Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie silnych i powtarzalnych infekcji bakteryjnych u drosofilii, melanogastera, a następnie zmierzenie ciężkości infekcji i ilościowe określenie odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Osiąga się to poprzez najpierw dostarczenie infekcji bakteryjnej do muszek za pomocą nanowtryskiwacza. Śmiertelność po infekcji można śledzić w czasie, a ogólnoustrojowe obciążenie bakteryjne można określić w dowolnym momencie, homogenizując zakażone muchy i mierząc liczbę obecnych bakterii.

Obronę immunologiczną gospodarza można również określić ilościowo, mierząc poziom ekspresji genów peptydów przeciwbakteryjnych, ostatecznie określając ilościowo i charakteryzując infekcję bakteryjną. U Drosophila melanogaster może być używany do testowania, jak czynniki genetyczne i środowiskowe zmieniają kompetencję immunologiczną muchy. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odporności owadów, takie jak to, w jaki sposób czynniki genetyczne i środowiskowe gospodarza wpływają na zdolność immunologiczną gospodarza lub jak różne bakterie różnią się w swojej infekcji Kinetyka, Chociaż używamy tej metody do pomiaru obrony immunologicznej Drosophila melanogaster przed infekcją bakteryjną, można ją również zastosować do innych owadów i może wykorzystywać inne rodzaje patogenów, takich jak wirusy lub grzyby.

Częstym problemem, z którym borykają się ludzie, gdy po raz pierwszy uczą się tej metody, jest to, że mogą spowodować zbyt wiele obrażeń u much, co może skutkować nadmiernie wysoką śmiertelnością, nawet w grupie kontrolnej. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie dla nauczenia się, jak przeprowadzić infekcję przy minimalnym uszkodzeniu muchy. Ponieważ nasz gatunek żywiciela oph melanogaster jest tak mały, infekcja musi być przeprowadzona pod mikroskopem, co zwiększa początkową złożoność techniki.

Wierzymy jednak, że niewielka demonstracja tej techniki sprawi, że będzie ona dostępna nawet dla naukowców, którzy mają tylko ograniczone doświadczenie z muchami. Aby rozpocząć eksperyment, należy wybrać pojedynczą kolonię z wcześniej przygotowanej płytki wzorcowej i zaszczepić kolbę sterylnego podłoża. Hoduj bakterie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza do fazy stacjonarnej.

Gdy hodowla osiągnie fazę stacjonarną, delikatnie granulować komórki z 600 mikrolitrów kultury w wirówce stołowej przez trzy minuty po 5 000 razy. G, a następnie odrzuć Rena i Resus. Zawieś bakterie w 1000 mikrolitrach sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS.

Następnie rozcieńczyć zawieszone komórki w sterylnym PBS, aby osiągnąć pożądaną absorbancję 600 nanometrów i użyć tej zawiesiny do zakażenia much. Przygotuj szklaną igłę, ciągnąc pożyczoną kapilę ze szkła krzemianowego i użyj kleszczyków, aby odłamać końcówkę igły, aby utworzyć otwór o średnicy 50 mikrometrów. Następnie umieść sufitowy O-ring i białą przekładkę z dużym wgłębieniem skierowanym na zewnątrz na metalowy tłok wtryskiwacza.

Napełnij szklaną igłę olejem mineralnym za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 30. Następnie umieść wypełnioną szklaną igłę przez tuleję zaciskową i umieść większy O-ring wokół jej podstawy w odległości jednego milimetra od końca igły. Wsuń igłę na metalowy tłok i delikatnie przykręć tuleję zaciskową, aż będzie bezpieczna.

Usuń olej mineralny z wtryskiwacza, pozostawiając niewielką objętość oleju w igle, która będzie działać jako bariera między wstrzykiwaczem a zawiesiną bakteryjną. Upewnij się, że w oleju mineralnym, zawiesinie bakteryjnej lub między tymi dwoma płynami nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie ustaw wtryskiwacz na żądaną objętość do wstrzyknięcia.

Ostrożnie włożyć końcówkę igły kapilarnej do probówki ze sterylnym PBS i nacisnąć przycisk napełniania na wstrzykiwaczu, aby napełnić igłę wstrzykiwacza w celu wytworzenia kontroli zranienia. Wstrzyknąć znieczulone muszki sterylnym PBS w przednią część brzucha na brzusznej powierzchni bocznej, umieścić wstrzyknięte muchy w świeżych fiolkach z nową pożywką i położyć fiolki na boku, aby zapobiec przyklejaniu się much do pokarmu, zanim wyjdą ze znieczulenia. Następnie należy wysunąć pozostałą jałową pożywkę z wstrzykiwacza i ponownie napełnić tę samą igłę zawiesiną bakteryjną.

Powtórz procedurę i wstrzyknij muszkom zawiesinę bakteryjną. Alternatywnie, infekcja może być dostarczona przez nakłucie szpilką septyczną. Aby przygotować zainfekowaną szpilkę, stopić koniec końcówki mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów i włożyć 0,15-milimetrową szpilkę do mnuchina owadów do stopionego plastiku.

Pozwól, aby plastik zastygł, tak aby szpilka była utrzymywana na miejscu za pomocą 0,5 centymetra szpilki wystającej z plastiku, znieczulij muchy dwutlenkiem węgla i nakłuj muchy w mostkową płytkę opłucnową klatki piersiowej za pomocą igły, unikając miejsc przyczepu skrzydeł i nóg. Usuń muchy ze szpilki do drobiazgów za pomocą miękkich kleszczy. Pamiętaj, aby zanurzyć szpilkę w zawiesinie bakteryjnej między nakłuwaniem każdej muchy.

Umieść ukłute muchy w świeżej fiolce z nową pożywką na muchy, kładąc fiolkę na boku, aż wszystkie muchy wyzdrowieją ze znieczulenia. Umieść podgrupę zakażonych much w oddzielnych mikroprobówkach wirówkowych na lodzie. Dodaj 250 mikrolitrów PBS do każdej probówki i użyj tłuczka do homogenizacji much.

Następnie rozłóż homogenat na napowietrzaczu LB za pomocą spiralnej płytki. Alternatywnie do powlekania homogenatu przez seryjne rozcieńczanie. Przenieść homogenat każdej muchy do pierwszego rzędu 96.

Dobrze płytkować i napełniać każdą studzienkę z pozostałych rzędów 90 mikrolitrami PBS za pomocą pipety wielokanałowej. Weź 10 mikrolitrów z pierwszego rzędu zawierającego homogenat muchowy i dozuj homogenat do drugiego rzędu. Przepompuj go w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać homogenat.

Następnie weź 10 mikrolitrów homogenatu i przenieś go do następnego rzędu. Powtórz tę procedurę, używając pozostałych rzędów, zaczynając od dolnego rzędu. Za pomocą pipety wielokanałowej pobierz 10 mikrolitrów z każdej studzienki i umieść je na płytce LB.

Upewnij się, że próbki są dozowane jako dyskretne miejsca, które nie stykają się ze sobą. Powtarzać ten krok, aż zostaną pobrane próbki ze wszystkich studzienek z każdego rzędu, dozując je w malejącej kolejności rozcieńczenia na płytce LB. Niezależnie od zastosowanej metody powlekania, uważaj, aby nie zarosnąć płytek, aby kolonie pozostały małe i dyskretne.

Wyjąć płytkę z inkubatora. Gdy eksperymentalne bakterie wyhodują widoczne kolonie, ale przed koloniami z drosophila, mikrobiota jelitowa staje się widoczna około 24 godziny później w przypadku spiralnych płytek. Policz kolonie, które rosną, za pomocą automatycznego licznika kolonii, który może oszacować obciążenie bakteryjne na mililitr homogenatu na podstawie liczby i położenia kolonii na płytce.

W przypadku płytek punktowych należy ręcznie policzyć kolonie dla każdej muchy z dowolnego rozcieńczenia zawierającego od 30 do 300 kolonii i obliczyć liczbę bakterii na mililitr oryginalnego homogenatu. Muchom wstrzyknięto 50 nanolitrów zawiesin bakteryjnych o różnych gęstościach optycznych, a natychmiast zhomogenizowana i podana dawka infekcji zmienia się wraz z gęstością optyczną zawiesiny bakteryjnej użytej do wstrzykiwań. Początkowe obciążenia bakteryjne silnie korelują z początkowym wstrzykniętym OD.

Protokół ten umożliwia obserwację różnych typów infekcji. Muchy zostały zarażone providencia rei, która może powodować przewlekłą infekcję subletalną, która utrzymuje się przez 20 dni lub dłużej. Muchy zakażone coli usuną infekcję w ciągu sześciu godzin. Po zakażeniu.

Indukcję układu odpornościowego można oszacować poprzez izolację RNA, a następnie Q rtpcr R transkryptu peptydu przeciwbakteryjnego analogicznie, ale mniej ilościowo muchy wykazujące ekspresję GFP pod kontrolą peptydu przeciwdrobnoustrojowego. Promotory genów mogą być wykorzystywane do wizualizacji indukcji układu odpornościowego po opanowaniu. Ta technika może pozwolić na zakażenie setek much na godzinę.

U muszek po zakażeniu można by zmierzyć dowolną liczbę fenotypów, w tym zdolność uczenia się, stan metaboliczny lub praktycznie każdą inną cechę, którą można sobie wyobrazić. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dostarczać silne i powtarzalne infekcje bakteryjne do drosophila, melanogaster oraz jak następnie mierzyć nasilenie infekcji i określać ilościowo odpowiedź immunologiczną gospodarza. Nie zapominaj, że niektóre bakterie mogą stanowić zagrożenie dla zdrowia ludzkiego.

Upewnij się, że przestrzegane są odpowiednie procedury bezpieczeństwa biologicznego i że stosowane są odpowiednie środki ograniczające rozprzestrzenianie się zakażonych much. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.