Name: Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę wstrzyknięć bakteryjnych i pomiaru odpowiedzi immunologicznej u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia badanie wrodzonej odporności i mechanizmów obrony gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować całemu laboratorium Lazzaro, a szczególnie Susan Rottschaefer, za pomoc zarówno w przeglądzie, jak i testowaniu tych protokołów. Jest to wynik ich skumulowanej wiedzy specjalistycznej. Prace w laboratorium Lazzaro są wspierane przez granty R01 AI083932 i R01 AI064950 z amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia.

<ol><li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual review of immunology. 25, 697-743 (2007).</li>
<li>Dionne, M. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+infectious+diseases+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Models of infectious diseases in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Disease models & mechanisms. 1 (1), 43-9 (2008).</li>
<li>Rutschmann, S., Jung, A. C., Hetru, C., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Ferrandon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rel+protein+DIF+mediates+the+antifungal+but+not+the+antibacterial+host+defense+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The Rel protein DIF mediates the antifungal but not the antibacterial host defense in Drosophila.</a> Immunity. 12 (5), 569-580 (2000).</li>
<li>Ayres, J. S., Freitag, N., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Drosophila+mutants+altering+defense+of+and+endurance+to+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of Drosophila mutants altering defense of and endurance to Listeria monocytogenes infection.</a> Genetics. 178 (3), 1807-1815 (2008).</li>
<li>Cronin, S. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+identifies+genes+involved+in+intestinal+pathogenic+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen identifies genes involved in intestinal pathogenic bacterial infection.</a> Science. 325 (5938), 340-343 (2009).</li>
<li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+Drosophila+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. , (2014).</li>
<li>Dionne, M. S., Pham, L. N., Shirasu-Hiza, M., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+and+FOXO+dysregulation+contribute+to+infection-induced+wasting+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+CB%22%5BJournal%5D)">Akt and FOXO dysregulation contribute to infection-induced wasting in Drosophila.</a> Current biology CB. 16 (20), 1977-1985 (2006).</li>
<li>McKean, K. a, Yourth, C. P., Lazzaro, B. P., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+costs+of+immunological+maintenance+and+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+evolutionary+biology%22%5BJournal%5D)">The evolutionary costs of immunological maintenance and deployment.</a> BMC evolutionary biology. 8 (1), 76(2008).</li>
<li>Kuo, T. -H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+triggered+by+an+immune+response+in+Drosophila+is+regulated+by+the+circadian+clock+and+requires+the+NFkappaB+Relish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish.</a> BMC neuroscience. 11, 17(2010).</li>
<li>Panayidou, S., Ioannidou, E., Apidianakis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pathogenic+bacteria%2C+fungi%2C+and+viruses+in+Drosophila%3A+disease+modeling%2C+lessons%2C+and+shortcomings%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Human pathogenic bacteria, fungi, and viruses in Drosophila: disease modeling, lessons, and shortcomings.</a> Virulence. 5 (2), 253-269 (2014).</li>
<li>Keebaugh, E. S., Schlenke, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+natural+host%E2%80%93parasite+interactions%3A+The+Drosophila+model%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights from natural host–parasite interactions: The Drosophila model.</a> Developmental & Comparative Immunology. 42 (1), 111-123 (2014).</li>
<li>Howick, V. M., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+and+diet+shape+resistance+and+tolerance+across+distinct+phases+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+evolutionary+biology%22%5BJournal%5D)">Genotype and diet shape resistance and tolerance across distinct phases of bacterial infection.</a> BMC evolutionary biology. 14 (1), 56(2014).</li>
<li>Babin, A., Kolly, S., Kawecki, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+bacterial+infection+improves+aversive+learning+performance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+behavior%2C+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Virulent bacterial infection improves aversive learning performance in Drosophila.</a> Brain, behavior, and immunity. , (2014).</li>
<li>Chambers, M. C., Song, K. H., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+infection+causes+metabolic+shifts+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes infection causes metabolic shifts in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 7 (12), e50679(2012).</li>
<li>Fellous, S., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+food+quality+affects+adult+%28but+not+larval%29+immune+gene+expression+independent+of+effects+on+general+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+ecology%22%5BJournal%5D)">Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition.</a> Molecular ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).</li>
<li>Stone, E. F., Fulton, B. O., Ayres, J. S., Pham, L. N., Ziauddin, J., Shirasu-Hiza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+protein+timeless+regulates+phagocytosis+of+bacteria+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila.</a> PLoS pathogens. 8 (1), e1002445(2012).</li>
<li>Chambers, M. C., Jacobson, E., Khalil, S., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thorax+injury+lowers+resistance+to+infection+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Thorax injury lowers resistance to infection in Drosophila melanogaster.</a> Infection and immunity. , (2014).</li>
<li>Rich, J. T., Neely, J. G., Paniello, R. C., Voelker, C. C. J., Nussenbaum, B., Wang, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+understanding+Kaplan-Meier+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology--head+and+neck+surgery+official+journal+of+American+Academy+of+Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">A practical guide to understanding Kaplan-Meier curves.</a> Otolaryngology--head and neck surgery official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 143 (3), 331-336 (2010).</li>
<li>Freeman, W. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSokal%2C+RR+%22Biometry%22">Biometry</a>. , (1995).</li>
<li>Frydman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+bacterial+infection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Wolbachia bacterial infection in Drosophila.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (2), 158(2007).</li>
<li>Kuo, T. -H., Handa, A., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+the+immune+response+and+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of the immune response and sleep in Drosophila.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (70), e4355(2012).</li>
<li>Vodovar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+host+defense+after+oral+infection+by+an+entomopathogenic+Pseudomonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila host defense after oral infection by an entomopathogenic Pseudomonas species.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (32), 11414-11419 (2005).</li>
<li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+bacterial+intestinal+infections+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster.</a> PLoS pathogens. 3 (11), e173(2007).</li>
<li>Jaenike, J., Polak, M., Fiskin, A., Helou, M., Minhas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+transmission+of+endosymbiotic+Spiroplasma+by+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Interspecific transmission of endosymbiotic Spiroplasma by mites.</a> Biology. 3 (1), 23-25 (2007).</li>
<li>Kanbar, G., Engels, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+bacterial+infection+of+wounds+in+honey+bee+%28+Apis+mellifera%29+pupae+punctured+by+Varroa+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and bacterial infection of wounds in honey bee ( Apis mellifera) pupae punctured by Varroa mites.</a> Parasitology research. 90 (5), 349-354 (2003).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów.

Opisana tutaj procedura daje rygorystyczne i wysokiej jakości zakażenie Drosophila melanogaster. Zilustrowane przykłady koncentrowały się przede wszystkim na zakażeniu Providencia rettgeri i E. coli, ale protokół jest wysoce elastyczny i może być stosowany do zakażeń różnymi bakteriami w różnych warunkach hodowli i utrzymania gospodarza.
Szczegóły optymalnego podejścia eksperymentalnego będą zależeć od bakterii użytej do infekcji, genotypu gospodarza i ogólnych warunków eksperymentalnych. Zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie testów pilotażowych wszelkich nowych warunków eksperymentalnych przed rozpoczęciem bardziej ambitnych projektów. Dobrym punktem wyjścia jest przetestowanie trzech dawek infekcji w 100-krotnym zakresie. Wysoce zjadliwe patogeny są często najlepiej wprowadzane w bardzo niskich dawkach zakaźnych, rzędu 10 - 100 komórek bakteryjnych na muchę. Bardziej umiarkowane patogeny mogą być wstrzykiwane w wyższych dawkach około 1000 bakterii na muchę, a niepatogeny mogą być wstrzykiwane w dawkach nawet 10 000 bakterii na muchę. Często pouczające jest zdefiniowanie kinetyki nowych infekcji poprzez śledzenie obciążenia patogenami, śmiertelności gospodarza i aktywności układu odpornościowego w podłużnych szeregach czasowych. Ponieważ pomiar obciążenia patogenem i ekspresji genów gospodarza są testami destrukcyjnymi, konieczne jest zakażenie odrębnych much na początku eksperymentu dla każdego punktu czasowego, który ma być mierzony.
Podejmując decyzję, czy zastosować iniekcję szpilkową, czy mikrokapilę, należy pamiętać, że każde podejście ma zalety i ograniczenia. Wstrzyknięcie kapilarne wprowadza do muchy objętość cieczy, która zarówno nieznacznie zwiększa ciśnienie turgoru, jak i wprowadza sole lub inne cząsteczki, które są zawieszone lub rozpuszczone w nośniku. Iniekcja kapilarna wymaga również dostępu do zakładu iniekcyjnego lub zakupu wymaganego sprzętu. Szpilka septyczna nie wymaga specjalnego sprzętu i wprowadza znikome podłoże do muchy i jest zazwyczaj bardziej skuteczna w infekowaniu dużej liczby much. Jednak infekcje po ukłuciu szpilkami nie pozwalają na precyzyjną kontrolę dawki infekcji, którą można osiągnąć za pomocą iniekcji kapilarnej. Obecny protokół koncentrował się na aparacie iniekcyjnym, który mechanicznie reguluje objętość wtrysku, ale istnieją również systemy iniekcyjne oparte na dyskretnych impulsach sprężonego powietrza. 20,21 Są one zazwyczaj droższe niż przedstawione tutaj urządzenia i wymagają kalibracji impulsu powietrza do każdej igły w celu zapewnienia stałych objętości wstrzyknięć.
Toczy się poważna dyskusja, ale bardzo mało danych na temat tego, w jaki sposób muchy stają się ogólnoustrojowo zakażone bakteriami na wolności. Niektórzy badacze twierdzą, że większość naturalnych infekcji występuje, gdy Drosophila połyka bakterie chorobotwórcze, a bakterie są następnie w stanie uciec z jelit, aby wywołać infekcję ogólnoustrojową. Jednak istnieje bardzo niewiele bakterii, o których wiadomo, że są w stanie przekroczyć jelito D. melanogaster, a te, które mają tę zdolność, są wysoce śmiertelne dla much22,23. Alternatywną teorią jest to, że muchy regularnie doznają uszkodzeń kutykularnych poprzez ucieczkę przed nieudanymi próbami drapieżnictwa lub atak roztoczy ektorazytów. Hipoteza ta jest wspierana przez częste zbieranie dzikich D. melanogaster zawierających plamy melanizacji, które wskazują na zagojone rany (obserwacje niepublikowane). Wykazano, że roztocza przenoszą infekcje bakteryjne u Drosophila24 , a rany pozostawione przez roztocza mogą być wtórnie zakażone przez bakterie u pszczół miodnych25. Jednak częstość występowania zakażenia D. melanogaster przez roztocza lub w inny sposób oportunistycznego poprzez naruszenie naskórka nie jest znana. Opisany tutaj protokół pozwala na wprowadzenie bakterii bezpośrednio do hemolimfy poprzez ilościowe wstrzyknięcie, które omija wszelkie bariery nabłonkowe lub odporność behawioralną. Metody podawania bakterii chorobotwórczych do D. melanogaster opisano w Vodovar i wsp.22 oraz Nehme i wsp.Lokal mieszkalny 23.
Wiele bakterii entomopatogenicznych stanowi niewielkie lub żadne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego, co pozwala naukowcom na wygodną pracę z nimi. Co więcej, bardzo niewiele bakterii ma zdolność do zakażania Drosophila w kontakcie bez interwencji eksperymentalnej, więc ryzyko "epidemicznego" rozprzestrzeniania się infekcji bakteryjnej w laboratorium za pośrednictwem skażonych powierzchni lub zbiegłych much jest na ogół bardzo niskie. Niemniej jednak wskazane jest zapewnienie odpowiednich środków ograniczających rozprzestrzenianie się wirusa, aby zapobiec ucieczce zakażonych much i odłowieniu wszelkich zbiegłych much. Laboratorium powinno być wyposażone w poziom bezpieczeństwa biologicznego współmierny do poziomu stosowanych czynników chorobotwórczych oraz powinny być stosowane standardowe najlepsze praktyki w dziedzinie mikrobiologii.
Opisana tutaj eksperymentalna metoda infekcji pozwala na zakażenie Drosophila melanogaster dowolną dawką dowolnej bakterii. Po ustaleniu infekcji łatwo jest zmierzyć kinetykę namnażania się lub usuwania bakterii, śledzić śmiertelność gospodarza i testować indukcję układu odpornościowego gospodarza. Zakażone muchy mogą być łatwo poddane innym testom fenotypowym, w tym testom funkcji fizjologicznych, które mogą kształtować się lub być kształtowane przez infekcję. Opisane procedury są niedrogie, wymagają stosunkowo niewielkiego specjalistycznego sprzętu i są łatwe do nauczenia, dzięki czemu można je stosować w różnych projektach w różnych laboratoriach badawczych i dydaktycznych.

Muszka owocowa Drosophila melanogaster jest jednym z głównych organizmów modelowych do badania funkcji i ewolucji obrony immunologicznej. Drosophila są niedrogie i łatwe w hodowli, są bardzo podatne na eksperymentalne manipulacje i są wspierane przez rozległą społeczność naukową, która opracowała szeroki wachlarz narzędzi badawczych. Wiele aspektów odporności wrodzonej jest zachowanych między owadami i ssakami, w tym transdukcja sygnału, w której pośredniczą receptory Toll-podobne i czynniki transkrypcyjne rodziny NF-kB, sygnalizacja JAK/STAT i odpowiedzi szlaku JNK. 1,2 Funkcję tych genów i szlaków można badać u D. melanogaster za pomocą mutacji lub knockdownów RNAi, które zwiększają lub zmniejszają aktywność szlaku. 3–6 Ponadto Drosophila może być wykorzystywana do badania fizjologicznych konsekwencji infekcji i chorób, w tym w kontekście ewolucyjnej teorii historii życia. 7–9 Wszystkie takie badania zależą jednak od zdolności do wiarygodnego infekowania eksperymentalnych muszek w określonych warunkach leczenia. Opisana tutaj procedura przedstawia ramy metodologiczne do dostarczania silnych i powtarzalnych infekcji bakteryjnych do Drosophila melanogaster, a następnie pomiaru ciężkości infekcji i ilościowego określenia odpowiedzi immunologicznej gospodarza.
Drosophila może być naturalnie i eksperymentalnie zainfekowana przez różnorodne pasożyty i patogeny, w tym bakterie, grzyby, wirusy, nicienie i pasożytnicze osy. Obecny protokół koncentruje się na dostarczaniu ogólnoustrojowych infekcji bakteryjnych. Do infekowania much można wykorzystać wiele różnych bakterii, a wybór eksperymentatora powinien opierać się na precyzyjnych pytaniach naukowych, które są mu zadawane. Na przykład ludzkie izolaty kliniczne mogą być stosowane do badania mechanizmów wirulencji bakterii10 lub izolaty istotne dla środowiska mogą być preferowane do badań ewolucyjnych. 11 Niektóre bakterie są kompetentnymi patogenami D. melanogaster, namnażając się po zakażeniu i powodując chorobę lub śmierć gospodarza. Inne bakterie są skutecznie kontrolowane przez układ odpornościowy gospodarza i usuwane w ciągu kilku dni. W tej demonstracji Providencia rettgeri zostanie wykorzystana jako patogen proliferacyjny, który może powodować śmiertelność gospodarza i utrzymuje się u żywicieli, którzy przeżyli. Escherichia coli będzie używana jako niepatogen, który jest usuwany przez układ odpornościowy gospodarza.
Infekcja zostanie stwierdzona przez wprowadzenie bakterii bezpośrednio do jamy ciała muchy. Takie podejście omija bariery nabłonkowe i zachowania ochronne, umożliwiając badanie infekcji ogólnoustrojowej niezależnie od naturalnego sposobu przenoszenia. Istnieją dwie podstawowe metody eksperymentalnego ustalania infekcji ogólnoustrojowej. W pierwszym z nich nanoiniektor i ciągnięte szklane igły kapilarne są używane do wstrzykiwania precyzyjnej liczby bakterii do muchy. Zaletą tej metody jest to, że pozwala na duży zakres dynamiczny dawek infekcji i jest ilościowo wysoce powtarzalna. Drugim podejściem jest dostarczenie infekcji za pomocą septycznego ukłucia szpilką. Takie podejście ma tę zaletę, że jest szybkie i nie wymaga specjalnego sprzętu. Po ustaleniu infekcji możliwe staje się zmierzenie ogólnoustrojowego obciążenia patogenami, śmiertelności gospodarza i indukowalnej aktywności układu odpornościowego. Oczywiście, u zakażonego D. melanogaster można by zmierzyć dowolną liczbę dodatkowych fenotypów, w tym płodność po infekcji12, zdolność uczenia się13, stan metaboliczny14 lub praktycznie każdą inną cechę, którą można sobie wyobrazić.

<table><tbody><tr><td>Inkubator</td><td>Powers Scientific, Inc</td><td>DROS52SD</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Flypads</td><td>FlyStuff</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD FG50</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka hodowlana Drosophila&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butelki z kwadratowym dnem o pojemności 6 uncji, polipropylen</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Nosterile Extra Large Bawełniane kulki</td><td>marki Fisher</td><td>22-456-882</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>FIOLKI SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila polistyren</td><td>VWR international</td><td>89092-720</td><td></td></tr><tr><td>Nosterylne duże waciki</td><td>Marka Fisher</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Kolba 2 L</td><td>VWR international</td><td>89000-370</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego z przezroczystymi pokrywkami, podniesiony grzbiet; 100 x 15 mm;</td><td>VWR international</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Pętla do wnoszenia</td><td>VWR international</td><td>80094-488</td><td></td></tr><tr><td>Pipety klasyczne Rainin w różnych rozmiarach 0,1 i mikro; l do 2 i mikro; L, 2 & mikro; l do 20 i mikro; L, 20 i mikro; l do 200 i mikro; L, 100 & mikro; l do 1,000 &mikro; l</td><td>Końcówki do</td> mikropipet Rainin <td>PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000</td><td></td></tr> (<tr><td>różne rozmiary)</td><td>VWR international</td><td>30128-376 53503-810 16466-008</td><td></td></tr><tr><td>Baza bulionowa Luria, Miller</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe probówki hodowlane Szkło borokrzemianowe</td><td>VWR international</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>S-500 Orbital Wytrząsarka</td><td>VWR international</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>VWR international</td><td>37001-300</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 10X</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spektrofotometr</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety półmikroobjętościowe</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz kapilarny</td><td>Igła Kopf Ściągacz</td><td></td><td></td>do pipet</tr><tr><td>3,5'' Wymienne szklane kapilary do Nanojet II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny, biały, jasny</td><td>Macron Chemikalia wysokowartościowe</td><td>6358-10</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki</td><td>Minutein Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml&nbsp; Probówki do mikrowirówek; Seal Rite</td><td>USA Scientific Inc.</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany tłuczek; Mieszadło laboratoryjne Talboys</td><td>Troemner</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>Talboys Homogenizator o wysokiej przepustowości</td><td>OPS Diagnostyka 930145</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kule szlifierskie 5/32 ''</td><td>Diagnostyka OPS</td><td>GBSS 156-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>Innowacje naukowe inc.</td>Pipetor wielokanałowy <td>G560</td><td></td></tr><tr><td>(10 &mu; l - 300 &mu; l)</td><td>Sartorius</td><td>730360</td><td></td></tr><tr><td>WASP2 Whitley Automated Spiral Plater</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProtoCOL automatyczny licznik kolonii / licznik płytek / czytnik płyt&nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>probówki qPCR; Niskoprofilowe paski z 8 probówkami 0,2 ml</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>kapsułki qPCR; Optyczne płaskie paski z 8 nasadkami</td><td>Bio-Rad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 Bez RNaz DNaza</td><td>Promega</td><td>m610a</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Odwrotna transkryptaza</td><td>Promega</td><td>m170b</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1240</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5260</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5200</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor rybonukleazy RNasin</td><td>Promega</td><td>N2115</td><td></td></tr></tbody></table>

ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u drosophila melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Muszka owocowa Drosophila melanogaster jest jednym z głównych organizmów modelowych do badania funkcji i ewolucji obrony immunologicznej. Wiele aspektów odporności wrodzonej jest zachowanych między owadami i ssakami, a ponieważ Drosophila może być łatwo manipulowana genetycznie i eksperymentalnie, są one potężne w badaniu funkcji układu odpornościowego i fizjologicznych konsekwencji choroby. Zademonstrowana tutaj procedura pozwala na zakażenie much poprzez wprowadzenie bakterii bezpośrednio do jamy ciała, omijając bariery nabłonkowe i bardziej pasywne formy obrony oraz pozwalając skupić się na infekcji ogólnoustrojowej. Procedura obejmuje protokoły pomiaru wskaźników śmiertelności gospodarza, ogólnoustrojowego obciążenia patogenami i stopnia indukcji układu odpornościowego gospodarza. Ta procedura infekcji jest niedroga, solidna i ilościowo powtarzalna i może być stosowana w badaniach genetyki funkcjonalnej, ewolucyjnej historii życia i fizjologii.

Ta sekcja przedstawia wyniki, jakie można uzyskać po infekcji bakteryjnej Drosophila melanogaster. Rysunek 1 pokazuje, że dawka infekcyjna zmienia się wraz z gęstością optyczną zawiesiny bakteryjnej użytej do iniekcji, a dostarczoną dawkę można wiarygodnie oszacować poprzez homogenizację i wysiew much bezpośrednio po iniekcji. Jak zilustrowano na Rysunku 2, różne patogeny mogą powodować różny poziom śmiertelności gospodarza (Rysunek 2A), a śmiertelność gospodarza może być zależna od dawki (Rysunek 2B). Co istotne, niniejszy protokół pozwala na uzyskanie różnych typów infekcji: Providencia rettgeri może wywołać przewlekłą, subletalną infekcję, która utrzymuje się przez 20 dni lub dłużej (Rysunek 3A). Jednak inne bakterie, takie jak Escerichia coli, są w większości eliminowane przez muchę-gospodarza w ciągu sześciu godzin po infekcji (Rysunek 3B). Indukcję układu odpornościowego można oszacować poprzez izolację RNA i następną qRT-PCR transkryptów peptydów przeciwbakteryjnych (Rysunek 4A i B). Analogicznie, choć w sposób mniej ilościowy, do wizualizacji indukcji układu odpornościowego można wykorzystać muchy wykazujące ekspresję GFP pod kontrolą promotorów genów peptydów przeciwdrobnoustrojowych (Rysunek 4C).
<img alt="Rysunek 1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Wyznaczanie dawki zakaźnej. Muchom wstrzyknięto 50 nl&#160;zawiesin bakteryjnych o różnych gęstościach optycznych (0,0001 - 0,05). Muchy natychmiast poddano homogenizacji i wysiano na płytki w celu oznaczenia liczby bakterii wprowadzonych podczas wstrzykiwania. Początkowa liczba bakterii jest silnie skorelowana z początkową wstrzykniętą gęstością optyczną (r2 = 0,96)
<img alt="Rysunek 2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Przeżywalność po wstrzyknięciu patogenów bakteryjnych. Samcom w wieku od pięciu do siedmiu dni wstrzyknięto 50 nl&#160;zawiesiny bakteryjnej lub medium sterylnego, a następnie monitorowano ich przeżywalność. (A) Muchom typu dzikiego wstrzyknięto około 5 000 bakterii jednego z trzech różnych gatunków. Tempo śmiertelności gospodarza w znacznym stopniu zależy od gatunku bakterii użytego do zakażenia. (B) Muchom typu dzikiego wstrzyknięto trzy różne dawki Enterococcus faecalis – 50, 500 i 5 000 bakterii na muchę. Muchy giną szybciej przy zakażeniu wyższymi dawkami zakaźnymi. (C) Mutantowi układu odpornościowego oraz jego izogenicznej linii kontrolnej typu dzikiego wstrzyknięto około 500 Burkholderia cepacia. Porównanie parzyste testem Log-Rank wykazuje, że mucha typu dzikiego znacznie lepiej przeżywa zakażenie niż mutant (χ2&#160;= 59,02, df = 1, p &#60;0,0001).
<img alt="Rysunek 3" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Obciążenie bakteryjne po wstrzyknięciu. Muchom wstrzyknięto około (A) 5 000 P. rettgeri (B) 3 400 E. coli. Obciążenie bakteryjne oznaczano bezpośrednio po wstrzyknięciu oraz w różnych późniejszych punktach czasowych. Każdy punkt danych reprezentuje obciążenie bakteryjne pojedynczej muchy. E. coli jest szybko eliminowana z organizmów gospodarzy, podczas gdy P. rettgeri utrzymuje się przez resztę życia gospodarza.
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Indukcja ekspresji genów odpornościowych po iniekcji. (A) Muchy wstrzyknięto 50 nl&#160;z P. rettgeri lub sterylny PBS do jamy brzusznej lub klatki piersiowej, lub pozostały niepoddane manipulacji, z wyjątkiem podania CO2 znieczulenie. Sześć godzin po zakażeniu much pobrano do izolacji RNA i analizy ekspresji Dipterycyna A ekspresję genu określono za pomocą qRT-PCR.A) Poziomy ekspresji przedstawiono na wykresie jako stosunek Dipterycyna A transkrypcja do rp49 transkrypcji i przeskalowane tak, aby współczynnik CO2 Kontrolę definiuje się jako posiadającą poziom ekspresji równy 1. Słupki przedstawiają średnią oraz błąd standardowy stosunków dla każdego stanu (n = 4).B) Poziomy ekspresji przedstawiono na wykresie jako 2&#916;&#916;tomografia komputerowa z przeciętnym CT wartość z CO2 muchy kontrolne z kontrolowaną znieczuleniem, wykorzystane jako standardowy stan nieindukowany. Słupki przedstawiają średnią i błąd standardowy &#916;&#916;CT z każdego stanu (n = 4). Chociaż nie stwierdzono różnic w indukcji transkrypcyjne zależnych od miejsca iniekcji, porównanie paneli A i B pokazuje, w jaki sposób &#916;&#916;CT metoda ta może potencjalnie prowadzić do przeszacowania poziomów indukcji. (C) Muchy wykazujące ekspresję GFP pod kontrolą Dipterycyna A do promotora wstrzyknięto 50 nl&#160;z *P. rettgeri* (OD = 0,1), a następnie wykonano obrazowanie po 7 dniach. Panel GFP pokazuje ekspresję GFP w ciałku tłuszczowym odwłoka zainfekowanych much, co wskazuje na aktywację Dyptyrycyna A promotor w muchach zainfekowanych bakteriami, ale nie w kontrolach wstrzykniętych pożywką.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gen</td>
			<td>Wprowadzenie</td>
			<td>Odwrócenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rp49 (zwany również rpL32)</td>
			<td>5’ AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3’</td>
			<td>5’ GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipterycyna A</td>
			<td>5’ GCGGCGATGGTTTTGG 3’</td>
			<td>5’ CGCTGGTCCACACCTTCTG 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drozomycyna</td>
			<td>5’ CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3’</td>
			<td>5’ TCCCTCCTCCTTGCACACA 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defensyna </td>
			<td>5’ GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3’</td>
			<td>5’ TCGCTTCTGGCGGCTATG 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attacyna A</td>
			<td>5’ CGTTTGGATCTGACCAAGG 3’</td>
			<td>5’ AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metchnikowan</td>
			<td>5’ AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3’</td>
			<td>5’ ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3’</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Startery do qRT-PCR.

Drosophila melanogaster to wybitny organizm modelowy do badania wrodzonego układu odpornościowego oraz fizjologicznych konsekwencji infekcji i chorób. Protokół ten opisuje, w jaki sposób dostarczyć D. melanogaster solidne i ilościowo powtarzalne infekcje bakteryjne, a następnie jak zmierzyć nasilenie infekcji i określić ilościowo odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie silnych i powtarzalnych infekcji bakteryjnych u drosofilii, melanogastera, a następnie zmierzenie ciężkości infekcji i ilościowe określenie odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Osiąga się to poprzez najpierw dostarczenie infekcji bakteryjnej do muszek za pomocą nanowtryskiwacza. Śmiertelność po infekcji można śledzić w czasie, a ogólnoustrojowe obciążenie bakteryjne można określić w dowolnym momencie, homogenizując zakażone muchy i mierząc liczbę obecnych bakterii.Obronę immunologiczną gospodarza można również określić ilościowo, mierząc poziom ekspresji genów peptydów przeciwbakteryjnych, ostatecznie określając ilościowo i charakteryzując infekcję bakteryjną. U Drosophila melanogaster może być używany do testowania, jak czynniki genetyczne i środowiskowe zmieniają kompetencję immunologiczną muchy. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odporności owadów, takie jak to, w jaki sposób czynniki genetyczne i środowiskowe gospodarza wpływają na zdolność immunologiczną gospodarza lub jak różne bakterie różnią się w swojej infekcji Kinetyka, Chociaż używamy tej metody do pomiaru obrony immunologicznej Drosophila melanogaster przed infekcją bakteryjną, można ją również zastosować do innych owadów i może wykorzystywać inne rodzaje patogenów, takich jak wirusy lub grzyby.Częstym problemem, z którym borykają się ludzie, gdy po raz pierwszy uczą się tej metody, jest to, że mogą spowodować zbyt wiele obrażeń u much, co może skutkować nadmiernie wysoką śmiertelnością, nawet w grupie kontrolnej. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie dla nauczenia się, jak przeprowadzić infekcję przy minimalnym uszkodzeniu muchy. Ponieważ nasz gatunek żywiciela oph melanogaster jest tak mały, infekcja musi być przeprowadzona pod mikroskopem, co zwiększa początkową złożoność techniki.Wierzymy jednak, że niewielka demonstracja tej techniki sprawi, że będzie ona dostępna nawet dla naukowców, którzy mają tylko ograniczone doświadczenie z muchami. Aby rozpocząć eksperyment, należy wybrać pojedynczą kolonię z wcześniej przygotowanej płytki wzorcowej i zaszczepić kolbę sterylnego podłoża. Hoduj bakterie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza do fazy stacjonarnej.Gdy hodowla osiągnie fazę stacjonarną, delikatnie granulować komórki z 600 mikrolitrów kultury w wirówce stołowej przez trzy minuty po 5 000 razy. G, a następnie odrzuć Rena i Resus. Zawieś bakterie w 1000 mikrolitrach sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS.Następnie rozcieńczyć zawieszone komórki w sterylnym PBS, aby osiągnąć pożądaną absorbancję 600 nanometrów i użyć tej zawiesiny do zakażenia much. Przygotuj szklaną igłę, ciągnąc pożyczoną kapilę ze szkła krzemianowego i użyj kleszczyków, aby odłamać końcówkę igły, aby utworzyć otwór o średnicy 50 mikrometrów. Następnie umieść sufitowy O-ring i białą przekładkę z dużym wgłębieniem skierowanym na zewnątrz na metalowy tłok wtryskiwacza.Napełnij szklaną igłę olejem mineralnym za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 30. Następnie umieść wypełnioną szklaną igłę przez tuleję zaciskową i umieść większy O-ring wokół jej podstawy w odległości jednego milimetra od końca igły. Wsuń igłę na metalowy tłok i delikatnie przykręć tuleję zaciskową, aż będzie bezpieczna.Usuń olej mineralny z wtryskiwacza, pozostawiając niewielką objętość oleju w igle, która będzie działać jako bariera między wstrzykiwaczem a zawiesiną bakteryjną. Upewnij się, że w oleju mineralnym, zawiesinie bakteryjnej lub między tymi dwoma płynami nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie ustaw wtryskiwacz na żądaną objętość do wstrzyknięcia.Ostrożnie włożyć końcówkę igły kapilarnej do probówki ze sterylnym PBS i nacisnąć przycisk napełniania na wstrzykiwaczu, aby napełnić igłę wstrzykiwacza w celu wytworzenia kontroli zranienia. Wstrzyknąć znieczulone muszki sterylnym PBS w przednią część brzucha na brzusznej powierzchni bocznej, umieścić wstrzyknięte muchy w świeżych fiolkach z nową pożywką i położyć fiolki na boku, aby zapobiec przyklejaniu się much do pokarmu, zanim wyjdą ze znieczulenia. Następnie należy wysunąć pozostałą jałową pożywkę z wstrzykiwacza i ponownie napełnić tę samą igłę zawiesiną bakteryjną.Powtórz procedurę i wstrzyknij muszkom zawiesinę bakteryjną. Alternatywnie, infekcja może być dostarczona przez nakłucie szpilką septyczną. Aby przygotować zainfekowaną szpilkę, stopić koniec końcówki mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów i włożyć 0,15-milimetrową szpilkę do mnuchina owadów do stopionego plastiku.Pozwól, aby plastik zastygł, tak aby szpilka była utrzymywana na miejscu za pomocą 0,5 centymetra szpilki wystającej z plastiku, znieczulij muchy dwutlenkiem węgla i nakłuj muchy w mostkową płytkę opłucnową klatki piersiowej za pomocą igły, unikając miejsc przyczepu skrzydeł i nóg. Usuń muchy ze szpilki do drobiazgów za pomocą miękkich kleszczy. Pamiętaj, aby zanurzyć szpilkę w zawiesinie bakteryjnej między nakłuwaniem każdej muchy.Umieść ukłute muchy w świeżej fiolce z nową pożywką na muchy, kładąc fiolkę na boku, aż wszystkie muchy wyzdrowieją ze znieczulenia. Umieść podgrupę zakażonych much w oddzielnych mikroprobówkach wirówkowych na lodzie. Dodaj 250 mikrolitrów PBS do każdej probówki i użyj tłuczka do homogenizacji much.Następnie rozłóż homogenat na napowietrzaczu LB za pomocą spiralnej płytki. Alternatywnie do powlekania homogenatu przez seryjne rozcieńczanie. Przenieść homogenat każdej muchy do pierwszego rzędu 96.Dobrze płytkować i napełniać każdą studzienkę z pozostałych rzędów 90 mikrolitrami PBS za pomocą pipety wielokanałowej. Weź 10 mikrolitrów z pierwszego rzędu zawierającego homogenat muchowy i dozuj homogenat do drugiego rzędu. Przepompuj go w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać homogenat.Następnie weź 10 mikrolitrów homogenatu i przenieś go do następnego rzędu. Powtórz tę procedurę, używając pozostałych rzędów, zaczynając od dolnego rzędu. Za pomocą pipety wielokanałowej pobierz 10 mikrolitrów z każdej studzienki i umieść je na płytce LB.Upewnij się, że próbki są dozowane jako dyskretne miejsca, które nie stykają się ze sobą. Powtarzać ten krok, aż zostaną pobrane próbki ze wszystkich studzienek z każdego rzędu, dozując je w malejącej kolejności rozcieńczenia na płytce LB. Niezależnie od zastosowanej metody powlekania, uważaj, aby nie zarosnąć płytek, aby kolonie pozostały małe i dyskretne.Wyjąć płytkę z inkubatora. Gdy eksperymentalne bakterie wyhodują widoczne kolonie, ale przed koloniami z drosophila, mikrobiota jelitowa staje się widoczna około 24 godziny później w przypadku spiralnych płytek. Policz kolonie, które rosną, za pomocą automatycznego licznika kolonii, który może oszacować obciążenie bakteryjne na mililitr homogenatu na podstawie liczby i położenia kolonii na płytce.W przypadku płytek punktowych należy ręcznie policzyć kolonie dla każdej muchy z dowolnego rozcieńczenia zawierającego od 30 do 300 kolonii i obliczyć liczbę bakterii na mililitr oryginalnego homogenatu. Muchom wstrzyknięto 50 nanolitrów zawiesin bakteryjnych o różnych gęstościach optycznych, a natychmiast zhomogenizowana i podana dawka infekcji zmienia się wraz z gęstością optyczną zawiesiny bakteryjnej użytej do wstrzykiwań. Początkowe obciążenia bakteryjne silnie korelują z początkowym wstrzykniętym OD.Protokół ten umożliwia obserwację różnych typów infekcji. Muchy zostały zarażone providencia rei, która może powodować przewlekłą infekcję subletalną, która utrzymuje się przez 20 dni lub dłużej. Muchy zakażone coli usuną infekcję w ciągu sześciu godzin. Po zakażeniu.Indukcję układu odpornościowego można oszacować poprzez izolację RNA, a następnie Q rtpcr R transkryptu peptydu przeciwbakteryjnego analogicznie, ale mniej ilościowo muchy wykazujące ekspresję GFP pod kontrolą peptydu przeciwdrobnoustrojowego. Promotory genów mogą być wykorzystywane do wizualizacji indukcji układu odpornościowego po opanowaniu. Ta technika może pozwolić na zakażenie setek much na godzinę.U muszek po zakażeniu można by zmierzyć dowolną liczbę fenotypów, w tym zdolność uczenia się, stan metaboliczny lub praktycznie każdą inną cechę, którą można sobie wyobrazić. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dostarczać silne i powtarzalne infekcje bakteryjne do drosophila, melanogaster oraz jak następnie mierzyć nasilenie infekcji i określać ilościowo odpowiedź immunologiczną gospodarza. Nie zapominaj, że niektóre bakterie mogą stanowić zagrożenie dla zdrowia ludzkiego.Upewnij się, że przestrzegane są odpowiednie procedury bezpieczeństwa biologicznego i że stosowane są odpowiednie środki ograniczające rozprzestrzenianie się zakażonych much. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

systemic-bacterial-infection-immune-defense-phenotypes-drosophila

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Układowa infekcja bakteryjna i fenotypy odpornościowe w Drosophila Melanogaster

Osy pasożytnicze stanowią główną grupę naturalnych wrogów wielu owadów, w tym Drosophila melanogaster. Przedstawimy techniki rozmnażania tych pasożytów w gatunkach Drosophila spp. oraz zademonstrujemy sposób analizy ich wpływu na tkanki odpornościowe larw Drosophila.

Wprowadzenie do os w pasożytach Drosophila i odpowiedzi immunologicznej przeciwpasożytniczej

Aby zrozumieć związek między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem, opisujemy metodę pomiaru aktywności lokomotorycznej Drosophila podczas infekcji bakteryjnej, a także zdolność much do wywołania odpowiedzi immunologicznej poprzez monitorowanie przeżywalności, obciążenia bakteryjnego oraz aktywności w czasie rzeczywistym kluczowego regulatora odporności wrodzonej, NFκB.

Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila

Ten film pokazuje nano-wstrzyknięcie zawiesiny bakteryjnej do jamy ciała muchy, co powoduje namnażanie się bakterii i infekcję. Odpowiedź immunologiczna muchy usuwa niektóre bakterie, podczas gdy inne uciekają przed klirensem immunologicznym i przeżywają w żywicielu, powodując infekcję.

Zakażenie much zawiesiną bakteryjną za pomocą nanowstrzykiwacza

Ten film demonstruje technikę infekowania Drosophila poprzez wprowadzenie bakterii chorobotwórczej bezpośrednio do ich jamy ciała. Metoda ta omija bariery nabłonkowe i inne pasywne mechanizmy obronne, pozwalając na indukcję infekcji ogólnoustrojowej. Po zakażeniu wynikającą z zakażenia odpowiedź immunologiczną ocenia się poprzez monitorowanie śmiertelności much i przeprowadzanie dalszych testów.

Technika septycznego nakłuwania szpilek w celu wprowadzenia ogólnoustrojowej infekcji bakteryjnej u much

W tym filmie demonstrujemy technikę pomiaru obciążenia bakteriami E. coli po wstrzyknięciu E. coli do klatki piersiowej Drosophila melanogaster.

Pomiar obciążenia bakteryjnego E. coli u Drosophila melanogaster po zakażeniu E. coli

Przedstawiono metodę hodowli Drosophila melanogaster w warunkach aksonicznych i gnotobiotycznych. Zarodki much są dechorionowane w podchlorynie sodu, przenoszone aseptycznie do jałowej diety i hodowane w zamkniętych pojemnikach. Zaszczepianie diety i zarodków bakteriami prowadzi do asocjacji gnotobiotycznych, a obecność bakterii potwierdza się poprzez posiew homogenatów Drosophila na całe ciało.

Hodowla muszki owocowej Drosophila melanogaster w warunkach aksenicznych i gnotobiotycznych

Ta metoda pokazuje, jak wizualizować inwazję patogenów na komórki owadów za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli. Hemocyty larw Drosophila były zakażone patogenami wirusowymi lub bakteryjnymi, zarówno ex vivo, jak i in vivo. Zainfekowane hemocyty zostały następnie utrwalone i wybarwione w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie rekonstrukcji komórkowej 3D.

Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

Ten protokół opisuje metody doustnego wystawiania i zarażania muszki owocowej Drosophila melanogaster patogenami bakteryjnymi, a także mierzenia liczby zakaźnych bakterii wydalanych po infekcji jelitowej. Dalej opisujemy wpływ mutantów immunologicznych na przeżywalność much po zakażeniu bakteryjnym jamy ustnej.

Zakażenie bakteryjne jamy ustnej i wydalanie u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje test fagocytozy in vivo u dorosłych Drosophila melanogaster w celu ilościowego określenia rozpoznawania fagocytów i usuwania infekcji mikrobiologicznych.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Ten protokół opisuje test in vivo fagocytozy używany do oceny i ilościowego określenia zdolności młodych i starszych hemocytów Drosophila melanogaster do fagocytozy bakterii.

Ocena specyficznej dla wieku zdolności fagocytarnej dorosłych hemocytów Drosophila melanogaster za pomocą testu fagocytozy in vivo

Dorosłe muchy Drosophila melanogaster były szeroko wykorzystywane jako organizmy modelowe do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wrodzonych odpowiedzi immunologicznych gospodarza i strategii infekcji mikrobiologicznej. Aby promować stadium larwy D. melanogaster jako dodatkowy lub alternatywny system modelowy, opisano technikę iniekcji larw.

Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Protokół wstrzyknięcia larw

Poznaj metodę wstrzyknięć bakteryjnych i pomiaru odpowiedzi immunologicznej u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia badanie wrodzonej odporności i mechanizmów obrony gospodarza.

Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów