Nowatorski biopanning oparty na mikroskopii sił atomowych do izolacji odczynników specyficznych dla morfologii przeciwko wariantom TDP-43 w stwardnieniu zanikowym bocznym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie odczynników specyficznych morfologicznie przeciwko białku wiążącemu DNA tar. 43 warianty obecne w LS, z wykorzystaniem dwufazowej technologii radiowego panningu w oparciu o A FM. Osiąga się to poprzez uprzednie poddanie zróżnicowanej biblioteki fagów wielokrotnym rundom panningu negatywnego przeciwko antygenom poza-celowym z użyciem rurek immunologicznych.

Negatywną selekcję (negative panning) przeprowadza się sekwencyjnie przeciwko albuminie surowicy bydlęcej, zagregowanej alfa-synukleinie oraz zdrowej tkance ludzkiego mózgu. Drugim krokiem jest przeprowadzenie weryfikacji metodą FM po każdym cyklu negatywnej selekcji, aby upewnić się, że wszystkie niepożądane fagie zostały skutecznie usunięte. W tym przykładzie negatywnej selekcji z użyciem zagregowanej alfa-synukleiny fagi są widoczne po jednej rundzie, ale nie występują już po 10. rundzie.

Następnie, ze względu na ograniczoną dostępność próbek, pozostałe rundy panningu negatywnego przeprowadza się na MICA. Fagi reagujące z TDP 43 immunoprecypitanym z tkanek zdrowych oraz z tkanek osób z otępieniem czołowo-skroniowym (FTD) są usuwane sekwencyjnie. Ostatnim krokiem jest wyizolowanie fagów wiążących się z immunoprecypitanem a LS.

Fagi wiążące TDP 43 z miki są eluowane przy użyciu trypsyny, trietyloaminy i komórek TG. Ostatecznie specyficzność tych potencjalnych klonów aLS jest weryfikowana za pomocą pośrednich testów ELISA oraz dot blot; w obu analizach unieruchomiono homogenizaty tkanek mózgowych osób zdrowych oraz pacjentów z ALS-FTD. Zazwyczaj wykrywana jest większa reaktywność wobec tkanki aLS w porównaniu z pozostałymi badanymi grupami.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnym biopanningiem fagowym jest zastosowanie wyczerpujących protokołów panningu negatywnego weryfikowanych za pomocą FM, co zapewnia izolację reagentów selektywnie rozpoznających warianty białek specyficzne dla choroby bezpośrednio z złożonych próbek biologicznych, nawet gdy występują one w niskich stężeniach. Chociaż FM może dostarczyć wiedzy na temat badania cech biomolekularnych i oddziaływań, można je również zastosować w innych systemach, takich jak monitorowanie postępów biopanningu i potwierdzanie specyficzności pojedynczych CLO. Rozpocznij tę procedurę od produkcji fagów zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym, aby najpierw przeprowadzić panning negatywny przeciwko BSA, dodając cztery mililitry roztworu o stężeniu jeden miligram na mililitr.

roztwór BSA w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo lub PBS do 12 probótek immunologicznych i inkubować przez noc w temperaturze 4°C. Następnie połączyć cząsteczki fagów z każdej z trzech bibliotek, odkładając niewielką ilość tej mieszaniny fagów do późniejszej weryfikacji procesu negatywnego panningu. Następnie odrzucić roztwór BSA z pierwszej probótki i przemyć probótkę dwa lub trzy razy PBS, aby usunąć niezwiązane BSA, dodać połączone biblioteki fagowe do tej pierwszej probótki, inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze, a następnie zebrać niezwiązane fagi.

Należy pamiętać, że istotne jest zachowanie niewielkiej ilości fagów po zakończeniu licznych rund negatywnego panningu przeciwko każdemu celowi, aby zweryfikować sukces procesu panningu oraz w przypadku kontaminacji móc powtórzyć proces negatywnego panningu przy użyciu pozostałych probówek z roztworem BSA za każdym razem. Należy użyć nie związanych fagów zebranych po inkubacji z poprzednią probówką. Następnie należy zweryfikować usunięcie wszystkich fagów wiążących BSA, stosując procedurę A FM szczegółowo opisaną w następnej sekcji filmu.

Aby zwizualizować wiązanie fagów przy użyciu FM, należy nanieść 10 do 20 µL antygenu docelowego na oczyszczoną mikę i inkubować przez 5 do 10 minut. Mikę należy przemyć wodą pięć razy, następnie nanieść 10 do 20 µL fagów na mikę i inkubować przez 5 do 10 minut. Mikę należy ponownie przemyć wodą pięć razy, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.

Przeprowadź proces obrazowania AFM w trybie stukowym (tapping mode) za pomocą NanoScope III oraz kontrolera w powietrzu, w temperaturze pokojowej. Sonda AFM wykonana z krzemu posiada częstotliwość rezonansową 300 kHz oraz stałą sprężystości 40 N/m. Umieść końcówkę AFM w ładowarce końcówek.

Zamocuj ładowarkę końcówek do mikroskopu AFM. Umieść próbkę pod mikroskopem AFM. Używając pokręteł, skieruj laser na końcówkę AFM.

Ustaw częstotliwość skanowania na 3,05 hertz oraz rozdzielczość skanowania na 512 próbek na linię. Przeprowadź automatyczną kalibrację (Auto-Tune) urządzenia, aby zoptymalizować drgania krzemionki. Po ustaleniu częstotliwości końcówki rozpocznij skanowanie próbki.

Sonda będzie skanować powierzchnię miki, mierząc wysokość związanych fagów. Fagi są widoczne jako długie białe linie; po procesie akwizycji obrazy poddawane są podstawowemu wyrównaniu tła, aby zapewnić porównywalność rozmiarów cząsteczek w obrębie każdego obrazu. Szerokość fagów może różnić się między obrazami ze względu na rozmiary innych cząsteczek oraz obszar skanowania, jednak nie wpłynie to na dokładność oceny tego, czy fagi związały się z antygenem.

Obraz zostaje spłaszczony do obrazu 2D, a obszary o niskiej jakości obrazowania spowodowane zanieczyszczeniem PEG są zaznaczone w celu usunięcia ich z przyszłych analiz danych. Przeprowadź immunoprecypitację prawidłowego białka TDP 43 z tkanki zdrowego ludzkiego mózgu zgodnie z opisem w protokole tekstowym ze względu na niższą ilość immunoprecypitowanego białka. Wykonaj te rundy negatywnego panningu, zaczynając od MICA. Przenieś osiem powierzchni MICA do pierwszej powierzchni MICA, dodając około 100 µl immunoprecypitowanego białka i inkubuj przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej po inkubacji.

Przemyj MICA pięciokrotnie 0,1% roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo z dodatkiem tween 20, w skrócie PBST. Następnie dodaj około 100 µL fagów po negatywnym panningu przeciwko zdrowej tkance ludzkiego mózgu i inkubuj przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej. W połowie czasu inkubacji dodaj immunoprecypitowane białko do drugiej MICA.

Zabierz fagi z pierwszej płytki MICA przed pięciokrotnym przemyciem płytki 0,1% PBST. Po przemyciu drugiej płytki mica dodaj wcześniej zebrane fagi. Powtórz cały proces, aż fagi zostaną poddane negatywnej selekcji (panningowi) przeciwko wszystkim ośmiu płytkom mica z immunoprecypitowanym białkiem.

Zweryfikuj sukces procesu panningu za pomocą faga po pierwszej i ósmej rundzie panningu negatywnego z FM, aby rozpocząć immunoprecypitację białka TDP 43 z mózgów osób z LS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, i odspój trzy powierzchnie MICA. Następnie dodaj 50 µL A LS TDP 43 do pierwszej powierzchni MICA po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej. Przemyj MICA pięciokrotnie 0,1% PBST.

Następnie do MICA należy dodać 50 µL fagów zebranych po negatywnym panningu przeciwko zdrowym TDP 43 i inkubować przez pięć minut. Następnie należy zebrać niezwiązane fagi. Ważne jest, aby wszystkie fagi zebrane podczas tych etapów panningu przechowywać osobno.

Następnie odzyskaj związane fagi, stosując trzy metody elucji. Najpierw dodaj 50 µL trypsyny do każdej MICA i inkubuj nie dłużej niż 10 minut. Zbierz roztwór i go zarchiwizuj.

Następnie do każdej próbki MICA dodaj 50 µL 100 mM trietyloaminy i inkubuj nie dłużej niż 10 minut. Roztwór zbierz, dodając równą objętość 1 M buforu Tris-HCl o pH 7,4 i odstaw na później; następnie dodaj 50 µL komórek TG1 bezpośrednio do MICA i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Dodaj również fagi zebrane podczas pierwszych dwóch metod elucji do 100 µL komórek TG1 o tej samej koncentracji i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

Następnie powtórz ten proces z drugą płytką miki. Pobierz niezwiązane fagi zebrane przy użyciu pierwszej płytki miki z A LST DP 43 i dodaj je do drugiej płytki miki z A-A-L-S-T-D-P 43, inkubując przez pięć minut. Połącz komórki TG1 zainfekowane fagami, uwolnione za pomocą trypsyny z każdej płytki miki A LST DP 43 i wysiej na płytki agarowe LB z ampicyliną lub płytki LBA.

Powtórz ten sam proces dla fagów triethyl amine i TG one z dwóch zestawów A LS TDP 43 MICA, łącznie dla trzech płytek. Powtórz wszystkie kroki z trzecim A LS mica, jednak w tym przypadku użyj fagów zebranych po dwóch rundach negatywnego panningu przeciwko TDP 43 z płytki z otępieniem czołowo-skroniowym. Wysiej zainfekowane komórki TG one na trzy płytki LBA i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.

Następnego dnia. Policz liczbę kolonii na sześciu płytkach LBA z potencjalnymi klonami a LS. Na trzech płytkach LBA z trzeciego etapu A LS MICA powinno być mniej kolonii w porównaniu do trzech płytek LBA po dwóch rundach pozytywnego panningu z wykorzystaniem fagów po negative panningu przeciwko zdrowym fagom produkującym TDP 43 i rozpuszczalne fragmenty przeciwciał z pojedynczą domeną zmienną łańcucha lub scV z tych klonów, a następnie przeanalizuj je za pomocą różnych testów immunoologicznych w celu weryfikacji specyficzności względem tkanki a LS.

Obrazowanie FM jest wykorzystywane do monitorowania etapów selekcji negatywnej przeciwko różnym celom, aby zapewnić usunięcie wszystkich reaktywnych fagów. Wyniki FM wykazały wiązanie fagów po jednej rundzie selekcji negatywnej przeciwko zagregowanej alfa-synukleinie oraz brak wiązania po ośmiu rundach. Wykonano selekcję negatywną przeciwko zdrowej tkance ludzkiego mózgu, aby usunąć fagi wiążące liczne antygeny obecne w homogenacie zdrowego ludzkiego mózgu.

Przedstawiono tutaj wiązanie faga z tkanką zdrową po jednej rundzie negatywnego panningu oraz brak wiązania faga po 10 rundach negatywnego panningu. Po przygotowaniu faga oraz rozpuszczalnego SCFE z potencjalnych klonów, przetestowano je w pośrednim teście ELISA pod kątem specyficzności wobec tkanki LS. Prawie wszystkie fagi wykazały preferencję do tkanki LS w stosunku do tkanki zdrowej.

Podobne wyniki uzyskano, porównując wiązanie fagów do tkanki LS oraz do tkanki z otępieniem czołowo-skroniowym (FTD). Porównanie wiązania SCFV do tkanki LS w obu przypadkach, tj. w tkance zdrowej i tkance FTD, ponownie wykazało selektywne wiązanie do tkanki LS w prawie wszystkich klonach. W celu dalszej weryfikacji wiązania do tkanki LS oraz ustalenia, które klony są reaktywne w innych zastosowaniach immunologicznych, zastosowano test dot blot.

Poniżej przedstawiono wiązanie dwóch klonów do tkanki LS. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat stosowania biopanningu opartego na FM w celu izolacji reagentów przeciwko specyficznym dla danej choroby celom zainteresowania, które mogą służyć jako potencjalne narzędzia diagnostyczne i/lub terapeutyczne.