Name: Guz pierwotny i izolacja komórek MEF w celu zbadania przerzutów do płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek pierwotnych z guzów piersi myszy oraz przygotowania fibroblastów zarodkowych MEF do badania przerzutów nowotworowych do płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować NIH, LACaTS i fundacji Ochsner clinic za wsparcie finansowe.

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) LSU School of Medicine. Wszystkie narzędzia muszą być autoklawowane przed preparacją.
1. Przygotowanie pierwotnych komórek z guzów piersi u myszy
<ol>
	<li>Użyj modelu mysiego, który został genetycznie zmodyfikowany za pomocą środkowego antygenu T wirusa guza sutka myszy (mysz transgeniczna MMTV-PyMT), u których spontanicznie rozwijają się guzy, jak opisano wcześniej 6.</li>
	<li>Uśmierc myszy izofluranem (99,9%) i spryskaj 75% etanolem, aby zapewnić sterylne środowisko (ryc. 1A).</li>
	<li>Otwórz skórę od obszaru ujścia cewki moczowej do szyi nożyczkami. Przypnij skórę w dół, aby umożliwić łatwy dostęp do narządów (ryc. 1B).</li>
	<li>Wyizoluj guz piersi sutka i przemyj zimnym, sterylnym, buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) (pH 7,4) (ryc. 1C).</li>
	<li>Przenieś guz na sterylną 10 cm płytkę do hodowli tkankowej i posiekaj go sterylną żyletką i nożyczkami na około 1 mm3 kawałki. Kolejne kroki należy wykonywać w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Inkubować posiekaną tkankę nowotworową z kolagenazą rozpuszczoną w pożywce DMEM wolnej od surowicy o końcowym stężeniu 1 mg / ml na kołysce przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Odwirować zawiesinę tkanki nowotworowej przez 3 minuty przy 200 x g. 
	UWAGA: Inkubacja kolagenazy jest niezbędna do enzymatycznej dysocjacji tkanki.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad i przepłukać go 3 razy PBS (pH 7,4) przez odwirowanie przez 3 minuty przy 200 x g. Po ostatnim przemyciu zdekantować supernatant.</li>
	<li>Zawiesić tkankę za pomocą 2 ml trypsyny EDTA na 5 minut w temperaturze 37 °C podczas nutowania. Odwirować zawiesinę przez 3 minuty przy 200 x g i powtórzyć płukanie.</li>
	<li>Zawiesić osad tkankowy w normalnym podłożu wzrostowym (DMEM, 10% FBS, 2X długopis/paciorkowiec) na 10-centymetrowej płytce. Zmieniaj nośnik codziennie przez następne 3 dni. Hoduj komórki, aż do uzyskania pożądanej liczby komórek. 
	UWAGA: Z tej procedury zostanie wyizolowanych około 1x107 komórek. Inne modele nowotworzenia sutka u myszy, takie jak MMTV-Neu, dają niższą wydajność komórek w porównaniu z MMTV-PyMT. W przypadku korzystania z modeli, które dają niższą wydajność, korzystne jest rozpoczęcie od większego guza i dłuższego hodowania komórek.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja płuc myszy w celu wizualizacji przerzutów do płuc
<ol>
	<li>Przed ekstrakcją płuc należy usunąć wątrobę i przeponę. Usuń żebra bez naruszania płuc.</li>
	<li>Za pomocą cienkich nożyczek otwórz górną część tchawicy, która znajduje się bliżej żyły szyjnej.</li>
	<li>Za pomocą cewnika wstrzyknij środek, taki jak 1 ml Z-fix lub tuszu indyjskiego, przez tchawicę, aby wypełnić płuca (ryc. 2A). Zanurz płuca Z-fix w parafinie.</li>
	<li>Odbarwić płuca wstrzyknięte tuszem indyjskim w roztworze Fekete (100 ml 70% alkoholu, 10 ml 10% buforowanej formaliny i 5 ml lodowatego kwasu octowego) przez 5 minut. Zdefiniuj guzki nowotworowe w miejscach wtórnych o średnicy ≥ 0,5 mm, określ guzki jako przerzuty. 
	UWAGA: Ze względu na zablokowanie oskrzeli i oskrzelików przez guz, guzki nowotworowe nie mogą wchłonąć 15% atramentu indyjskiego, a zatem normalna tkanka płucna będzie, a guzki nowotworowe będą w kolorze białym 7. Umożliwi to wizualizację poszczególnych guzków nowotworowych (ryc. 2B).</li>
</ol>
3. Przygotowanie mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) z embrionów myszy
<ol>
	<li>Poświęć ciężarne myszy izofluranem (99,9%) i spryskaj 75% etanolem, aby zapewnić sterylne środowisko.</li>
	<li>Otwórz skórę od obszaru ujścia cewki moczowej do szyi nożyczkami i odizoluj zarodki od macicy.</li>
	<li>Uważaj, aby nie przeszkadzać zarodkom podczas otwierania skóry.</li>
	<li>Usuń rogi macicy i opłucz je w zimnym, sterylnym PBS (pH 7,4).</li>
	<li>Bardzo ostrożnie oddziel zarodek od łożyska i umieść zarodki na 10-centymetrowej płytce zawierającej lodowaty PBS (pH 7,4).</li>
	<li>Usunąć głowę, wątrobę i jelito z zarodka i umieścić pozostałą część na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej zawierającej PBS (pH 7,4).</li>
	<li>Przenieść ciało zarodka na inną 12-dołkową płytkę zawierającą trypsynę EDTA i pokroić na małe kawałki (~ 1 mm3) za pomocą sterylnej żyletki i nożyczek. Inkubować posiekany materiał z 5 ml trypsyny EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dezaktywuj trypsynę, dodając 1 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do posiekanych zarodków. Odwirować zawiesinę z prędkością 200 x g przez 10 minut, ostrożnie usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad z 1 ml ciepłej pożywki DMEM i przenieść całą zawartość do 10 cm naczynia zawierającego 10 ml DMEM (z 20% FBS i 2X Penicylina/Streptomycyna).</li>
	<li>Zmieniaj podłoże codziennie przez dwa dni. Hoduj komórki, aż do osiągnięcia pożądanej liczby komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Natur%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Poste, G., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Natur%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of cancer metastasis.</a> Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).</li>
<li>Wan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Metastasis+Moving+New+Biological+Insights+into+the+Clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic.</a> Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).</li>
<li>Bergers, G., Benjamin, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenesis+and+the+angiogenic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumorigenesis and the angiogenic switch.</a> Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).</li>
<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).</li>
<li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene%3A+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).</li>
<li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Identification+of+Experimental+Pulmonary+Metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases.</a> J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).</li>
<li>Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tumor+immunity+and+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+using+dendritic+cells+transfected+with+messenger+RNA+amplified+from+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells.</a> Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).</li>
<li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+breast+cancer%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li>
<li>Watts, A. M., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+Tumor+Foci+in+an+Experimental+Murine+Tumor+Model+Using+Computer-Assisted+Video+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioche%22%5BJournal%5D)">Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging.</a> Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+Established+Pulmonary+Metastases+and+Subcutaneous+Tumor+Mediated+by+the+Systemic+Administration+of+High-Dose+Recombinant+Interleukin+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Me%22%5BJournal%5D)">Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2.</a> J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).</li>
<li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Re%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Re. 8 (4), 212(2006).</li>
<li>Veer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+predicts+clinical+outcome+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer.</a> Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Ten protokół służy do izolowania komórek pierwotnych ze świeżego guza myszy. Lizaty przygotowane tą metodą są przydatne do analizy białek, DNA i RNA. Komórki rakowe z pierwotnego guza piersi często dają przerzuty do mózgu, płuc i kości 1. W zestawie znajduje się technika ekstrakcji płuc w celu wykrycia przerzutów. Zabarwienie płuc plamą atramentową pozwoli na wizualizację guzków nowotworowych, jak pokazano na rycinie 2B. Unieruchomienie płuc w roztworze Z-fix pozwoli nam na wykonanie odcinków ...

Przerzuty są ostatnim krokiem w postępie raka piersi 1. Obejmuje szereg etapów, w których komórki nowotworowe są uwalniane z guza pierwotnego i rozprzestrzeniane do innych narządów 2. Komórki muszą być zdolne do wewnątrznaczyniowego, przetrwania w krążeniu, wynaczynienia do odległych narządów i przetrwania w tym nowym układzie narządów 3. Każdy etap nowotworzenia jest ściśle kontrolowany przez komórki poprzez różne zmiany genetyczne i epigenetyczne 4. Do badania mechanizmów nowotworzenia raka piersi wykorzystano mysie systemy modelowe ze względu na ich krótką żywotność, niewielkie rozmiary i szybki czas rozmnażania. Niektóre główne zalety stosowania modeli mysich w badaniach nad rakiem to molekularne i fizjologiczne podobieństwa, które dzielą z ludźmi 5. 
Uznane linie komórkowe myszy i ludzi były szeroko wykorzystywane w badaniach nad rakiem piersi. Chociaż możemy uzyskać pewne informacje na temat etapów przerzutów za pomocą tych komórek, genetycznie zmodyfikowane modele zwierzęce z supresorami/onkogenami nowotworów dostarczą znacznie więcej informacji na temat rozwoju guza i przerzutów, począwszy od stadium embrionalnego. W ten sposób dzięki tym mysim modelom możemy uzyskać genetyczną i rozwojową regulację wzrostu guza. Co więcej, mikrośrodowisko guza odgrywa również ważną rolę w ekspresji genów komórek nowotworowych i naśladowanie tego samego scenariusza w badaniach z wykorzystaniem ustalonych linii komórkowych może być trudne. Pierwotne ludzkie guzy sutka można również wykorzystać do badania nowotworzenia sutka u myszy. Główną wadą stosowania izolowanych guzów piersi jest to, że ten nowo zagnieżdżony guz nie ma unaczynienia myszy i tkanki limfatycznej. Natomiast systemy genetycznego modelu myszy do badania nowotworzenia sutka pozwolą nam monitorować etapy przerzutów, analizować mikrośrodowisko guza i dostęp do całego organizmu 5.
Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie nowotworów piersi u myszy. Wiadomo, że rak piersi zazwyczaj daje przerzuty do mózgu, płuc i kości. Protokół ten pozwala na izolację pierwotnych komórek guza sutka, a także badanie przerzutów raka piersi do płuc. Ponadto dołączono inny protokół analizy fibroblastów embrionalnych myszy (MEF) z zarodka myszy. Razem techniki te są przydatne w badaniu nowotworzenia sutka u myszy.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td>Przechowywać pod kątem 4 stopni; C</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Życie&nbsp; technologie</td><td>25300-062</td><td>Przechowywać w &ndash; 20 & deg; C</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>Przechowywać pod adresem &ndash; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>Przechowywać pod adresem &ndash; 20&deg; C</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Life&nbsp; technologie</td><td>15140-122</td><td>Przechowywać pod adresem 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td>Przechowywać pod adresem &ndash; 80 & deg; C</td></tr><tr><td>Z-fix</td><td></td> <td>ANATECH#174</td><td>Sklep w RT</td></tr><tr><td>India Ink</td><td>Yasutomo</td><td></td><td>Sklep w RT</td></tr><tr><td>AERRANE (Isoflurane)</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-773-60</td><td>Sklep w RT</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>EMD</td><td>AX0441-3</td><td>Sklep w RT</td></tr></tbody></table>

guz pierwotny i izolacja komórek mef w celu zbadania przerzutów do płuc

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

W procesie nowotworu piersi, przerzutowe stadium choroby stanowi największe zagrożenie dla osoby dotkniętej chorobą. Normalne komórki piersi ze zmienionymi genotypami mają teraz zdolność do inwazji i przetrwania w innych tkankach. W tym protokole guzy sutka myszy są usuwane, a komórki pierwotne są przygotowywane z guzów. Komórki wyizolowane w wyniku tej procedury są następnie dostępne do eksperymentów z profilowaniem genów. Aby przerzuty zakończyły się sukcesem, komórki te muszą być zdolne do wewnątrznaczyniowego, przetrwania w krążeniu, wynaczynienia do odległych narządów i przetrwania w nowym układzie narządów. Płuca są typowym celem przerzutów raka piersi. Odkryto zestaw genów, które pośredniczą w selektywności przerzutów do płuc. Tutaj opisujemy metodę badania przerzutów do płuc z genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy. Ponadto dołączono inny protokół analizy fibroblastów embrionalnych myszy (MEF) z zarodka myszy. Komórki MEF z tego samego typu zwierząt dostarczają wskazówek dotyczących ekspresji genów komórek nienowotworowych. Razem techniki te są przydatne w badaniu nowotworzenia sutka u myszy, związanych z nim mechanizmów sygnalizacyjnych i szlaków nieprawidłowości w zarodkach.

Stopień progresji guza, przy którym następuje uśpienie zwierzęcia, zależy od konkretnego badania oraz wytycznych IACUC. Na Rysunku 1A przedstawiono 100-dniową mysz szczepu C57BL/6 z wirusem nowotworu gruczołu mlekowego myszy z antygenem T środkowym polyoma (MMTV-PyMT), która została uśpiona w trzecim miesiącu. Skórę rozcięto nożyczkami od obszaru ujścia cewki moczowej do szyi i przypięto szpilkami, aby umożliwić łatwy dostęp do organów, jak pokazano na Rysunku 1B. Umożliwiło to łatwy dos...

Celem tego protokołu jest badanie nowotworów piersi. Dzięki tej technice guzy sutka myszy są usuwane, a komórki pierwotne są przygotowywane z guzów. Dołączony jest protokół ekstrakcji płuc do badania przerzutów do płuc. Ponadto dołączono inny protokół analizy fibroblastów embrionalnych myszy z zarodka myszy.

Guz pierwotny i izolacja komórek MEF w celu zbadania przerzutów do płuc

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie agenezy guzów raka piersi u myszy. W pierwszej kolejności zaprezentowano przygotowanie pierwotnych komórek z guzów piersi myszy. Następnie przedstawiono sposób wyizolowania płuc myszy w celu wizualizacji przerzutów do płuc.Na koniec przedstawiono przygotowanie embrionalnych fibroblastów mysich z embrionów mysich, ponieważ metody te wykazują, że myszy transgeniczne dla antygenu T środkowego poliomy wirusa guzów piersi myszy mogą być wykorzystywane do badania genezy guzów raka piersi. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat raka piersi, można ją również zastosować do badania innych guzów litych. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ podczas etapów izolacji guza ważne jest wyizolowanie wyłącznie nowotworów, a nie innych tkanek. Należy rozpocząć od użycia nożyczek w celu otwarcia skóry od otworu cewki moczowej do szyi myszy transgenicznej dla antygenu T środkowego poliomy wirusa guzów piersi myszy.Następnie przypnij skórę i wyizoluj guz gruczołu mlekowego. Przemyj guz in situ zimnym PBS, a następnie umieść go w sterylnej 10-centymetrowej płytce do hodowli tkanek. Potem przenieś płytkę do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza i za pomocą sterylnego ostrza do golenia oraz nożyczek posiekaj guz na fragmenty o wielkości jednego milimetra sześciennego.Inkubować fragmenty z kolagenazą na kołysce w temperaturze 37 °C. Po dwóch godzinach odwirować powstałą zawiesinę tkanki nowotworowej. Osad przemyć jeszcze trzy razy w PBS Resus, a po ostatnim przemyciu zawiesić w dwóch mililitrach trypsyny EDTA na pięć minut w temperaturze 37 °C przy jednoczesnym mieszaniu.Następnie przemyć komórki jeszcze trzy razy i resuspender je w zwykłej pożywce wzrostowej. Na koniec inkubuj komórki w 10 centymetrowej szalce hodowlanej, wymieniając pożywkę codziennie przez kolejne trzy dni, aż do uzyskania pożądanej liczby komórek. Przed wyjęciem płuca usuń wątrobę oraz przeponę i odsunie żebra.Następnie otwórz górną część tchawicy, w pobliżu żyły szyjnej i za pomocą cewnika wstrzyknij odpowiedni preparat przez tchawicę, aby wypełnić płuca, a następnie wyjmij płuca i, w przypadku stosowania utrwalacza Z fix, zalej tkankę parafiną. W przypadku stosowania tuszu chińskiego zanurz tkankę w roztworze przez pięć minut; prawidłowa tkanka płucna przybierze czarny kolor, podczas gdy guzki nowotworowe będą widoczne jako białe. Wszelkie guzki nowotworowe zaobserwowane w miejscach przerzutów o średnicy większej lub równej 0.5 mm zaklasyfikuj jako przerzuty w celu wygenerowania embrionalnych fibroblastów mysich.W pierwszej kolejności należy rozciąć skórę ciężarnej myszy od otworu cewki moczowej do karku, tak jak właśnie pokazano, dbając o to, aby nie uszkodzić embrionów. Następnie należy wyciąć rogi macicy i wypłukać je w sterylnym PBS. Potem, jeden po drugim, należy ostrożnie oddzielić embriony od łożyska.Każdy embrion należy umieścić w 10 centymetrowej szalce hodowlanej zawierającej lodowaty PBS. Po usunięciu głowy, wątroby i jelit, pozostałą część embrionu należy przepłukać w jednym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli tkanek zawierającej PBS, a następnie pociąć ciało na kawałki o rozmiarach jeden milimetr sześcienny. Przenieść materiał do innego dołka zawierającego pięć mililitrów tripsyny EDTA i inkubować tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po pięciu minutach dodać 1 ml FBS, aby zatrzymać proces trawienia. Następnie odwirować otrzymaną zawiesinę komórkową i resuspender osad w 1 ml ogrzanego DMEM. Na koniec przenieść komórki do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm zawierającego 10 ml DMEM uzupełnionego o antybiotyki i hodować komórki do momentu uzyskania pożądanej liczby komórek.Etap progresji guza, przy którym należy uśmiercić zwierzę, zależy od konkretnego badania oraz wytycznych I-A-C-U-C. Na przykład ta 100-dniowa mysz FVB z antygenem T średnim polyoma wirusa guzów piersi myszy została uśmiercona trzy miesiące po wyizolowaniu guza piersi myszy, tak jak właśnie zaprezentowano. Uzyskano pierwotne komórki guza.Ponieważ wiele genów pośredniczy w przerzutowaniu raka piersi do płuc, w celu zbadania procesu przerzutowania wyekstrahowano również płuca, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie płuca wypełniono utrwalaczem Z fix i zabarwiono tuszem indyjskim, aby uwizualizować guzki nowotworowe. Przedstawiono tutaj embrionalne fibroblasty mysie, wyizolowane z embrionów myszy szczepu FVB.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować pierwotne komórki nowotworowe myszy oraz embrionalne fibroblasty mysie, a także jak wypreparować płuco myszy. Należy pamiętać, że praca z izofluranem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w dygestorium chemicznym.

primary-tumor-and-mef-cell-isolation-to-study-lung-metastasis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Izolowanie pierwotnego guza i komórek MEF w celu badania przerzutów do płuc

Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalnego testu przerzutowania, który jest wykorzystywany do określania potencjału metastatycznego ludzkich linii komórkowych raka.

Test eksperymentalny przerzutowania

W niniejszym raporcie opisujemy protokół izolacji wysoko oczyszczonych populacji leukocytów infiltrujących guzy. Protokół ten został opracowany na podstawie metody firmy Miltenyi Biotech w celu zwiększenia wydajności i czystości izolacji komórek z złożonej tkanki nowotworowej.

Izolacja komórek odpornościowych z guzów pierwotnych

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Ten manuskrypt opisuje metodę ilościowego określania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w zwierzęcym modelu przerzutów nowotworowych.

Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc

Opisujemy stosunkowo prostą metodę obrazowania na żywo ex vivo interakcji komórka nowotworowa - zrąb w obrębie przerzutów do płuc, wykorzystując fluorescencyjne reportery u myszy. Wykorzystując mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, technika ta umożliwia wizualizację żywych komórek przez co najmniej 4 godziny i może być dostosowana do badania innych stanów zapalnych płuc.

Ex vivo Obrazowanie na żywo przerzutów do płuc i ich mikrośrodowiska

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu protokołu testu przerzutów do płuc (PuMA). Model ten pozwala naukowcom badać wzrost komórek kostniakomięsaka z przerzutami (OS) w tkance płucnej za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

Praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Tutaj prezentujemy protokół dla modelu raka płuc ex vivo, który naśladuje etapy progresji guza i pomaga wyizolować guz pierwotny, krążące komórki nowotworowe i zmiany przerzutowe.

Bezkomórkowy i komórkowy model płuc do badania przerzutów nowotworowych

Ten artykuł ma na celu dostarczenie protokołu izolacji i hodowli pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu potrójnie ujemnego raka piersi oraz ich zastosowanie w badaniach przedklinicznych nowych nanocząstek zaprojektowanych do celowania w mikrośrodowisko guza.

Izolacja pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu raka piersi w celu zbadania celowanych nanocząstek

Prezentujemy metodę badania redystrybucji komórek nowotworowych z przerzutów do płuc z wykorzystaniem protokołu chirurgicznego selektywnej fotokonwersji przerzutów do płuc, a następnie identyfikacji zaczerwienionych komórek nowotworowych w narządach trzeciego rzędu.

Śledzenie rozsiewu komórek nowotworowych z przerzutów do płuc za pomocą fotokonwersji

Poznaj metodę izolacji komórek pierwotnych z guzów piersi myszy oraz przygotowania fibroblastów zarodkowych MEF do badania przerzutów nowotworowych do płuc.

Guz pierwotny i izolacja komórek MEF w celu zbadania przerzutów do płuc

Przeglądaj więcej filmów