Propagacja aktywności neuronalnej w rozłożonym preparacie hipokampa z penetrującym układem mikroelektrod

Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie procesu rozwijania hipokampa gryzoni i umieszczania preparatu z płaskiej tkanki na penetrującym układzie mikroelektrod. Do nagrywania. Osiąga się to poprzez najpierw odizolowanie hipokampa myszy od połowy jej mózgu.

Drugim krokiem jest rozwinięcie zakrzywionej struktury hipokampa za pomocą specjalnie wykonanych narzędzi. Następnie rozłożony hipokamp jest przenoszony do komory nagraniowej i umieszczany na matrycy rejestracyjnej. Ostatnim krokiem jest usunięcie rozłożonego hipokampa z matrycy po eksperymencie.

Ostatecznie w analizie danych stosuje się indywidualną metodę mapowania normalizacji, aby pokazać propagację aktywności neuronalnej rejestrowaną przez penetrujący układ mikroelektrod. Otóż główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam rejestrować aktywność neuronalną w dwóch kierunkach, poprzecznym i podłużnym. Aby zobaczyć rzeczywistą propagację aktywności neuronalnej, potrzebujesz nienaruszonego hipokampa, rozwiń słoiki z wgnieceniami i połóż się płasko w komorze nagrywającej, a propagacja będzie odbywać się zarówno w kierunku poprzecznym, jak i podłużnym.

Udało nam się wtedy ustalić prędkość rozprzestrzeniania się tkanki. Byliśmy aktywni w dwóch kierunkach i byliśmy w stanie badać mechanizmy propagacji, w szczególności mechanizmy nonsynaptyczne. Byliśmy w stanie zaobserwować aktywność rozchodzącą się wraz z transmisją synaptyczną z tymi połączeniami szczelinowymi, a ze względu na prędkość, wiemy, że nie jest to dyfuzja.

Teraz próbujemy rozgryźć rzeczywiste mechanizmy tej propagacji. Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej technice będą zmagać się z trudnymi procedurami rozkładania hipokampa i umieszczania preparatu z płaskiej tkanki na tym penetrującym układzie mikroelektrod bez uszkadzania tkanki lub matrycy. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść głowę myszy w lodowatej natlenionej sacharozy.

Płyn mózgowo-rdzeniowy użyj cienkich nożyczek, aby usunąć skórę czaszki. Następnie przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej i dwa końce w pobliżu płata skroniowego. Następnie obierz odciętą czaszkę w kierunku boków głowy.

Aby odsłonić mózg, ostrożnie usuń mózg z czaszki za pomocą szpatułki. Następnie umieść mózg na lodowatym etapie chirurgicznym pokrytym mokrą bibułą filtracyjną. Usuń móżdżek za pomocą lodowatego ostrza.

Następnie oddziel dwie półkule, przecinając linię środkową mózgu. Następnie umieść dwie oddzielone półkule w zlewce wypełnionej lodowatą sacharozą. Płyn mózgowo-rdzeniowy bulgoczący z 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla.

Przenieś jedną półkulę do lodowatego etapu pokrytego bibułą filtracyjną. Umieść zwykłe ręczniki papierowe lub bibuły filtracyjne wokół mózgu, aby wchłonąć dodatkowy roztwór. Następnie użyj dwóch pipet z polerowanego szkła, aby oddzielić korę od centralnej części mózgu, aby odsłonić hipokamp.

Następnie nałóż dwie do trzech kropli lodowatego płynu mózgowo-rdzeniowego na tkankę i usuń nadmiar roztworu. Przetnij połączenia z korą na dwóch końcach hipokampa. Następnie wypreparuj hipokamp z mózgu za pomocą narzędzi z polerowanego szkła.

Następnie oddziel cały hipokamp stroną skierowaną do góry i bruzdą hipokampa skierowaną w dół Szybko nałóż dwie do trzech kropli lodowatego sase CSF ponownie na tkankę i usuń dodatkowy roztwór wokół niej. Następnie użyj narzędzia do polerowanego szkła, aby obrócić cały hipokamp. Aby odsłonić bruzdę, użyj lodowatego ostrza, aby przyciąć przegrodę i skroniowe końce hipokampa.

W razie potrzeby włóż specjalnie wykonaną szklaną igłę do bruzdy i przetnij ścieżkę światłowodową od DG do około trzech. Następnie użyj metalowej pętli z drutu, aby przeciągnąć DG i rozłożyć hipokamp. Cały proces zabiegu trwa zwykle około dwóch minut.

Nałóż kolejne dwie do trzech kropli lodowatej sacharozy A CSF na tkankę i usuń nadmiar roztworu wokół niej. Następnie przytnij krawędzie rozłożonego hipokampa lodowatym ostrzem. Przenieść preparat do komory odzysku wypełnionej normalnym płynem mózgowo-rdzeniowym A i bąbelkować 95% tlenem, 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze pokojowej przez godzinę przed przeniesieniem go do komory rejestracyjnej.

W tej procedurze napełnij jedną butelkę normalnym płynem mózgowo-rdzeniowym A, a drugą butelką czterema pęcherzykami płynu mózgowo-rdzeniowego AP A. Roztwory zawierające 95% tlenu, 5% dwutlenku węgla od początku eksperymentów. Użyj łącznika trójzaworowego, aby kontrolować, które rozwiązanie zostanie wybrane podczas eksperymentu.

Następnie podłącz rurkę próżniową do wylotu komory. Aby usunąć roztwór do pojemnika na kurz, podgrzej rurociąg przed dostarczeniem roztworu do komory rejestracyjnej i utrzymuj go w kontrolowanej temperaturze 35 stopni Celsjusza. Po zamknięciu wlotu i wylotu komory nagrywania, użyj specjalnie wykonanego szklanego zakraplacza do pipet, aby przenieść rozłożony hipokamp do komory nagrywającej.

Pod mikroskopem ustaw rozłożony hipokamp stroną alvia skierowaną w dół, ca trzy obszary skierowane na zewnątrz i ca jedno pole skierowane w stronę badacza, ostrożnie odessaj roztwór w komorze za pomocą pipety próżniowej od krawędzi komory rejestrującej, aż komora zostanie wysuszona, a tkanka będzie leżeć na matrycy. Następnie ostrożnie umieść specjalnie wykonaną kotwicę tkankową na wierzchu tkanki, aby utrzymać rozłożony hipokamp na tablicy. Napełnij komorę nagrywania kilkoma kroplami roztworu.

Stopniowo otwieraj wlot i wylot, aby dostosować natężenie przepływu do około dwóch kropli na sekundę w komorze wyzwalania dożylnego. Inkubować tkankę w komorze rejestracyjnej z normalnym płynem mózgowo-rdzeniowym A przez około jedną minutę. Następnie zmień rozwiązania.

Nałożyć na cztery rozpuszczone AP A CSF i odpowiednio wyregulować natężenie przepływu. Inkubować tkankę w czterech rozpuszczonych AP CSF przez około pięć do 10 minut przed nagraniem. Aby usunąć tkankę z PMEA, należy kontrolować kotwicę tkankową za pomocą mikromanipulatora i stopniowo podnosić kotwicę z komory rejestracyjnej.

Zamknij zarówno wlot, jak i wylot, aby zatrzymać przepływ. W komorze nagraniowej użyj małego pędzla, aby podnieść róg chusteczki. Jeśli tkanka nie unosi się w roztworze, użyj rurki próżniowej, aby ostrożnie wysuszyć komorę, tak aby tkanka nadal znajdowała się na matrycy.

Następnie ostrożnie otwórz wlot, aby stopniowo napełniać komorę i zamknij wlot, aby zatrzymać przepływ. Gdy komora nagraniowa jest pełna, użyj małego pędzelka, aby podnieść róg chusteczki. Znów. Jeśli tkanka unosi się w roztworze, użyj rurki próżniowej, aby odessać tkankę.

Otwórz przepływ na wlocie i podciśnienie na wylocie. Umyj system wodą destylowaną i wysusz go. Jest to przykład spontanicznej aktywności indukowanej przez 100 mikromolowe cztery AP A CSF zarejestrowane z jednej z mikroelektrod znajdujących się w podstawowym obszarze dendrytycznym o stosunku sygnału do szumu 34,9 decybeli.

A oto powiększone działania w czerwonym prostokącie. Są to surowe dane z innej mikroelektrody umieszczonej bliżej somaty, której stosunek sygnału do szumu wynosi 27,2 decybeli. Oto kolejny przykład zapisu uzyskanego z elektrody umieszczonej w warstwie somatycznej.

W tym przykładzie stosunek sygnału do szumu wynosi 18,53 decybeli, a oto podstawowy szum zarejestrowany przez mikroelektrodę. Linia bazowa ma zwykle wartość szczytową od 150 do 200 mikrowoltów, a impedancja pojedynczej elektrody wynosi około jednego do dwóch megaomów. Ten film przedstawia propagację neuronową zarejestrowaną za pomocą tablicy, a następnie przetworzoną przy użyciu indywidualnej metody normalizacji.

W analizie danych cała propagacja w całej tkance trwa około 100 milisekund Po tej procedurze. Inne metody, takie jak neuroobrazowanie w rozłożonym, hipokampie in vitu, mogą być również wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak ruch ognisk nerwowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozłożyć hipokamp na miejscu, przygotowanie płaskiej tkanki na mikro tablicę wykładową.