Name: Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metody PCR w czasie rzeczywistym oparte na sondach do ilościowego oznaczania mikroRNA w osoczu i surowicy. Techniki te umożliwiają odkrywanie nowych biomarkerów chorób, w tym nowotworów i cukrzycy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wszyscy autorzy dziękują za wsparcie infrastrukturalne ze strony NHMRC CTC, University of Sydney, Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australia i Rebecca Cooper Foundation, Australia. Badania te zostały sfinansowane z grantów Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (FT110100254) i JDRF, Australia (CRN201314) na AAH WW, RJF i MVJ przeprowadziły wszystkie eksperymenty w mokrym laboratorium, ASJ przeprowadziło analizę danych. WW napisał pierwszy szkic. AAH zaplanowało badanie i przeanalizowało dane. Wszyscy autorzy zapoznali się i zgodzili się na ostateczną wersję manuskryptu, ryciny i karty pracy zgłoszone do publikacji.

<ol><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+animal+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li>
<li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li>
<li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+estimation+of+multiple+miRNAs+and+mRNAs+from+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478(2010).</li>
<li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet-specific+microRNAs+in+pancreas+development%2C+regeneration+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes.</a> Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).</li>
<li>Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+non-coding+RNAs+as+biomarkers+of+beta+cell+death+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Endocrinol+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes.</a> Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).</li>
<li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+islet-specific+microRNAs+during+human+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development.</a> Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).</li>
<li>Iorio, M. V., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling in ovarian cancer.</a> Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Mattie, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+high-throughput+microRNA+expression+profiling+provides+novel+biomarker+assessment+of+clinical+prostate+and+breast+cancer+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies.</a> Mol Cancer. 5, 24(2006).</li>
<li>Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+breast+cancer+and+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects.</a> BMC Res Notes. 2, 89(2009).</li>
<li>Zhu, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+suitable+reference+genes+for+qRT-PCR+analysis+of+circulating+microRNAs+in+hepatitis+B+virus-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients.</a> Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).</li>
<li>Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+autoimmune+thyroid+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Endocrinol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases.</a> Clin Endocrinol (Oxf). , (2014).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+MicroRNA+Expression+Profile+as+a+Biomarker+in+the+Diagnosis+and+Prognosis+of+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer.</a> Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).</li>
<li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PLoS One. 3, e3148(2008).</li>
<li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+of+developing+and+regenerating+pancreas+reveal+post-transcriptional+regulation+of+neurogenin3%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3.</a> Dev Biol. 311, 603-612 (2007).</li>
<li>Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+understanding+the+limits+for+quantitative+measurement+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR.</a> J Am Heart Assoc. 3, e000792(2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+Prognostic+Implications+of+a+Serum+miRNA+Panel+in+Oesophageal+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma.</a> PLoS One. 9, e92292(2014).</li>
<li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+microRNA+profiling+of+exosomes+derived+from+blood+and+culture+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media.</a> J Vis Exp. , e50294(2013).</li>
<li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li>
<li>Genda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA+changes+in+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+of+rats+with+chronic+constriction+injury%3A+A+TaqMan%28R%29+Low+Density+Array+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study.</a> Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+three+microRNA+profiling+platforms%3A+microarray%2C+beads+array%2C+and+quantitative+real-time+PCR+array%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array.</a> PLoS One. 6, e17167(2011).</li>
<li>Cuk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+plasma+as+early+detection+markers+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer.</a> Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).</li>
<li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34, e123(2006).</li>
<li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+microarray+profiling%2C+real-time+PCR%2C+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16, 991-1006 (2010).</li>
<li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR%2C+how+to+use+it+and+what+is+available%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50, 244-249 (2010).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44, 31-38 (2008).</li>
<li>Kodani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+TaqMan+low-density+arrays+for+simultaneous+detection+of+multiple+respiratory+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens.</a> J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).</li>
<li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta,, V, M., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Exp Diabetes Res. 2012, 168368(2012).</li>
<li>TPF & SPF File Download Options [Internet]. , Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html">http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html</a> (2014).</li>
<li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).</li>
<li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li>
</ol>

Koszty opracowania artykułu/publikacji zostały pokryte przez firmę Life Technologies, po przyjęciu tego manuskryptu do publikacji.

Krytycznymi krokami w protokołach qPCR opartych na sondzie w celu uzyskania dokładnych i powtarzalnych wyników jest upewnienie się, że 1) ta sama objętość i stężenie produktu RT jest ładowane w każdej reakcji qPCR, 2) właściwe proporcje i objętości składników potrzebnych do reakcji qPCR są przygotowywane i dobrze mieszane, 3) do każdej reakcji qPCR dodaje się właściwe i stałe objętości, oraz 4) przygotowanie i ładowanie każdej próbki i mieszaniny reakcyjnej odbywa się w możliwie najkrótszym czasie, przy jednoczesnym zachowaniu wyżej wymienionych krytycznych etapów.
Karty matrycowe mikrofluidyki wymagają odpowiedniej wirówki i specjalnych wiader. Każde wiadro może pomieścić do 3 kart (załadowanych / pustych). Zawsze upewnij się, że wszystkie 3 szczeliny wiadra są zajęte, a wiadro jest zrównoważone, umieszczając podobne wiadro (to wiadro powinno również zawierać 3 karty, puste lub pełne) w przeciwległym gnieździe wirówki. Umieszczając kartę w uchwycie wiadra, upewnij się, że 8 zbiorników wystaje do góry, a studzienki reakcyjne są skierowane w stronę zewnętrznej ścianki wirówki. Obracaj karty w temperaturze 331 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Po pierwszym wirowaniu otwórz wirówkę i wizualnie upewnij się, że mieszanina reakcyjna została dozowana przez 384 dołki. Powtórz wirowanie z tymi samymi ustawieniami jeszcze 1 raz. Wyjmij kartę z wiadra i upewnij się, że poziom mieszaniny reakcyjnej w każdym z 8 zbiorników jest równomierny. Wszelkie niespójności w objętościach płynów pozostawionych w zbiornikach powodują, że karta nie nadaje się do dalszego użytkowania.
Aby uzyskać takie samo stężenie produktu RT, do każdej reakcji RT dodaje się to samo stężenie wejściowe RNA. Całkowite stężenie RNA mierzy się za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Obserwowany stosunek 260/280 może wynosić zaledwie 1,3 dla RNA wyizolowanego z osocza/surowicy; Wydaje się, że nie ma to wpływu na dalszy proces związany z qPCR ani na generowane dane30. Podobnie, stosunek 260/280 badanych w próbkach RNA wynosił 1,3-1,7 bez zaobserwowanych nieprawidłowych efektów w qPCR.
W przypadku korzystania z próbek o niskiej zawartości RNA, takich jak te z płynów biologicznych, określenie ilościowe RNA przed przetwarzaniem może być trudne. Zalecamy stosowanie syntetycznego spike-in na etapie izolacji RNA, a także na etapach odwrotnej transkrypcji. Z naszego doświadczenia wynika, że kandydaci na miRNA Arabidopsis thaliana (ath-miR-159a i ath-miR-172a) są preferowani w stosunku do miRNA Caenorhabditis elegans (takich jak cel-miR-39 lub cel-miR-54), które z naszego doświadczenia mogą mieć wyższą homologię niż te z A. thaliana. Zastosowanie takiego specyficznego dla etapu skoku może wyjaśnić normalizację danych miRNA w wielu próbkach testowanych w różnym czasie. Zaleca się również stosowanie stałej objętości wejściowej RNA do reakcji syntezy cDNA32,33.
Opisane tutaj trzy protokoły kwantyfikacji miRNA oparte na sondzie wymagają różnych ilości całkowitego wkładu RNA, różnych przepływów pracy i kosztów. Każdy z przepływów pracy jest zaprojektowany tak, aby zapewnić różne przepustowości w zależności od liczby celów miRNA i liczby próbek do analizy. Wraz ze wzrostem przepustowości (96 rxn 384 rxn 3072 rxn) koszt reakcji zmniejsza się wraz ze wzrostem ilości danych uzyskiwanych w jednostce czasu. Ponieważ wszystkie te platformy wykorzystują chemię TaqMan, można oczekiwać, że jakość uzyskanych danych będzie podobna. TaqMan qPCR jest dobrze znaną metodą identyfikacji obfitości miRNA w próbkach surowicy/osocza9,11,27. Chociaż trzy omawiane tutaj platformy mają ten sam skład chemiczny, zmniejszenie objętości reakcji prowadzi do zmniejszenia zakresu dynamicznego wykrywania transkryptów (Farr RJ i wsp., dane niepublikowane). 96-dołkowa platforma qPCR jest platformą o niższej przepustowości, ale wysokiej czułości i naszym zdaniem "złotym standardem" dla wszystkich platform PCR opartych na sondzie (lub barwniku). Jednak może to nie być najbardziej ekonomiczna lub wydajna platforma, jeśli testuje się kilkaset lub tysiące próbek i dla wielu mikroRNA. Platformy mikrofluidyki (TLDA) i nanofluidyki (OA) to platformy o wysokiej przepustowości / treści, zaprojektowane tak, aby umożliwić pozyskiwanie większych danych w krótszym czasie. Chociaż zaobserwowano różnice w partiach kart TLDA, można je zminimalizować, żądając kart TLDA z tej samej partii. Obserwujemy, że platforma TLDA (ryc. 3) wykazała znaczną zmienność w 17% miRNA o średniej i niskiej liczebności podczas testowania przy użyciu tej samej próbki na różnych partiach kart TLDA. Dlatego zalecamy używanie tych samych numerów partii do analizy za pomocą kart TLDA. Różnice te mogą być również spowodowane zmiennością techniczną, w tym potencjalnymi błędami ładowania i pipetowania. Zalecamy jednak zamówienie/poproszenie o tę samą partię kart TLDA. Na platformie OA nie zaobserwowano istotnych różnic w partiach. Mimo to eksperymentalne metody qPCR oparte na TaqMan ułatwiają pomiar obfitości miRNA w próbkach osocza/surowicy. Omówione tutaj podejścia o niskiej, średniej i wysokiej przepustowości oferują elastyczność w analizie szeregu próbek i miRNA przy użyciu wysoce wydajnej, powtarzalnej i czystej (o niskim poziomie szumów tła) chemii.

MikroRNA (miRNA) to ~22 nukleotydowe niekodujące (nc)RNA, funkcjonujące jako regulatory ekspresji genów1-3. Większość miRNA u zwierząt funkcjonuje poprzez specyficzne dla sekwencji parowanie zasad z mRNA, ukierunkowane na 3' UTR, co prowadzi do negatywnej regulacji ekspresji genu2-4. Zwykle dzieje się to poprzez hamowanie translacji mRNA lub spadek rybosomów. Wykazano, że miRNA w krążeniu są nowymi biomarkerami w badaniach i dziedzinach klinicznych dla różnych chorób, takich jak cukrzyca5-7, jajnik8, prostata9 i rak piersi10,11, wirusowe zapalenie wątroby typu B12 i inne choroby autoimmunologiczne13. Przeprowadzono badania w celu zidentyfikowania obfitych miRNA w różnych komórkach lub tkankach, a także w krążeniu z próbek ludzkiego osocza i surowicy, co jest bardziej dostępne i mniej inwazyjne9,11-15.
Różne metody kwantyfikacji miRNA zostały ustalone przy użyciu wielu platform, takich jak standardowa platforma 96-dołkowa 4,12,16-18, platforma kart mikrofluidycznych12,18-23 i platforma tablic nanofluidycznych17,24. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) oferuje możliwość pomiaru względnej lub bezwzględnej liczby transkryptów przy użyciu wielu (opartych na barwniku lub sondzie) substancji chemicznych. Chemia PCR w czasie rzeczywistym oparta na sondzie oferuje korzyści płynące z niskiej fluorescencji tła i wysokiej czułości wykrywania pojedynczej kopii transkryptu. Jest stosunkowo opłacalna, prosta w użyciu i wysoce odtwarzalna, co czyni ją ulubioną metodą ilościowego określania i określania ekspresji miRNA25. Metoda qPCR oparta na sondzie zazwyczaj obejmuje dwa etapy: odwrotną transkrypcję (RT) i qPCR4,26,27. RT to miejsce, w którym starter RT pętli macierzystej jest hybrydyzowany z dojrzałą lub pierwotną cząsteczką miRNA i przekształcany w komplementarne (c)DNA. Kwantyfikacja produktu cDNA jest następnie przeprowadzana przy użyciu starterów PCR specyficznych dla miRNA26-28. Zasada działania qPCR opartego na sondzie opiera się na wykrywaniu wydłużenia nici komplementarnej w czasie rzeczywistym, co wiąże się z hydrolizą sondy znakowanej fluorescencyjnie. Sondy te są zaprojektowane tak, aby zawierały fluorescencyjny reporter i wygaszacz, które są po prostu oddalone od siebie, aby umożliwić FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Detekcja emisji z reportera fluorescencji (emitera) jest maskowana przez bliskie sąsiedztwo cząsteczki wygaszającej. Kiedy polimeraza Taq (pol) rozciąga się od startera i dociera do widelca (końca 5' sondy), aktywność egzonukleazy Taq pol hydrolizuje sondę, prowadząc do fizycznej dysocjacji/oddzielenia emitera fluorescencyjnego od wygaszacza. To uwolnienie pojedynczej cząsteczki emitera fluorescencji jest rejestrowane przez detektor i przedstawiane jako przyrostowy wzrost sygnału fluorescencji z tej studni/reakcji. Wzrost fluorescencji jest proporcjonalny do ilości wygenerowanego produktu PCR, co pozwala na dokładne określenie ilościowe amplifikowanego celu26,28.
Wraz z rosnącym zapotrzebowaniem na kwantyfikację miRNA, opracowano technologie średnio- i wysokoprzepustowe, które pozwalają na przetwarzanie większej liczby próbek w krótkim czasie. TaqMan Low Density Array (TLDA) to średnioprzepustowa, innowacyjna konstrukcja mikroprzepływowa oparta na chemii qPCR opartej na sondzie, oferująca wzrost liczby analizowanych miRNA na jednej płytce. TLDA polega na użyciu predefiniowanej puli starterów RT, które są używane do syntezy cDNA. Te cDNA są następnie przędzone do dostosowanej 384-dołkowej karty mikroprzepływowej w celu określenia ekspresji wielu miRNA za pomocą qPCR22,26,29. Każda studzienka karty zawiera wysuszone startery i sondy do amplifikacji określonych miRNA, dlatego na jednej karcie TLDA26 można przetworzyć do 384 reakcji.
Tablica nanofluidyczna to platforma o wysokiej przepustowości, która jest używana do wykrywania transkryptów genów24 przy użyciu tej samej chemii opartej na sondzie. Wykorzystuje opatentowaną matrycę oferującą oddziaływania hydrofobowo-hydrofilowe, aby ułatwić łatwe ładowanie 33-nanolitrowej mieszaniny reakcyjnej do zestawu 3072 otworów przelotowych na suwaku ze stali nierdzewnej24. Ten artykuł koncentruje się na zademonstrowaniu, w jaki sposób te metody ilościowego oznaczania miRNA w surowicy/osoczu są wykonywane oraz krytycznych czynników, które należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania i interpretacji takich danych. Biorąc pod uwagę, ich indywidualne zalety i ograniczenia zostaną omówione w tym artykule.

<table><tbody><tr><td>96 platforma studzienkowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>do odwrotnej transkrypcji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Testy mikroRNA INV SM&NBSP;</td><td>Biosystemy stosowane &nbsp;</td><td>4427975</td><td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 Testy są dostarczane jako zestaw starterów RT i starterów PCR.</td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqMan</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4366597 lub 4366596</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 lub http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 Zestaw do odwrotnej transkrypcji TaqMan MicroRNA to ten sam zestaw, który jest używany do odwrotnej transkrypcji we wszystkich trzechTaqMan platformach - 96-dołkowej, TLDA i OpenArray.</td></tr><tr><td>Do qPCR uruchomić na platformie</td><td></td><td></td><td></td>96-dołkowej</tr><tr><td>2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, bez AmpErase UNG&nbsp;</td><td>Biosystemy stosowane &nbsp;</td><td>4367846</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix służy do qPCR na&nbsp; dwie platformy TaqMan - platforma 96-studniowa i TLDA.</td></tr><tr><td>MicroAmp Optyczna folia samoprzylepna</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td></tr><tr><td>MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna, 0,1 ml&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td></tr><tr><td>Platforma mikroprzepływowa (TLDA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Do odwrotnej transkrypcji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zapoznaj się z zestawem 96-dołkowej platformy TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (4366597 lub 4366596) (jak pokazano powyżej).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4399966</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 służy do RT na&nbsp; dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444281</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 służy do RT na&nbsp; dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.</td></tr><tr><td>LUB</td><td></td><td></td><td>LUB</td></tr><tr><td>Megaplex Primer Pools, zestaw basenów dla ludzi v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444750</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 służy do RT na&nbsp; dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.</td></tr><tr><td>Do pre-amplifikacji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4391128 lub 4488593</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 lub http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 TaqMan PreAmp Master Mix służy do wstępnego wzmacniania qPCR na&nbsp; dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primer, Human Pool B v3.0&nbsp;</td><td>Biosystemy stosowane &nbsp;</td><td>4444303</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 służy do wstępnego wzmacniania qPCR na&nbsp; dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4399233</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 służy do wstępnego wzmacniania qPCR na&nbsp; dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.</td></tr><tr><td>1x Bufor TE (100 ml)</td><td>Invitrogen</td><td>12090-015</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product Bufor 1x TE służy do wstępnej amplifikacji qPCR on&nbsp; dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.</td></tr><tr><td>Aby załadować i uruchomić 384-dołkową kartę</td><td></td><td></td><td></td>mikrofluidyczną (TLDA)</tr><tr><td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444913</td> platforma <td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td></tr><tr><td>Nanofluidics (OpenArray)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Do odwrotnej transkrypcji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zapoznaj się z zestawem do odwrotnej transkrypcji TaqMan MicroRNA z 96 dołkami (4366597 lub 4366596) (jak pokazano powyżej).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aby uzyskać informacje na temat wstępnego amplifikacji</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>zapoznaj się z odczynnikami do wstępnej amplifikacji TLDA (jak pokazano powyżej)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aby załadować i uruchomić slajdy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4470187</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td></tr><tr><td>Zestaw akcesoriów do QuantStudio 12K Flex OpenArray&nbsp;</td><td>Biosystemy stosowane &nbsp;</td><td>4469576</td><td></td></tr><tr><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 384-dołkowe płytki próbne OpenArray&nbsp; &nbsp;</td><td>Biosystemy stosowane &nbsp;</td><td>4406947</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4462159</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td></tr><tr><td>Wskazówki dotyczące systemu OpenArray AccuFill&nbsp;</td><td>Biosystemy stosowane &nbsp;</td><td>4457246</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td></tr><tr><td>inne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Qiagen</td><td>129117</td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td></tr></tbody></table>

oparte na sondzie podejścia pcr w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikrorna

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Ilościowy PCR oparty na sondach (qPCR) jest preferowaną metodą pomiaru obfitości transkryptów, ponieważ jest to jedna z najbardziej czułych metod wykrywania, która zapewnia dokładną i powtarzalną analizę. Chemia oparta na sondzie oferuje najmniejszą fluorescencję tła w porównaniu z innymi chemikaliami (opartymi na barwnikach). Obecnie dostępnych jest kilka platform, które wykorzystują chemię opartą na sondzie do ilościowego określania obfitości transkryptów. qPCR na płytce 96-dołkowej jest najczęściej stosowaną metodą, jednak w jednym cyklu można przetestować maksymalnie 96 próbek lub miRNA. Jest to czasochłonne i żmudne, jeśli ma być analizowana duża liczba próbek/miRNA. Wysokowydajne platformy oparte na sondach, takie jak macierze mikrofluidyczne (np. TaqMan Array Card) i macierze nanofluidyczne (np. OpenArray), zapewniają łatwość powtarzalnego i wydajnego wykrywania obfitości wielu mikroRNA w dużej liczbie próbek w krótkim czasie. Tutaj demonstrujemy eksperymentalną konfigurację i protokół kwantyfikacji miRNA z próbek surowicy lub osocza-EDTA, wykorzystując chemię opartą na sondzie i trzy różne platformy (płytki 96-dołkowe, macierze mikrofluidyczne i nanofluidyczne) oferujące rosnące poziomy przepustowości.

Zalecana objętość reakcji qPCR w teście opartym na sondach miRNA wynosi 20 µl. UWAGA: Potwierdziliśmy, że objętość reakcji 5 µl pozwala uzyskać wyniki zbliżone do tych osiągniętych przy objętości 20 µl4,7,30. Zmniejszenie objętości reakcji do 5 µl pozwala na redukcję kosztów odczynników o 75% bez znaczącej utraty czułości. Jak przedstawiono na Rysunku 2, objętości reakcji 20 µl i 5 µl wykazują silną korelację do 39 cykli (przy r2 wynoszącym 0,92, p = 0,0002).
Macierz mikrofluidyczna stanowi narzędzie do uzyskiwania danych na temat 754 miRNA ekspresjonowanych w próbce w czasie około 5 h (dla karty A i karty B), co jest bardziej wydajnym sposobem analizy wielu próbek w porównaniu do konwencjonalnych reakcji PCR na płytkach 96-dołkowych. Porównaliśmy karty macierzy mikrofluidycznej miRNA dla tej samej próbki (próbka A i powtórzenie próbki A). Rycina 3A-B przedstawia wykres Blanda-Altmana (3A) oraz wykres korelacji (3B) dla wszystkich 754 miRNA przetestowanych w tych próbkach. Na obu kartach (karta A i B) w wielu miejscach rozmieszczono losowo 3 różne kontrolne miRNA (U6, RNU44 i RNU48). Po porównaniu wartości progu cyklu (Ct) dla U6 pomiędzy dwoma przebiegami nie zaobserwowano istotnych różnic między wartościami (Tabela 4). Należy tutaj również zauważyć, że U6 wykazuje większą obfitość ekspresji (niższa wartość Ct) w analizowanej próbce. Następnie porównaliśmy wszystkie miRNA, których wartości Ct w obu przebiegach mieściły się w zakresie 0-19,99 (n = 150); wykazały one ogólnie podobną ekspresję miRNA z współczynnikiem determinacji wynoszącym 98% (Rycina 3C-D). Spośród wszystkich 277 miRNA, których wartości Ct w obu przebiegach mieściły się w zakresie od 20 do 29,99, 16 miRs różniło się istotnie pomiędzy przebiegiem oryginalnym a powtórzeniem (Rycina 3E-F). Liczba miRNA z istotną różnicą między przebiegami wzrosła (89 z 327), gdy wybrano wartości Ct w zakresie 30-40 dla obu przebiegów (Rycina 3G-H). 
Platforma z matrycą nanofluidyczną dostarcza danych dla 754 miRNA z każdej przebadanej próbki surowicy/osocza, co przedstawiono na rysunku 4A. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów qPCR, istotna jest analiza tych krzywych amplifikacji, aby upewnić się, że wynik wskazuje na rzeczywistą amplifikację. Każda z 48 podmatryc (rysunek 1) zawiera również testy dla trzech najpopularniejszych niekodujących RNA „housekeepingowych”: U6, RNU44 i RNU48. Rysunek 4B ilustruje typową klastryzację powtórzeń U6 z jednej próbki. Powtórzenia te wykazują niskie odchylenie standardowe (SD &lt;0,5), co stanowi wskaźnik wiarygodności. Z kolei rysunek 4C demonstruje zwiększoną zmienność powtórzeń U6 (SD &gt;0,5) w drugiej próbce. Nie podważa to ważności pozostałych testów, choć wymaga dokładniejszej analizy krytycznej. U6, podobnie jak większość miRNA „housekeepingowych” w płynach ustrojowych, może wykazywać zmienną ekspresję. Należy zauważyć, że jedna z próbek, przedstawiona na rysunku 4C, wykazuje 4-krotnie niższą zawartość U6 niż ta zaprezentowana na rysunku 4B. Ponieważ poziom U6 w próbce przedstawionej na rysunku 4C jest początkowo o 75% niższy niż w próbce z panelu 4B, spodziewana jest większa zmienność techniczna ze względu na rozkład Poissona transkryptów, co jest potęgowane przez małą objętość reakcji17.
Kolejnym przydatnym narzędziem są obrazy kontroli jakości (QC), które są dostępne do eksportu po zakończeniu przebiegu. Wybrane z nich wykorzystują fluorescencję ROX, pasywnego barwnika zawartego w mieszaninie odczynników qPCR, aby potwierdzić, że każdy otwór przelotowy został prawidłowo napełniony (Rysunek 5). Otwór przelotowy, a nawet cała podmacierz, mogą nie zostać napełnione z powodu niewystarczającej objętości próbki, odparowania, pęcherzyków powietrza w dołkach płytki z próbkami 384-dołkowej, niecałkowitego usunięcia folii uszczelniającej płytkę z próbkami lub wad w systemie Accufill lub jego końcówkach. Należy zidentyfikować wszystkie nienapełnione otwory przelotowe, aby uniknąć klasyfikowania miRNA jako „niewykrywalne”, podczas gdy w rzeczywistości test w ogóle nie został napełniony. W przypadku wystąpienia tego problemu należy potwierdzić, że do każdego dołka płytki 384-dołkowej wprowadzono co najmniej 5 µl próbki/mastermixu, płytka z próbkami została prawidłowo odwirowana przed napełnieniem, folia uszczelniająca została całkowicie usunięta, a załadowana płytka OpenArray została uszczelniona i uruchomiona w wyznaczonym czasie dla wszystkich kolejnych przebiegów. Jeśli problemy z napełnianiem nadal występują, mogą one wynikać z konkretnej partii lub serii macierzy lub powiązanych materiałów eksploatacyjnych; w takim przypadku należy skontaktować się z producentą w celu uzyskania dalszej pomocy.
<img alt="Schemat płyty 384-dołkowej OpenArray z układem próbek dla załadunku systemu AccuFill i slajdu OpenArray." src="/files/ftp_upload/52586/52586fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Układ próbek dla procedury z wykorzystaniem matryc nanofluidycznych: (A) Każda płyta 384-dołkowa z próbkami może pomieścić próbki dla maksymalnie 8 matryc nanofluidycznych. (B) Rozcieńczone, wstępnie namnożone cDNA jest umieszczane w 8 dołkach (2 kolumny na 4 rzędy), przy czym Pool A i Pool B znajdują się w sąsiednich grupach 8-dołkowych. Każde koło reprezentuje jeden dołek. (C) Każdy dołek płyty z próbkami zostanie załadowany do jednej podmatrycy matrycy nanofluidycznej. Każdy mały kwadrat reprezentuje jedną podmatrycę.
<img alt="Wykres regresji liniowej dla objętości reakcji 5-20 µl, ilustrujący korelację danych w wynikach eksperymentu." src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Analiza korelacji dla konwencjonalnych platform PCR 96-dołkowych: Korelacja między objętościami reakcji 20 µl i 5 µl w badaniu TaqMan Real-time qPCR z wykorzystaniem standardowej platformy z płytką 96-dołkową w odniesieniu do wartości CT (39 cykli). Porównano 4 różne mikroRNA (miR-375, miR-30c, miR-30d i miR-7) w 4 różnych próbkach ludzkiego surowicy i osocza. Wykreślono tylko 11 punktów danych, ponieważ pozostałe były niewykrywalne. R2 = 0,92, p = 0,0002.
<img alt="Analiza miRNA; wykresy powtarzalności wartości Ct, analiza regresji, badanie korelacji, wykres statystyczny" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Profilowanie krążących miRNA z wykorzystaniem mikroprzepływowych kart matrycowych. Z wykorzystaniem 2 kart mikroprzepływowych (karta-A i karta-B) wygenerowano profil 754 miRNA (A-B). Jak pokazano tutaj, do dwóch uruchomień matrycy mikroprzepływowej wykorzystano tę samą próbkę, aby sprawdzić powtarzalność wyników z karty mikroprzepływowej. Zaobserwowano podobną ogólną ekspresję miRNA z wartościami Ct w zakresie 0-19,99 (C-D). Nieliczne miRNA (16 z 277) wykazały wartości Ct między 20 a 29,99 oraz istotne różnice między powtórzeniami serii (E-F). Osiemdziesiąt dziewięć z 327 mikroRNA o wyższych wartościach Ct (30-40) wykazało istotne różnice między obydwoma uruchomieniami (G-H). Dane przeanalizowano za pomocą testu t dla prób zależnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Amplifikacja PCR, ΔRn vs Cykl, seria wykresów liniowych pokazująca zmianę fluorescencji w kolejnych cyklach." src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywny profil produktu PCR Krzywe amplifikacji: Reprezentatywny wykres połączonych (A) krzywych amplifikacji dla wszystkich docelowych miRNA w próbce ludzkiej osocza. Analiza U6 (powszechny kontrolny ncRNA) jest umieszczona w każdym podmodule. Próbka w (B) wykazuje niską zmienność (SD &lt;0,5), podczas gdy (C) wykazuje wysokie odchylenie standardowe (SD &gt;0,5) w powtórzeniach U6. Obie próbki stanowią całkowite RNA wyizolowane z ludzkiego osocza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mikromacierzy; wyniki hybrydyzacji DNA; detekcja fluorescencji w układzie siatki; zastosowanie badawcze." src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Analiza QC macierzy nanofluidycznych: Obrazy kontroli jakości (QC) prawidłowo załadowanej macierzy nanofluidycznej (po lewej) oraz nieprawidłowo załadowanej macierzy nanofluidycznej (po prawej). Pasywny barwnik ROX (obecny w mieszaninie odczynników do qPCR) fluoreskuje, wskazując na prawidłowo załadowany otwór przelotowy. Macierz po prawej stronie posiada kilka podmacierzy/otworów przelotowych, które nie zostały załadowane mieszaniną odczynników do qPCR, co powinno zostać zidentyfikowane jako fałszywie ujemne reakcje PCR.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponenty</td>
			<td>Objętość na 5 µl reakcja (µl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor RT (10x)</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (100 mM)</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inhibitor RNazy</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od nukleaz</td>
			<td>1.39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>odwrotna transkryptaza</td>
			<td>0.33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość całkowita</td>
			<td>2.33</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1A: Składniki mieszaniny odczynników do RT w preparacji 5 µl reakcji RT dla TaqMan Real-time qPCR przy użyciu standardowej platformy z płytką 96-dołkową.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Składniki</td>
			<td >Objętość na reakcję 5 µl (µl)</td>
			<td >Objętość na reakcję 20 µl (µl)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Fast PCR mastermix (2x)</td>
			<td >2.5</td>
			<td >10</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >TaqMan qPCR assay (20x) *</td>
			<td >0.25</td>
			<td >1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Woda wolna od nukleaz</td>
			<td >1.45</td>
			<td >5.8</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Objętość całkowita:</td>
			<td >4.2</td>
			<td >16.8</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
*składnik analizy zależny od wybranego testowanego miRNA.
Tabela 1B: Składniki mieszaniny reagentów qPCR w przygotowaniu reakcji qPCR o objętości 5 lub 20 µl dla metody TaqMan Real-time qPCR z wykorzystaniem standardowej platformy z płytką 96-dołkową.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponenty</td>
			<td>Objętość na reakcję (µl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primery Megaplex RT (10x)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP z dTTp (100 mM)</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odwrotna transkryptaza Multiscribe (50 U/µl)</td>
			<td>1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X bufor do odwrotnej transkrypcji (RT)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl₂2 (25 mM)</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inhibitor RNazy (20 j./µl)</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od nukleaz</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2A: Składniki mieszaniny odczynników do RT w przygotowaniu 5 µl reakcji RT dla panelu miRNA TLDA.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponenty</td>
			<td>Objętość na jedną reakcję (µl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Mastermix (2x)</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primery do przedwzmacniania Megaplex (10x)</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od nukleaz</td>
			<td>7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma</td>
			<td>22.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2B: Składniki mieszaniny odczynników PreAmp w 25 µl reakcji preamplifikacji dla panelu miRNA TLDA.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponenty</td>
			<td>Objętość na reakcję (µl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Startery Megaplex RT (10x)</td>
			<td>0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP z dTTP (100 mM)</td>
			<td>0.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiscribe Reverse Transcriptase (50 U/µl)</td>
			<td>1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X bufor RT</td>
			<td>0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl₂2 (25 mM)</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inhibitor RNazy (20 U/µl)</td>
			<td>0.09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od nukleaz</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3A: Składniki mieszaniny odczynników do RT w przygotowaniu 5 µl reakcji RT dla panelu nanofluidycznych miRNA opartych na sondach.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Składniki</td>
			<td >Objętość na reakcję (µl)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >TaqMan PreAmp Mastermix (2x)</td>
			<td >12.5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Primery Megaplex PreAmp (10x)</td>
			<td >2.5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Woda wolna od nukleaz</td>
			<td >7.5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Suma</td>
			<td >22.5</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 3B: Składniki mieszaniny odczynników PreAmp w 25 µl przygotowania reakcji preamplifikacji dla nanofluidycznego panelu miRNA opartego na sondach. UWAGA: Interaktywne uzupełniające arkusze Excel dostarczone dla trzech platform uwzględniają już 5% dodatku w celu zrekompensowania błędu pipetowania.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Próbka A</td>
			<td>Powtórzenie próby A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15.535</td>
			<td>16.156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15.471</td>
			<td>15.652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15.623</td>
			<td>16.063</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15.963</td>
			<td>15.889</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14.006</td>
			<td>13.993</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14.502</td>
			<td>14.623</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14.907</td>
			<td>14.384</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.732</td>
			<td>14.946</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Profilowanie krążącego miRNA U6 z wykorzystaniem mikroprzepływowej karty matrycowej. Wykorzystano dwie mikroprzepływowe karty matrycowe (A i B). Wartości Ct kontrolnego miRNA U6 z próbki A (łącznie = 8). Zaobserwowano spójną zawartość kontrolnego miRNA U6 pomiędzy poszczególnymi seriami pomiarowymi.

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zademonstrowanie trzech różnych metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondzie, stosowanych do ilościowego oznaczania mikro RNA w próbkach osocza i surowicy. PCR w czasie rzeczywistym oparty na sondzie uzyskuje się poprzez hydrolizę i detekcję fluorescencyjnie znakowanej sondy, która zawiera fluorescencyjny reporter i wygaszacz. Kiedy polimeraza sczepna rozciąga się od poprzedzającego startera i dociera do pięciu głównych końców sondy, prowadzi to do fizycznej dysocjacji emitera fluorescencyjnego od wygaszacza.Następnie uwalniana jest pojedyncza cząsteczka fluoru czterech, która jest rejestrowana przez detektor i przedstawiana jako przyrostowy wzrost sygnału fluorescencyjnego z tej reakcji. Ostatecznie ilość wygenerowanego produktu PCR można zmierzyć na podstawie wzrostu fluorescencji, co pozwala na dokładne określenie ilościowe amplifikowanego docelowego amplifi. Metoda ta staje się obiecującą metodą odkrywania nowych biomarkerów różnych nowotworów i innych chorób, takich jak cukrzyca.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w obfitość mikroRNA w surowicy i osoczu, można ją również zastosować do innych próbek, takich jak komórki obwodowe i tkanki. Wizualna demonstracja tego protokołu ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre kroki związane z uszczelnianiem szkiełka z matrycą nano fluidics mogą być trudne do nauczenia się po prostu czytając protokół W przypadku opartego na sondzie wykrywania ilościowego mikro RNA PCR w czasie rzeczywistym w 4,2 mikrolitra poszczególnych mieszanin odczynników QPCR do każdej studzienki optycznej płytki 96-dołkowej, następnie 0,8 mikrolitra odpowiedniego, świeżo przygotowanego roztworu reakcyjnego CDNA. Uszczelnij płytkę odpowiednią osłoną optyczną, a następnie uruchom QPCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym.Aby przygotować kartę macierzy mikrofluidycznej z jednym do 1000 nanogramów całkowitego początkowego wejścia RNA, najpierw rozmrozić bufor starterów puli A i B, fosforany deoksynukleotydów, chlorek magnezu i inhibitor RNA na lodzie. Następnie, aby przeprowadzić odwrotną transkrypcję, należy podwielokrotnić 100 nanogramów każdej próbki RNA do probówki z puli A lub B, a następnie dodać odpowiednią objętość wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość w każdej probówce do trzech mikrolitrów. Następnie podwielokrotność 4,5 mikrolitra odpowiedniego odczynnika do odwrotnej transkrypcji wymieszać z odpowiednimi odpowiednimi probówkami.Następnie umieść próbki w termocyklerze i rozpocznij odwrotną transkrypcję. Podczas gdy odwrotna transkrypcja postępuje. W przypadku całkowitej ilości wejściowej próbki RNA od jednego do 350 nanogramów należy rozmrozić predefiniowaną pulę starterów do wstępnej amplifikacji na lodzie, gdy próbki są gotowe, podwielokrotność 22,5 mikrolitra odpowiedniego odczynnika przedwzmacniacza.Wymieszać z probówkami z puli A i B i dodać do każdej z nich 2,5 mikrolitra próbki CDNA z odwrotną transkrypcją. Następnie załaduj próbki do termocyklera i rozpocznij cykl przedwzmacniacza. Pod koniec cyklu dodaj 75 mikrolitrów buforu 0,1 x tris EDTA do wstępnie wzmocnionego CDNA, aby załadować kartę mikrofluidyczną.Następnie dodać 450 mikrolitrów mieszaniny odczynników QPCR do dziewięciu mikrolitrów rozcieńczonego PREPL amplifikowanego CDNA dla karty A, użyć amplifikowanego produktu PREPL przygotowanego przy użyciu puli starterów A i dodać 441 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do końcowej objętości 900 mikrolitrów. Następnie, gdy osiągnie temperaturę pokojową, wyjmij kartę tack man low density array z opakowania i połóż ją folią do dołu na czystym miejscu. Dodać 100 mikrolitrów reakcji PCR.Wymieszaj z każdym z ośmiu portów napełniania na karcie. Obracaj kartę przez minutę w temperaturze 331 GS i temperaturze pokojowej. Następnie powolnym, równomiernym i pojedynczym, równomiernym ruchem popchnij karetkę w poprzek karty, aż dotrze do punktu końcowego zgrzewarki.Wyjmij zapieczętowaną kartę macierzy i odetnij zbiorniki. Następnie upewnij się, że w systemie realtime PCR z matrycą mikrofluidyczną zainstalowano odpowiedni blok, podgrzewaną pokrywę i nośnik próbki. Aby załadować matryce nanofluidyczne, rozmrozić rozcieńczony prepl, amplifikowany CDNA i przykleić odczynnik QPCR w czasie rzeczywistym.Wymieszaj i wymieszaj butelkę z odczynnikiem QPCR, mieszając. Następnie dodaj 22,5 mikrolitra mieszanki odczynników QPCR do 22,5 mikrolitrów rozcieńczonego prepl, amplifikowanego CDNA. Następnie dodaj pięć mikrolitrów każdej próbki do ośmiu dołków płytki z próbkami nano fluidics array workflow 384 dołków, zwracając uwagę na umieszczenie puli A i B każdej próbki.W sąsiednich ośmiu blokach studzienek, gdy wszystkie próbki zostały przeniesione, przykryj każdą sekcję płytki kawałkami uszczelniacza do płytek z próbkami z otwartą matrycą. Następnie po około 15 minutach rozmrozić pierwszy szkiełko z matrycą nanofluidics do temperatury pokojowej. Potwierdzono, że w systemie nano fluidics zainstalowano prawidłową pokrywę do edycji bloku i nośnik próbki, a następnie delikatnie pociągając poluzować tłok strzykawki z płynem zanurzeniowym.Zdejmij nasadkę, umieść końcówkę na miejscu i spłucz powietrze z końcówki. Następnie umieść końcówki systemu załadunku w systemie załadunku. Otwórz pokrywę i umieść płytkę z próbką w systemie załadowczym.Teraz załóż parę ciasno przylegających rękawiczek. Ostrożnie otwórz opakowanie szkiełka i powoli wychyl suwak z opakowania, nie dotykając jego górnej części. Umieść szkiełko w systemie załadowczym z kodem kreskowym po lewej stronie.Następnie wyjmij zgrzewarkę z części płytki próbki przeznaczonej do załadunku i użyj oprogramowania systemu ładowania, aby wprowadzić pozycję suwaka kodu kreskowego suwaka, pozycję próbki i konfigurację końcówki. Podczas ładowania zjeżdżalni usuń przezroczysty i czerwony plastik z dolnej części pokrywy prowadnicy. Następnie ostrożnie wyjmij i uszczelnij suwak w ciągu 90 sekund od zakończenia procesu ładowania.Umieść szkiełko w talerzu clamp i przesuwaną pokrywę na szkiełku na 30 sekund, potwierdzając, że pokrywka jest ustawiona tak, aby kod kreskowy był prawidłowo wyświetlany. Następnie umieść strzykawkę z płynem zanurzeniowym w szkiełku tak, aby końcówka naciskała na pokrywę i powoli napełniaj szkiełko płynem zanurzeniowym, uważając, aby płyn płynął wzdłuż pokrywy. Gdy suwak jest pełny, uszczelnij go korkiem, przekręcając, aż uchwyt się oderwie.Na koniec zdejmij plastikową osłonę z górnej części pokrywy szkiełka i ostrożnie umieść szkiełko w uchwycie szkiełka systemu PCR w czasie rzeczywistym. Uważaj, aby podeprzeć dolną część zjeżdżalni podczas jej opuszczania bez dotykania górnej części zjeżdżalni. Następnie zainicjuj system PCR i rozpocznij ilościowy program PCR w ciągu godziny od załadowania próbek.Dzięki tej procedurze objętość reakcji wynosząca pięć mikrolitrów może dać wyniki podobne do tych osiągniętych przy użyciu objętości 20 mikrolitrów z silną korelacją. Do 39 cykli pokazano tutaj nijakie wykresy Altmana i korelacji dla wszystkich 754 mikro RN testowanych na tej samej próbce przy użyciu kart z matrycą mikrofluidyczną, ponieważ właśnie wykazano, że mikroRNA, które mają wartości CT od zera do 19,99 w obu ścieżkach, również wykazują podobne ekspresje ze współczynnikiem determinacji 98%Ponadto liczba mikroRNA ze znaczącymi różnicami obserwowanymi między badaniami wzrasta, gdy wybierane są wartości CT między 30 a 40. Na tym wykresie przedstawiono dane platformy nano fluidics array dla wszystkich 754 mikroRNA.Ważne jest, aby zbadać krzywe wzmocnienia, aby upewnić się, że wyniki wskazują na rzeczywiste wzmocnienie. MikroRNA utrzymujące porządek, takie jak U six, powinny być również badane pod kątem zmienności. Na przykład na tym wykresie pokazano typowe grupowanie sześciu powtórzeń U wykazujących niskie odchylenie standardowe, co wskazuje na wiarygodność danych.Wreszcie, dane te ilustrują zwiększoną zmienność powtórzeń U sześciu w drugiej próbce. Technologie oparte na sondach o wysokiej przepustowości, takie jak macierze mikrofluidyczne i Nana fluidics, umożliwiają powtarzalne i skuteczne wykrywanie obfitości wielu mikroRNA w dużej liczbie próbek w bardzo krótkim czasie. Każdy z przepływów pracy został zaprojektowany tak, aby zaspokoić różne przepustowości w zależności od liczby celów mikroRNA i liczby próbek do analizy.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać różne techniki PCR w czasie rzeczywistym oparte na sondzie w celu zwiększenia obfitości mikro NA.

probe-based-real-time-pcr-approaches-for-quantitative-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Podejścia oparte na sondach do techniki PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru microRNA

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) jest szybką i czułą metodą badania poziomów ekspresji różnych cząsteczek mikroRNA (miRNA) w próbkach nowotworowych. Zastosowanie tej metody pozwala na amplifikację, kwantyfikację i analizę ekspresji setek różnych cząsteczek miRNA z tej samej matrycy cDNA.

Wykrywanie mikroRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Ten raport opisuje protokół pomiaru bezwzględnych poziomów miRNA w osoczu, przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym z lub bez wstępnej amplifikacji. Protokół ten pozwala lepiej zrozumieć ilość miRNA w osoczu i umożliwia jakościową ocenę odpowiednich danych z różnych badań lub laboratoriów.

Bezwzględna kwantyfikacja poziomów mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym

Tutaj przedstawiono ilościowy protokół oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym do określania natywnej zawartości mikro-RNA (bezwzględnej/względnej) w cząsteczkach lipoprotein. Ponadto przedstawiono metodę zwiększania poziomu mikro-RNA, a także metodę określania szybkości wychwytu komórkowego cząstek lipoprotein.

Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego

Ten protokół wykorzystuje opartą na sondzie reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), test sulforodaminy B (SRB), klonowanie 3' nietranslowanych regionów (3' UTR) oraz test lucyferazy w celu weryfikacji docelowych genów interesującego miRNA i zrozumienia funkcji miRNA.

Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

Tutaj opisujemy krok po kroku strategię izolowania małych RNA, wzbogacania mikroRNA i przygotowywania próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Następnie opisujemy, jak przetwarzać odczyty sekwencji i dopasowywać je do mikroRNA za pomocą narzędzi open source.

Kompletny potok do izolowania i sekwencjonowania mikroRNA oraz analizowania ich przy użyciu narzędzi open source

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj metody PCR w czasie rzeczywistym oparte na sondach do ilościowego oznaczania mikroRNA w osoczu i surowicy. Techniki te umożliwiają odkrywanie nowych biomarkerów chorób, w tym nowotworów i cukrzycy.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Przeglądaj więcej filmów