do ultrastruktury komórkowej. O sile tego podejścia świadczy ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 w wygłodzonych komórkach bez leczenia bafilomycyną.

Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Poznaj metodę analizy autofagii u grzybów nicieniowych przy użyciu podkładek głodowych i mikroskopii fluorescencyjnej. Technika umożliwia śledzenie translokacji markerów fluorescencyjnych do wakuoli w Penicillium chrysogenum.

Analiza autofagii u Penicillium chrysogenum przy użyciu podkładek głodowych w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną

Przeglądaj więcej filmów