Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy
6 maja 2015
Opisujemy protokół monitorowania dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopków za pomocą preparatu ex-vivo siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji stożka Ca2 + w ważnym systemie modelowym ssaków, myszy.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja sygnałów wapniowych wywołanych bodźcem świetlnym w fotoreceptorach czopkowych siatkówki myszy przy użyciu fluorescencyjnego biosensora. Osiąga się to poprzez wyizolowanie siatkówki z transgeniczną linią myszy, która wykazuje ekspresję genetycznie kodowanego sensora wapnia wyłącznie w fotoreceptorach czopkowych. Drugim krokiem jest wykonanie pionowych przekrojów tkanki siatkówki.
Następnie skrawki siatkówki montuje się na szkiełkach nakrywkowych i umieszcza pod mikroskopem dwufotonowym. Ostatnim krokiem jest rejestracja sygnałów wapniowych z poszczególnych zakończeń synaptycznych fotoreceptorów czopkowych w odpowiedzi na stymulację światłem. Ostatecznie zarejestrowane sygnały wapniowe są analizowane offline.
Dzięki tej metodzie możemy jednocześnie rejestrować aktywność wielu receptorów pokarmowych kukurydzy z rozdzielczością podkomórkową. Jest to główna zaleta w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak elektryczne rejestracje z pojedynczych komórek, które są trudniejsze i bardziej czasochłonne. W związku z tym zagadnieniem, którym chcielibyśmy się zająć, jest to, czy i w jaki sposób wapń bierze udział w degeneracji fotoreceptorów.
Metoda ta pozwala określić, czy napływ wapnia napędza degenerację fotoreceptorów, czy też jest on wynikiem obumierania komórki. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności głównie ze względu na konieczność zachowania światłoczułości siatkówki, przez co wszystkie delikatne etapy, w tym sekcja siatkówki i jej krojenie, muszą być przeprowadzane w czerwonym świetle. Aby rozpocząć procedurę, przenieś gałkę oczną myszy do szalki Petriego zawierającej świeżo nasycony węglanem tlenu roztwór pozakomórkowy.
Przebij gałkę oczną w dowolnym punkcie na granicy rogówki i twardówki za pomocą ostrej igły wstrzyknięciowej. Następnie przytrzymaj oko za twardówkę pęsetą i delikatnie wprowadź jedno ostrze nożyczek do otworu. Przetnij wzdłuż ora serrata, aby oddzielić przednią część oka od kielicha oka.
Następnie należy przeciąć czaszkę oczną promieniście w miejscu zaznaczenia pisakiem, aby wskazać pozycję grzbietową siatkówki. Następnie należy ustawić czaszkę oczną tak, aby cięcie grzbietowe było skierowane na zewnątrz. Chwyć twardówkę po lewej i prawej stronie czaszki ocznej, wprowadzając końcówki pęsety pomiędzy siatkówkę a twardówkę.
Następnie odseparuj siatkówkę, delikatnie odchylając część twardówki iica. Na koniec przetnij nerw wzrokowy, aby uwolnić siatkówkę od twardówki. Przytrzymaj krawędź siatkówki pęsetą i delikatnie usuń z jej powierzchni zanieczyszczenia oraz ciało szkliste, używając drugiej pęsety.
Po oczyszczeniu powierzchni siatkówki wykonaj trzy dodatkowe, krótsze cięcia radialne. Następnie powoli zanurz szkiełko przedmiotowe w roztworze pozakomórkowym w pobliżu tkanki. Delikatnie przeciągnij siatkówkę na szkiełko przedmiotowe stroną komórek zwojowych do góry, chwytając za krawędź, aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne i zwijanie się tkanki.
Następnie, za pomocą zakrzywionego ostrza skalpela, wytnij prostokąt o wymiarach około jednego na dwa milimetry z wybranego obszaru siatkówki i usuń nadmiar roztworu wokół tkanki. Następnie umieść wcześniej przygotowaną membranę z włókien nitrocelulozowych na kawałku siatkówki w taki sposób, aby strona z komórkami zwojowymi przylegała do membrany. Natychmiast dodaj kroplę medium zewnątrzkomórkowego na membranę, aby mocno przytwierdzić do niej tkankę.
Przenieś przymocowaną do błony tkankę siatkówki do komory do cięcia zawierającej świeży roztwór zewnątrzkomórkowy. Następnie przetnij siatkówkę na pionowe plastry o grubości 200 µm. Używając mikrotomu do tkanek, przyklej pojedynczy przymocowany do błony plaster do szkiełka podstawowego przygotowanego wcześniej za pomocą smaru próżniowego.
Utrzymaj szklaną powierzchnię poniżej siatkówki i upewnij się, że jest wolna od tłuszczu. Następnie dodaj kroplę roztworu zewnątrzkomórkowego do każdego skrawka zamocowanego na szkiełku nakrywkowym w komorze holdingowej w temperaturze pokojowej. Wprowadź karbogen do komory poprzez napowietrzanie niewielkiego zbiornika z wodą, aby utrzymać w komorze holdingowej nawilżoną atmosferę.
Pozostaw plastry w komorze oczekującej na 10 do 15 minut przed przenoszeniem ich pojedynczo do komory rejestracyjnej. Przenieś plaster z komory oczekującej do komory rejestracyjnej i natychmiast rozpocznij jego perfuzję nasyconym węglanem roztworem pozakomórkowym. Utrzymuj szybkość przepływu perfuzji na poziomie 2 ml/min oraz temperaturę 37 °C.
W komorze rejestracyjnej. Należy użyć obiektywu imersyjnego z wodą 20 x 0,95 NA oraz kamery CCD w połączeniu z diodą LED emitującą podczerwień, umieszczoną pod komorą rejestracyjną. Aby zlokalizować przekrój siatkówki, należy uruchomić system obrazowania dwufotonowego zgodnie z instrukcją producenta.
Następnie włącz laser i ustaw go na 860 nanometrów. Włącz dwa kanały detekcji do obrazowania fluorescencyjnego ECFP i cytryny. Następnie, korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazu, steruj mikroskopem dwufotonowym, aby zeskanować i wybrać rząd zakończeń czopków do rejestracji; ustaw akwizycję obrazu na obrazy o rozmiarach 128 na 16 pikseli lub podobną konfigurację, ograniczając skanowany obszar do zakończeń czopków, aby uniknąć blaknięcia fotopigmentów w segmentach zewnętrznych.
Włącz laser. Pozostaw czopki na 20 do 30 sekund, aby zaadaptowały się do lasera skanującego oraz tła świetlnego stymulacji, przed podaniem bodźców świetlnych lub zastosowaniem czynników farmakologicznych. Następnie rozpocznij prezentację wybranych bodźców.
Bodźce są generowane poprzez modulację intensywności dwóch diod LED w czasie, przy użyciu płytki z mikroprocesorem sterowanej przez dedykowane oprogramowanie. Następnie rozpoczyna się jednoczesny zapis dwóch kanałów fluorescencji przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do akwizycji obrazu. Rejestracje skupiały się na zakończeniach synaptycznych fotoreceptorów czopkowych w skrawkach siatkówki.
Jest to przykład zarejestrowanego obszaru z siedmioma poszczególnymi terminalami. Fluorescencję zarejestrowano przy użyciu dwóch kanałów: jednego dla fre scepter citrine oraz jednego dla fret donor.ECFP. Przedstawione tutaj zmiany fluorescencji citrine i ECFP wywołane światłem zostały zarejestrowane w pojedynczym obszarze zainteresowania.
Oto odpowiedzi wapniowe zakończenia czopka na serię jednosekundowych błysków jasnego światła w odstępach pięciosekundowych. Rysunek ten przedstawia przykładową analizę ilościową wywołanych światłem odpowiedzi wapniowych czopka. A tutaj znajdują się wywołane światłem odpowiedzi wapniowe z pojedynczego zakończenia czopka.
Na tej ilustracji przedstawiono wyznaczenie średniej odpowiedzi wapniowej. Poziom wapnia spoczynkowego reprezentuje linię bazową przed stymulacją światłem, a wielkość odpowiedzi ra to pole powierzchni pomiędzy poziomem wapnia spoczynkowego a amplitudą szczytową, ograniczoną kinetyką początku i końca odpowiedzi. Procedurę tę można dalej rozszerzyć.
Na przykład sygnały wapniowe fotoreceptorów mogą być znacznie silniejsze w różnych warunkach farmakologicznych oraz przy intensywnej stymulacji, co pozwala badać takie zjawiska jak adaptacja lub szczegółowo analizować poszczególne etapy fototransdukcji. Ta technika umożliwia badanie dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopkowych w normalnych warunkach fizjologicznych. Jest to szczególnie istotne dla zrozumienia pierwotnej i wtórnej degeneracji fotoreceptorów czopkowych w przebiegu chorób prowadzących do ślepoty u ludzi, takich jak achromatopsja czy retinitis pigmentosa.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół monitorowania dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopkowych z wykorzystaniem preparatów ex-vivo wycinków siatkówki mysiej. Metoda ta umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji Ca2+ w czopkach w ssaczym modelu badawczym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Funkcje fotoreceptorów
Wstęp
- Sygnalizacja wapniowa jest kluczowa dla funkcjonowania fotoreceptorów.
- Zrozumienie dynamiki Ca2+ może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów degeneracji fotoreceptorów.
- Istniejące techniki badania tej dynamiki są często złożone i czasochłonne.
- Celem niniejszego protokołu jest uproszczenie tego procesu przy jednoczesnym zapewnieniu danych o wysokiej rozdzielczości.
Cel badania
- W celu rejestracji wywołanych światłem sygnałów wapniowych w fotoreceptorach czopkowych.
- W celu zbadania roli wapnia w degeneracji fotoreceptorów.
- W celu umożliwienia jednoczesnej rejestracji sygnałów z wielu zakończeń czopków z rozdzielczością subkomórkową.
Zastosowane metody
- Izolacja siatkówki z myszy transgenicznej wykazującej ekspresję genetycznie kodowanego sensora wapnia.
- Przygotowanie pionowych przekrojów tkanki siatkówki.
- Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania sygnałów wapniowych.
- Analiza odpowiedzi wapniowych na bodźce świetlne.
Główne wyniki
- Pomyślna rejestracja dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopkowych.
- Wykazanie możliwości analizy odpowiedzi wapniowej na różne bodźce świetlne.
- Przedstawienie spostrzeżeń na temat związku między napływem wapnia a kondycją fotoreceptorów.
- Wskazanie zalet tej metody w porównaniu z technikami tradycyjnymi.
Wnioski
- Niniejszy protokół oferuje niezawodną metodę badania dynamiki Ca2+ w fotoreceptorach czopkowych.
- Umożliwia on badanie roli wapnia w degeneracji fotoreceptorów.
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie mechanizmów sygnalizacji siatkówkowej.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Ilościowe obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopkowych pozwala wypełnić istotną lukę w zrozumieniu mechanizmów degradacji siatkówki. Niniejszy protokół umożliwia wysokorozdzielczy, multipleksowy pomiar odpowiedzi Ca2+ wywołanych bodźcem, co zwiększa pewność predykcyjną w procesie walidacji celów w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Podejście to ma na celu wsparcie wczesnego etapu odkryć oraz strategii translacyjnych w ramach projektów przywracania wzroku.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Umożliwia badanie zależnych od Ca2+ szlaków sygnałowych zaangażowanych w degenerację fotoreceptorów.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez odróżnianie przyczynowego od wtórnego napływu Ca2+ w modelach chorób.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w genetycznie modyfikowanych liniach myszy istotnych dla ludzkich schorzeń siatkówki.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system ex vivo do ilościowych i powtarzalnych odczytów Ca2+ w terminalach czopków.
- Umożliwia standaryzację i skalowalność testów w celu przesiewowego badania związków lub modyfikatorów genetycznych.
- Dostarcza danych o rozdzielczości subkomórkowej, co pozwala na wiarygodną ocenę potencjalnych interwencji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla badanych chorób w zakresie analizy mechanizmów pierwotnej i wtórnej degeneracji czopków.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną, umożliwiając krzyżowanie z modelami degeneracyjnymi.
- Oferuje wartość prognostyczną dla rozwoju translacyjnych biomarkerów w procesach badawczych nad chorobami siatkówki.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół obrazowania integruje się z kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, łącząc studia mechanistyczne z badaniami translacyjnymi w zakresie chorób siatkówki.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie zmian stężenia Ca2+ wywołanych bodźcem w celu wyjaśnienia szlaków sygnałowych fotoreceptorów oraz czynników wyzwalających ich degenerację.
- Przesiewanie: Ustalanie powtarzalnych, ilościowych punktów końcowych do oceny interwencji farmakologicznych lub genetycznych.
- Analityka: Dostarczanie pomiarów bezwzględnych i względnych stężeń Ca2+ dla rzetelnego porównania statystycznego między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Umożliwienie dopasowania do modeli chorobowych oraz wsparcie rozwoju strategii biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji do różnych modeli mysich i warunków eksperymentalnych w celu szerokiego zastosowania w badaniach i rozwoju (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz zrozumienie mechanizmów degeneracji siatkówki.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne schematy obrazowania dla porównywalności międzybadawczej.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach programów przywracania wzroku.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów i interwencji w potokach badawczych nad neurodegeneracją w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w preparatyce siatkówki, mikroskopii dwufotonowej oraz pracy z genetycznie kodowanymi biosensorami.
- Wymaga specjalistycznego sprzętu obrazowego oraz infrastruktury do analizy fluorescencji.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Metoda jest możliwa do zastosowania w różnych modelach mysich, lecz wrażliwa na sposób obchodzenia się z tkanką oraz warunki ekspozycji na światło.
- Zależna od dostępności linii transgenicznych oraz protokołów kalibracji dla bezwzględnego oznaczania ilości Ca2+.
