Guz pierwotny i izolacja komórek MEF w celu zbadania przerzutów do płuc

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie agenezy guzów raka piersi u myszy. W pierwszej kolejności zaprezentowano przygotowanie pierwotnych komórek z guzów piersi myszy. Następnie przedstawiono sposób wyizolowania płuc myszy w celu wizualizacji przerzutów do płuc.

Na koniec przedstawiono przygotowanie embrionalnych fibroblastów mysich z embrionów mysich, ponieważ metody te wykazują, że myszy transgeniczne dla antygenu T środkowego poliomy wirusa guzów piersi myszy mogą być wykorzystywane do badania genezy guzów raka piersi. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat raka piersi, można ją również zastosować do badania innych guzów litych. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ podczas etapów izolacji guza ważne jest wyizolowanie wyłącznie nowotworów, a nie innych tkanek. Należy rozpocząć od użycia nożyczek w celu otwarcia skóry od otworu cewki moczowej do szyi myszy transgenicznej dla antygenu T środkowego poliomy wirusa guzów piersi myszy.

Następnie przypnij skórę i wyizoluj guz gruczołu mlekowego. Przemyj guz in situ zimnym PBS, a następnie umieść go w sterylnej 10-centymetrowej płytce do hodowli tkanek. Potem przenieś płytkę do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza i za pomocą sterylnego ostrza do golenia oraz nożyczek posiekaj guz na fragmenty o wielkości jednego milimetra sześciennego.

Inkubować fragmenty z kolagenazą na kołysce w temperaturze 37 °C. Po dwóch godzinach odwirować powstałą zawiesinę tkanki nowotworowej. Osad przemyć jeszcze trzy razy w PBS Resus, a po ostatnim przemyciu zawiesić w dwóch mililitrach trypsyny EDTA na pięć minut w temperaturze 37 °C przy jednoczesnym mieszaniu.

Następnie przemyć komórki jeszcze trzy razy i resuspender je w zwykłej pożywce wzrostowej. Na koniec inkubuj komórki w 10 centymetrowej szalce hodowlanej, wymieniając pożywkę codziennie przez kolejne trzy dni, aż do uzyskania pożądanej liczby komórek. Przed wyjęciem płuca usuń wątrobę oraz przeponę i odsunie żebra.

Następnie otwórz górną część tchawicy, w pobliżu żyły szyjnej i za pomocą cewnika wstrzyknij odpowiedni preparat przez tchawicę, aby wypełnić płuca, a następnie wyjmij płuca i, w przypadku stosowania utrwalacza Z fix, zalej tkankę parafiną. W przypadku stosowania tuszu chińskiego zanurz tkankę w roztworze przez pięć minut; prawidłowa tkanka płucna przybierze czarny kolor, podczas gdy guzki nowotworowe będą widoczne jako białe. Wszelkie guzki nowotworowe zaobserwowane w miejscach przerzutów o średnicy większej lub równej 0.5 mm zaklasyfikuj jako przerzuty w celu wygenerowania embrionalnych fibroblastów mysich.

W pierwszej kolejności należy rozciąć skórę ciężarnej myszy od otworu cewki moczowej do karku, tak jak właśnie pokazano, dbając o to, aby nie uszkodzić embrionów. Następnie należy wyciąć rogi macicy i wypłukać je w sterylnym PBS. Potem, jeden po drugim, należy ostrożnie oddzielić embriony od łożyska.

Każdy embrion należy umieścić w 10 centymetrowej szalce hodowlanej zawierającej lodowaty PBS. Po usunięciu głowy, wątroby i jelit, pozostałą część embrionu należy przepłukać w jednym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli tkanek zawierającej PBS, a następnie pociąć ciało na kawałki o rozmiarach jeden milimetr sześcienny. Przenieść materiał do innego dołka zawierającego pięć mililitrów tripsyny EDTA i inkubować tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po pięciu minutach dodać 1 ml FBS, aby zatrzymać proces trawienia. Następnie odwirować otrzymaną zawiesinę komórkową i resuspender osad w 1 ml ogrzanego DMEM. Na koniec przenieść komórki do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm zawierającego 10 ml DMEM uzupełnionego o antybiotyki i hodować komórki do momentu uzyskania pożądanej liczby komórek.

Etap progresji guza, przy którym należy uśmiercić zwierzę, zależy od konkretnego badania oraz wytycznych I-A-C-U-C. Na przykład ta 100-dniowa mysz FVB z antygenem T średnim polyoma wirusa guzów piersi myszy została uśmiercona trzy miesiące po wyizolowaniu guza piersi myszy, tak jak właśnie zaprezentowano. Uzyskano pierwotne komórki guza.

Ponieważ wiele genów pośredniczy w przerzutowaniu raka piersi do płuc, w celu zbadania procesu przerzutowania wyekstrahowano również płuca, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie płuca wypełniono utrwalaczem Z fix i zabarwiono tuszem indyjskim, aby uwizualizować guzki nowotworowe. Przedstawiono tutaj embrionalne fibroblasty mysie, wyizolowane z embrionów myszy szczepu FVB.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować pierwotne komórki nowotworowe myszy oraz embrionalne fibroblasty mysie, a także jak wypreparować płuco myszy. Należy pamiętać, że praca z izofluranem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w dygestorium chemicznym.