Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zademonstrowanie trzech różnych metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondzie, stosowanych do ilościowego oznaczania mikro RNA w próbkach osocza i surowicy. PCR w czasie rzeczywistym oparty na sondzie uzyskuje się poprzez hydrolizę i detekcję fluorescencyjnie znakowanej sondy, która zawiera fluorescencyjny reporter i wygaszacz. Kiedy polimeraza sczepna rozciąga się od poprzedzającego startera i dociera do pięciu głównych końców sondy, prowadzi to do fizycznej dysocjacji emitera fluorescencyjnego od wygaszacza.

Następnie uwalniana jest pojedyncza cząsteczka fluoru czterech, która jest rejestrowana przez detektor i przedstawiana jako przyrostowy wzrost sygnału fluorescencyjnego z tej reakcji. Ostatecznie ilość wygenerowanego produktu PCR można zmierzyć na podstawie wzrostu fluorescencji, co pozwala na dokładne określenie ilościowe amplifikowanego docelowego amplifi. Metoda ta staje się obiecującą metodą odkrywania nowych biomarkerów różnych nowotworów i innych chorób, takich jak cukrzyca.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w obfitość mikroRNA w surowicy i osoczu, można ją również zastosować do innych próbek, takich jak komórki obwodowe i tkanki. Wizualna demonstracja tego protokołu ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre kroki związane z uszczelnianiem szkiełka z matrycą nano fluidics mogą być trudne do nauczenia się po prostu czytając protokół W przypadku opartego na sondzie wykrywania ilościowego mikro RNA PCR w czasie rzeczywistym w 4,2 mikrolitra poszczególnych mieszanin odczynników QPCR do każdej studzienki optycznej płytki 96-dołkowej, następnie 0,8 mikrolitra odpowiedniego, świeżo przygotowanego roztworu reakcyjnego CDNA. Uszczelnij płytkę odpowiednią osłoną optyczną, a następnie uruchom QPCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym.

Aby przygotować kartę macierzy mikrofluidycznej z jednym do 1000 nanogramów całkowitego początkowego wejścia RNA, najpierw rozmrozić bufor starterów puli A i B, fosforany deoksynukleotydów, chlorek magnezu i inhibitor RNA na lodzie. Następnie, aby przeprowadzić odwrotną transkrypcję, należy podwielokrotnić 100 nanogramów każdej próbki RNA do probówki z puli A lub B, a następnie dodać odpowiednią objętość wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość w każdej probówce do trzech mikrolitrów. Następnie podwielokrotność 4,5 mikrolitra odpowiedniego odczynnika do odwrotnej transkrypcji wymieszać z odpowiednimi odpowiednimi probówkami.

Następnie umieść próbki w termocyklerze i rozpocznij odwrotną transkrypcję. Podczas gdy odwrotna transkrypcja postępuje. W przypadku całkowitej ilości wejściowej próbki RNA od jednego do 350 nanogramów należy rozmrozić predefiniowaną pulę starterów do wstępnej amplifikacji na lodzie, gdy próbki są gotowe, podwielokrotność 22,5 mikrolitra odpowiedniego odczynnika przedwzmacniacza.

Wymieszać z probówkami z puli A i B i dodać do każdej z nich 2,5 mikrolitra próbki CDNA z odwrotną transkrypcją. Następnie załaduj próbki do termocyklera i rozpocznij cykl przedwzmacniacza. Pod koniec cyklu dodaj 75 mikrolitrów buforu 0,1 x tris EDTA do wstępnie wzmocnionego CDNA, aby załadować kartę mikrofluidyczną.

Następnie dodać 450 mikrolitrów mieszaniny odczynników QPCR do dziewięciu mikrolitrów rozcieńczonego PREPL amplifikowanego CDNA dla karty A, użyć amplifikowanego produktu PREPL przygotowanego przy użyciu puli starterów A i dodać 441 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do końcowej objętości 900 mikrolitrów. Następnie, gdy osiągnie temperaturę pokojową, wyjmij kartę tack man low density array z opakowania i połóż ją folią do dołu na czystym miejscu. Dodać 100 mikrolitrów reakcji PCR.

Wymieszaj z każdym z ośmiu portów napełniania na karcie. Obracaj kartę przez minutę w temperaturze 331 GS i temperaturze pokojowej. Następnie powolnym, równomiernym i pojedynczym, równomiernym ruchem popchnij karetkę w poprzek karty, aż dotrze do punktu końcowego zgrzewarki.

Wyjmij zapieczętowaną kartę macierzy i odetnij zbiorniki. Następnie upewnij się, że w systemie realtime PCR z matrycą mikrofluidyczną zainstalowano odpowiedni blok, podgrzewaną pokrywę i nośnik próbki. Aby załadować matryce nanofluidyczne, rozmrozić rozcieńczony prepl, amplifikowany CDNA i przykleić odczynnik QPCR w czasie rzeczywistym.

Wymieszaj i wymieszaj butelkę z odczynnikiem QPCR, mieszając. Następnie dodaj 22,5 mikrolitra mieszanki odczynników QPCR do 22,5 mikrolitrów rozcieńczonego prepl, amplifikowanego CDNA. Następnie dodaj pięć mikrolitrów każdej próbki do ośmiu dołków płytki z próbkami nano fluidics array workflow 384 dołków, zwracając uwagę na umieszczenie puli A i B każdej próbki.

W sąsiednich ośmiu blokach studzienek, gdy wszystkie próbki zostały przeniesione, przykryj każdą sekcję płytki kawałkami uszczelniacza do płytek z próbkami z otwartą matrycą. Następnie po około 15 minutach rozmrozić pierwszy szkiełko z matrycą nanofluidics do temperatury pokojowej. Potwierdzono, że w systemie nano fluidics zainstalowano prawidłową pokrywę do edycji bloku i nośnik próbki, a następnie delikatnie pociągając poluzować tłok strzykawki z płynem zanurzeniowym.

Zdejmij nasadkę, umieść końcówkę na miejscu i spłucz powietrze z końcówki. Następnie umieść końcówki systemu załadunku w systemie załadunku. Otwórz pokrywę i umieść płytkę z próbką w systemie załadowczym.

Teraz załóż parę ciasno przylegających rękawiczek. Ostrożnie otwórz opakowanie szkiełka i powoli wychyl suwak z opakowania, nie dotykając jego górnej części. Umieść szkiełko w systemie załadowczym z kodem kreskowym po lewej stronie.

Następnie wyjmij zgrzewarkę z części płytki próbki przeznaczonej do załadunku i użyj oprogramowania systemu ładowania, aby wprowadzić pozycję suwaka kodu kreskowego suwaka, pozycję próbki i konfigurację końcówki. Podczas ładowania zjeżdżalni usuń przezroczysty i czerwony plastik z dolnej części pokrywy prowadnicy. Następnie ostrożnie wyjmij i uszczelnij suwak w ciągu 90 sekund od zakończenia procesu ładowania.

Umieść szkiełko w talerzu clamp i przesuwaną pokrywę na szkiełku na 30 sekund, potwierdzając, że pokrywka jest ustawiona tak, aby kod kreskowy był prawidłowo wyświetlany. Następnie umieść strzykawkę z płynem zanurzeniowym w szkiełku tak, aby końcówka naciskała na pokrywę i powoli napełniaj szkiełko płynem zanurzeniowym, uważając, aby płyn płynął wzdłuż pokrywy. Gdy suwak jest pełny, uszczelnij go korkiem, przekręcając, aż uchwyt się oderwie.

Na koniec zdejmij plastikową osłonę z górnej części pokrywy szkiełka i ostrożnie umieść szkiełko w uchwycie szkiełka systemu PCR w czasie rzeczywistym. Uważaj, aby podeprzeć dolną część zjeżdżalni podczas jej opuszczania bez dotykania górnej części zjeżdżalni. Następnie zainicjuj system PCR i rozpocznij ilościowy program PCR w ciągu godziny od załadowania próbek.

Dzięki tej procedurze objętość reakcji wynosząca pięć mikrolitrów może dać wyniki podobne do tych osiągniętych przy użyciu objętości 20 mikrolitrów z silną korelacją. Do 39 cykli pokazano tutaj nijakie wykresy Altmana i korelacji dla wszystkich 754 mikro RN testowanych na tej samej próbce przy użyciu kart z matrycą mikrofluidyczną, ponieważ właśnie wykazano, że mikroRNA, które mają wartości CT od zera do 19,99 w obu ścieżkach, również wykazują podobne ekspresje ze współczynnikiem determinacji 98%Ponadto liczba mikroRNA ze znaczącymi różnicami obserwowanymi między badaniami wzrasta, gdy wybierane są wartości CT między 30 a 40. Na tym wykresie przedstawiono dane platformy nano fluidics array dla wszystkich 754 mikroRNA.

Ważne jest, aby zbadać krzywe wzmocnienia, aby upewnić się, że wyniki wskazują na rzeczywiste wzmocnienie. MikroRNA utrzymujące porządek, takie jak U six, powinny być również badane pod kątem zmienności. Na przykład na tym wykresie pokazano typowe grupowanie sześciu powtórzeń U wykazujących niskie odchylenie standardowe, co wskazuje na wiarygodność danych.

Wreszcie, dane te ilustrują zwiększoną zmienność powtórzeń U sześciu w drugiej próbce. Technologie oparte na sondach o wysokiej przepustowości, takie jak macierze mikrofluidyczne i Nana fluidics, umożliwiają powtarzalne i skuteczne wykrywanie obfitości wielu mikroRNA w dużej liczbie próbek w bardzo krótkim czasie. Każdy z przepływów pracy został zaprojektowany tak, aby zaspokoić różne przepustowości w zależności od liczby celów mikroRNA i liczby próbek do analizy.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać różne techniki PCR w czasie rzeczywistym oparte na sondzie w celu zwiększenia obfitości mikro NA.