Wizualizacja Streptococcus pneumoniae w obrębie mikrouszkodzeń serca i późniejsza przebudowa serca

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zaprezentowanie powtarzalnego protokołu tworzenia mikrozniszczeń serca wywołanych przez ESMO w sercach zakażonych myszy. Osiąga się to poprzez zakażenie myszy ESMO i dopuszczenie do rozwoju bakteriemii, co umożliwia bakteriom dostęp do naczyń krwionośnych serca, gdzie mogą one nacieknąć mięsień sercowy i tworzyć mikroskopijne zmiany. Następnie serca są albo zatapiane w parafinie i barwione w sposób konwencjonalny, albo utrwalane w związku OCT w celu przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego.

Ocena barwionych przekrojów może wykazać mikrourazy serca rozproszone losowo w mięśniu sercowym, złogi kolagenu, przekroje mięśnia sercowego w fazie rekonwalescencji oraz kapsułki pneumokokowe w obrębie mikrourazów serca, co demonstruje procedurę. Armand Brown jest studentem studiów magisterskich w moim laboratorium. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat niszczycielskiego wpływu S. pneumoniae na serce podczas inwazyjnej choroby pneumokokowej u myszy.

Metodę tę można również zastosować do próbek serca z innych układów, takich jak naczelne lub ludzie. Należy rozpocząć od hodowli szczepu ESMO Serotype four Tiger four w pożywce Todd Hewitt do uzyskania gęstości optycznej 0,5 przy 620 nm. Po osiągnięciu odpowiedniej gęstości kulturę należy odwirować przy 3 500 G przez 10 minut.

Następnie usunąć supernatant za pomocą linii próżniowej i resuspender bakterie w sterylnym PBS do stężenia 10 000 jednostek tworzących kolonie na mililitr. Następnie zanestezjować myszy Valve C w wieku od 10 do 12 tygodni i potwierdzić stan znieczulenia, delikatnie uciskając palec stopy tępą pęsetą. Nabrać do strzykawki zawiesinę bakteryjną i założyć igłę o rozmiarze od 27 do 30 G. Następnie chwycić znieczuloną mysz za kark jedną ręką, podczas gdy drugą ręką wstrzyknąć 100 µL zawiesiny drogą dostępu dootrzewnowego. Umieścić każdą mysz z powrotem w klatce.

Myszy zazwyczaj budzą się od 30 do 40 sekund po iniekcji. Precyzyjne dobranie dawki S. pneumoniae jest kluczowe, w przeciwnym razie myszy mogą wyzdrowieć z infekcji lub zbyt szybko rozwinąć inwazyjną chorobę pneumokokową, co uniemożliwi powstanie zmian chorobowych. Ponieważ każdy szczep bakteryjny charakteryzuje się inną zjadliwością, ustalenie właściwej dawki może wymagać metody prób i błędów.

Pozostaw infekcję do rozwinięcia się przez co najmniej 24 godziny dla wczesnego stadium lub do 30 godzin dla stadium zaawansowanego. Następnie przeprowadź eutanazję każdej zainfekowanej myszy. W pierwszej kolejności pobierz próbkę krwi: zdezynfekuj ogon za pomocą gazika nasączonego alkoholem i odetnij odcinek o długości od dwóch do trzech milimetrów.

Pobrać 2 µL krwi z miejsca nacięcia. Krew rozcieńczyć seryjnie dziesięciokrotnie w PBS zawierającym heparynę sodową w stężeniu 1 U/mL. Pięć poziomów rozcieńczeń wysiać na płytki z agarem sojowo-krwiowym (triptic soy blood agar) i inkubować przez noc.

Następnego dnia należy przeprowadzić zliczenie kolonii. Następnie przystąpić do pobrania serca zgodnie z opisem w kolejnej sekcji. Alternatywnie, 30 godzin po zakażeniu.

Podjęto próbę ratowania myszy poprzez podanie ampicyliny drogą doszpczewną w 100 µL soli fizjologicznej. Kontynuowano podawanie ampicyliny co 12 godzin przez 36 godzin, a następnie pobrano serca w wybranych punktach czasowych. W pierwszej kolejności wykonano pobranie serca.

Utrwalonego po eutanazji myszy ułóż na platformie chirurgicznej w pozycji grzbietowej, a klatkę piersiową spryskaj 70% ethanol i osusz. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęset otwórz jamę klatki piersiowej. Usuń klatkę piersiową i przetnij przeponę, aby odsłonić serce i płuca.

Następnie należy przeciąć naczynia krwionośne połączone z sercem i za pomocą pęsety delikatnie wyciąć serce, unikając jego uszkodzenia. Serce należy przepłukać w PBS i umieścić w kasecie do pobierania próbek tkanek w celu wykonania przekrojów czołowych. Następnie kasety przenosi się do 10% buforowanego roztworu formaliny, a następnego dnia przekazuje do zatopienia w parafinie.

W wczesnych stadiach zmiany w sercu można zidentyfikować po zmianie ich wyglądu kolorystycznego, a w niektórych przypadkach po obecności komórek odpornościowych. W zaawansowanych zmianach komórki odpornościowe nie występują i są duże. W ich miejsce pojawiają się zmiany przypominające VA.

Używając pięciomikronowych przekrojów serca na szkiełkach przedmiotowych dodatnio naładowanych, najpierw zamrozić przekroje, następnie je rozmrozić i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Utrwalić preparaty w 10% neutralnym buforowanym formalinie przez 10 minut w temperaturze 25°C. Następnie usunąć utrwalacz poprzez trzy przemycia w PBS, po pięć minut każde.

Następnie przeprowadź permeabilizację tkanki w 0,2% tritton X 100 w PBS przez 15 minut. Usuń detergent, wykonując trzy kolejne przemycia w samym PBS. Następnie zablokuj tkankę, stosując 10% serum w PBS przez godzinę; po przemyciu w PBS pokryj preparat przeciwciałem wtórnym na dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Kontrole negatywne traktuj naiwnym antyserum króliczym. Ponieważ tkanka serca łatwo absorbuje barwnik immunofluorescencyjny XI, co prowadzi do wysokiego poziomu tła, stężenie oraz czas inkubacji dla różnych typów przeciwciał będą prawdopodobnie wymagały optymalizacji. Po dwóch godzinach wypłucz antyserum przy użyciu PBS. Następnie zastąp roztwór przeciwciałem wtórnym i inkubuj preparaty w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Teraz zastosuj DPI w stężeniu 5 mg/mL i wypłucz preparaty za pomocą PBS.

Na koniec przygotuj preparaty na szkiełkach, zapisz je i obrazuj za pomocą mikroskopii konfokalnej. Rozpocznij od usunięcia parafiny i nawodnienia przekrojów tkankowych. Przeprowadź płukanie ksylenem, a następnie zastosuj szereg płukań w alkoholach o malejącym stężeniu.

Następnie należy zanurzyć przekroje w 0,2% kwasie fosfomolybdenowym na pięć minut, a następnie płukać w wodzie przez pięć minut; kolejnie barwić 0,1% sirianinę czerwona i kwasem pikrykowym przez dwie godziny. Następnie należy przemyć przekroje 0,01 N kwasem solnym przez trzy minuty i płukać w 70% etanolu przez minutę. Teraz należy odwodnić przekroje, stosując odwróconą serię kąpieli w alkoholach o rosnącym stężeniu, a następnie przemyć ksylenem; preparaty należy zamontować i ocenić przy użyciu mikroskopii świetlnej.

U myszy rozwinęła się inwazyjna choroba pneumokokowa po zakażeniu szczepem Tiger 4. W komorach serca zaobserwowano mikroprusaki, a między 24. a 30. godziną po infekcji odnotowano wzrost ich liczby i wielkości. Aby potwierdzić obecność S. pneumoniae w obrębie zmian, wykonano barwienie przekrojów pod kątem wielocukru kapsularnego serotypu 4 produkowanego przez szczep Tiger 4.

Potwierdziło to obecność ciasno upakowanych i gęstych agregatów w obrębie obszarów mikrolesji. Barwienie Piro serious red wykonano na przekrojach serca myszy, u których zastosowano ratunkowe leczenie ampicyliną, oraz na nieinfected kontrolach. W grupach ratunkowych.

Odnotowano gwałtowny wzrost obecności i intensywności barwienia, z pasmami rozciągającymi się z miejsc, które wydają się być poprzednimi lokalizacjami zmian w komorach mózgu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zainfekowaniu myszy odpowiednią dawką S. pneumoniae, aby infekcja mogła postępować przez co najmniej 28 do 30 godzin, co zapewni wystarczający czas na rozwinięcie się bakteriemii oraz mikrozmian w sercu.