Name: Wizualizacja Streptococcus pneumoniae w obrębie mikrouszkodzeń serca i późniejsza przebudowa serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji mikrouszkodzeń serca wywołanych przez Streptococcus pneumoniae w modelu mysim. Protokół obejmuje barwienie immunofluorescencyjne i ocenę przebudowy mięśnia sercowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant 13IRG14560023 od American Heart Association oraz granty NIH AI078972 i HL108054 dla CJO. Wsparcie dla AOB pochodziło z NIH National Center for Advancing Translational Sciences, NIH ULTR001120 i F31 A110417701.

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na myszach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio (protokół #13032-34-01C). Opieka nad zwierzętami i protokoły eksperymentalne są zgodne z prawem publicznym 89-544 (Ustawa o dobrostanie zwierząt) i jej poprawkami, wytycznymi Publicznej Służby Zdrowia oraz Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych (Departament Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych).
1. Infekcja
<ol>
	<li>Zdobądź myszy BALB/c obu płci w wieku 10-12 tygodni. 
	UWAGA: Szczep S. pneumoniae serotyp 4 TIGR4 jest zjadliwym izolatem klinicznym, który został zsekwencjonowany16.</li>
	<li>Hodować TIGR4 w bulionie Todda-Hewitta w temperaturze 37 °C w 5% CO2 aż do osiągnięcia gęstości optycznej (OD)620 0,5 (co odpowiada 1,0 x 108 jednostek tworzących kolonie [CFU]/ml). Osadzać kulturę pneumokokową przez wirowanie przez 10 minut przy 3 500 x g i usunąć supernatant za pomocą przewodu próżniowego. Zawiesić i rozcieńczyć bakterie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 1,0 x 104 jtk/ml.</li>
	<li>Za pomocą komory indukcyjnej znieczulij myszy 2,5% odparowanym izofluranem w tlenie. Potwierdź stan znieczulenia, delikatnie szczypiąc palec u nogi pęsetą.
	<ol>
		<li>Trzymając znieczuloną mysz za kark i pionowo jedną ręką, wstrzyknąć każdej myszy dootrzewnowo (i.p.) 100 μl zawiesiny S. pneumoniae za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 27-30 (co odpowiada dawce prowokacyjnej 1,0 x 103 CFU). Umieść mysz z powrotem w klatce. Myszy zazwyczaj budzą się 30-40 sekund po wstrzyknięciu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozwól, aby infekcja postępowała przez co najmniej 24 (wcześnie) lub 30 (zaawansowanie) godzin.
	<ol>
		<li>Poddać myszy eutanazji przez uduszenie CO2 . Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby upewnić się, że mysz nie żyje. Eutanazja jest dodatkowo potwierdzana przez usunięcie serca w kroku 1.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdezynfekuj ogon wacikiem nasączonym alkoholem i odetnij odcinek 2-3 mm. Zebrać 2 μl krwi i seryjnie rozcieńczyć krew 10-krotnie w PBS zawierającym heparynę sodową 1 j./ml pięć razy. Umieścić seryjne rozcieńczenia na płytce z tryptyczną krwią sojową i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Następnego dnia ekstrapoluje się z kolonii poziom bakteriemii.</li>
	<li>Unieruchomij mysz w pozycji leżącej na pozycji na platformie operacyjnej. Spryskaj klatkę piersiową 70% etanolem i osusz. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy otwórz jamę klatki piersiowej, usuń klatkę piersiową i przetransektuj przeponę, aby odsłonić serce i płuca. Za pomocą nożyczek przetnij naczynia krwionośne połączone z sercem i delikatnie wytnij serce, ostrożnie, aby uniknąć siniaków kleszczami.</li>
	<li>Przepłucz serce PBS, a następnie umieść w kasetach do pobierania próbek tkanek tak, aby podczas cięcia tkanek uzyskano skrawki koronalne. W celu zatopienia parafiny umieść kasety w 10% buforowym roztworze formaliny i następnego dnia wyślij do zatopienia parafiny.
	<ol>
		<li>Alternatywnie można je błyskawicznie zamrozić za pomocą związku O.C.T. w krioformie, który został umieszczony na suchym lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wizualizacja zmian w sercu i pneumokoków w obrębie zmian
<ol>
	<li>Wytnij sekcje serca zatopione w parafinie tak, aby 4 komory serca były widoczne w każdym fragmencie tkanki. Cięcie szkiełek o grubości 5 μm.</li>
	<li>Deparafinować i barwić szkiełka hematoksyliną i eozyną (H&E) przy użyciu standardowych metod17.</li>
	<li>Oglądaj wycinki serca barwione metodą H&E za pomocą mikroskopu świetlnego przy małych (100x, 200x) i wysokich (immersja w oleju: 400x, 1,000x) powiększeniach. Scharakteryzuj serca pod kątem obecności mikrouszkodzeń w mięśniu sercowym. Tutaj można uzyskać obrazy H&E za pomocą mikroskopu Zeiss Axioskop 2 wyposażonego w obiektyw Plan-NEOFLUAR z aperturą numeryczną 100X 1,3. 
	UWAGA: We wczesnych stadiach zmiany w sercu są rozróżniane na podstawie ich zróżnicowanego wyglądu, aw niektórych przypadkach obecności komórek odpornościowych (monocytów i granulocytów), które wydają się być monocytami. W zaawansowanych zmianach, szczególnie tych obserwowanych po 30 godzinach, komórki odpornościowe są nieobecne, a w ich miejsce obserwuje się duże zmiany wakuolowe. Ważne jest, aby pamiętać, że chociaż może wystąpić napływ komórek odpornościowych we wczesnych stadiach rozwoju zmian w sercu, nie wydaje się, aby był to wymóg.</li>
</ol>
3. Mikroskopia immunofluorescencyjna dla pneumokoków w mikrouszkodzeniach
<ol>
	<li>Serce należy przeciąć w krioformach z mikrotomem do grubości 5 μm i umieścić skrawki na dodatnio naładowanych szkiełkach podstawowych. Pozostaw zamrożone skrawki serca do rozmrożenia i wyschnięcia na powietrzu. Utrwalać skrawki na 10 minut w 10% obojętnej buforowanej formalinie (pH 6,8-7,2 w 25 °C).</li>
	<li>Myć szkiełka (3x) w PBS przez 5 min, przepuszczać przez 15 min w 0,2% Triton X-100 w PBS, a następnie ponownie umyć w PBS.</li>
	<li>Zablokuj wycinek tkanki na szkiełkach z 10% surowicą kozią w PBS przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka PBS, przykryć i inkubować skrawki serca surowicą przeciwko pneumokokom królika anty-serotypu 4 w stosunku 1:1 000 w PBS z 10% surowicą kozią przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Do kontroli ujemnych badacze powinni stosować naiwną surowicę króliczą</li>
	<li>Po umyciu PBS przykryć i inkubować sekcje 10% kozią surowicą-PBS z kozim przeciwciałem anty-króliczym FITC skoniugowanym w stosunku 1:2 000 przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Postępując zgodnie z instrukcją producenta, należy użyć DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole) w dawce 5 mg/ml do wizualizacji jąder eukariotycznych. Umyj i zamontuj skrawki tkanek za pomocą FluorSave.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy fluorescencyjne za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego zarówno przy małym, jak i dużym powiększeniu. Dostosuj odpowiednio przysłonę numeryczną, aby uzyskać optymalne wyniki. Tutaj uzyskaj obrazy fluorescencyjne za pomocą systemu konfokalnego z obiektywem o aperturze numerycznej 60X 1,42.</li>
</ol>
4. Antybiotykowe ratowanie myszy septycznych
<ol>
	<li>Zacznij od myszy zakażonych i.p. 1,0 x 103 CFU TIGR4, jak wskazano wcześniej w kroku 1.</li>
	<li>Począwszy od 30 godzin po zakażeniu, podawać ampicylinę farmaceutyczną i.p. (80 mg/kg masy ciała) w 100 μl soli fizjologicznej co 12 godzin przez 36 godzin. Zbierz serca w żądanym punkcie czasowym i postępuj zgodnie z opisem w kroku 1.6 dla zatapiania parafiny i cięcia, tkanki.</li>
</ol>
5. Wykrywanie osadzania kolagenu
<ol>
	<li>Za pomocą ksylenu i stopniowanego alkoholu przemywać się wodą dejonizowaną, należy odparafinować i uwodnić skrawki tkanek przy użyciu standardowych metod17. Skrawki należy traktować wodnym roztworem 0,2% kwasu fosfomolibdynowego przez 5 minut i płukać wodą dejonizowaną przez 5 minut.</li>
	<li>Zabarwić skrawki 0,1% czerwieni Sirius Red w kwasie pikrynowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myć sekcje w 0,01 N kwasie solnym przez 3 minuty i płukać 70% etanolem przez 1 min.</li>
	<li>Odwodnić skrawki przy użyciu identycznej, ale odwrotnej kolejności płukania do opisanej w ppkt 5.1, odwodnić skrawki serca w rosnących i stopniowanych stężeniach etanolu, a następnie ksylenu.</li>
	<li>Zamontuj skrawki tkanek za pomocą roztworu montażowego do oceny mikroskopowej.</li>
	<li>Aby zidentyfikować obszary odkładania się kolagenu, zbadaj barwione skrawki tkanek pod kątem obszarów głębokiego barwienia odczytem przy małym i dużym powiększeniu za pomocą mikroskopu świetlnego. Każdy obszar w komorach serca, który jest czerwony, jest obszarem, w którym został zdeponowany kolagen. Obszary bez tej czerwonej plamy to miejsca zdrowej tkanki, w których brakuje odkładania kolagenu. W tym celu uzyskaj obrazy zabarwione na czerwono Picro Sirius za pomocą mikroskopu wyposażonego w obiektyw z aperturą numeryczną 20X 0,5. 
	UWAGA: Przedsionek zabarwia się na czerwono w zdrowych tkankach.</li>
</ol>

<ol><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia%3A+incidence%2C+timing%2C+risk+factors%2C+and+association+with+short-term+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality.</a> Circulation. 125, 773-781 (2012).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+pneumonia+is+associated+with+the+occurrence+of+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes.</a> Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies.</a> PLoS Med. 8, e1001048(2011).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+stratification+for+cardiac+complications+in+patients+hospitalized+for+community-acquired+pneumonia.+Mayo+Clin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc%22%5BJournal%5D)">Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin.</a> Proc. 89, 60-68 (2014).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+11+common+viral+and+bacterial+pathogens+causing+community-acquired+pneumonia+or+sepsis+in+asymptomatic+patients+by+using+a+multiplex+reverse+transcription-PCR+assay+with+manual+%28enzyme+hybridization%29+or+automated+%28electronic+microarray%29+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection.</a> Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).</li>
<li>Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+pneumococcal+pneumonia+and+acute+cardiac+events%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events.</a> Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).</li>
<li>Brown, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+translocates+into+the+myocardium+and+forms+unique+microlesions+that+disrupt+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function.</a> PLoS Pathogens. In press, (2014).</li>
<li>Orihuela, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+receptor+initiates+bacterial+contact+with+the+blood+brain+barrier+in+experimental+meningitis+models%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).</li>
<li>Flick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elimination+of+the+binding+motif+on+fibrinogen+for+the+S.+aureus+virulence+factor+ClfA+improves+host+survival+in+septicemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia.</a> Blood. 121, 1783-1794 (2013).</li>
<li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+play+in+four+acts%3A+Staphylococcus+aureus+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).</li>
<li>Arenal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+the+spatial+characteristics+of+myocardial+scar+tissue+determine+the+risk+of+ventricular+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).</li>
<li>Deneke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+histopathology+of+electroanatomic+mapping+after+cooled-tip+radiofrequency+ablation+to+treat+ventricular+tachycardia+in+remote+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).</li>
<li>Bakker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reentry+as+a+cause+of+ventricular+tachycardia+in+patients+with+chronic+ischemic+heart+disease%3A+electrophysiologic+and+anatomic+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation.</a> Circulation. 77, 589-606 (1988).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+successful+ablation+sites+and+the+scar+border+zone+defined+by+substrate+mapping+for+ventricular+tachycardia+post-myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).</li>
<li>Wu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+risk+for+ventricular+tachyarrhythmias+and+sudden+cardiac+death%3A+is+there+a+role+for+cardiac+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).</li>
<li>Tettelin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+a+virulent+isolate+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae.</a> Science. 293, 498-506 (2001).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w tym badaniu.

W niniejszym raporcie przedstawiono wysoce powtarzalną metodę indukowania mikrozmian serca za pośrednictwem S. pneumoniae u myszy podczas IChP oraz techniki ich wizualizacji. Myszy są zakażone dawką bakterii, która przekracza próg klirensu układu odpornościowego, co prowadzi do bakteriemii wysokiego stopnia, podobnej do tej, która występuje podczas sepsy u ludzi, i prowadzi do ostatecznej translokacji bakteryjnej do mięśnia sercowego. Z nieznanych jeszcze przyczyn S. pneumoniae w sercu jest w stanie rep...

Hospitalizacja dorosłych z powodu pozaszpitalnego zapalenia płuc (CAP) niesie ze sobą udokumentowane ryzyko wystąpienia niepożądanych zdarzeń sercowych, które przyczyniają się do śmiertelności1-4. W niedawnym badaniu przeprowadzonym przez Corrales-Medina i wsp. stwierdzono, że powikłania sercowe są związane z i/lub odpowiedzialne za 27% zgonów związanych z zapaleniem płuc3. Streptococcus pneumoniae (pneumokoki), najczęstsza przyczyna CAP i sepsy5, jest bezpośrednio związana z niepożądanymi zdarzeniami sercowymi aż u 19% przyjętych dorosłych pacjentów6. Niepożądane zdarzenia sercowe związane z zapaleniem płuc obejmują nową lub nasiloną zastoinową niewydolność serca, zaburzenia rytmu serca i zawał mięśnia sercowego w kolejności malejącej częstości6.
W niedawnym artykule PLoS Pathogens autorstwa Browna i wsp.stwierdzono, że S. pneumoniae jest zdolny do translokacji przez śródbłonek naczyń sercowych, wnikania do mięśnia sercowego i tworzenia dyskretnych, nieropnych zmian mikroskopowych (mikrouszkodzeń) wypełnionych bakteriami w komorach podczas inwazyjnej choroby pneumokokowej (IPD)7. Dowody na powstawanie mikrouszkodzeń serca zaobserwowano w próbkach serca pobranych od naczelnych innych niż ludzie i osób, które uległy zakażeniu pneumokokiem. Podobnie, eksperymentalnie zakażone myszy w powtarzalny sposób rozwijały mikrouszkodzenia serca. U myszy wielkość i liczba mikrozmian była dodatnio skorelowana z czasem trwania i nasileniem bakteriemii, poziomem troponiny sercowej w surowicach i nieprawidłową elektrofizjologią serca. Stwierdzono, że translokacja bakteryjna do serca zachodzi poprzez te same mechanizmy, które są odpowiedzialne za translokację pneumokoków przez barierę krew-mózg i rozwój pneumokokowe zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, tj. inwazję komórek śródbłonka naczyniowego za pośrednictwem białka A za pośrednictwem receptora Lamininy i receptora czynnika aktywującego płytki krwi8. Powstawanie mikrozmian wymagało również pneumokokowej toksyny tworzącej pory, pneumolizyny, która, jak stwierdzono, zabija kardiomiocyty7.
Pneumokokowe mikrouszkodzenia serca różnią się od ropnych ropni tkanek miękkich i serca, które są wywoływane przez inne bakterie Gram-dodatnie, w tym Staphylococcus aureus. Charakteryzują się one pojedynczymi ogniskami bakterii otoczonymi neutrofilami i odkładaniem fibryny9,10. Mikrouszkodzenia utworzone przez S. pneumoniae są mniejsze, rozmieszczone w chorym sercu i nie mają nacieków komórek odpornościowych. We wczesnych stadiach infekcji mikrouszkodzenia wywołane przez S. pneumoniae pojawiają się jako obszary uszkodzonej lub objętej stanem zapalnym tkanki, przypominające patologiczne objawy kardiomiopatii. W tym czasie można zaobserwować niektóre monocyty, jednak ich obecność jest krótkotrwała, a zmiany szybko stają się nekrotyczne i wypełnione bakteriami, jednocześnie kontynuując wzrost wielkości aż do śmierci zwierzęcia lub interwencji przeciwdrobnoustrojowej. Co ważne, w ciągu 3 dni od interwencji antybiotykowej obserwuje się obfity naciek komórek odpornościowych w miejscu pierwszej zmiany, któremu towarzyszy silne odkładanie kolagenu. Doniesiono, że podobna przebudowa serca występuje po zawale wraz z trwałymi konsekwencjami dla funkcji serca11-15. W związku z tym mikrouszkodzenia są potencjalnym wyjaśnieniem niepożądanych zdarzeń sercowych, które występują podczas IChP i prawdopodobnie zwiększonej częstości występowania śmiertelności związanej z sercem u osób ozdrowieńców, którzy przeżyli epizod choroby.
Tutaj, instrukcje są podane na eksperymentalnym mysim modelu IChP i powstawania zmian w sercu oraz wizualizacji mikrouszkodzeń serca we wczesnych i późnych stadiach infekcji. Przedstawiono protokół wykrywania odkładania się kolagenu u zwierząt, które zostały uratowane przez interwencję przeciwdrobnoustrojową. Celem tego artykułu jest ułatwienie innym badaczom badań nad tą ważną i nową patologią pneumokokową.

<table><tbody><tr><td>Rosół Todda-Hewitta&nbsp;</td><td>Związek Neogen</td><td>7161A</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T&NBSP;</td><td>Tissue-Tek (Sakura Finetek)&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tryton X-100&nbsp;</td><td>Fisher Scientific (Acros)</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>antyserotyp 4 surowica przeciw pneumokokom&nbsp;</td><td>Statens Serum Institut</td><td>16747</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało sprzężone FITC przeciwko królikowi&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-096-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70104</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>kwas fosfomolibdowy 0,2%&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>26357-01</td><td></td></tr><tr><td>0,1% czerwień Syriusza w kwasie pikrynowym&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>26357-02</td><td></td></tr><tr><td>0,01 N kwas solny&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>26357-03</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe do przyczepności tkanek</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>Maść weterynaryjna Paralube</td><td>Dechra</td><td>12920060</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozyny</td><td>nieokreślony&nbsp;</td><td></td><td>norma</td></tr></tbody></table>

wizualizacja streptococcus pneumoniae w obrębie mikrouszkodzeń serca i późniejsza przebudowa serca

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Podczas bakteriemii Streptococcus pneumoniae może przemieszczać się przez śródbłonek naczyń krwionośnych do mięśnia sercowego i tworzyć dyskretne, wypełnione bakteriami mikroskopijne zmiany (mikrouszkodzenia), które są niezwykłe ze względu na brak infiltrujących komórek odpornościowych. Uważa się, że ze względu na uwalnianie produktów kardiotoksycznych, S. pneumoniae w obrębie mikrozmian przyczynia się do niewydolności serca, która jest często obserwowana podczas piorunującej inwazyjnej choroby pneumokokowej u dorosłych. W tym artykule przedstawiono protokół eksperymentalnego zakażenia myszy, który prowadzi do powtarzalnego tworzenia się mikrouszkodzeń serca w ciągu 30 godzin. Podano instrukcje dotyczące identyfikacji mikrouszkodzeń w wycinkach serca barwionych hematoksyną i eozyną oraz podkreślono różnice morfologiczne między wczesnymi i późnymi mikrouszkodzeniami. Przedstawiono instrukcję dotyczącą protokołu weryfikacji S. pneumoniae w obrębie mikrozmian przy użyciu przeciwciał przeciwko polisacharydowi otoczkowemu pneumokokom i mikroskopii immunofluorescencyjnej. Na koniec przedstawiono protokół interwencji antybiotykowej, która ratuje zakażone myszy oraz wykrywania i oceny tworzenia się blizn w sercach rekonwalescentów. Łącznie protokoły te ułatwią badanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw inwazji pneumokoków serca, śmierci kardiomiocytów, przebudowy serca w wyniku ekspozycji na S. pneumoniae oraz odpowiedzi immunologicznej na pneumokoki w sercu.

Wizualizacja mikrozeszkleń metodą H&amp;E
Mikrourazy serca zaobserwowano w komorach preparatów serca barwionych H&amp;E u myszy z IPD po wyzwaniu i.p. szczepem TIGR4. Rycina 1 pokazuje wzrost rozmiaru tych zmian między 24. a 30. godziną po infekcji (hpi), przy większej liczbie pneumokoków barwiących się hematoksyliną (t.j. na kolor purpurowo-niebieski) widocznych w obrębie zmiany. Mikrourazy charakteryzowały się morfologią przypominającą wakuole, intensywniej...

Streptococcus pneumoniae tworzy dyskretne, nieropne, mikroskopijne zmiany w sercu. Przedstawiono protokół mysiego modelu powstawania mikrouszkodzeń serca. Prowadzone są szkolenia dotyczące wizualizacji mikrozmian za pomocą mikroskopii, rozróżniania wczesnych i późnych mikrouszkodzeń oraz metod wykrywania przebudowy serca w sercach rekonwalescentów.

Wizualizacja Streptococcus pneumoniae w obrębie mikrouszkodzeń serca i późniejsza przebudowa serca

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zaprezentowanie powtarzalnego protokołu tworzenia mikrozniszczeń serca wywołanych przez ESMO w sercach zakażonych myszy. Osiąga się to poprzez zakażenie myszy ESMO i dopuszczenie do rozwoju bakteriemii, co umożliwia bakteriom dostęp do naczyń krwionośnych serca, gdzie mogą one nacieknąć mięsień sercowy i tworzyć mikroskopijne zmiany. Następnie serca są albo zatapiane w parafinie i barwione w sposób konwencjonalny, albo utrwalane w związku OCT w celu przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego.Ocena barwionych przekrojów może wykazać mikrourazy serca rozproszone losowo w mięśniu sercowym, złogi kolagenu, przekroje mięśnia sercowego w fazie rekonwalescencji oraz kapsułki pneumokokowe w obrębie mikrourazów serca, co demonstruje procedurę. Armand Brown jest studentem studiów magisterskich w moim laboratorium. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat niszczycielskiego wpływu S. pneumoniae na serce podczas inwazyjnej choroby pneumokokowej u myszy.Metodę tę można również zastosować do próbek serca z innych układów, takich jak naczelne lub ludzie. Należy rozpocząć od hodowli szczepu ESMO Serotype four Tiger four w pożywce Todd Hewitt do uzyskania gęstości optycznej 0,5 przy 620 nm. Po osiągnięciu odpowiedniej gęstości kulturę należy odwirować przy 3 500 G przez 10 minut.Następnie usunąć supernatant za pomocą linii próżniowej i resuspender bakterie w sterylnym PBS do stężenia 10 000 jednostek tworzących kolonie na mililitr. Następnie zanestezjować myszy Valve C w wieku od 10 do 12 tygodni i potwierdzić stan znieczulenia, delikatnie uciskając palec stopy tępą pęsetą. Nabrać do strzykawki zawiesinę bakteryjną i założyć igłę o rozmiarze od 27 do 30 G. Następnie chwycić znieczuloną mysz za kark jedną ręką, podczas gdy drugą ręką wstrzyknąć 100 µL zawiesiny drogą dostępu dootrzewnowego. Umieścić każdą mysz z powrotem w klatce.Myszy zazwyczaj budzą się od 30 do 40 sekund po iniekcji. Precyzyjne dobranie dawki S. pneumoniae jest kluczowe, w przeciwnym razie myszy mogą wyzdrowieć z infekcji lub zbyt szybko rozwinąć inwazyjną chorobę pneumokokową, co uniemożliwi powstanie zmian chorobowych. Ponieważ każdy szczep bakteryjny charakteryzuje się inną zjadliwością, ustalenie właściwej dawki może wymagać metody prób i błędów.Pozostaw infekcję do rozwinięcia się przez co najmniej 24 godziny dla wczesnego stadium lub do 30 godzin dla stadium zaawansowanego. Następnie przeprowadź eutanazję każdej zainfekowanej myszy. W pierwszej kolejności pobierz próbkę krwi: zdezynfekuj ogon za pomocą gazika nasączonego alkoholem i odetnij odcinek o długości od dwóch do trzech milimetrów.Pobrać 2 µL krwi z miejsca nacięcia. Krew rozcieńczyć seryjnie dziesięciokrotnie w PBS zawierającym heparynę sodową w stężeniu 1 U/mL. Pięć poziomów rozcieńczeń wysiać na płytki z agarem sojowo-krwiowym (triptic soy blood agar) i inkubować przez noc.Następnego dnia należy przeprowadzić zliczenie kolonii. Następnie przystąpić do pobrania serca zgodnie z opisem w kolejnej sekcji. Alternatywnie, 30 godzin po zakażeniu.Podjęto próbę ratowania myszy poprzez podanie ampicyliny drogą doszpczewną w 100 µL soli fizjologicznej. Kontynuowano podawanie ampicyliny co 12 godzin przez 36 godzin, a następnie pobrano serca w wybranych punktach czasowych. W pierwszej kolejności wykonano pobranie serca.Utrwalonego po eutanazji myszy ułóż na platformie chirurgicznej w pozycji grzbietowej, a klatkę piersiową spryskaj 70% ethanol i osusz. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęset otwórz jamę klatki piersiowej. Usuń klatkę piersiową i przetnij przeponę, aby odsłonić serce i płuca.Następnie należy przeciąć naczynia krwionośne połączone z sercem i za pomocą pęsety delikatnie wyciąć serce, unikając jego uszkodzenia. Serce należy przepłukać w PBS i umieścić w kasecie do pobierania próbek tkanek w celu wykonania przekrojów czołowych. Następnie kasety przenosi się do 10% buforowanego roztworu formaliny, a następnego dnia przekazuje do zatopienia w parafinie.W wczesnych stadiach zmiany w sercu można zidentyfikować po zmianie ich wyglądu kolorystycznego, a w niektórych przypadkach po obecności komórek odpornościowych. W zaawansowanych zmianach komórki odpornościowe nie występują i są duże. W ich miejsce pojawiają się zmiany przypominające VA.Używając pięciomikronowych przekrojów serca na szkiełkach przedmiotowych dodatnio naładowanych, najpierw zamrozić przekroje, następnie je rozmrozić i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Utrwalić preparaty w 10% neutralnym buforowanym formalinie przez 10 minut w temperaturze 25°C. Następnie usunąć utrwalacz poprzez trzy przemycia w PBS, po pięć minut każde.Następnie przeprowadź permeabilizację tkanki w 0,2% tritton X 100 w PBS przez 15 minut. Usuń detergent, wykonując trzy kolejne przemycia w samym PBS. Następnie zablokuj tkankę, stosując 10% serum w PBS przez godzinę; po przemyciu w PBS pokryj preparat przeciwciałem wtórnym na dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Kontrole negatywne traktuj naiwnym antyserum króliczym. Ponieważ tkanka serca łatwo absorbuje barwnik immunofluorescencyjny XI, co prowadzi do wysokiego poziomu tła, stężenie oraz czas inkubacji dla różnych typów przeciwciał będą prawdopodobnie wymagały optymalizacji. Po dwóch godzinach wypłucz antyserum przy użyciu PBS. Następnie zastąp roztwór przeciwciałem wtórnym i inkubuj preparaty w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Teraz zastosuj DPI w stężeniu 5 mg/mL i wypłucz preparaty za pomocą PBS.Na koniec przygotuj preparaty na szkiełkach, zapisz je i obrazuj za pomocą mikroskopii konfokalnej. Rozpocznij od usunięcia parafiny i nawodnienia przekrojów tkankowych. Przeprowadź płukanie ksylenem, a następnie zastosuj szereg płukań w alkoholach o malejącym stężeniu.Następnie należy zanurzyć przekroje w 0,2% kwasie fosfomolybdenowym na pięć minut, a następnie płukać w wodzie przez pięć minut; kolejnie barwić 0,1% sirianinę czerwona i kwasem pikrykowym przez dwie godziny. Następnie należy przemyć przekroje 0,01 N kwasem solnym przez trzy minuty i płukać w 70% etanolu przez minutę. Teraz należy odwodnić przekroje, stosując odwróconą serię kąpieli w alkoholach o rosnącym stężeniu, a następnie przemyć ksylenem; preparaty należy zamontować i ocenić przy użyciu mikroskopii świetlnej.U myszy rozwinęła się inwazyjna choroba pneumokokowa po zakażeniu szczepem Tiger 4. W komorach serca zaobserwowano mikroprusaki, a między 24. a 30. godziną po infekcji odnotowano wzrost ich liczby i wielkości. Aby potwierdzić obecność S. pneumoniae w obrębie zmian, wykonano barwienie przekrojów pod kątem wielocukru kapsularnego serotypu 4 produkowanego przez szczep Tiger 4.Potwierdziło to obecność ciasno upakowanych i gęstych agregatów w obrębie obszarów mikrolesji. Barwienie Piro serious red wykonano na przekrojach serca myszy, u których zastosowano ratunkowe leczenie ampicyliną, oraz na nieinfected kontrolach. W grupach ratunkowych.Odnotowano gwałtowny wzrost obecności i intensywności barwienia, z pasmami rozciągającymi się z miejsc, które wydają się być poprzednimi lokalizacjami zmian w komorach mózgu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zainfekowaniu myszy odpowiednią dawką S. pneumoniae, aby infekcja mogła postępować przez co najmniej 28 do 30 godzin, co zapewni wystarczający czas na rozwinięcie się bakteriemii oraz mikrozmian w sercu.

visualization-streptococcus-pneumoniae-within-cardiac-microlesions

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wizualizacja Streptococcus pneumoniae w mikrozmianach mięśnia sercowego i późniejszej remodelacji serca

Źródło: Brown, A. O. i in. Wizualizacja Streptococcus pneumoniae w mikrozmianach serca i późniejsza remodelacja serca. J. Vis. Exp. (2015).Ten film pokazuje mikroskopową wizualizację mikrozmian bakteryjnych w tkance serca myszy. Serce myszy zakażonej Streptococcus pneumoniae jest pobierane, myte i zabiegane przed przetworzeniem w celu uzyskania przekrojów koronalnych. Te fragmenty są barwione hematoksyliną i eozyną oraz badane pod mikroskopem, aby zobaczyć bakterie zamieszkujące mikrozmiany.

Mikroskopowa wizualizacja mikrozmian bakteryjnych w tkance serca myszy

Źródło: Brown, A. O., i Orihuela, C. J. Wizualizacja Streptococcus pneumoniae w mikrozmianach serca i późniejsza remodelacja serca. J. Vis. Exp. (2015)Film demonstruje immunobarwienie chemicznie utrwalonych przekrojów tkanki sercowej myszy, aby zobrazować bakterie patogenne zlokalizowane w mikrozmianach wywołanych infekcją. Proces obejmuje mycie tkanek, przepuszczanie błon, blokowanie miejsc niespecyficznych, znakowanie przeciwciał, przeciwbarwienie jądrowe oraz mikroskopię konfokalną w celu...

Immunobarwienie mikrozmian wypełnionych bakteriami w przekroju tkanki sercowej myszy do obrazowania

To badanie pokazuje udane wprowadzenie obrazowania metodą rezonansu magnetycznego jako nieinwazyjnego narzędzia do oceny nieprawidłowości serca u myszy dotkniętych autoimmunologicznym zapaleniem mięśnia sercowego.  Dane wskazują, że technika ta może być stosowana do monitorowania postępu choroby u żywych zwierząt.

Nieinwazyjna ocena nieprawidłowości serca w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mięśnia sercowego za pomocą obrazowania za pomocą rezonansu magnetycznego u myszy

Pokazana tutaj jest metoda wizualizacji ultrastruktury macierzy zewnątrzkomórkowej w zdecelularyzowanych tkankach serca.

Skaningowa mikroskopia elektronowa zmacerowanej tkanki w celu wizualizacji macierzy zewnątrzkomórkowej

Rzetelna i dokładna ocena wyników jest kluczem do przełożenia terapii przedklinicznych na leczenie kliniczne. W niniejszej pracy opisano, w jaki sposób można ocenić trzy klinicznie istotne pierwszorzędowe parametry końcowe dotyczące wydolności i uszkodzenia serca w modelu ostrego zawału mięśnia sercowego u świni.

Pierwszorzędowa ocena wyniku w świńskim modelu ostrego zawału mięśnia sercowego

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Tutaj prezentujemy protokół indukcji kriouszkodzenia lewej komory, po którym następuje wszczepienie łaty mięśnia sercowego, pochodzącej z ludzkich kardiomiocytów komórek iPS w modelu świnki morskiej.

Implantacja plastrów sercowo-mięśniowych pochodzących z hiPSC po urazie mięśnia sercowego w modelu świnki morskiej

Ten protokół opisuje kroki do wywołania zawału mięśnia sercowego u myszy, przy jednoczesnym zachowaniu osierdzia i jego zawartości.

Nienaruszony model gryzonia niedokrwiennego osierdzia

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania wysokiej rozdzielczości obrazów mikrotomografii komputerowej zdrowych i patologicznych całych serc dużych ssaków z selektywnym wzmocnieniem kontrastu.

Techniki przygotowania tkanek do obrazowania mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym modeli serca dużych ssaków z chorobami przewlekłymi

Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja uszkodzenia serca w reperfuzji ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI) umożliwia wierną kwantyfikację i kolokalizację powiązanych wzorców wpływających na chorobę. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowane obrazowanie sterowane arkuszem świetlnym do jednoczesnego pomiaru uszkodzenia serca, obszaru ryzyka i odpowiedzi komórek odpornościowych.

Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Poznaj metodę wizualizacji mikrouszkodzeń serca wywołanych przez Streptococcus pneumoniae w modelu mysim. Protokół obejmuje barwienie immunofluorescencyjne i ocenę przebudowy mięśnia sercowego.

Wizualizacja Streptococcus pneumoniae w obrębie mikrouszkodzeń serca i późniejsza przebudowa serca

Przeglądaj więcej filmów