Name: Propagacja aktywności neuronalnej w rozłożonym preparacie hipokampa z penetrującym układem mikroelektrod (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj metodę rozwijania hipokampa myszy do płaskiego preparatu tkankowego z rejestracją aktywności neuronalnej za pomocą penetrującej macierzy mikroelektrod. Technika umożliwia jednoczesne monitorowanie sygnałów w całej strukturze hipokampa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 oraz przez ufundowane przez E.L. Lindseth krzesło Dominique M. Durand. Dziękujemy laboratorium dr Andrew M. Rollinsa za pomoc w obrazowaniu OCT.

UWAGA: Protokoły eksperymentalne na zwierzętach zostały przejrzane i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na uniwersytecie. W tym badaniu wykorzystano myszy CD1 obu płci w wieku od P10 do P20.
1. Rozwiązania dla chirurgii i eksperymentalnego nagrywania
<ol>
	<li>Przygotować normalny bufor sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) zawierający (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH2PO4 1,25, MgSO4 2, NaHCO3 26, dekstroza 10 i CaCl2 2. Użyj tego normalnego aCSF do regeneracji tkanek po sekcji, a także do systemu mycia na początku eksperymentu.</li>
	<li>Przygotuj sacharozę aCSF, która jest używana podczas rozwarstwiania hipokampa i zawiera (mM): sacharozę 220, KCl 2,95, NaH2PO4 1,3, MgSO4 2, NaHCO3 26, dekstrozę 10 i CaCl2 2. W celu wywołania aktywności padaczkowej w nienaruszonym preparacie tkanki hipokampa, należy dodać 4-aminopirydynę (4-AP) do normalnego aCSF w stężeniu 100 μM.</li>
</ol>
2. Zabieg chirurgiczny w celu przygotowania nienaruszonego hipokampa
<ol>
	<li>Wrzuć izofluran (1 ml) do komory na dnie szklanego słoika z eksykatorem (nr 1 w określonych materiałach i sprzęcie) i użyj zwykłego ręcznika papierowego, aby przykryć powierzchnię dolnego stopnia, aby zwierzę nie miało kontaktu z płynem. Następnie umieść mysz CD1 w słoiku i zamknij pokrywkę. Trzymaj zwierzę w zamkniętym słoiku przez około 1 min do 2 min. Gdy częstotliwość oddechu wynosi około jednego na sekundę, wyjmij mysz ze słoika.</li>
	<li>Umieść mysz na etapie operacji i odetnij głowę odpowiednimi nożyczkami. Bezpośrednio po dekapitacji umieścić głowę w lodowatej (3-4 °C), natlenionej sacharozie aCSF na około 30 sekund.</li>
	<li>Użyj cienkich nożyczek (nr 5 w określonych materiałach i sprzęcie), aby usunąć skórę z góry czaszki i przeciąć czaszkę wzdłuż środkowej linii głowy, a także na dwóch końcach w pobliżu płata skroniowego. Użyj kleszczy (nr 6 w Specjalnych Materiałach i Sprzęcie), aby oderwać odciętą czaszkę w kierunku każdej strony głowy, aby odsłonić mózg.</li>
	<li>Włóż mikroszpatułkę laboratoryjną (nr 8 w określonych materiałach i sprzęcie) w szczelinę między płatami ciemieniowymi mózgu i czaszki, aby ostrożnie oderwać mózg od spodu czaszki, a następnie upuść go na przygotowany lodowaty (3-4 ° C) stolik chirurgiczny pokryty mokrą bibułą filtracyjną (nr 2 w określonych materiałach i sprzęcie). Usuń móżdżek za pomocą chłodzonego lodem ostrza i oddziel dwie półkule, przecinając linię środkową mózgu. Następnie umieść dwie oddzielone półkule w zlewce wypełnionej lodowatą sacharozą aCSF z bąbelkami 95% O2/5% CO2 .</li>
	<li>Weź połowę półkuli i umieść na lodowatym stoliku z bibuły filtracyjnej. Umieść zwykłe ręczniki papierowe lub bibułę filtracyjną wokół mózgu, aby zassać dodatkowy roztwór. Użyj dwóch narzędzi do pipet z polerowanego szkła (nr 10 w Materiałach i Sprzęcie), aby oddzielić korę mózgową od reszty centralnej części mózgu.</li>
	<li>Po tym, jak hipokamp zostanie odsłonięty z wnętrza kory mózgowej i umieszczony w lodowatym etapie, umieść dwie lub trzy krople lodowatej sacharozy aCSF na tkance, a następnie usuń dodatkowy roztwór wokół hipokampa. Przetnij połączenia z korą na dwóch końcach hipokampa. Następnie wypreparuj hipokamp z mózgu za pomocą narzędzi z polerowanego szkła i usuń pozostałą część mózgu.</li>
	<li>Oddziel cały hipokamp stroną z zębodołem skierowanym do góry i bruzdą hipokampa skierowaną w dół. Szybko upuść dwie lub trzy krople lodowatej sacharozy aCSF ponownie na tkankę i usuń dodatkowy roztwór wokół tkanki za pomocą kawałka ręcznika papierowego. Użyj narzędzia z polerowanego szkła, aby obrócić cały hipokamp, aby odsłonić bruzdę (ryc. 1B, C).</li>
	<li>Pod normalnym mikroskopem optycznym włóż specjalnie wykonaną szklaną igłę (nr 11 w określonych materiałach i sprzęcie) do jednego końca bruzdy i przetnij połączenia światłowodowe, od zakrętu zębatego (DG) do subiculum lub pola CA1, wzdłuż kierunku bruzdy (ryc. 1C). W razie potrzeby zastosuj lodowato zimne ostrze, aby przyciąć przegrodę i skroniowe końce hipokampa. Włóż wykonaną na zamówienie pętlę z drutu metalowego (nr 12 w określonych materiałach i sprzęcie) do przeciętej bruzdy i pociągnij DG z dala od tkanki, przytrzymując koniec subiculum / CA1 hipokampa za pomocą narzędzia z polerowanego szkła (ryc. 1D).</li>
	<li>Postępując zgodnie z powyższą procedurą rozkładania, dodaj kolejne dwie lub trzy krople lodowatej sacharozy aCSF na tkankę i usuń dodatkowy roztwór wokół tkanki. Następnie przyciąć rozłożony hipokamp lodowatym ostrzem na krawędziach (ryc. 1E) i umieścić preparat szpatułką w komorze regeneracyjnej wypełnionej normalnym aCSF i bąbelkowanej 95% O2/5% CO2 w temperaturze RT (około 25 °C). Pozostaw rozłożoną tkankę hipokampa do odzyskania około 1 godziny przed umieszczeniem jej w komorze rejestracyjnej.</li>
	<li>Weź drugą półkulę mózgu i użyj jej, aby przejść przez kroki od 2,5 do 2,9. Zwykle poświęć około 1 do 2 minut, aby zakończyć całą procedurę, aby rozłożyć pojedynczy hipokamp i upuszczać lodowatą sacharozę aCSF w sposób ciągły, aby utrzymać tkankę dotlenioną i nawodnioną.</li>
</ol>
3. Eksperymentalna konfiguracja systemu
<ol>
	<li>Przyklej specjalnie wyprodukowany PMEA do pakietu z siatką styków (PGA) i użyj połączenia mikrodrutowego, aby połączyć każdą końcówkę z pojedynczej mikroelektrody z podkładką kołka na opakowaniu (Rysunek 3B). Następnie włóż opakowanie do gniazdka na wykonanej na zamówienie płytce drukowanej 13.</li>
	<li>Indywidualnie podłącz każdą mikroelektrodę do jej filtrów z częstotliwością odcięcia pasma przepustowego od 1 Hz do 4 KHz i wzmacniaczy o wzmocnieniu 100 na specjalnie wykonanej płytce drukowanej 13. Digitalizacja wyjścia analogowego z płytki drukowanej za pomocą systemu konwersji A/D oraz pozyskiwanie i przechowywanie danych na komputerze.</li>
	<li>Przyklej specjalnie wykonaną plastikową komorę rejestracyjną wokół matrycy z rurkami wlotowymi i wylotowymi do przepływu roztworu (Rysunek 4A). Użyj co najmniej dwóch butelek, aby utrzymać różne roztwory w systemie, a następnie połącz i kontroluj rurki wyjściowe butelek za pomocą trzech zaworów. Podłącz wyjście zaworu trójzaworowego do systemu rurek z komorą kroplówkową, która kieruje roztwór do komory nagrywania.</li>
	<li>Pomiędzy zaworem trójzaworowym a wlotem komory rejestracyjnej umieścić grzałkę elektryczną w celu podgrzania roztworu do kontrolowanej temperatury (35 °C) przed skierowaniem roztworu do komory zapisu. Podłączyć wylot komory rejestracyjnej do rurki próżniowej, aby zebrać roztwór do kolby podłączonej do rurki próżniowej. Nie poddawaj recyklingowi żadnego roztworu w żadnym eksperymencie w tym badaniu.</li>
</ol>
4. Umieszczenie rozwiniętego hipokampa na PMEA w celu zarejestrowania aktywności neuronalnej
<ol>
	<li>Aby przygotować zestaw eksperymentalny, napełnij jedną butelkę zwykłym aCSF, a drugą butelką 4-AP aCSF. W obu butelkach bąbelkować 95% O2/ 5% CO2 od samego początku każdego eksperymentu. Użyj złącza trójzaworowego, aby kontrolować, które rozwiązanie zostanie wybrane podczas eksperymentu. Podłącz rurkę próżniową na wylocie komory, aby przepompować roztwór do pojemnika na kurz. Podgrzać rurociąg przed dostarczeniem go do komory rejestracyjnej i utrzymywać roztwór na kontrolowanym poziomie temperatury (35 °C).</li>
	<li>Gdy wlot i wylot komory nagraniowej są zamknięte, użyj specjalnie wykonanego szklanego zakraplacza do pipet, aby przenieść i umieścić rozłożony hipokamp w komorze nagrywającej. Pod mikroskopem umieść rozłożony hipokamp za pomocą zwykłego małego pędzla, podczas gdy tkanka unosi się w roztworze. Umieść rozłożony hipokamp stroną z zębodołem skierowanym w dół, obszarem CA3 skierowanym na zewnątrz i polem CA1 skierowanym w stronę badacza.</li>
	<li>Ostrożnie odessać roztwór z komory za pomocą pipety próżniowej od krawędzi komory rejestrującej, aby obniżyć poziom roztworu, aż komora zostanie wysuszona, a tkanka zostanie opuszczona na matrycę. Następnie ostrożnie umieść wykonaną na zamówienie kotwicę tkankową (ryc. 4) (nr 14 w określonych materiałach i sprzęcie) na wierzchu tkanki, aby utrzymać rozłożony hipokamp na tablicy. Wlej kilka kropli roztworu do komory nagrywającej, aby ją napełnić, i stopniowo otwieraj wlot i wylot, aby dostosować natężenie przepływu do około dwóch kropli na sekundę w komorze kroplowej dożylnej.</li>
	<li>Inkubować tkankę w komorze rejestracyjnej z normalnym aCSF przez około 1 minutę, aby wyzdrowieć, a następnie zmienić dopływ roztworu na rozpuszczony aCSF 4-AP i odpowiednio dostosować szybkość przepływu. Inkubuj tkankę w rozpuszczonym 4-AP aCSF przez około 5 do 10 minut, a następnie badacz może uruchomić oprogramowanie, aby zarejestrować sygnał, gdy pojawi się spontaniczna aktywność.</li>
</ol>
5. Usuwanie tkanki z PMEA po eksperymencie
<ol>
	<li>Kontroluj kotwicę tkankową za pomocą mikromanipulatora i stopniowo podnoś tkankę z komory zapisu. Wyłącz zarówno wlot, jak i wylot, aby zatrzymać przepływ w komorze nagrywania. Komora zapisu powinna być wypełniona roztworem lub dodać kilka kropli roztworu, aby napełnić komorę, jeśli komora zapisu nie jest pełna.</li>
	<li>Użyj małego pędzla, aby podnieść każdy róg chusteczki. Jeśli tkanka nie unosi się w roztworze, należy użyć rurki próżniowej, aby ostrożnie wysuszyć komorę, tak aby tkanka nadal znajdowała się na matrycy. Następnie ostrożnie otwórz wlot, aby stopniowo napełniać komorę i zamknij wlot, aby zatrzymać przepływ, gdy komora nagrywania jest pełna. Nałóż mały pędzelek, aby ponownie podnieść każdy róg chusteczki.</li>
	<li>Powtarzać krok 5.2, aż tkanka zostanie odłączona od matrycy i zacznie unosić się w roztworze. Jeśli tkanka unosi się w roztworze, użyj rurki próżniowej, aby odessać tkankę. Otwórz przepływ na wlocie i otwórz podciśnienie na wylocie. Umyj system wodą destylowaną i wysusz go.</li>
</ol>

<ol><li>Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+traveling+waves+in+the+Mammalian+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Control of traveling waves in the Mammalian cortex.</a> Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).</li>
<li>Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+propagation+of+4-AP-induced+epileptiform+activity+in+neonatal+intact+limbic+structures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro.</a> Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).</li>
<li>Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+spread+of+electrical+activity+in+rat+hippocampal+slices+by+voltage-sensitive+optical+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes.</a> J Physiol. 333, 269-291 (1982).</li>
<li>Gloveli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+arrangement+of+rhythm-generating+microcircuits+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).</li>
<li>Amaral, D. G., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+the+hippocampal+formation%3A+a+review+of+anatomical+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data.</a> Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).</li>
<li>Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+studies+of+the+hippocampus+and+hippocampal-dependent+behaviors%3A+insights+from+interdisciplinary+studies+and+tips+for+new+investigators%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators.</a> Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+Epileptiform+Activity+Can+Be+Independent+of+Synaptic+Transmission%2C+Gap+Junctions%2C+or+Diffusion+and+Is+Consistent+with+Electrical+Field+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission.</a> J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).</li>
<li>Kibler, A. B., Durand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+wave+propagation+of+epileptiform+activity+in+the+planar+mouse+hippocampus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro.</a> Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).</li>
<li>Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+voltage+sensor+imaging+of+electrical+activity+from+neurons+in+hippocampal+slices+from+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice.</a> J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).</li>
<li>Wingenfeld, K., Wolf, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+%2C+memory%2C+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stress , memory, the hippocampus.</a> Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).</li>
<li>Liu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+high-K%2B-induced+epileptiform+discharges+in+hippocampal+slice+and+the+effects+of+valproate%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate.</a> Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).</li>
<li>Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+planar+multielectrode+array+for+extracellular+recording%3A+application+to+hippocampal+acute+slice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice.</a> J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).</li>
<li>Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+aspect+ratio+microelectrode+array+for+mapping+neural+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro.</a> J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).</li>
<li>Schechter, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potassium+channel+blockers+4-aminopyridine+and+tetraethylammonium+increase+the+spontaneous+basal+release+of+%5B3H%5D5-hydroxytryptamine+in+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices.</a> J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).</li>
<li>Perreault, P., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-aminopyridine-induced+epileptiform+activity+and+a+GABA-mediated+long-lasting+depolarization+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus.</a> J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).</li>
<li>Chesnut, T. J., Swann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+activity+induced+by+4-aminopyridine+in+immature+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus.</a> Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).</li>
<li>Nam, Y., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Microelectrode+Array+Technology+and+Neural+Recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Sulser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neuron+firing+and+local+field+potentials+in+the+in+vitro+4-aminopyridine+epilepsy+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model.</a> J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowanie rozłożonego preparatu hipokampa, w którym podłużne i poprzeczne osie hipokampa są zachowane w połączeniu z penetrującym układem mikroelektrod, stanowi potężne narzędzie do badania połączeń anatomicznych lub propagacji neuronalnej w hipokampie 7. Ta procedura rozwijania ma również zastosowanie do badania hipokampa u dorosłych myszy. Ostatnie badania z tym preparatem wykazały, że indukowana przez 4-AP aktywność padaczkowa może rozprzestrzeniać się z ukośnym frontem fali na całym obszarze rozłożonego ...

Zrozumienie przewodnictwa lub propagacji sygnałów neuronowych jest kluczowe dla określenia mechanizmu komunikacji neuronalnej zarówno w normalnym funkcjonowaniu, jak i w stanach patologicznych w mózgu 1-3. Hipokamp jest jedną z najszerzej badanych struktur w mózgu, ponieważ odgrywa fundamentalną rolę w kilku funkcjach mózgu, takich jak pamięć i śledzenie przestrzenne, a także bierze udział w kilku patologicznych zmianach, które dramatycznie wpływają również na zachowanie 1,6 . Chociaż hipokamp wykazuje złożoną organizację, różne elementy jego struktury można łatwo zidentyfikować i uzyskać do nich dostęp w przygotowaniu plastrów4-6. Wiadomo, że w kierunku poprzecznym hipokampa aktywność neuronalna rozprzestrzenia się przez szlak trisynaptyczny, który obejmuje zakręt zębaty (DG), CA3, CA1 i subiculum 4,5. Uważa się, że transmisja synaptyczna i przewodnictwo aksonalne odgrywają główną rolę w komunikacji w tym obwodzie poprzecznym 4,6. Jednak propagacja sygnału neuronalnego odbywa się zarówno w kierunku poprzecznym, jak i podłużnym 4,6. Oznacza to, że hipokamp nie może być w pełni zbadany za pomocą preparatów warstwowych, które ograniczają obserwację do określonego kierunku propagacji 4. Wycinek podłużny został opracowany w celu zbadania ścieżek aksonalnych wzdłuż osi podłużnej 5. Naukowcy zaobserwowali specyficzne dla zachowania oscylacje gamma i theta, głównie wzdłuż osi poprzecznej i podłużnej6. Zachowania te były badane oddzielnie, jednak jednoczesny dostęp do obu kierunków jest kluczowy dla zrozumienia tych zachowań. Nawet przy rozwoju nienaruszonego preparatu hipokampa trudno jest monitorować rozmnażanie się w całej tkance ze względu na pofałdowaną strukturę hipokampa 4. Rozłożysty hipokamp zapewnia dostęp do upakowanych neuronów w postaci płaskiej dwuwymiarowej warstwy komórkowej 7,8.
Rozwijając zakręt zębaty (DG) (Rysunek 1), hipokamp przyjmuje spłaszczony kształt z prostokątną konfiguracją, w której zarówno poprzeczne, jak i podłużne połączenia pozostają nienaruszone, a piramidalna warstwa komórkowa ułożona w dwuwymiarowy arkusz zawierający zarówno CA3, jak i CA1, pozostawiając płaski kawałek tkanki nerwowej, który może być użyty do zbadania propagacji neuronalnej (Rysunek 2) 8. Aktywność neuronalna może być następnie monitorowana za pomocą indywidualnych szklanych pipet, układów mikroelektrod, elektrod stymulujących, a także barwników wrażliwych na napięcie (VSD) 3,7,8. Ponadto genetycznie kodowany wskaźnik napięcia od myszy transgenicznych może być używany do śledzenia wzorca propagacji 9.
Płaska konfiguracja rozwiniętej sieci hipokampa dobrze nadaje się do zapisu metodą optyczną, ale także do układu mikroelektrod. Większość dostępnych na rynku macierzy jest wytwarzana z płaskich lub niskoprofilowych elektrod i może rejestrować aktywność neuronalną zarówno w wycinkach tkanki, jak i hodowanych neuronach 10-12. Jednak stosunek sygnału do szumu (SNR) zmniejsza się, gdy sygnały są uzyskiwane z nienaruszonej tkanki, ponieważ soma neuronów znajduje się głębiej w tkance. Do poprawy SNR wymagane są układy elektrod mikroelektrodowych o wysokim współczynniku kształtu.
W tym celu w naszym laboratorium opracowano penetrujący układ mikroelektrod (PMEA), który umożliwia bezpośrednie sondowanie tkanki poprzez wprowadzenie 64 kolców o średnicy 20 μm i wysokości 200 μm do rozłożonego hipokampa 7,13. Ten układ mikroelektrod ma wyższy stosunek sygnału do szumu w porównaniu z obrazowaniem barwnika wrażliwym na napięcie, a stosunek sygnału do szumu pozostaje stabilny podczas eksperymentu 7,13. Połączenie rozłożonego preparatu hipokampa i PMEA zapewnia nowy sposób badania propagacji neuronalnej w płaszczyźnie dwuwymiarowej. Eksperymenty z wykorzystaniem tej techniki przyniosły już znaczące wyniki dotyczące mechanizmów propagacji sygnałów nerwowych w hipokampie, dzięki którym aktywność neuronalna może rozprzestrzeniać się niezależnie od synaps lub synaps elektrycznych 7.

<table><tbody><tr><td>słoik eksykatora</td><td>LABRECYCLERS Inc.</td><td>5410</td><td>Umieść zwykłe ręczniki papierowe na dnie słoika do znieczulenia zwierzęcego.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ostrze i wykonany przez Custome stolik chirurgiczny do rozkładania hipokampa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Szalkę Petriego umieszcza się do góry nogami (pośrodku) w lodzie, a na niej umieszczono mokrą bibułę filtracyjną.</td></tr><tr><td>Wykonana na zamówienie komora do odzyskiwania tkanek</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Plastikowe rurki zostały sklejone plastikową siatką na dole i bąbelkowane 95% O2 / 5% CO2 w aCSF.</td></tr><tr><td>Prosta obsługa&nbsp; Nożyczki</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17336B&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Instrumenty Medco nr: 81995&nbsp;</td><td>Te nożyczki są używane do&nbsp; &nbsp; Odetnij głowę myszom.</td></tr><tr><td>Integra Miltex Goldman-Fox&nbsp; Nożyczki</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-517&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MILTEX INC&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Nr: 5-SC-320</td><td>Te nożyczki służą do cięcia czaszki myszy.</td></tr><tr><td>Miltex Kleszcze do histerektomii</td><td>Claflin Sprzęt medyczny</td><td>CESS-722033-00001</td><td>Te kleszcze służą do obierania przeciętej czaszki w celu odsłonięcia mózgu</td></tr><tr><td>Mikroszpatułka</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td>Ta mikroszpatułka służy do przenoszenia całego mózgu półsfery do komory rezonansowej.</td></tr><tr><td>Frey Scientific Półmikroszpatułka ze stali nierdzewnej</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td>ta półmikroszpatułka służy do przenoszenia rozłożonego hipokampa do glukozy aCSF w komorze regeneracyjnej.</td></tr><tr><td>mały pędzel</td><td>Lowe's</td><td>tem #:&nbsp; 105657&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Wzór #:&nbsp; 90219</td><td>Ten o najmniejszym rozmiarze w normalnym opakowaniu pędzli</td></tr><tr><td>Narzędzie pomocy ze szkła polerowanego ogniowo</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY</td><td>To narzędzie zostało wypolerowane ogniowo i wykonane ze zwykłych szklanych pipet Pasteura.</td></tr><tr><td>Igła szklana</td><td>wykonana</td><td></td> na zamówienie, nie dotyczy <td>To narzędzie zostało wypolerowane ogniowo i wykonane ze zwykłych szklanych pipet Pasteura.</td></tr><tr><td>Wykonane na zamówienie szklane narzędzie z metalową pętlą z drutu</td>, <td>nie</td><td>dotyczy</td><td>To narzędzie zostało wypolerowane ogniowo i wykonane ze zwykłych szklanych pipet Pasteura z metalową pętlą z drutu o zmienionym kształcie.</td></tr><tr><td>Wykonany na zamówienie szklany zakraplacz</td><td>do roztworu N/A</td><td>N/A</td><td>To narzędzie zostało wykonane ze zwykłych szklanych pipet Pasteura z naciętymi końcówkami i gumową głowicą przymocowaną do odciętego końca.</td></tr><tr><td>Wykonana na zamówienie kotwa tkankowa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Siatka z włókna nylonowego została przyklejona do izolowanego pierścienia z drutu miedzianego. Kotwica tkankowa była przytrzymywana przez mikromanipulator.</td></tr><tr><td>Niestandardowa matryca mikroelektrod</td><td>NIE DOTYCZY</td><td></td><td>Więcej szczegółów na temat matrycy można znaleźć do&nbsp; Kibler, i wsp., 2011.&nbsp;</td></tr><tr><td>Wykonane na zamówienie obwody filtrów i wzmacniaczy dla macierzy</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Więcej szczegółów na temat tablicy można znaleźć w&nbsp; Kibler, i wsp., 2011.&nbsp;</td></tr><tr><td>Procesor akwizycji danych 3400a</td><td>Microstar Laboratories</td><td>N/A</td><td>Jest to kompletny system akwizycji danych z przetwornikiem A/D.</td></tr></tbody></table>

propagacja aktywności neuronalnej w rozłożonym preparacie hipokampa z penetrującym układem mikroelektrod

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

Ten protokół opisuje metodę przygotowania nowego preparatu in vitro płaskiego hipokampa w połączeniu z mikro-maszynową matrycą do mapowania aktywności neuronalnej w hipokampie. Preparat poprzeczny plastra hipokampa jest najczęstszym preparatem tkankowym do badania elektrofizjologii hipokampa. Opracowano również podłużny wycinek hipokampa w celu zbadania połączeń podłużnych w hipokampie. Nienaruszony hipokamp myszy może być również utrzymywany in vitro, ponieważ jego grubość umożliwia odpowiednią dyfuzję tlenu. Jednak te trzy preparaty nie zapewniają bezpośredniego dostępu do propagacji neuronalnej, ponieważ brakuje części tkanki lub jest ona pofałdowana. Rozłożony, nienaruszony hipokamp zapewnia zarówno poprzeczne, jak i podłużne połączenia w płaskiej konfiguracji dla bezpośredniego dostępu do tkanki w celu analizy pełnego zakresu propagacji sygnału w hipokampie in vitro. Aby skutecznie monitorować aktywność neuronalną z warstwy komórkowej, wyprodukowano specjalnie wykonany penetrujący układ mikroelektrod (PMEA) i nałożono go na rozłożony hipokamp. PMEA z 64 elektrodami o wysokości 200 μm może rejestrować aktywność neuronalną głęboko w hipokampie myszy. Unikalne połączenie rozłożonego preparatu hipokampa i PMEA zapewnia nowe narzędzie in vitro do badania prędkości i kierunku propagacji aktywności neuronalnej w dwuwymiarowych regionach CA1-CA3 hipokampa o wysokim stosunku sygnału do szumu.

Dane przedstawione na rysunkach zostały zarejestrowane w preparacie rozłożonego hipokampa z dodatkiem 4-AP (100 µM) do aCSF podczas inkubacji tkanki w komorze rejestracyjnej w temperaturze pokojowej (25 °C). Zazwyczaj aktywność rozpoczyna się w ciągu 5 min, jednak w niektórych tkankach hipokampa pochodzących od starszych zwierząt może to zająć więcej czasu. Wywołane 4-AP wyładowania neuronalne obserwowane za pomocą PMEA są zgodne z wcześniej raportowanymi 14,15. Ponieważ elektrody mają wysokość 200 µm, końcówk...

Opracowaliśmy in vitro rozkładany hipokamp, który zachowuje układ neuronów CA1-CA3. W połączeniu z penetrującym układem mikroelektrod, aktywność neuronalna może być monitorowana zarówno w orientacji podłużnej, jak i poprzecznej. Ta metoda ma przewagę nad preparatami plastrów hipokampa, ponieważ rozmnażanie w całym hipokampie może być rejestrowane jednocześnie.

Propagacja aktywności neuronalnej w rozłożonym preparacie hipokampa z penetrującym układem mikroelektrod

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie procesu rozwijania hipokampa gryzoni i umieszczania preparatu z płaskiej tkanki na penetrującym układzie mikroelektrod. Do nagrywania. Osiąga się to poprzez najpierw odizolowanie hipokampa myszy od połowy jej mózgu.Drugim krokiem jest rozwinięcie zakrzywionej struktury hipokampa za pomocą specjalnie wykonanych narzędzi. Następnie rozłożony hipokamp jest przenoszony do komory nagraniowej i umieszczany na matrycy rejestracyjnej. Ostatnim krokiem jest usunięcie rozłożonego hipokampa z matrycy po eksperymencie.Ostatecznie w analizie danych stosuje się indywidualną metodę mapowania normalizacji, aby pokazać propagację aktywności neuronalnej rejestrowaną przez penetrujący układ mikroelektrod. Otóż główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam rejestrować aktywność neuronalną w dwóch kierunkach, poprzecznym i podłużnym. Aby zobaczyć rzeczywistą propagację aktywności neuronalnej, potrzebujesz nienaruszonego hipokampa, rozwiń słoiki z wgnieceniami i połóż się płasko w komorze nagrywającej, a propagacja będzie odbywać się zarówno w kierunku poprzecznym, jak i podłużnym.Udało nam się wtedy ustalić prędkość rozprzestrzeniania się tkanki. Byliś

neural-activity-propagation-an-unfolded-hippocampal-preparation-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Propagacja aktywności neuronowej w rozwiniętym preparacie hipokampu z mikroelektrodowym penetracyjnym układem elektrod

Niezawodna metoda badania lawin neuronalnych, czyli niezależnych od skali czasowo-przestrzennych wybuchów aktywności, które świadczą o dynamice stanu krytycznego w korze mózgu. Lawiny pojawiają się spontanicznie w rozwijających się warstwach powierzchownych hodowli kory, co umożliwia długoterminowe pomiary aktywności przy użyciu planarnych zintegrowanych matryc wieloelektrodowych (MEA) w ściśle kontrolowanych warunkach.

Rejestracja lawin neuronalnych w kulturach organotypowych za pomocą macierzy wieloelektrodowej

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Ten film demonstruje procedurę konfiguracji komory rejestracyjnej z penetrującym układem mikroelektrod (PMEA) do przechwytywania sygnałów neuronowych z rozłożonego hipokampa. Metoda ta pozwala nam badać szybkość i kierunek propagacji aktywności neuronalnej w obrębie rozwiniętego hipokampa in vitro.

Rejestracja aktywności neuronalnej rozwiniętej tkanki hipokampa za pomocą penetrującego układu mikroelektrod

Ten film demonstruje procedurę ustawiania wycinka mózgu w komorze zanurzeniowej w celu rejestrowania aktywności synaptycznej. Proces ten polega na zabezpieczeniu wycinka na papierze soczewki, utrzymaniu ciągłego przepływu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) w celu zapewnienia żywotności neuronów oraz dokładnym ustawieniu elektrod stymulacyjnych i rejestrujących względem określonego obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Taka konfiguracja pozwala na precyzyjne monitorowanie...

Rejestrowanie pobudzających potencjałów postsynaptycznych pola neuronalnego w ostrych wycinkach hipokampa

Źródło: Slezia, A. i wsp. Elektroforetyczne dostarczanie kwasu γ-aminomasłowego (GABA) do ogniska padaczkowego zapobiega napadom padaczkowym u myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje elektroforetyczne dostarczanie kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) w celu zahamowania aktywności napadowej u znieczulonej myszy. Przedstawiono w nim etapy związane z implantacją sondy, rejestracją aktywności neuronalnej, indukcją napadów i kontrolowanym dostarczaniem GABA za pomocą mikroprzepływowej pompy...

Elektroforetyczne dostarczanie GABA do ogniska padaczkowego znieczulonej myszy

Wszczepianie zorganizowanych układów mikroprzewodów do użycia w jednojednostkowych zapisach elektrofizjologicznych stanowi szereg wyzwań technicznych. Opisano również metody wykonywania tej techniki i niezbędny sprzęt. Omówiono również korzystne wykorzystanie zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrywania z różnych podregionów neuronowych o wysokiej selektywności przestrzennej.

Procedura wszczepiania zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrań pojedynczych jednostek u obudzonych, zachowujących się zwierząt

Ten artykuł wideo opisuje eksperymentalne procedury badania długoterminowej plastyczności i jej procesów asocjacyjnych, takich jak znakowanie synaptyczne, przechwytywanie i krzyżowanie w neuronach piramidowych CA1 przy użyciu ostrych wycinków hipokampa od gryzoni.

Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Ten protokół opisuje rejestrację lokalnych potencjałów pola za pomocą wielozębowych liniowych sond krzemowych. Konwersja sygnałów za pomocą analizy gęstości źródła prądu pozwala na rekonstrukcję lokalnej aktywności elektrycznej w hipokampie myszy. Dzięki tej technice można badać ograniczone przestrzennie oscylacje mózgu u swobodnie poruszających się myszy.

Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Poznaj metodę rozwijania hipokampa myszy do płaskiego preparatu tkankowego z rejestracją aktywności neuronalnej za pomocą penetrującej macierzy mikroelektrod. Technika umożliwia jednoczesne monitorowanie sygnałów w całej strukturze hipokampa.

Propagacja aktywności neuronalnej w rozłożonym preparacie hipokampa z penetrującym układem mikroelektrod

Przeglądaj więcej filmów