Nowatorski biopanning oparty na mikroskopii sił atomowych do izolacji odczynników specyficznych dla morfologii przeciwko wariantom TDP-43 w stwardnieniu zanikowym bocznym

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie odczynników specyficznych dla morfologii przeciwko białku wiążącemu smołowe DNA. 43 warianty obecne w LS wykorzystującym dwufazową technologię panoramowania radiowego opartego na A FM. Osiąga się to poprzez poddanie najpierw zróżnicowanej biblioteki fagów wielu rundom negatywnego panoramowania antygenów poza celem za pomocą probówek immunologicznych.

Ujemne płukanie przeprowadza się sekwencyjnie w stosunku do albuminy surowicy bydlęcej, zagregowanej alfa synukleiny i zdrowej ludzkiej tkanki mózgowej. Drugim krokiem jest przeprowadzenie weryfikacji FM po każdym zestawie negatywnego panoramowania, aby zapewnić pomyślne usunięcie wszystkich niechcianych fagów. W tym przykładzie z ujemnym panoramowaniem, przy użyciu zagregowanych fagów alfa synukleiny, są widoczne po jednej rundzie, ale nie ma ich po 10. rundzie.

Następnie pozostałe ujemne rundy panoramowania są wykonywane na MICA ze względu na ograniczoną dostępność próbki. Fagi reagujące na wytrącone immunologicznie TDP 43 ze zdrowych i z otępienia czołowo-skroniowego lub FTD są usuwane sekwencyjnie. Ostatnim krokiem jest wyizolowanie fagów, które wiążą się z wytrąconą odpornością LS.

TDP 43 przy użyciu fagów związanych z miką jest oznaczany przy użyciu trypsyny, trietylu, aminy i komórek TG one. Ostatecznie specyficzność tych potencjalnych klonów LS jest weryfikowana za pomocą pośrednich fa eliza i dot blots, homogenizowanych A-L-S-F-T-D, a zdrowe ludzkie tkanki mózgowe są unieruchomione w obu testach. Zwykle wykrywa się większą reaktywność na tkankę LS w porównaniu z innymi badanymi grupami.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnym płukaniem biologicznym fagów jest zastosowanie wyczerpujących protokołów płukania ujemnego, zweryfikowanych przez FM, w celu zapewnienia izolacji odczynników, które selektywnie rozpoznają specyficzne dla choroby warianty białek bezpośrednio ze złożonych próbek biologicznych, nawet jeśli są obecne w niskich stężeniach. Chociaż FM może zapewnić wgląd w badanie cech biomolekularnych i interakcji, może być również stosowany w innych systemach, takich jak monitorowanie postępu biozagrodowania i potwierdzanie specyficzności pojedynczych CLO. Rozpocznij tę procedurę od produkcji fagów, jak opisano w protokole tekstowym, aby najpierw wykonać ujemne panoramowanie względem BSA, dodaj cztery mililitry po jednym miligramie na mililitr

Roztwór BSA w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS do 12 probówek immunologicznych i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie połącz cząstki fagów z każdej z trzech bibliotek, odkładając niewielką ilość tej mieszaniny fagów do przyszłej weryfikacji procesu ujemnego panoramowania. Następnie wyrzuć roztwór BSA z pierwszej probówki i umyj probówkę dwa do trzech razy PBS, aby usunąć wszelkie niezwiązane BSA, dodaj połączone biblioteki fagów do tej pierwszej probówki, inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze przed zebraniem niezwiązanych fagów.

Należy pamiętać, że ważne jest, aby zachować niewielką ilość faga po zakończeniu licznych rund ujemnego płukania względem każdego celu, aby zweryfikować powodzenie procesu płukania, a w przypadku zanieczyszczenia powtórzyć proces płukania ujemnego z pozostałymi probówkami roztworu BSA za każdym razem. Użyć niezwiązanego faga zebranego po inkubacji poprzedniej probówki. Następnie sprawdź, czy usunięto wszystkie spoiwa fagowe BSA, korzystając z procedury A FM opisanej w następnej sekcji filmu.

Aby uwidocznić wiązanie faga za pomocą FM, dodaj 10 do 20 mikrolitrów docelowego antygenu do rozszczepionej miki i inkubuj przez pięć do 10 minut. Umyj MICA pięć razy wodą, a następnie dodaj 10 do 20 mikrolitrów fagów do MICA i inkubuj przez pięć do 10 minut. Umyj mikę kolejne pięć razy wodą i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

Wykonaj proces obrazowania FM przy użyciu trybu stukania FM z nano scope three, kontrolerem w powietrzu o temperaturze pokojowej. Sondy krzemowe a FM mają częstotliwość rezonansową 300 kiloherców i stałą sprężystości 40 niutonów na metr. Włóż końcówkę FM do ładowarki końcówek.

Podłącz ładowarkę końcówek do mikroskopu A FM. Umieścić próbkę pod mikroskopem A FM. Użyj pokręteł, aby ustawić laser na końcówce A FM.

Ustaw częstotliwość skanowania na 3,05 Hz, a rozdzielczość skanowania na 512 próbek na linię. Automatyczne dostrajanie maszyny w celu optymalizacji wibracji krzemionki. Częstotliwość końcówki, zainicjuj skanowanie próbki.

Końcówka zeskanuje powierzchnię MICA, mierząc wysokość związanego faga. Fagi to długie białe linie następujące po procesie akwizycji obrazów poprzez podstawowe spłaszczenie tła, aby zapewnić, że wszystkie rozmiary cząstek są porównywalne na każdym obrazie. Szerokość faga może się różnić w zależności od obrazu ze względu na inne rozmiary cząstek i obszar skanowania, ale nigdy nie wpłynie to negatywnie na dokładność tego, czy wiąże się z antygenem, czy nie.

Obraz jest spłaszczany do obrazu 2D, a słabo zobrazowane obszary spowodowane zanieczyszczeniem PEG są podświetlane w celu usunięcia z przyszłej analizy danych. Immuno wytrącić zdrowe białko TDP 43 ze zdrowej ludzkiej tkanki mózgowej, jak opisano w protokole tekstowym, ze względu na mniejszą ilość białka wytrąconego immunologicznie. Przeprowadzić te rundy ujemnego panoramowania za pomocą MICA, najpierw rozszczepić osiem powierzchni MICA do pierwszego MICA przy około 100 mikrolitrach białka wytrąconego immunologicznie i inkubować przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej po inkubacji.

Umyj MICA pięciokrotnie 0,1% roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem z 20 w skrócie PBST. Następnie dodaj około 100 mikrolitrów faga po ujemnym płukaniu na zdrowej ludzkiej tkance mózgowej i inkubuj przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej. W połowie inkubacji dodać białko wytrącone przez układ odpornościowy do drugiej miki.

Pobrać z pierwszego MICA przed pięciokrotnym przemyciem MICA 0,1% PBST. Po umyciu drugiej miki dodaj wcześniej zebrany. Powtarzaj cały proces, aż zostanie ujemnie przesunięty na wszystkie osiem miki za pomocą białka wytrąconego immunologicznie.

Sprawdź powodzenie procesu panoramowania za pomocą faga po pierwszej i ośmiu rundach ujemnego panoramowania za pomocą FM, aby rozpocząć immunowytrącić białko TDP 43 z mózgów osób z LS, jak opisano w protokole tekstowym, rozszczepić trzy powierzchnie MICA. Następnie dodać 50 mikrolitrów A LS TDP 43 do pierwszego MICA po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej. Umyj MICA pięć razy 0,1% PBST.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów faga zebranego po ujemnym płukaniu przeciwko zdrowemu TDP 43 do MICA i inkubuj przez pięć minut. Zbierz niezwiązane fagi. Ważne jest, aby wszystkie zebrane fagi w tych etapach panoramowania były oddzielone.

Następnie zbierz związane fagi za pomocą trzech metod wyjaśniających. Najpierw dodaj 50 mikrolitrów trypsyny do każdego MICA i inkubuj nie dłużej niż 10 minut. Zbierz roztwór i zapisz.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów 100-milimolowej trietyloaminy do każdego MICA i inkubuj nie dłużej niż 10 minut. Zebrać roztwór o równej objętości jednego molowego buforu tris HCL o pH 7,4 i zapisać po trzecie, dodać 50 mikrolitrów TG jednej komórki bezpośrednio do MICA i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj również fagi zebrane z pierwszych dwóch metod wyjaśnień do 100 mikrolitrów TG one komórek o tym samym stężeniu i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie powtórz ten proces z drugą miką. Pobrać zebrany niezwiązany za pomocą pierwszego MICA z A LST DP 43 i dodać go do drugiego MICA z A-A-L-S-T-D-P 43 inkubować przez pięć minut. Połącz komórki TG one zakażone fagami, z trypsyną z każdej MIKI A LST DP 43 i płytką na wszystkich płytkach ślimakowych luria burani z ampicyliną lub płytką LBA.

Powtórz ten sam proces dla trietyloaminy i fagów TG z dwóch zestawów A LS TDP 43 MICA, co daje w sumie trzy płytki. Powtórz wszystkie kroki z trzecią miką A LS, jednak w tym przypadku użyj faga zebranego po dwóch rundach ujemnego panoramowania przeciwko otępieniu czołowo-skroniowemu. T DP 43 umieszczono na trzech płytkach LBA i poddano inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia. Policz liczbę kolonii na sześciu płytkach LBA z potencjałem klonów LS. Na trzech płytkach LBA z trzeciej miki A LS MICA powinno być mniej kolonii w porównaniu z trzema płytkami LBA po dwóch rundach dodatniego płukania z wykorzystaniem faga po ujemnym płukaniu przeciwko zdrowemu TDP 43 wytwarza fagi i rozpuszczalne jednołańcuchowe fragmenty przeciwciał o zmiennej domenie lub s CVS z tych klonów i analizuje przy użyciu różnych testów immunologicznych w celu zweryfikowania swoistości dla tkanki LS.

Obrazowanie FM służy do monitorowania ujemnych etapów panoramowania w stosunku do różnych celów, aby upewnić się, że wszystkie reaktywne fagi zostały usunięte. Wyniki FM wykazały wiązanie faga po jednej rundzie ujemnego panoramowania względem zagregowanej alfa synukleiny i brak wiązania po ośmiu rundach. Przeprowadzono ujemne panoramowanie na zdrowej ludzkiej tkance mózgowej w celu usunięcia fagów wiążących wiele antygenów obecnych w zdrowym homogenacie ludzkiego mózgu.

Pokazano tutaj wiązanie faga ze zdrową tkanką po jednej rundzie ujemnego panoramowania i brak wiązania faga po 10 rundach ujemnego panoramowania. Po przygotowaniu zarówno faga, jak i rozpuszczalnego SCFE z potencjalnych klonów, przetestowano je w pośrednim Elizie pod kątem swoistości dla tkanki LS. Prawie wszystkie fagi wykazywały preferencję dla tkanki LS w stosunku do zdrowej tkanki.

Podobne wyniki uzyskuje się, porównując wiązanie faga z LS z otępieniem czołowo-skroniowym lub tkanką FTD. Porównanie wiązania SCFV z tkanką LS zarówno w tkance zdrowej, jak i w tkance FTD ponownie wykazało selektywne wiązanie z tkanką LS w prawie wszystkich klonach. Test immunologiczny dot blot został wykorzystany do dalszej weryfikacji wiązania z tkanką LS, a także do ustalenia, które klony są reaktywne w innych zastosowaniach immunologicznych.

Tutaj klon dwa pokazane jest wiązanie z tkanką LS. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować panoramowanie biopów oparte na FM w celu wyizolowania odczynników przeciwko chorobie, konkretnemu celowi zainteresowania, odczynnikom, które mogą służyć jako potencjalne narzędzia diagnostyczne i/lub terapeutyczne.