Wizualizacja Streptococcus pneumoniae w obrębie mikrouszkodzeń serca i późniejsza przebudowa serca

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zademonstrowanie powtarzalnego protokołu tworzenia mikrouszkodzeń serca ESMO w sercu zakażonych myszy. Osiąga się to poprzez zakażenie myszy ESMO i umożliwienie rozwoju bakteriemii, dając w ten sposób bakteriom dostęp do układu naczyniowego serca, gdzie mogą zaatakować mięsień sercowy i tworzyć mikroskopijne zmiany. Następnie serca są albo parafinowe, zatopione i barwione konwencjonalnie, albo utrwalone w związku OCT w celu barwienia immunofluorescencyjnego.

Ocena barwionych skrawków może wykazać mikrouszkodzenia serca losowo rozmieszczone w osadach kolagenu mięśnia sercowego i rekonwalescencyjne odcinki serca i kapsułki pneumokokowe w obrębie mikrouszkodzenia serca Demonstrując procedurę. Czy Armand Brown jest doktorantem w moim laboratorium? Chociaż ta metoda może dostarczyć wglądu w niszczące serce skutki zapalenia płuc typu S podczas inwazyjnej choroby pneumokokowej u myszy.

Może być również stosowany do próbek sercowych z innych układów, takich jak naczelne lub ludzie. Zacznij od wyhodowania ESMO Serotype Four szczepu Tiger four w bulionie Todda Hewitta do gęstości optycznej 0,5 przy 620 nanometrach. Przy odpowiedniej gęstości osadzać kulturę w ilości 3 500 G przez 10 minut.

Następnie usuń supernatant za pomocą linii próżniowej i ponownie zawieś bakterie sterylnym PBS w ilości 10 000 jednostek tworzących kolonie na mililitr. Teraz znieczulone 10 do 12 tygodniowe myszy z zastawką C i potwierdź ich stan znieczulenia delikatnym szczypnięciem palca u nogi za pomocą pęsety, strzykawki lotosowej z zawiesiną bakteryjną i przymocuj igłę o rozmiarze od 27 do 30. Następnie chwyć znieczuloną mysz jedną ręką za kark, podczas gdy dootrzewnowo wstrzyknij 100 mikrolitrów zawiesiny drugą ręką, umieść każdą mysz z powrotem w klatce.

Myszy zazwyczaj budzą się 30 do 40 sekund po wstrzyknięciu. Uzyskanie prawidłowej dawki S zapalenia płuc ma kluczowe znaczenie, w przeciwnym razie myszy mogą wyzdrowieć z infekcji lub zbyt szybko dojdą do inwazyjnej choroby pneumokokowej, aby rozwinęły się zmiany. Ponieważ każdy szczep bakteryjny ma inny poziom soczewki usznej, określenie właściwej dawki może wymagać prób i błędów.

Pozwól, aby infekcja postępowała przez co najmniej 24 godziny do wczesnego stadium lub do 30 godzin w przypadku infekcji w zaawansowanym stadium. Później poddaj eutanazji każdą zainfekowaną mysz. Najpierw pobierz próbkę krwi, zdezynfekuj ogon wacikiem nasączonym alkoholem i odetnij odcinek o długości od dwóch do trzech milimetrów.

Zbierz dwa mikrolitry krwi z miejsca wycinka. Seryjnie rozcieńczyć krew dziesięciokrotnie w PBS zawierającym heparynę sodową w jednej jednostce na mililitr. Umieść pięć poziomów rozcieńczeń na tryptykach z krwią sojową na płytkach agarowych i inkubuj je przez noc.

Następnego dnia weź liczenie kolonii. Kontynuuj zbieranie serca zgodnie z opisem w następnej sekcji. Alternatywnie, 30 godzin po zakażeniu.

Spróbuj uratować mysz, podając ampicylinę międzyotrzewnową w 100 mikrolitrach soli fizjologicznej. Kontynuuj podawanie ampicyliny co 12 godzin przez 36 godzin i zbieraj serca w żądanych punktach czasowych. Najpierw zbierz serce.

Unieruchomij unieruchomioną mysz w pozycji leżącej na plecach na platformie operacyjnej, spryskaj klatkę piersiową 70% etanolem i osusz. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy otwórz jamę klatki piersiowej. Usuń klatkę piersiową i przetnij przeponę, aby odsłonić serce i płuca.

Następnie przetnij naczynia krwionośne połączone z sercem i użyj kleszczy, aby delikatnie wyciąć serce bez siniaków. Opłucz serce PBS i umieść je w kasecie do pobierania próbek tkanek w celu przekroju koronalnego. Następnie przenieś kasety do 10% buforowanego roztworu formaliny, a następnego dnia wyślij do zatopienia w parafinie.

We wczesnych stadiach zmiany w sercu można rozpoznać po zmianie koloru, wyglądzie, a w niektórych przypadkach po obecności komórek odpornościowych. W zaawansowanych zmianach chorobowych komórki odpornościowe będą nieobecne i duże. W ich miejscu znajdują się zmiany podobne do VA.

Używając pięciomikronowego odcinka serca na dodatnio naładowanych szkiełkach szklanych, najpierw zamroź sekcje, a następnie rozmroź je i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Utrwal szkiełka w 10% neutralnej buforowanej forminie na 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie usuń utrwalacz za pomocą trzech prań i PBS przez pięć minut na pranie.

Następnie przepuszczalnie tkankę za pomocą 0,2% tritton X 100 w PBS przez 15 minut. Usuń detergent przez trzy kolejne prania w prostym PBS. Następnie zablokuj tkankę 10% surowicą w PBS na godzinę po spłukaniu w PBS, przykryj fragment surowicą antysurowicę na dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Traktuj kontrole ujemne naiwną surowicą królika Ponieważ tkanka serca łatwo wchłania barwnik immunofluorescencyjny XI, co prowadzi do wysokich poziomów tła, stężenie w czasie inkubacji dla różnych typów przeciwciał prawdopodobnie będzie musiało zostać zoptymalizowane Dwie godziny później zmyj surowicę antys PBS. Następnie zastąp roztwór przeciwciałem drugorzędowym i pozwól szkiełkom inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Teraz zastosuj DPI na poziomie pięciu miligramów na mililitr i umyj szkiełka PBS.

Na koniec zamontuj szkiełka w podłodze, zapisz je i zobrazuj za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zacznij od usunięcia parafiny i nawilżenia skrawków tkanki. Stosować płukanie ksylenem, a następnie stopniowaną serię płukań alkoholowych.

Następnie wykąp skrawki w 0,2% kwasie fosfometycznym przez pięć minut, a następnie spłucz wodą przez pięć minut następną plamę 0,1% poważnym kwasem czerwonym i rynowym przez dwie godziny. Następnie umyj skrawki w 0,01 zwykłym kwasie solnym przez trzy minuty i płucz je w 70% etanolu przez minutę. Teraz odwodnić skrawki, odwracając stopniowaną serię kąpieli alkoholowych, a następnie przemyć ksylenem za pomocą mikroskopu świetlnego i ocenić szkiełka.

Myszy rozwinęły inwazyjną chorobę pneumokokową po wyzwaniu z tygrysem. W komorach zaobserwowano cztery mikrouszkodzenia serca szczepu, a między 24 a 30 godzinami po zakażeniu odnotowano wzrost wielkości i liczby zmian, aby sprawdzić, czy zapalenie płuc rzeczywiście znajduje się w obrębie zmian. Skrawki wybarwiono pod kątem serotypu czterotorebkowego polisacharydu wytwarzanego przez Tiger four.

Potwierdziło to obecność ciasno upakowanych i gęstych agregatów w miejscach mikrouszkodzeń. Poważne czerwone barwienie Piro przeprowadzono na wycinkach serca myszy uratowanych za pomocą ampicyliny i niezakażonych kontrol. W akcjach ratowniczych.

Nastąpił dramatyczny wzrost obecności i intensywności plamy z pasmami wypływającymi z tego, co wydaje się być dawnymi miejscami zmian w komorach. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zarazić myszy wystarczającą ilością zapalenia płuc typu S, aby infekcja mogła postępować przez co najmniej 28 do 30 godzin, aby bakteriemia i mikrouszkodzenia serca miały wystarczająco dużo czasu na uformowanie się.