Name: Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj metodę obrazowania dynamiki Ca²⁺ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Technika ta umożliwia badanie sygnalizacji wapniowej w modelu ssaczym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience Tübingen, EXC 307 do T.E. i T.S.; KFO 134 do B.W. i F.P.D.), niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002 do T.E i T.B.) oraz Unii Europejskiej (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 do M.K. i F.P.D.).

Wszystkie procedury z użyciem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt określonymi przez rząd federalny Niemiec oraz zatwierdzonymi przez instytucjonalny komitet ds. dobrostanu zwierząt Uniwersytetu w Tübingen.
1. Modele zwierzęce
<ol>
	<li>Mysz z biosensorem Ca2+ HR2.1:TN-XL
	<ol>
		<li>Należy użyć transgenicznej linii myszy HR2.1:TN-XL wykazującej ekspresję biosensora Ca2+ TN-XL selektywnie w fotoreceptorach czopkowych10. Należy wykorzystać myszy obu płci w wieku od 3 do 6 tygodni, utrzymywane w standardnym 12-godzinnym cyklu dzień/noc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Disekcja siatkówki
<ol>
	<li>Roztwór fizjologiczny
	<ol>
		<li>Przygotować na świeżo 2 L roztworu zewnątrzkomórkowego zawierającego 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 0,5 mM L-glutaminy oraz 20 mM (+) glukozy. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia wszystkich składników.</li>
		<li>Napowietrzyć roztwór zewnątrzkomórkowy karboksygenem (95% O2, 5% CO2) przez 5-10 min. Dodać CaCl2 do uzyskania stężenia 2 mM.</li>
		<li>Po napowietrzeniu roztworu zewnątrzkomórkowego zmierzyć jego pH. pH powinno wynosić 7,4; w przeciwnym razie prawdopodobnie podczas przygotowania roztworu popełniono błąd. Aby zapewnić stałe pH, utrzymać stałą szybkość napowietrzania i temperaturę roztworu przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
		<li>Podzielić roztwór zapasowy do dwóch kolb: jednej do dysekcji siatkówki i drugiej do zestawu pomiarowego (perfuzji).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Enukleacja oka i izolacja siatkówki (5-10 min)
	<ol>
		<li>W obszarze roboczym podczas enukleacji zachować słabe czerwone oświetlenie. Użyć diod LED o szczytowej długości fali 650 nm (lub dłuższej), aby uniknąć wybielania czopków podczas dysekcji.</li>
		<li>Adaptować mysz do ciemności przez 2 h, umieszczając jej klatkę w dobrze wentylowanym, nieprzepuszczającym światła pudełku, aby upewnić się, że czopki są w pełni uwrażliwione w momencie pomiarów.</li>
		<li>Zznieczulić mysz pod dygestorium laboratoryjnym izofluranem (5%), używając parownika i szczelnego pojemnika mieszczącego standardową klatkę dla myszy. Starannie przestrzegać instrukcji producenta podczas obsługi parownika. Stosować rękawiczki i maskę ochronną, aby zmniejszyć ekspozycję na alergeny.</li>
		<li>Do dysekcji użyć mikroskopu binokularnego z powiększeniem 10-40X.</li>
		<li>Uśmiercić znieczuloną mysz poprzez dekapitację.</li>
		<li>W celu orientacji zaznaczyć górną część każdego oka (= grzbietową) wodoodpornym pisakiem. Odnotować, czy używane jest oko lewe czy prawe.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć oko za pomocą zakrzywionych nożyczek, przecinając nerw wzrokowy za gałką oczną. Do dysekcji przenieść gałkę oczną do szalki Petriego zawierającej świeżo napowietrzony karboksygenem roztwór zewnątrzkomórkowy. Przenosząc gałkę oczną, trzymać ją za kikut nerwu wzrokowego.</li>
		<li>Przebić oko w dowolnym punkcie wzdłuż granicy między rogówką a twardówką (tzn. w obrębie ora serrata) ostrą igłą wstrzykiwacza.</li>
		<li>Utrzymać oko za twardówkę pęsetą i delikatnie wprowadzić jedno ostrze nożyczek do otworu wykonanego w poprzednim kroku. Przeciąć wzdłuż ora serrata, aby oddzielić przednią część oka (rogówkę, soczewkę, ciało szkliste) od części tylnej (skorupa gałki ocznej). Przeciąć skorupę gałki radialnie (w kierunku tarczy nerwu wzrokowego) w miejscu zaznaczenia pisakiem, aby wskazać położenie grzbietowe siatkówki. 
		Uwaga: Przygotowane w ten sposób skorupy gałek ocznych można przechowywać w stale napowietrzanym karboksygenem roztworze do późniejszego użycia.</li>
		<li>Obrócić skorupę gałki w szalce Petriego tak, aby cięcie grzbietowe było skierowane w stronę przeciwną do badacza. Chwycić twardówkę po lewej i prawej stronie skorupy gałki za pomocą dwóch pęset, wprowadzając końcówki pęset między siatkówkę a twardówkę.</li>
		<li>Oddzielić siatkówkę, delikatnie wywijając twardówkową część skorupy gałki. Na koniec przeciąć nerw wzrokowy za pomocą mikronożyczek dysekcyjnych, aby uwolnić siatkówkę z twardówki. 
		Uwaga: Jest to krytyczny etap. Należy unikać uszkodzenia siatkówki (np. poprzez dotykanie jej lub ściskanie pęsetą).</li>
		<li>Przytrzymać jedną z krawędzi siatkówki pęsetą i delikatnie usunąć z jej powierzchni zanieczyszczenia i ciało szkliste za pomocą drugiej pęsety. Po oczyszczeniu powierzchni siatkówki użyć mikronożyczek dysekcyjnych do wykonania trzech dodatkowych, krótszych cięć radialnych (w odstępach około 90°). Cięcia te umożliwiają ostrożne rozprostowanie siatkówki w szalce Petriego stroną z fotoreceptorami do dołu (Rycina 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie plastrów (10-15 min)
	<ol>
		<li>Przygotować wcześniej nitrocelulozowe membrany filtracyjne do cięcia siatkówki oraz szkiełka nakrywkowe do montowania plastrów i przenoszenia ich do komory pomiarowej. Wyciąć z membrany nitrocelulozowej prostokątne kawałki o wymiarach około 10 x 5 mm za pomocą nożyczek. Wyciąć z szkiełek nakrywek prostokątne kawałki o wymiarach około 10 x 5 mm za pomocą przecinaka do szkła.</li>
		<li>Powoli zanurzyć szkiełko przedmiotowe w roztworze zewnątrzkomórkowym w pobliżu tkanki. Delikatnie naciągnąć siatkówkę na szkiełko przedmiotowe stroną z komórkami zwojowymi do góry, chwytając ją za samą krawędź pęsetą. Proces ten ogranicza uszkodzenia mechaniczne i zwijanie się tkanki.</li>
		<li>Wybrać obszar siatkówki odpowiadający danej kwestii badawczej (patrz również sekcja Dyskusja). Należy pamiętać, że długie cięcie wykonane w kroku 2.2.9 wyznacza grzbietową połowę siatkówki (Rycina 1A). Wyciąć prostokątny kawałek o wymiarach około 1 x 2 mm z wybranego obszaru siatkówki za pomocą zakrzywionego ostrza skalpela. Przetrzeć nadmiar roztworu wokół tkanki.</li>
		<li>Położyć membranę filtracyjną na kawałku siatkówki w taki sposób, aby strona z komórkami zwojowymi przylegała do membrany. Natychmiast dodać kroplę medium zewnątrzkomórkowego na membranę, aby mocno przytwierdzić tkankę do membrany.</li>
		<li>Przenieść tkankę siatkówki zamontowaną na membranie do komory do cięcia zawierającej świeży roztwór zewnątrzkomórkowy.</li>
		<li>Przeciąć siatkówkę na pionowe plastry o grubości 200 µm (Rycina 1B) za pomocą świeżego ostrza brzytwy zamontowanego w urządzeniu do cięcia tkanki (tissue chopper)23. Wymieniać ostrze dla każdego kawałka siatkówki. 
		Uwaga: Ostrze brzytwy musi być idealnie wyrównane z powierzchnią dna komory do cięcia, tak aby cała membrana rozdzieliła się jednocześnie, co objawia się słyszalnym „kliknięciem” podczas cięcia – w przeciwnym razie ostrze może się wygiąć i uszkodzić plaster.</li>
		<li>Przykleić pojedynczy plaster zamontowany na membranie do szkiełka nakrywkowe, nakładając smar wysokopróżniowy wyłącznie na krawędzie membrany (Rycina 1C). Powierzchnia szkiełka pod siatkówką musi pozostać wolna od smaru.</li>
		<li>Przechowywać plastry zamontowane na szkiełkach pod kroplą roztworu zewnątrzkomórkowego w komorze holdingowej – zamkniętym i nieprzepuszczającym światła pojemniku, np. szalce Petriego z pokrywką owiniętą folią aluminiową – w atmosferze karboksygenu w temperaturze pokojowej (RT). Wprowadzać karboksygen poprzez napowietrzanie niewielkiego zbiornika z wodą, aby utrzymać wilgotność atmosfery w komorze holdingowej; zapobiega to wysychaniu plastrów.</li>
		<li>Pozostawić plastry w komorze holdingowej na 10-15 min przed przeniesieniem ich (po kolei) do komory pomiarowej. Plastry mogą być utrzymywane w komorze holdingowej w temperaturze pokojowej (~21 °C) do 4-5 h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Dwufotonowe obrazowanie Ca2+
<ol>
	<li>Mikroskopia dwufotonowa
	<ol>
		<li>Należy użyć mikroskopu dwufotonowego typu MOM (Movable Objective Microscope). Zarówno konstrukcja MOM, jak i procedury obrazowania zostały opisane wcześniej24, szczegóły znajdują się również w10,21,25 (źródła i firmy wymieniono w Tabeli 1). 
		Uwaga: Można użyć dowolnego pionowego mikroskopu dwufotonowego, który spełnia następujące minimalne wymagania: musi być wyposażony w (a) laser impulsowy z możliwością strojenia do ~860 nm, (b) minimum dwa kanały fluorescencji rejestrowane jednocześnie, (c) filtry dla fluorescencji eCFP i cytryny, (d) stymulator światła (możliwe konstrukcje opisano w24,26) oraz (e) oprogramowanie umożliwiające rejestrację sekwencji obrazów w odstępach czasu (time-lapse) z częstotliwością klatek wystarczającą do rozdzielenia interesujących sygnałów Ca2+.</li>
		<li>Uruchomić system obrazowania dwufotonowego zgodnie z instrukcją producenta. Należy ściśle przestrzegać wytycznych dotyczących bezpieczeństwa pracy z laserem w danej placówce. Włączyć laser i nastroić go na ~860 nm.</li>
		<li>Przenieść skrawek z komory holdingowej do komory rejestracyjnej i niezwłocznie rozpocząć perfuzję nasyconym karboksygenem roztworem zewnątrzkomórkowym. W komorze rejestracyjnej należy utrzymać szybkość przepływu perfuzji na poziomie 2 ml/min oraz temperaturę 37 °C.</li>
		<li>Użyć obiektywu imersyjnego z wodą 20X 0.95 NA. Jeśli jest dostępna, należy użyć kamery CCD w połączeniu z podczerwienioną diodą LED pod komorą rejestracyjną, aby zlokalizować skrawek siatkówki (Rysunek 2). W przeciwnym razie skrawek należy zlokalizować za pomocą obrazowania dwufotonowego (patrz pkt 3.1.5).</li>
		<li>Przełączyć na obrazowanie dwufotonowe w celu sprawdzenia ekspresji biosensora. Włączyć dwa kanały detekcji dla obrazowania fluorescencyjnego eCFP i cytryny.</li>
		<li>Użyć oprogramowania do akwizycji obrazu sterującego mikroskopem dwufotonowym, aby przeskanować i wybrać rząd zakończeń czopków do rejestracji (Rysunek 3A). Ustawić akwizycję obrazu na obrazy o wymiarach 128 x 16 pikseli (31,25 Hz) lub konfigurację pokrewną. Ograniczyć obszar skanowania do zakończeń czopków, aby uniknąć blaknięcia fotopigmentów w segmentach zewnętrznych. 
		Uwaga: Dla sensora wapnia TN-XL (τ = ~0,6 s dla wiązania Ca2+, τ = ~0,2 s dla odwiązania Ca2+; patrz16) zaleca się minimalną częstotliwość klatek ~8 Hz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stymulacja światłem i rejestracja
	<ol>
		<li>Do wykonania następujących kroków należy użyć pełnopowierzchniowego stymulatora światła podstolikowego, opisanego w innych publikacjach10,21,26. 
		Uwaga: Prostym rozwiązaniem dla pełnopowierzchniowego stymulatora światła jest użycie dwóch diod LED z filtrami pasmowymi (np., „niebieska”: 360 BP 12, „zielona”: 578 BP 10), które odpowiadają czułości długości fali czopków mysich, ale jednocześnie nie nakładają się na filtry używane do detekcji fluorescencji (por. 3.2.4). Światło z diod LED jest skupiane przez kondensator przez dno komory rejestracyjnej (Rysunek 2). Szczegółowe informacje na temat konstrukcji tego stymulatora, jego kalibracji, użytych natężeń światła i wywołanych szybkości fotoizomeryzacji czopków znajdują się w10,21,26.</li>
		<li>Włączyć laser i pozwolić czopkom zaadaptować się do lasera skanującego i tła światła stymulującego (20 - 30 s, patrz również Potencjalne trudności) przed prezentacją bodźców świetlnych (patrz 3.2.3) lub zastosowaniem środków farmakologicznych.</li>
		<li>Rozpocząć prezentację dowolnych bodźców (np., błyski światła, jak pokazano na Rysunku 3B,C). W przypadku stymulatora opisanego w kroku 3.2.1 bodźce należy generować poprzez modulację natężenia dwóch diod LED w czasie za pomocą płyty mikroprocesorowej sterowanej przez dedykowane oprogramowanie (szczegóły w10,21,26).</li>
		<li>Rozpocząć jednoczesną rejestrację dwóch kanałów fluorescencji (np., 483 nm dla „niebieskiego” donora FRET eCFP i 535 nm dla „żółtego” akceptora FRET; specyfikacje w Tabeli 1) przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do akwizycji obrazu (patrz również 3.1.6). Na przykład, w przypadku błysków światła (Rysunek 3B,C), należy zarejestrować co najmniej 8 - 10 prezentacji bodźców (prób).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibracja Ca2+ „w skrawku”
	<ol>
		<li>Zarejestrować sygnały Ca2+ w zakończeniach czopków (jak opisano w 3.1.6 i 3.2.4) i wyznaczyć bazowy poziom Ca2+ w zestawie czopków (jak opisano w 3.4).</li>
		<li>Przełączyć na medium zewnątrzkomórkowe „wolne od Ca2+” z dodatkiem 5 µM ionomycyny (rozpuszczonej w DMSO) i 10 mM EGTA (lub alternatywnie BAPTA). Ponownie rejestrować zakończenia czopków co 5 min, aby wyznaczyć minimalny stosunek fluorescencji (Rmin), tzn. stosunek przy (prawie) całkowitym braku wewnątrzkomórkowego Ca2+. Może to zająć od 15 do 30 min. 
		Uwaga: Wymagany jest system perfuzyjny umożliwiający przełączanie między różnymi zbiornikami.</li>
		<li>Przełączyć na medium zewnątrzkomórkowe z 5 µM ionomycyny (rozpuszczonej w DMSO) i 2,5 mM Ca2+. Po 5 min inkubacji ponownie rejestrować czopki co 5 min, aby zmierzyć maksymalny stosunek fluorescencji (Rmax), tzn. stosunek przy nasycających stężeniach wewnątrzkomórkowego Ca2+. Po zastosowaniu ionomycyny stabilizacja stosunku Ca2+ może zająć od 3 do 15 min. 
		Uwaga: Długotrwała ekspozycja skrawków na wysokie stężenie Ca2+ i ionomycynę doprowadzi w końcu do uszkodzenia komórek. Do analizy należy włączyć tylko komórki, które zachowały normalną morfologię. Stężenia (tzn. EGTA, ionomycyny) mogą wymagać dostosowania. Więcej szczegółów na temat protokołu kalibracji Ca2+ znajduje się w13,17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych 
	 Uwaga: Należy użyć pakietu oprogramowania do przetwarzania obrazów i analizy danych, który jest kompatybilny z oprogramowaniem mikroskopu i umożliwia uruchamianie niestandardowych skryptów analizy.
	<ol>
		<li>Wczytać plik danych obrazowania i wyznaczyć obszary zainteresowania (ROI) wokół każdego zakończenia czopka (Rysunek 3A). Dla każdej klatki obliczyć średnią intensywność fluorescencji w obrębie ROI i odjąć fluorescencję tła, a następnie obliczyć stosunek (R) między fluorescencją akceptora FRET (cytryny) a donora (eCFP) (R=FA/FD; Rysunek 3B,C). Stosunek ten jest zazwyczaj używany jako wskaźnik względnego stężenia wewnątrzkomórkowego Ca2+, ale po kalibracji (patrz 3.3) można oszacować również stężenia bezwzględne (patrz 3.4.3). 
		Uwaga: Pedykle można rozpoznać po ich lokalizacji w zewnętrznej warstwie splotowej i morfologii (nieco spłaszczone „plamki” mniejsze niż soma czopka, znajdujące się na końcu aksonu czopka).</li>
		<li>Uśrednić próby stymulacji (Rysunek 4A). Z uśrednionych przebiegów (Rysunek 4B) wyznaczyć parametry odpowiedzi, takie jak bazowy poziom Ca2+ (Rbase) przed stymulacją światłem, amplituda szczytowa (Ramp) oraz pole pod krzywą (RA) jako miary wielkości odpowiedzi. Należy również wyznaczyć kinetykę odpowiedzi z uśrednionych przebiegów, np. czas narastania odpowiedzi (trise) i czas zaniku (tdecay) (= odpowiednie odstępy czasu między 20% a 80% Ramp; patrz ilustracja na Rysunku 4B). Więcej szczegółów na temat wyznaczania tych parametrów znajduje się w10.</li>
		<li>Obliczyć szacunkowe bezwzględne stężenie Ca2+ w czopkach na podstawie pomiarów z kroków 3.3.1-3.3.3. Użyć stosunków dla minimalnego i maksymalnego stężenia Ca2+, odpowiednio Rmin i Rmax, fluorescencji donora w stanie z wiązanym (FD,Ca-bound) i niezwiazanym (FD,Ca-free) Ca2+, a także stałej dysocjacji in-vivo (Kd = 0,77, patrz16) dla TN-XL za pomocą następującego równania (analogicznie do27):</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Równanie stężenia wapnia, obliczanie stosunku, fluorescencja, formuła analizy, badania naukowe." src="/files/ftp_upload/52588/52588eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">

<ol><li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+strategies+for+the+treatment+of+inherited+photoreceptor+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration.</a> Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).</li>
<li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain+is+activated+in+degenerating+photoreceptors+in+the+rd1+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse.</a> Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).</li>
<li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+role+for+cyclic+nucleotide+gated+%28CNG%29+channels+in+cGMP-related+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa.</a> Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).</li>
<li>Frasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%3A+rod+photoreceptor+rescue+by+a+calcium-channel+blocker+in+the+rd+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse.</a> Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).</li>
<li>Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+calcium+channel+blocker+diltiazem+on+photoreceptor+degeneration+in+the+rhodopsin+Pro213His+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).</li>
<li>Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+photoreceptor+rescue+with+D-cis-diltiazem+in+the+rd+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).</li>
<li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-dependent+changes+in+outer+segment+free-Ca2%2B+concentration+in+salamander+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors.</a> The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).</li>
<li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+light+intensity+by+the+cone+photoreceptor+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 48, 555-562 (2005).</li>
<li>Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+stores+in+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium stores in vertebrate photoreceptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).</li>
<li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+calcium+signals+in+mouse+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).</li>
<li>Johnson, J. E. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+regulation+of+ATP+and+Ca2%2B+dynamics+in+vertebrate+rod+and+cone+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses.</a> Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-disruptive+technique+for+loading+calcium+buffers+and+indicators+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells.</a> Nature. 290, 527-528 (1981).</li>
<li>Hendel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).</li>
<li>Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+reporter+of+synaptic+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo.</a> Nature Methods. 6, 883-889 (2009).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+locus+control+region+adjacent+to+the+human+red+and+green+visual+pigment+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes.</a> Neuron. 9, 429-440 (1992).</li>
<li>Connaughton, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+retinal+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).</li>
<li>Baden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+two+retinal+domains%3A+near-optimal+sampling+of+achromatic+contrasts+in+natural+scenes+through+asymmetric+photoreceptor+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution.</a> Neuron. 80, 1206-1217 (2013).</li>
<li>Kemmler, R., Schultz, k, Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+cone+calcium+signals+by+different+horizontal+cell+feedback+mechanisms+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).</li>
<li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Euler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyecup+scope--optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.+Pflugers+Archive%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive.</a> European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).</li>
<li>Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spikes+in+mammalian+bipolar+cells+support+temporal+layering+of+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina.</a> Current Biology. 23, 48-52 (2013).</li>
<li>Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+bipolar+cell+pathways+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Thoreson, W. B., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+interactions+in+the+outer+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Lateral interactions in the outer retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).</li>
<li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).</li>
<li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%3A+rapid+neurodegeneration+is+governed+by+slow+cell+death+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms.</a> Cell Death & Disease. 4, e488(2013).</li>
<li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+gene+knock-out+increases+resistance+to+retinal+degeneration+without+affecting+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function.</a> PloS One. 5, e15495(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istniejące wcześniej protokoły wykorzystujące elektrofizjologiczne zapisy pojedynczych komórek lub obrazowanie Ca2 + z syntetycznymi wskaźnikami fluorescencyjnymi mają trudności z rejestracją dynamiki Ca2 + w fotoreceptorach czopków myszy z wielu powodów technicznych (patrz Wprowadzenie). Opisany tutaj protokół pozwala w wydajny i stosunkowo prosty sposób na pomiar sygnałówCa2+ , a nawet bezwzględnych poziomów Ca2+ w pojedynczych, zidentyfikowanych końcówkach stożkowych myszy.
Protokół ten został już z powodzeniem zastosowany w trzech badaniach dotyczących różnych aspektów funkcji czopków w zdrowej siatkówce myszy. W pierwszym badaniu10 mysz HR2.1: TN-XL scharakteryzowano za pomocą immunohistochemii, zapisów ERG, obrazowania dwufotonowego Ca2 + i farmakologii, wykazując, że specyficzna dla stożka ekspresja bioczujnika Ca2 + nie utrudnia anatomii i funkcji czopka. W drugim badaniu21 chromatyczne i achromatyczne właściwości odpowiedzi czopków myszy zostały zmapowane w poprzek siatkówki, wykazując uderzające różnice w funkcji czopków między "zieloną" siatkówką grzbietową zdominowaną przez opsynę a "niebieską" brzuszną siatkówką myszy zdominowaną przez opsynę. Te regionalne różnice we właściwościach stożków odpowiadały zróżnicowanemu rozkładowi kontrastu w środowisku naturalnym (tj. niebo vs. ziemia), co sugeruje, że różne typy widmowe czopków myszy zapewniają (prawie) optymalne próbkowanie kontrastów achromatycznych, a tym samym mogą oferować ewolucyjną przewagę. W trzecim badaniu22 badano wzajemne sprzężenie zwrotne, które zakończenia aksonów stożkowych otrzymują od komórek poziomych. Ponieważ wszystkie proponowane poziome mechanizmy sprzężenia zwrotnego komórek działają na bramkowanych napięciem kanałach Ca2+ w zaciskach aksonów stożka28, końcówka stożkowa Ca2+ może służyć jako proxy dla poziomych interakcji komórka-stożek. Badanie przeprowadzone przez Kemmlera i współpracownikówpotwierdza pogląd, że komórki poziome wykorzystują złożony system sprzężenia zwrotnego składający się z kilku mechanizmów do kontrolowania uwalniania glutaminianu fotoreceptorów.
Badania te ilustrują wszechstronność opisanego protokołu i pokazują, że można go dostosować do szerokiego zakresu pytań dotyczących funkcji czopków i ich obwodów synaptycznych. Ponadto protokół umożliwia badanie lokalnej sygnalizacji Ca2+ w różnych przedziałach czopków, w celu lepszego zrozumienia fizjologii czopków. Taka wiedza jest istotna dla zrozumienia procesów patofizjologicznych zachodzących w zwyrodniałych czopkach, aby ostatecznie umożliwić racjonalne opracowanie potencjalnych podejść terapeutycznych, w szczególności w przypadku chorób zwyrodnieniowych dotykających czopki.
W linii myszy HR2.1:TN-XL bioczujnik Ca2+ jest wyrażany w całym stożku, z wyjątkiem segmentu zewnętrznego. Daje to możliwość bezpośredniej i ratiometrycznej oceny dynamiki Ca2+ w różnych przedziałach stożków. Ponieważ zmiany prądów Ca2+ w segmencie zewnętrznym są odbijane na zaciskach poprzez potencjał membranowy i wynikającą z tego aktywację kanałów Ca2+ bramkowanych napięciem, procesy w segmencie zewnętrznym można obserwować pośrednio.
Potencjalne pułapki:
Rozwarstwienie siatkówki jest krytycznym etapem: u myszy siatkówka oddziela się od muszli ocznej, zwykle między zewnętrznymi segmentami fotoreceptora a nabłonkiem barwnikowym. W związku z tym wrażliwe na światło zewnętrzne segmenty fotoreceptorów izolowanej siatkówki są odsłonięte i niezwykle wrażliwe na uszkodzenia mechaniczne. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić tkanki poprzez dotykanie jej narzędziami po stronie fotoreceptora lub przesuwanie tkanki na boki po powierzchni klejącej (np. membranie filtrującej).
Wysokiej jakości plastry siatkówki można rozpoznać pod mikroskopem po czystej powierzchni cięcia i dobrze zorganizowanej warstwie fotoreceptorów z wyraźnie zaznaczonymi segmentami zewnętrznymi. Funkcjonalną ocenę jakości plastrów można szybko przeprowadzić, jasnymi bodźcami świetlnymi i określając procent reagujących czopków (np. w polu widzenia z 10 - 20 czopkami). W tym przypadku jakość odpowiedzi należy ocenić, obliczając stosunek sygnału do szumu (S/N) (amplituda szumu wyjściowego przed bodźcem świetlnym w stosunku do amplitudy odpowiedzi świetlnej); Za minimalny próg należy uznać wartość S/N wynoszącą od 2 do 3. Zazwyczaj odrzucamy plasterki z mniej niż 50% responsywnymi stożkami. Należy również wyrzucić plastry z szyszkami, które wykazują nadmierne spontaniczne wystrzeliwanie (patrz rysunek 4 w10).
Warstwy w komorze rejestracyjnej, które spełniają wyżej wymienione kryteria anatomiczne i funkcjonalne, wykazują spójne odpowiedzi przez 1 - 2 godziny (szczegółowe informacje na temat spójności odpowiedzi znajdują się wpunkcie 10). Ponieważ plastry przeżywają wiele godzin w komorze przetrzymywania, udany eksperyment może trwać do 6 godzin. Warto zauważyć, że istnieją pewne ograniczenia w odniesieniu do badania dalekosiężnych interakcji przestrzennych między czopkami a komórkami poziomymi, ponieważ krojenie nieuchronnie zrywa boczne połączenia w sieciach siatkówki. Jednak zwiększenie grubości plastrów siatkówki do 300 μm łagodzi ten problem22.
Zastosowanie pionowych wycinków siatkówki pozwala uniknąć skanowania światłoczułych zewnętrznych segmentów stożków za pomocą lasera wzbudzającego, a tym samym w znacznym stopniu zapobiega wybielaniu opsyny (obszerne omówienie znajduje się w10,21). Niemniej jednak zarejestrowane sygnały Ca2+ zależą nie tylko od bodźców świetlnych, ale także są pod wpływem składowej oświetlenia tła generowanej przez skaningowy laser wzbudzający. W rzeczywistości efektywne oświetlenie tła w takich eksperymentach obrazowania dwufotonowego jest kombinacją rozproszonego światła laserowego, światła fluorescencyjnego emitowanego przez zarejestrowane komórki i dowolnego składnika tła bodźca LED. W związku z tym stożki powinny mieć możliwość przystosowania się przez co najmniej 20 - 30 s do skanowania laserowego (przy włączonej składowej tła bodźca świetlnego) przed rejestracją.
Zalety i zastosowania:
Podczas gdy niektóre zastosowania tego protokołu obrazowania stożka Ca2 + zostały opisane powyżej10,21,22, można przewidzieć inne zastosowania: Badania farmakologiczne w połączeniu z obrazowaniem stożka Ca2 + mogą potwierdzić szlaki sygnałowe Ca2 + w czopkach i mogą być wykorzystane do testowania skuteczności i siły działania leków ukierunkowanych na różnych graczy w sygnalizacji Ca2 + 10. Jednak kluczowym zastosowaniem może być badanie chorób wpływających na funkcję czopków. Dostępnych jest wiele modeli myszy ze zwyrodnieniem siatkówki naśladujących choroby ludzkie. Na przykład mysz z utratą fotoreceptora czopka 1 (cpfl1) jest pierwotnym modelem zwyrodnienia czopka cierpiącym na mutację Pde6c 29. I odwrotnie, mysz z zwyrodnieniem pręcików 1 (rd1) cierpi na mutację Pde6b . Chociaż powoduje to pierwotne zwyrodnienie fotoreceptorów pręcików30, po zakończeniu utraty pręcika rd1, wtórne zwyrodnienie czopka pojawia się w1. Krzyżowanie tych zwierząt z linią HR2.1:TN-XL pozwoli na badanie i porównywanie dynamikiCa2+ zarówno w pierwotnym, jak i wtórnym zwyrodnieniu czopków i prawdopodobnie dostarczy cennych informacji na temat roliCa2+ podczas śmierci czopków. Również farmakologicznie indukowane zwyrodnienie czopków – na przykład przy użyciu selektywnych inhibitorów PDE6 – może służyć do identyfikacji dalszych mechanizmów zwyrodnienia czopków10,29,31.
Podsumowując, opisany tutaj protokół pozwala na pomiar Ca2+ w subkomórkowych przedziałach fotoreceptorów czopków myszy i daje ogromne możliwości odkrycia fizjologii czopków w szerokim zakresie warunków fizjologicznych i patofizjologicznych. Ponadto protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych środków farmakologicznych zaprojektowanych w celu zakłócania sygnalizacji stożka Ca2 +, a tym samym pomocy w ustaleniu nowych terapii chorób czopków.

Widzenie zaczyna się od wywołanej światłem aktywacji kaskady fototransdukcji w fotoreceptorach siatkówki. Fotoreceptory pręcikowe umożliwiają widzenie przy słabym oświetleniu, podczas gdy fotoreceptory czopkowe pośredniczą w widzeniu kolorów i wysokiej rozdzielczości w świetle dziennym. Wiele genów specyficznych dla fotoreceptorów jest podatnych na mutacje, które prowadzą do degeneracji tych komórek. Zidentyfikowano szereg markerów molekularnych związanych z utratą fotoreceptorów1, ale jak dotąd szczegółowe mechanizmy molekularne i sekwencja zdarzeń pozostają niejasne. Spekulowano, że zmieniona homeostaza Ca2 + jest wyzwalaczem śmierci komórki fotoreceptora, hipoteza wspierana przez regulację w górę aktywności proteaz typu kalpainy zależnych od Ca2 + podczas procesu degeneracji2,3. Jednak do tej pory hipoteza ta nie jest poparta fizjologicznymi pomiaramiCa2+. Niespójności w kilku badaniach dotyczących wpływu blokerów kanału Ca2 + w chorobach siatkówki dodatkowo zakwestionowały udział Ca2 + w śmierci komórki4-6, wzywając do opracowania metod bezpośredniej oceny Ca2 + w fotoreceptorach czopków ssaków.
Wcześniej, większość badań nad zapisem elektrycznym i obrazowaniem Ca2+ była wykonywana na modelach i ze względu na łatwiejszy dostęp do stożków7-9. Fizjologia fotoreceptorów ssaków może jednak różnić się od fizjologii zwierząt niebędących ssakami10, a zwłaszcza w kontekście dziedzicznego zwyrodnienia siatkówki u ludzi lepsze zrozumienie fizjologii fotoreceptorów ssaków jest kluczem do opracowania innowacyjnych metod leczenia. Dostępnych jest wiele modeli myszy naśladujących choroby ludzkiej siatkówki, ale niewiele wiadomo na temat dynamiki Ca2 + w czopkach myszy11. Techniki elektryczne nie nadają się do wysokoprzepustowych nagrań z czopków, w szczególności nie u myszy, gdzie pręciki (~97%) znacznie przewyższają liczebnie czopki (~3%)12. Co więcej, czułe techniki elektrofizjologiczne, takie jak zapisy patch-clamp całych komórek, zaburzają środowisko wewnątrzkomórkowe i dostarczają danych o prądachCa2+, ale nie o bezwzględnych wewnątrzkomórkowych stężeniachCa2+. W związku z tym, pomimo niższej rozdzielczości czasowej, obrazowanie jest metodą z wyboru przy rozwiązywaniu problemów dotyczących dynamiki stożka Ca2+. Kluczową kwestią związaną z obrazowaniem jest to, jak selektywnie oznaczyć czopki fluorescencyjnym barwnikiem wskaźnikowym Ca2+. Właściwa kompartmentalizacja i specyficzność komórkowa jest trudna do osiągnięcia poprzez "masowe ładowanie" syntetycznych barwników wskaźnikowych Ca2 + do tkanki. W związku z tym nie można wiarygodnie odróżnić znakowanych czopków, pręcików13,14 i komórek glejowych Müllera. Ponadto syntetyczne barwniki mają tendencję do wyciekania z komórek, co zapobiega długotrwałym zapisom w stałych warunkach. Ponadto ładowanie syntetycznych wskaźników Ca2+ w postaci estrów AM jest problematyczne, ponieważ wymaga detergentów (np. DMSO) i generuje formaldehyd15. W przypadku pomiarów bezwzględnych Ca2+ wskaźniki ratiometryczne są obowiązkowe. Jednak najlepszy obecnie dostępny syntetyczny wskaźnik ratiometryczny Fura-2 wymaga światła wzbudzającego w zakresie od 700 do 760 nm (dla wzbudzenia dwufotonowego), które w zależności od jego intensywności może samo w sobie stymulować czopki, a tym samym utrudniać badania dynamiki stożka Ca2+ w fizjologicznych warunkach oświetlenia.
W przeciwieństwie do barwników syntetycznych, genetycznie kodowane wskaźniki Ca2+ mogą być wyrażane w sposób selektywny pod względem typu komórki. Nie wyciekają one z komórek, dlatego też, jeśli unika się wybielania, możliwe są długotrwałe i wiarygodne pomiary ratiometryczne. Selektywna ekspresja biosensorów Ca2 + w połączeniu z mikroskopią dwufotonową stanowi potężne narzędzie do oceny i badania subkomórkowego Ca2 + w warunkach w dużej mierze fizjologicznych13,16,17. W tym miejscu opisujemy protokół badania dynamiki stożka Ca2 + wywołanego bodźcem świetlnym w transgenicznej linii myszy biosensora Ca2 + (HR2.1: TN-XL), która selektywnie wyraża bioczujnik Ca2 + TN-XL18 oparty na FRET w stożkach, pod ludzkim promotorem czerwonej opsyny HR2.119. Aby uzyskać dostęp do końcówek stożkowych, zastosowano preparat do plastrów ex-vivo 20. Protokół został już z powodzeniem zastosowany w trzech badaniach nad funkcją czopków u zdrowych myszy10,21,22. Ponadto protokół umożliwia badanie sygnalizacji stożkowej Ca2 + w określonych warunkach genetycznych, np. poprzez krzyżowanie modeli myszy pod kątem dziedzicznego zwyrodnienia siatkówki z myszami HR2.1: TN-XL.

<table><tbody><tr><td>Smar wysokopróżniowy</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td><a href="http://www.dowcorning.com/">http://www.dowcorning.com</a></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>R. Langenbrinck</td><td></td><td>24 x 60 mm; 

<a href="http://www.langenbrinck.com">http://www.langenbrinck.com</a></td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>R. Langenbrinck</td><td></td><td>76 x 26 mm; 
<a href="http://www.langenbrinck.com">http://www.langenbrinck.com</a></td></tr><tr><td>Ostrza do rozdrabniacza tkanek</td><td>MARTOR KG</td><td>ARGENTAX Nr 1044</td><td>0,25 mm; 

<a href="http://www.martor.de">http://www.martor.de</a></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz tkanek</td><td>Zbudowany</td><td></td><td>na zamówienie Na podstawie projektu F. Werblina23, zaadaptowanego przez T. Schuberta</td></tr><tr><td>Nitrocelulozowa membrana filtracyjna z siatką</td><td>Merck Millipore</td><td>AABG01300</td><td>Typ filtra: 0,8 &mikro; m;

<a href="http://www.emdmillipore.com">http://www.emdmillipore.com</a></td></tr><tr><td>Isoflurane CP</td><td>CP pharma</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td><a href="http://www.cp-pharma.de/">http://www.cp-pharma.de</a></td></tr><tr><td>UV/zielony stymulator pełnego pola oparty na diodach LED</td><td>Custom-build</td><td></td>, <td>aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz10</td></tr><tr><td>Płytka mikroprocesora Open source</td><td>Arduino</td><td></td><td><a href="http://www.arduino.cc/">http://www.arduino.cc</a></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania CfNT</td><td>Napisane</td><td></td> na zamówienie <td>opracowane przez Michaela M&uuml; ller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Niemcy</td></tr><tr><td>IgorPro</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td><a href="http://www.wavemetrics.com/">http://www.wavemetrics.com</a></td></tr><tr><td>VC3-4 System ogniskowy system perfuzyjny</td><td>ALA Instrument</td><td></td> naukowy <td>z 100 &mu; Kolektor końcówki o średnicy M; 

<a href="http://www.alascience.com/">http://www.alascience.com/</a></td></tr><tr><td>Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td><a href="http://www.spectra-physics.com/">http://www.spectra-physics.com</a></td></tr><tr><td>Ruchomy mikroskop obiektywowy (MOM), Zaprojektowany przez W. Denka, MPImF, Heidelberg, Niemcy</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td><a href="http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html">http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html</a></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>XLUMPlanFL 20X/0.95w</td><td>obiektyw Olympus</td><td></td><td><a href="http://www.olympusamerica.com/">http://www.olympusamerica.com</a></td></tr><tr><td>Vaporizer 100 series</td><td>Surgivet</td><td></td><td><a href="http://www.surgivet.com/ ">http://www.surgivet.com</a></td></tr><tr><td>Ionomycyna, Sól wapniowa</td><td>Life technologies</td><td>I24222</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/">https://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>101191250<a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Leica MZ95</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td><a href="http://www.leica-microsystems.com/">http://www.leica-microsystems.com/</a></td></tr></tbody></table>

obrazowanie dynamiki ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Fotoreceptory (czopki) stożków siatkówki służą do widzenia w świetle dziennym i są podstawą rozróżniania kolorów. Ulegają zwyrodnieniom, co często prowadzi do ślepoty w wielu chorobach siatkówki. Zaproponowano, że wapń (Ca2+), kluczowy drugi przekaźnik w sygnalizacji i metabolizmie fotoreceptorów, jest pośrednio związany ze zwyrodnieniem fotoreceptorów w różnych modelach zwierzęcych. Systematyczne badanie tych aspektów fizjologii i patofizjologii czopków było utrudnione ze względu na trudności w elektrycznym zapisie z tych małych komórek, w szczególności u myszy, gdzie siatkówka jest zdominowana przez fotoreceptory pręcikowe. Aby obejść ten problem, opracowaliśmy protokół obrazowania dwufotonowego Ca2 + przy użyciu transgenicznej linii myszy, która wyraża genetycznie kodowany bioczujnik Ca2 + TN-XL wyłącznie w czopkach i może być krzyżowany z modelami myszy w celu zwyrodnienia fotoreceptorów. Opisany tutaj protokół polega na przygotowaniu pionowych odcinków ("wycinków") siatkówki od myszy i obrazowaniu optycznym wywołanych bodźcem świetlnym zmian poziomu Ca2+ w czopkach. Protokół umożliwia również "pomiar w warstwie" bezwzględnych stężeń Ca2+; ponieważ po nagraniach można przeprowadzić kalibrację. Protokół ten umożliwia badania nad funkcjonalnymi właściwościami stożków i oczekuje się, że przyczyni się do zrozumienia sygnalizacji stożka Ca2 +, a także potencjalnego udziału Ca2 + w śmierci fotoreceptorów i zwyrodnieniu siatkówki.

Dzięki połączeniu przekrojów pionowych (Rysunek 1) przygotowanych z siatkówki myszy HR2.1:TN-XL z obrazowaniem dwufotonowym (Rysunek 2), możliwe było przeprowadzenie pomiarów ratiometrycznych sygnałów Ca2+ wywołanych bodźcem świetlnym w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopkowych. Podejście to stanowi znaczną poprawę w zakresie dostępu i wizualizacji czopków myszy w porównaniu do istniejących metod obrazowania optycznego z zastosowaniem syntetycznych wskaźników Ca2+ . Przykładowo, specyficzna dla czopków ekspresja genetycznie kodowanego ratiometrycznego biosensora Ca2+ TN-XL znacznie ułatwiła identyfikację zakończeń aksonów czopków (patrz. ROI na Rysunku 3A). W związku z tym nasz protokół eliminuje ryzyko rejestracji sygnałów o niejasnym pochodzeniu, takich jak na przykład sygnały „mieszane” z udziałem zakończeń aksonów zarówno czopków, jak i pręcików.
Nasze podejście pozwala na rozdzielenie odpowiedzi z pojedynczych prób na poziomie pojedynczych zakończeń aksonów czopków. Wywołana światłem ekstruzja Ca2+ z zakończenia czopka objawia się odpowiednio wzrostem fluorescencji donora i spadkiem fluorescencji akceptora (Rysunek 3B). Spadek stosunku fluorescencji (R) odpowiada ekstruzji Ca2+ z zakończenia czopka (Rysunek 3C), spowodowanej indukowaną światłem hiperpolaryzacją czopka i następującym po niej zamknięciem napięciowo zależnych kanałów Ca2+. Ponieważ można jednocześnie monitorować kilka zakończeń aksonów czopków (Rysunek 3A), akwizycja danych jest bardzo wydajna, a w ramach jednego eksperymentu można zebrać setki odpowiedzi Ca2+ w czopkach. Poprzez ilościową ocenę tych odpowiedzi (Rysunek 4), sygnały Ca2+ w czopkach mogą być porównywane i oceniane w różnych warunkach (patrz Dyskusja).
Często wystarczające jest zastosowanie stosunku fluorescencji akceptora FRET (cytryny) do donora (eCFP) (FA/FD; szczegóły w punkcie 3.4) jako wzglomnego pomiaru wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2+. Jednak w razie potrzeby stosunek ten można skalibrować, aby uzyskać bezwzględne stężenia wewnątrzkomórkowego Ca2+ ([Ca2+]) (Rycina 5). Przy oświetleniu tła zastosowanym w niniejszym protokole (szczegóły w przypisie10 oraz w legendzie do Ryciny 3), kalibracja pozwoliła oszacować bezwzględne spoczynkowe [Ca2+] w zakończeniach czopków myszy „dzikiego typu” HR2.1:TN-XL na 243 ± 159 nM (średnia ± S.D.), co mieści się w zakresie raportowanym dla myszy w literaturze11.
<img alt="Schemat cięcia siatkówki; przygotowanie skrawków siatkówki do mikroskopii; oznaczenia anatomiczne." src="/files/ftp_upload/52588/52588fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przygotowanie pionowych skrawków siatkówki. (A) Izolowana i spłaszczona siatkówka przygotowana do cięcia. (B) Prostokątny fragment siatkówki (patrz czerwona ramka w A) zamontowany na błonie z papieru filtracyjnego (ciemnoszara) po wykonaniu cięć. (C) Widok z góry na zamontowany na błonie skrawkek siatkówki, przymocowany do szkiełka nakrywkowego za pomocą smaru. (D) Schematycznie narysowany fragment skrawka siatkówki (patrz czerwona ramka w C). Fotoreceptory czopkowe zaznaczono na zielono. V, brzuszna; D, grzbietowa; N, nosowa; T, skroniowa; OS, segment zewnętrzny; ONL, zewnętrzna warstwa jądrowa; OPL, zewnętrzna warstwa splotowa; INL, wewnętrzna warstwa jądrowa; IPL, wewnętrzna warstwa splotowa; GCL, warstwa komórek zwojowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat układu mikroskopii fluorescencyjnej z laserem wzbudzającym i wycinkiem siatkówki w komorze perfuzyjnej." src="/files/ftp_upload/52588/52588fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Obrazowanie dwufotonowe wycinków siatkówki: Ilustracja konfiguracji pomiarowej. Góra: Obiektyw z imersją wodną skupiający wiązkę skanującego lasera (czerwona strzałka w dół) na siatkówce i zbierający emitowaną fluorescencję (strzałki w górę). Soczewka zbiera również przenikające światło podczerwone z diody LED do oświetlenia zamontowanej pod kondensorem podczas obrazowania wycinka za pomocą kamery CCD. Środek: Wycinek siatkówki zamontowany w komorze pomiarowej i perfundowany roztworem zewnątrzkomórkowym. Dół: Soczewka kondensora skupiająca światło z diod LED do stymulacji (oraz diody IR dla obrazowania kamerą CCD) przez przezrozyste dno komory pomiarowej do tkanki siatkówki. IR LED, dioda emitująca światło podczerwone; CCD, urządzenie ładunkowo-sprzężone; BP, filtr pasmowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres sygnałów fluorescencyjnych obrazowania wapnia; eCFP, citrine, analiza ROI, odpowiedź na intensywność światła." src="/files/ftp_upload/52588/52588fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reakcje Ca2+ wywołane światłem w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopkowych myszy. (A) Lewo: Rejestracje skupione na zakończeniach synaptycznych (czerwona ramka) fotoreceptorów czopkowych (zielone) w skrawkach siatkówki. Prawo: Przykład zarejestrowanego obszaru z 7 pojedynczymi zakończeniami. Fluorescencję rejestrowano za pomocą dwóch kanałów: jednego dla akceptora FRET citrine (góra; 535 BP 50) i jednego dla donora FRET eCFP (dół; 480 BP 32). (B) Wywołane światłem zmiany fluorescencji citrine (FA) i eCFP (FD) zarejestrowane w jednym ROI. (C) Odpowiedzi Ca2+ (jako stosunek FA/FD) zakończenia czopka na serię 1 s błysków jasnego światła w odstępach 5 s. ROI, obszar zainteresowania; BP, filtr pasmowy; F, intensywność fluorescencji; a.u., jednostki dowolne; FRET, Försterowski transfer energii rezonansowej; eCFP, ulepszone białko fluorescencyjne cyjanowe. Intensywność bodźca (jako szybkość fotoizomeryzacji w 103·P·s-1 na czopek): odpowiednio 13,0 i 12,8 dla opsyn M i S, dodane do poziomu tła (= wyłączone diody LED, skanowanie laserem wzbudzającym) wynoszącego ~10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza odpowiedzi na błysk; wykresy przedstawiające dynamikę sygnału optycznego ΔR oraz parametry czasowe." src="/files/ftp_upload/52588/52588fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4. Przykładowa analiza ilościowa odpowiedzi Ca2+ w czopkach wywołanych światłem. (A) Odpowiedzi Ca2+ wywołane światłem (jako ΔR) z pojedynczego zakończenia czopka (pojedyncze próby: ślad szary, n=16; średnia: ślad czarny). (B) Parametry określone dla średniej odpowiedzi Ca2+: spoczynkowy poziom Ca2+ (Rbase) reprezentujący linię bazową przed stymulacją światłem, wielkość odpowiedzi jako pole pod krzywą (RA) i amplituda szczytowa (Ramp), kinetyka narastania odpowiedzi (trise, odstęp czasu od 20% do 80% Ramp) i opadania (tdecay, odstęp czasu od 80% do 20% Ramp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić ten rysunek w większej wersji, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres przedstawiający stosunki spoczynkowej koncentracji wapnia z efektami traktowania EGTA i jonomycyną." src="/files/ftp_upload/52588/52588fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Szacowanie bezwzględnej koncentracji Ca2+ . Spoczynkowa koncentracja Ca2+ ([Ca2+], jako stosunek FA/FD) zarejestrowana w 8 zakończeniach aksonów stożkowych u myszy TN-XL (kółka, średnia ± S.D.) dla różnych roztworów zewnątrzkomórkowych: dwukrotnie w standardowym medium zewnątrzkomórkowym (Ctrl 1 i 2), następnie przy minimalnej („zerowej”) [Ca2+] (10 mM EGTA) oraz przy wysokiej [Ca2+] (2.5 mM); dwie ostatnie warunki z zastosowaniem 5 µM jonomycyny w celu wyrównania stężeń Ca2+ zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Opisujemy protokół monitorowania dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopków za pomocą preparatu ex-vivo siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji stożka Ca2 + w ważnym systemie modelowym ssaków, myszy.

Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja sygnałów wapniowych wywołanych bodźcem świetlnym w fotoreceptorach czopkowych siatkówki myszy przy użyciu fluorescencyjnego biosensora. Osiąga się to poprzez wyizolowanie siatkówki z transgeniczną linią myszy, która wykazuje ekspresję genetycznie kodowanego sensora wapnia wyłącznie w fotoreceptorach czopkowych. Drugim krokiem jest wykonanie pionowych przekrojów tkanki siatkówki.Następnie skrawki siatkówki montuje się na szkiełkach nakrywkowych i umieszcza pod mikroskopem dwufotonowym. Ostatnim krokiem jest rejestracja sygnałów wapniowych z poszczególnych zakończeń synaptycznych fotoreceptorów czopkowych w odpowiedzi na stymulację światłem. Ostatecznie zarejestrowane sygnały wapniowe są analizowane offline.Dzięki tej metodzie możemy jednocześnie rejestrować aktywność wielu receptorów pokarmowych kukurydzy z rozdzielczością podkomórkową. Jest to główna zaleta w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak elektryczne rejestracje z pojedynczych komórek, które są trudniejsze i bardziej czasochłonne. W związku z tym zagadnieniem, którym chcielibyśmy się zająć, jest to, czy i w jaki sposób wapń bierze udział w degeneracji fotoreceptorów.Metoda ta pozwala określić, czy napływ wapnia napędza degenerację fotoreceptorów, czy też jest on wynikiem obumierania komórki. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności głównie ze względu na konieczność zachowania światłoczułości siatkówki, przez co wszystkie delikatne etapy, w tym sekcja siatkówki i jej krojenie, muszą być przeprowadzane w czerwonym świetle. Aby rozpocząć procedurę, przenieś gałkę oczną myszy do szalki Petriego zawierającej świeżo nasycony węglanem tlenu roztwór pozakomórkowy.Przebij gałkę oczną w dowolnym punkcie na granicy rogówki i twardówki za pomocą ostrej igły wstrzyknięciowej. Następnie przytrzymaj oko za twardówkę pęsetą i delikatnie wprowadź jedno ostrze nożyczek do otworu. Przetnij wzdłuż ora serrata, aby oddzielić przednią część oka od kielicha oka.Następnie należy przeciąć czaszkę oczną promieniście w miejscu zaznaczenia pisakiem, aby wskazać pozycję grzbietową siatkówki. Następnie należy ustawić czaszkę oczną tak, aby cięcie grzbietowe było skierowane na zewnątrz. Chwyć twardówkę po lewej i prawej stronie czaszki ocznej, wprowadzając końcówki pęsety pomiędzy siatkówkę a twardówkę.Następnie odseparuj siatkówkę, delikatnie odchylając część twardówki iica. Na koniec przetnij nerw wzrokowy, aby uwolnić siatkówkę od twardówki. Przytrzymaj krawędź siatkówki pęsetą i delikatnie usuń z jej powierzchni zanieczyszczenia oraz ciało szkliste, używając drugiej pęsety.Po oczyszczeniu powierzchni siatkówki wykonaj trzy dodatkowe, krótsze cięcia radialne. Następnie powoli zanurz szkiełko przedmiotowe w roztworze pozakomórkowym w pobliżu tkanki. Delikatnie przeciągnij siatkówkę na szkiełko przedmiotowe stroną komórek zwojowych do góry, chwytając za krawędź, aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne i zwijanie się tkanki.Następnie, za pomocą zakrzywionego ostrza skalpela, wytnij prostokąt o wymiarach około jednego na dwa milimetry z wybranego obszaru siatkówki i usuń nadmiar roztworu wokół tkanki. Następnie umieść wcześniej przygotowaną membranę z włókien nitrocelulozowych na kawałku siatkówki w taki sposób, aby strona z komórkami zwojowymi przylegała do membrany. Natychmiast dodaj kroplę medium zewnątrzkomórkowego na membranę, aby mocno przytwierdzić do niej tkankę.Przenieś przymocowaną do błony tkankę siatkówki do komory do cięcia zawierającej świeży roztwór zewnątrzkomórkowy. Następnie przetnij siatkówkę na pionowe plastry o grubości 200 µm. Używając mikrotomu do tkanek, przyklej pojedynczy przymocowany do błony plaster do szkiełka podstawowego przygotowanego wcześniej za pomocą smaru próżniowego.Utrzymaj szklaną powierzchnię poniżej siatkówki i upewnij się, że jest wolna od tłuszczu. Następnie dodaj kroplę roztworu zewnątrzkomórkowego do każdego skrawka zamocowanego na szkiełku nakrywkowym w komorze holdingowej w temperaturze pokojowej. Wprowadź karbogen do komory poprzez napowietrzanie niewielkiego zbiornika z wodą, aby utrzymać w komorze holdingowej nawilżoną atmosferę.Pozostaw plastry w komorze oczekującej na 10 do 15 minut przed przenoszeniem ich pojedynczo do komory rejestracyjnej. Przenieś plaster z komory oczekującej do komory rejestracyjnej i natychmiast rozpocznij jego perfuzję nasyconym węglanem roztworem pozakomórkowym. Utrzymuj szybkość przepływu perfuzji na poziomie 2 ml/min oraz temperaturę 37 °C.W komorze rejestracyjnej. Należy użyć obiektywu imersyjnego z wodą 20 x 0,95 NA oraz kamery CCD w połączeniu z diodą LED emitującą podczerwień, umieszczoną pod komorą rejestracyjną. Aby zlokalizować przekrój siatkówki, należy uruchomić system obrazowania dwufotonowego zgodnie z instrukcją producenta.Następnie włącz laser i ustaw go na 860 nanometrów. Włącz dwa kanały detekcji do obrazowania fluorescencyjnego ECFP i cytryny. Następnie, korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazu, steruj mikroskopem dwufotonowym, aby zeskanować i wybrać rząd zakończeń czopków do rejestracji; ustaw akwizycję obrazu na obrazy o rozmiarach 128 na 16 pikseli lub podobną konfigurację, ograniczając skanowany obszar do zakończeń czopków, aby uniknąć blaknięcia fotopigmentów w segmentach zewnętrznych.Włącz laser. Pozostaw czopki na 20 do 30 sekund, aby zaadaptowały się do lasera skanującego oraz tła świetlnego stymulacji, przed podaniem bodźców świetlnych lub zastosowaniem czynników farmakologicznych. Następnie rozpocznij prezentację wybranych bodźców.Bodźce są generowane poprzez modulację intensywności dwóch diod LED w czasie, przy użyciu płytki z mikroprocesorem sterowanej przez dedykowane oprogramowanie. Następnie rozpoczyna się jednoczesny zapis dwóch kanałów fluorescencji przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do akwizycji obrazu. Rejestracje skupiały się na zakończeniach synaptycznych fotoreceptorów czopkowych w skrawkach siatkówki.Jest to przykład zarejestrowanego obszaru z siedmioma poszczególnymi terminalami. Fluorescencję zarejestrowano przy użyciu dwóch kanałów: jednego dla fre scepter citrine oraz jednego dla fret donor.ECFP. Przedstawione tutaj zmiany fluorescencji citrine i ECFP wywołane światłem zostały zarejestrowane w pojedynczym obszarze zainteresowania.Oto odpowiedzi wapniowe zakończenia czopka na serię jednosekundowych błysków jasnego światła w odstępach pięciosekundowych. Rysunek ten przedstawia przykładową analizę ilościową wywołanych światłem odpowiedzi wapniowych czopka. A tutaj znajdują się wywołane światłem odpowiedzi wapniowe z pojedynczego zakończenia czopka.Na tej ilustracji przedstawiono wyznaczenie średniej odpowiedzi wapniowej. Poziom wapnia spoczynkowego reprezentuje linię bazową przed stymulacją światłem, a wielkość odpowiedzi ra to pole powierzchni pomiędzy poziomem wapnia spoczynkowego a amplitudą szczytową, ograniczoną kinetyką początku i końca odpowiedzi. Procedurę tę można dalej rozszerzyć.Na przykład sygnały wapniowe fotoreceptorów mogą być znacznie silniejsze w różnych warunkach farmakologicznych oraz przy intensywnej stymulacji, co pozwala badać takie zjawiska jak adaptacja lub szczegółowo analizować poszczególne etapy fototransdukcji. Ta technika umożliwia badanie dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopkowych w normalnych warunkach fizjologicznych. Jest to szczególnie istotne dla zrozumienia pierwotnej i wtórnej degeneracji fotoreceptorów czopkowych w przebiegu chorób prowadzących do ślepoty u ludzi, takich jak achromatopsja czy retinitis pigmentosa.

imaging-ca2-dynamics-cone-photoreceptor-axon-terminals-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopków w siatkówce mysi

Przedstawimy sposób rejestracji odpowiedzi na błysk z pojedynczych czopków mysich przy użyciu elektrody ssącej.

Rejestracje metodą ssania z pojedynczych komórek fotoreceptorów czopkowych myszy

Opisujemy stosunkowo prostą metodę rejestracji transretinalnego elektroretinogramu (ERG) w celu uzyskania odpowiedzi fotoreceptorowych pręcików i czopków z nienaruszonej siatkówki myszy. Podejście to wykorzystuje blokadę przekaźnictwa synaptycznego z fotoreceptorów w celu wyizolowania ich odpowiedzi na światło i zarejestrowania ich za pomocą elektrod polowych umieszczonych w poprzek wyizolowanej, rozłożonej płasko siatkówki.

Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Źródło: Wang, Z., et al. Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy.  J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia technikę obrazowania siatkówki in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Znieczulone myszy są przygotowywane do obrazowania poprzez zabezpieczenie głowy, nałożenie lubrykantu do oczu i umieszczenie szkiełka nakrywkowego na oku. Komórki zwojowe siatkówki (RGC) eksprymujące białka fluorescencyjne są najpierw wizualizowane za pomocą epifluorescencji w celu...

Dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Źródło: Kulkarni, M. et al. Obrazowanie ca2+ Dynamika w stożku fotoreceptorów zakończeń aksonów siatkówki myszy. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków transgenicznej siatkówki myszy. Przedstawiono w nim etapy przygotowania wycinków siatkówki, obrazowania biosensorów wapnia opartych na FRET oraz analizy zmian fluorescencji w celu ilościowego określenia poziomu wapnia przy oświetleniu tła i...

Mikroskopia dwufotonowa do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków siatkówki myszy

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Badanie to przedstawia podejście in vivo do obrazowania dwufotonowego do wizualizacji struktur niskoprogowych zakończeń aksonów mechanoreceptorów (LTMR) w skórze przedniej łapy myszy. Wykorzystując powtarzalne, wysokorozdzielcze obrazowanie poszczególnych aksonów, metoda ta stanowi nową platformę do badania struktury i funkcji skórnego obwodu czuciowego podczas rozwoju oraz u dorosłych.

Dwufotonowe obrazowanie wewnątrzżyciowe morfologii aksonów dotykowych u skóry myszy

Poznaj metodę obrazowania dynamiki Ca²⁺ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Technika ta umożliwia badanie sygnalizacji wapniowej w modelu ssaczym.

Obrazowanie dynamiki Ca²⁺ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy

Przeglądaj więcej filmów