Suszone plamy krwi - przygotowanie i przetwarzanie do stosowania w testach immunologicznych i technikach molekularnych

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie ustandaryzowanego protokołu przygotowania i przetwarzania wysuszonych plamek krwi, które zostaną następnie wykorzystane w testach immunologicznych i technikach molekularnych. Osiąga się to poprzez pobranie krwi włośniczkowej i przeniesienie jej na kartę filtracyjną. Drugim krokiem jest wysuszenie plam krwi przez noc i uzyskanie sześciomilimetrowych stempli z okręgów karty filtracyjnej.

Następnie, ian wysuszonej krwi z ciosów uzyskuje się przez zanurzenie w buforze na wytrząsarce na minimum cztery godziny. Hemolityczne EIT są następnie uwalniane z zanieczyszczeń przez odwirowanie. Ostatnim krokiem jest analiza oczyszczonych EIT pod kątem markerów serologicznych i molekularnych zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu B, wirusowym zapaleniem wątroby typu C i ludzkimi wirusami niedoboru odporności za pomocą dostępnych na rynku testów immunologicznych i technik molekularnych.

Pomysł wykorzystania wykresu zebranego na karcie filtracyjnej wykonanej z komórki zrodził się sto lat temu. Niemniej jednak osoby stosujące tę metodę po raz pierwszy często będą zmagać się z nią nawet dzisiaj, ponieważ cała faza przedanalityczna, która obejmuje przygotowanie i przetwarzanie wysuszonych plamek krwi do ich końcowej analizy, nie została ustandaryzowana dla prawie wszystkich zastosowań badania suchej kropli krwi. Biorąc to pod uwagę, sugerujemy kompleksowy, ustandaryzowany protokół krok po kroku dotyczący przygotowania i przetwarzania wysuszonych plam krwi, który zostanie następnie wykorzystany w testach immunologicznych i technikach molekularnych.

Wizualna demonstracja tej metodologii wydaje się być kluczowa, ponieważ kilka kroków, takich jak usunięcie krwi włośniczkowej, jest kilka kroków. Zgadza się. Przeniesienie na karty filtrujące lub przygotowanie odpowiednich ciosów z tłumu nie jest łatwe do nauczenia, a co za tym idzie, osoby, które po raz pierwszy używają tej techniki, bez wątpienia skorzystają z reprezentacji wizualnej.

Krew włośniczkowa zostanie pobrana z palca Nica przez technika z naszego laboratorium, który zademonstruje procedurę przetwarzania. Pobrane plamy krwi zostaną wykonane przez technika ko, który już od wielu lat pracuje w naszym laboratorium zajmującym się diagnostyką molekularno-biologiczną do nakłuwania skóry. Najpierw załóż parę jednorazowych rękawiczek z gumy lateksowej.

Przed wykonaniem nakłucia skóry pacjent powinien ogrzać dłonie. Palec jest znacznie masowany, aby wzbogacić przepływ krwi w kierunku górnego miejsca nakłucia. Następnie oczyść skórę po stronie Palmera końcówki, dystalnego paliczka trzeciego lub czwartego palca ręki niepiszącej, odpowiednim środkiem dezynfekującym, nakłuć skórę jednorazowym nakłuwaczem bezpiecznym.

Palce powinny być trzymane w takiej pozycji, aby grawitacja ułatwiała gromadzenie się krwi na opuszku palca. Zetrzyj pierwszą kroplę krwi gazikiem, ponieważ może on zawierać nadmiar płynów tkankowych. Po ponownym masowaniu palca w celu zwiększenia przepływu krwi w miejscu nakłucia, przenieś następującą kroplę do jednego z okręgów karty filtracyjnej, nie dotykając powierzchni bezpośrednio opuszkiem palca.

Niech następna duża kropla krwi włośniczkowej utworzy się na opuszku palca i zbierz ją w następnym okręgu. Kontynuuj tę procedurę, aż wszystkie niezbędne kręgi zostaną wypełnione lub przepływ krwi ustanie podczas pobierania. Pozwól, aby krew wsiąkła w teksturę filtra tylko pod wpływem sił kapilarnych.

Nie ściskaj ani nie doić palca nadmiernie, jeśli przepływ krwi nie jest wystarczający do wypełnienia wszystkich wymaganych okręgów karty filtracyjnej. Jeśli przepływ krwi zatrzyma się, umieść bandaż na opuszku palca, wykonaj drugie nakłucie skóry na innym palcu, jeśli do badania potrzeba więcej krwi, aby wysuszyć plamy krwi, połóż karty filtracyjne na czystym ręczniku papierowym w szafce bezpieczeństwa biologicznego i pozostaw do wyschnięcia, najlepiej przez noc w temperaturze pokojowej. W przypadku braku jakiegokolwiek zewnętrznego źródła ciepła, po zakończeniu procesu suszenia, plamy krwi mają jednolicie ciemnobrązowawy kolor i nie są już widoczne żadne czerwone obszary do przechowywania.

Umieść kartę bibuły filtracyjnej w pojedynczej nieprzepuszczalnej dla gazów torbie z zamkiem błyskawicznym zawierającej jedną lub dwie saszetki ze środkiem osuszającym, aby chronić próbki przed wilgocią. Przenieś tę torbę do zamrażarki o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub niższej tak szybko, jak to możliwe. Jeśli zamrażarki nie są dostępne w warunkach polowych, przechowywanie w temperaturze minus czterech stopni Celsjusza lub nawet w temperaturze otoczenia jest możliwe do 14 dni.

Wybij jedno miejsce za pomocą jednorazowego sześciomilimetrowego urządzenia z każdego nasączonego krwią okręgu przeniesienia karty filtra stopnia 9 0 3, wszystkie wysuszone plamy krwi od jednego pacjenta do jednej studzienki z 12. Płytka studzienna wypełnij studzienkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanem zawierającą 0,05% między 20 i 0,08% azydku sodu. Powtórz te kroki, aby uzyskać drugą serię wysuszonych plamek krwi EIT w celu przeprowadzenia analiz molekularnych.

Następnie umieść płytkę z kulturą komórkową na wytrząsarce laboratoryjnej i pozwól, aby wysuszone plamy krwi delikatnie wymywały się przez co najmniej cztery godziny lub najlepiej przez noc. Następnego dnia plamy są prawie wolne od krwi i utworzyły się supernatanty hemolityczne. Przenieś te EIT do mikroprobówek wirówek, a następnie poddaj je wirowaniu przez dwie minuty w temperaturze 10 500 razy G, aby się uwolnić.

Supernatanty z wszelkich szczątków, które powstały podczas ellucjańskich wirówek EIT, są teraz gotowe do wykorzystania w zamierzonych analizach. Pierwsza seria EIT jest przenoszona do kubków w celu przeprowadzenia testów serologicznych. Druga seria jest przenoszona do mikroprobówek w celu analizy PCR.

Zbadaj EIT pod kątem markerów wirusa zapalenia wątroby typu B, wirusa zapalenia wątroby typu C i zakażenia HIV przy użyciu dostępnych na rynku testów i postępuj zgodnie z instrukcjami odpowiedniego producenta. Na koniec wyniki testów serologicznych na w pełni zautomatyzowanym analizatorze są wyświetlane na ekranie systemu. Skuteczność protokołu sugerowanego do przygotowania i przetwarzania wysuszonych plamek krwi została po raz pierwszy oceniona poprzez analizę 1 762 sprzężonych par suchych plamek krwi w surowicy w odniesieniu do oznaczeń antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B.

Protokół testu został zmodyfikowany, ponieważ przy wartości granicznej wynoszącej 0,05 jednostki międzynarodowej na mililitr, 56,2% EIT było reaktywnych w porównaniu z wynikami uzyskanymi z Sarah. Odpowiadało to odsetkowi wyników fałszywie dodatnich wynoszącemu 14,7% w testach antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B. Analiza charakterystyki operacyjnej odbiornika danych wykazała, że zwiększenie progu do 0,15 jednostki międzynarodowej na mililitr skutkowałoby idealnym oddzieleniem dodatnich antygenów powierzchniowych wirusa zapalenia wątroby typu B od ujemnych antygenów powierzchniowych wirusa zapalenia wątroby typu B podczas badania par suchych plamek krwi w surowicy na obecność antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B, Uzyskano tylko dwa rozbieżne egzemplarze.

Dwie fałszywie ujemne wyniki Sarah pochodziły od pacjentów leczonych przeciwwirusowo. Jakościowe oznaczanie H-B-V-D-N-A metodą PCR w czasie rzeczywistym z EIT krwi pełnej wykazało czułość 93%W związku z tym nie wykryto siedmiu próbek o niskich stężeniach H-B-V-D-N-A w surowicy. Tylko cztery fałszywie ujemne wyniki anty HCV uzyskano z wysuszonych plamistości krwi EIT.

Odpowiednie C zostały najprawdopodobniej pobrane od pacjentów, u których infekcje już dawno ustąpiły. Czułość analityczna wynosząca 100% dla oznaczeń H-C-V-R-N-A z wysuszonych plamistości krwi EIT wskazała na doskonałą czułość podejścia do amplifikacji za pośrednictwem transkrypcji izotermicznej, które zastosowano do amplifikacji H-C-V-R-N-A. Wykrycie przeciwciał anty HIV w wysuszonych plamistkach krwi EIT za pomocą w pełni zautomatyzowanego systemu zaowocowało również czułością analityczną na poziomie 100%Ten film pokazuje, że obecnie możliwe jest wiarygodne wykrywanie markerów serologicznych i molekularnych zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu B, wirusem zapalenia wątroby typu C i HIV we wszystkich ciasnych plamkach krwi, nawet jeśli stosuje się stosunkowo dużą objętość elucji i modyfikacje protokołów esejowych ustanowionych dla badań surowicy lub osocza są nie uległ znaczącym zmianom.

Jednak przekazane wyniki potwierdziły również nieodłączne ograniczenia techniki suszenia plam krwi. W niektórych przypadkach. Przedstawiony protokół został również przetestowany w warunkach terenowych na 534 aktywnych użytkownikach narkotyków w niemieckich miastach Berlinie i Essen podczas fazy pilotażowej badania nad lekami i chorobami zakaźnymi.

Uzyskane wyniki doprowadziły do niewielkiej modyfikacji algorytmu testowego dla głównej fazy badania leku w sześciu dodatkowych dużych miastach niemieckich.