Ulepszona analiza genetyczna pojedynczych ludzkich biocząstek odzyskanych za pomocą uproszczonej mikromanipulacji z dowodów kryminalistycznych "dotykowego DNA"

Ogólnym celem tej procedury jest odzyskanie pojedynczych lub aglomerowanych komórek zwanych domniemanymi cząstkami biologicznymi z dowodów DNA w toku postępowania sądowego i uzyskanie profilu DNA dawcy. Podczas popełniania przestępstwa z użyciem przemocy niewielka liczba komórek jest przenoszona z jednej osoby na drugą, na przykład gdy napastnik chwyta ofiarę za nadgarstek. Aby najpierw odzyskać niewielką liczbę komórek, użyj folii żelowej o niskiej przyczepności przymocowanej do szkiełka mikroskopowego, aby pobrać próbkę z obszaru kontaktu.

Drugim krokiem jest zabarwienie przeniesionych biocząstek w celu łatwiejszego oglądania pod mikroskopem. Następnie odizoluj biocząsteczki od folii żelowej za pomocą mikromanipulacji. Zbierz rozpuszczalny w wodzie klej na końcu igły wolframowej i użyj go do usunięcia interesujących biocząstek z powierzchni filmu żelowego.

Ostatnim krokiem jest ostrożne przeniesienie indywidualnie pobranych biocząstek do mieszaniny amplifikacyjnej PCR na dnie kolekcji A PCR, aby ostatecznie zastosować ulepszone metody typowania DNA w celu uzyskania profilu DNA dawcy śladowych dowodów DNA. W moim laboratorium skupiamy się na analizie genetycznej niewielkiej liczby komórek, które są przenoszone podczas popełniania brutalnego przestępstwa przeciwko osobie między jedną osobą a drugą osobą lub między osobą a przedmiotem. Tradycyjne metody często nie są w stanie odzyskać profilu DNA z tak małej liczby komórek.

W tym przypadku opracowaliśmy uproszczoną metodę fizycznego odzyskiwania i analizy genetycznej tak małej liczby komórek, zarówno pojedynczych komórek, jak i aglomeratów komórek, które można włączyć do dowolnego laboratorium kryminalistycznego. Procedurę zademonstruje Katie Fairish, doktorantka w moim laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj folię żelową, która będzie używana do zbierania biocząstek.

Przyciąć folię żelową do żądanego rozmiaru odpowiedniego dla szklanego szkiełka mikroskopowego używanego jako solidne podparcie. Na przykład w przypadku szkiełka o wymiarach trzy cale na jeden cal użyj folii żelowej o wymiarach dwa cale na 0,75 cala. Usuń biały podkład z folii żelowej i przymocuj folię żelową do szkiełka mikroskopu, mocno dociskając, aby zapewnić pełne mocowanie.

Należy pamiętać, że istnieje przezroczysta górna warstwa ochronna, której nie należy usuwać, aby umożliwić wywieranie nacisku wzdłuż kawałka folii żelowej bez zanieczyszczania powierzchni folii żelowej, przygotowane szkiełka z folii żelowej z dołączoną warstwą ochronną można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu, gdy będą potrzebne. Gdy folia żelowa jest gotowa do użycia, użyj sterylnej pęsety, aby usunąć przezroczystą wierzchnią warstwę ochronną. Umieść powierzchnię filmu żelowego w bezpośrednim kontakcie z pożądanym dotykanym przedmiotem lub powierzchnią.

Na przykład ludzka skóra z nadgarstka. Zastosuj niewielki nacisk, aby zapewnić skuteczne przenoszenie cząsteczek bio do folii żelowej. Nie wywieraj zbyt dużego nacisku, ponieważ szkiełko może pęknąć Wiele próbek z tego samego przedmiotu lub powierzchni można zebrać na tym samym kawałku folii żelowej W ten sam sposób cząsteczki biologiczne mogą być zbierane z przedmiotów i elementów odzieży, takich jak kołnierzyk koszuli.

Aby potwierdzić przeniesienie cząstek biologicznych na folię żelową, zbadaj szkiełko pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą oświetlenia trans lub epi. Powiększenie około 20x jest najlepsze do oglądania większych obszarów filmu żelowego, podczas gdy powiększenie około 200x jest najlepsze do oglądania pojedynczych biocząstek. Przechowywać szkiełko z próbką folii żelowej w temperaturze pokojowej w zakrytym pudełku na szkiełka.

Dopóki nie będą gotowe do barwienia i/lub zbierania biocząstek, cząstki biologiczne mogą być barwione, aby pomóc w wizualizacji. Aby to osiągnąć, najpierw umieść szkiełko z próbką folii żelowej przygotowane tak, jak pokazano wcześniej, na stojaku do barwienia szkiełek nad zlewem. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej pokryj całą powierzchnię filmu żelowego niebieskim barwnikiem trian, inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch minut.

Usuń nadmiar plamy, przechylając suwak, aby w razie potrzeby plama mogła spłynąć do zlewu. Szkiełko można przepłukać poprzez delikatne zalanie sterylną wodą za pomocą jednorazowej pipety transferowej. Po wysuszeniu szkiełka należy obejrzeć slajd za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby zapewnić prawidłowe barwienie.

Wybarwione szkiełko można przechowywać w temperaturze pokojowej w zakrytym pudełku na szkiełka. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia odpowiedniej liczby 0,2 mililitrowych probówek PCR w stojaku i odpowiedniego oznaczenia probówek. Przygotować odpowiednią objętość mieszanki do amplifikacji STR dla żądanej liczby próbek.

Wir i mistrz dobrze się mieszają i krótko odwirować w ścieżce PI mini wirówki. 3,5 mikrolitra amplifikacji. Wymieszaj luźno z każdą nakrętką probówki o pojemności 0,2 mililitra.

Umieść kawałek dwustronnej taśmy klejącej bezpośrednio na pustaku szklanym. Będzie to służyło do utrzymywania probówki o pojemności 0,2 mililitra na miejscu podczas pobierania próbki. Umieść kolejny kawałek dwustronnej taśmy klejącej na czystym szklanym szkiełku mikroskopowym.

Następnie umieść kawałek rozpuszczalnej w wodzie taśmy naramiennej z falami na wierzchu dwustronnej taśmy klejącej. Zabezpiecz taśmę na miejscu, wywierając nacisk na całej długości taśmy. Wierzchnią białą warstwę ochronną można następnie usunąć.

Następnie umieść pierwszą tubkę o pojemności 0,2 mililitra na dwustronnej taśmie klejącej Na pustaku szklanym. Odłóż tę probówkę na bok do czasu pobrania próbki. Umieść rozpuszczalną w wodzie taśmę żołnierską z falą pod mikroskopem, patrząc w małym powiększeniu.

Użyj końcówki igły do stojaka na języki, aby delikatnie zeskrobać powierzchnię taśmy, aby zebrać niewielką ilość lub kulkę kleju na końcu igły. Rozmiar kulki kleju będzie zależał od liczby cząstek bio, które należy zebrać ostrożnie. Usuń języki.

Odsunąć igłę z klejem spod mikroskopu, nie naruszając końcówki igły. W razie potrzeby umieść igłę w stojaku. Najbardziej krytycznym aspektem procedury jest pobieranie i przenoszenie biocząstek.

Aby zapewnić sukces, techniki muszą być ćwiczone do momentu, aż analityk będzie w nich biegły. Umieścić wcześniej przygotowaną próbkę filmu żelowego na stoliku mikroskopowym, używając szklanego bloku do podparcia szkiełka. Dostosuj ostrość i powiększenie, aż cząsteczki biologiczne będą mogły być łatwo oglądane.

Zidentyfikuj cząstki biologiczne, które zostaną zebrane. Wyjmij igłę wolframową za pomocą kulki samoprzylepnej i umieść igłę na powierzchni filmu żelowego, gdzie znajdują się interesujące cząstki bio. Dociśnij końcówkę igły w dół, tak aby stykała się z biocząstką.

Podnieś igłę do góry, aby upewnić się, że biocząstka została zebrana. Powtarzaj ten proces, aż zostanie zebrana żądana liczba cząstek biologicznych. Umieść przygotowaną probówkę PCR o pojemności 0,2 mililitra na stoliku mikroskopu.

Dostosuj powiększenie tak, aby spód rurki zawierającej mieszankę amplifikacji była ostra. Podczas oglądania przez mikroskop ostrożnie włóż igłę wolframową do 0.2 mililitrowej probówki PCR, aż końcówka igły znajdzie się w mieszance amplifikacyjnej. Trzymać igłę w mieszance amplifikacyjnej, aż klej się rozpuści i zaobserwuje się uwalnianie cząstek biologicznych do roztworu.

Wyjąć igłę. Umieść rurkę o pojemności 0.2 mililitra pionowo i luźno ją przykryj. Oczyść igłę wolframową wstępnie zwilżoną chusteczką nasączoną alkoholem i powtórz tę procedurę pobierania w celu uzyskania dodatkowych próbek.

Aby rozpocząć protokół wzmocnionej amplifikacji do autosomalnego profilowania STR zebranych bioczęści, dodaj 1,5 mikrolitra buforu do lizy do każdej 0,2 mililitrowej probówki zawierającej mieszankę amplifikacyjną, a biocząstki szczelnie zamkną pokrywki probówek. Umieścić próbki w termocyklerze i amplifikować próbki, stosując warunki cykliczne opisane w tekście protokołu Po zakończeniu amplifikacji. Produkty amplifikacji należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do wykrycia za pomocą elektroforezy kapilarnej.

Nie pokazano reprezentatywnych obrazów poszczególnych cząstek biologicznych w próbce kołnierzyka koszuli. Zebrane cząstki biologiczne są zakreślone. Czerwone kółka oznaczają, że profil został odzyskany.

Uwzględniono procentowe odtworzenie alleli. Czarne kółka oznaczają, że profil nie został odzyskany. Podobnie, obrazy te przedstawiają zbite cząstki biologiczne w próbce kołnierzyka koszuli, pokazany tutaj jest profil STR uzyskany z jednej z pojedynczych próbek cząstek biologicznych z kołnierzyka koszuli.

Jego dokładność została określona przez porównanie z profilem referencyjnym. Numery alleli są oznaczane poniżej każdego piku w każdym locus. Oś x reprezentuje rozmiar fragmentu, a oś Y reprezentuje intensywność sygnału.

Ten profil jest wysokiej jakości, z rozsądnie zrównoważonymi wysokościami pików między miejscami i bez zaniku alleli. Następny profil to pełny profil STR uzyskany z jednej z zbitych próbek biocząstek z kołnierzyka koszuli. Wreszcie, rysunek ten pokazuje przykład nieudanego profilowania DNA pojedynczej cząstki biologicznej z odzyskiem alleli na poziomie 3%.

Metoda ta powinna sprzyjać odzyskiwaniu profili DNA pochodzących z jednego źródła od napastników w przypadkach napaści fizycznej. Nie umknęło naszej uwadze, że metoda ta usuwa również niektóre problemy związane z interpretacją i dekonwolucją mieszanych profili DNA.