Name: Suszone plamy krwi - przygotowanie i przetwarzanie do stosowania w testach immunologicznych i technikach molekularnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Poznaj standaryzowany protokół przygotowania suszonych plam krwi do testów immunologicznych i technik molekularnych. Metoda umożliwia wykrywanie markerów wirusowych zakażeń HBV, HCV i HIV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta komunikacja jest oparta na wynikach wcześniej opublikowanych w Virology Journal17 w trybie otwartego dostępu na warunkach licencji Creative Commons Attribution License (<a href="http://creativecommons.org/licenses/by/2.0">http://creativecommons.org/licenses/by/2.0</a>) z BioMed Central jako licencjobiorcą. Autorzy wyrażają wdzięczność za owocną współpracę w ramach pilotażu badania "Drugs and Chronic Infectious Diseases" ("DRUCK Study") z U. Marcusem, W. Cai, W. Zhangiem i R. Zimmermannem z Instytutu Roberta Kocha (Berlin, Niemcy) i są wdzięczni S. Moyrerowi za wykonanie zdjęć zebranych na rysunku 1 a także dr D. F. Whybrewowi (Getynga, Niemcy) za poprawienie manuskryptu. Wyrażają również wdzięczność za umiejętną pomoc techniczną J. Ackermannowi, E. Bayrambasiemu, U. Büttnerowi, S. Dziubkowi, I. Jakobschemu, B. Krellenbergowi, H. Krohnowi, P. Kusimskiemu, A. Metcalfowi, J. Piejkowi, S. Saarowi, M. Schröterowi i K. Seidelowi. Badanie to zostało częściowo wsparte dotacją niemieckiego Ministerstwa Zdrowia dla Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Wirusowego Zapalenia Wątroby typu C.

Ponieważ protokół został opracowany do zastosowania w diagnostyce medycznej, jego stosowanie musi być zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej19. W przypadku pierwszej części wyników przedstawionych w niniejszym komunikacie, zarówno oddzielna zgoda pacjentów, jak i zatwierdzenie przez komisję etyki wydawały się zbędne z dwóch powodów: (1) „Przy przyjęciu” do szpitala Uniwersytetu w Essen „każdy pacjent wyraża pisemną zgodę na wszystkie niezbędne badania biochemiczne, bakteriologiczne i wirusologiczne”.17 (2) „Wszystkie próbki wykorzystane podczas oceny testów DBS zostały wysłane do Instytutu Wirusologii w ramach rutynowej diagnostyki klinicznej. W związku z tym żadna z próbek nie została pobrana specjalnie na potrzeby badania, nie wykonano żadnego dodatkowego wkłucia żylnego, a żadne z materiałów nie było badane pod kątem innych parametrów niż te wymagane przez lekarzy w przebiegu standardowej diagnostyki”.17 Badanie „Leki i Przewlekłe Choroby Zakaźne” (badanie DRUCK)18, w którym testy DBS zostały ostatecznie zastosowane w niemieckich miastach Berlin i Essen do oceny osób aktywnie przyjmujących narkotyty drogą dożylną, zostało zatwierdzone przez Federalnego Komisarza ds. Ochrony Danych i Wolności Informacji (Berlin, Niemcy), a także przez komisję etyki Uniwersytetu Medycznego Charité (Berlin, Niemcy).
1. Pobieranie krwi
<ol>
	<li>Wenopunkcja14, 15, 20, 21
	<ol>
		<li>Założyć jednorazowe rękawice lateksowe i oczyścić obszar planowanego miejsca nakłucia (najlepiej żyłę łokciową środkową w dole łokciowym) odpowiednim środkiem dezynfekcyjnym, np. 70% alkoholem izopropylowym.</li>
		<li>Założyć stazę 4 – 6 cali powyżej przewidywanego miejsca nakłucia, aby poszerzyć żyły. Wprowadzić igłę do żyły pacjenta i, po jej umieszczeniu, delikatnie napełnić podłączoną probówkę na krew zawierającą EDTA jako antykoagulant.</li>
		<li>Niezwłocznie po zakończeniu wenopunkcji zdjąć stazę i wycofać igłę. Następnie przycisnąć suchy gazik do miejsca nakłucia, który można później przymocować plastrem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nakłucie skóry (Rysunek 1A)13 - 15, 20, 22, 23
	<ol>
		<li>Założyć parę jednorazowych rękawic lateksowych.</li>
		<li>Przed nakłuciem skóry pacjent powinien rozgrzać dłonie. Palec należy masować w kierunku dystalnym, aby zwiększyć przepływ krwi w stronę miejsca nakłucia.</li>
		<li>Oczyścić skórę strony dłoniowej opuszka dalszej części paliczka trzeciego lub czwartego palca ręki niedominującej odpowiednim środkiem dezynfekcyjnym, np. 70% alkoholem izopropylowym. Nakłuć skórę za pomocą jednorazowego lancetu bezpiecznego. Palec powinien być trzymany w pozycji takiej, aby grawitacja ułatwiała zbieranie krwi na opuszku palca.</li>
		<li>Po zakończeniu pobrania krwi kapilarnej drogą nakłucia skóry, nałożyć plaster na opuszek palca.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie plamek krwi
<ol>
	<li>Przygotowanie z krwi pobranej drogą żylną15
	<ol>
		<li>Jak najszybciej nanieś pobraną przeciwkrzeplącą (EDTA) pełną krew żylną na karty filtracyjne. Nie przygotowuj suchych kropli krwi więcej niż 24 h po nakłuciu żyły.</li>
		<li>Wpisz na karcie filtracyjnej wszystkie informacje niezbędne do identyfikacji pacjenta. Jedna karta powinna zawierać krew tylko jednej osoby.</li>
		<li>Załóż jednorazowe rękawice lateksowe.</li>
		<li>Delikatnie odwróć probówkę z krwią 2 – 4 razy, a następnie ostrożnie otwórz korek.</li>
		<li>Pobierz 50 µl pełnej krwi żylnej za pomocą pipety z jednorazowym końcem. Przenieś krew do centrum jednego z kółek, nie dotykając końcem pipety bezpośrednio papieru filtracyjnego. Staraj się w pełni nasycić kółko.</li>
		<li>Powtarzaj tę procedurę, aż wypełnisz wszystkie wymagane kółka na karcie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie z krwi pobranej przez nakłucie skóry (Rysunki 1B oraz 1C)13 - 16, 23
	<ol>
		<li>Zetrzyj pierwszą kroplę krwi gazikiem, ponieważ może ona zawierać nadmiar płynów tkankowych. Ponownie masuj palec, aby zwiększyć przepływ krwi w miejscu nakłucia. Przenieś kolejną kroplę do jednego z kółek karty filtracyjnej, nie dotykając bezpośrednio powierzchni opuszkiem palca. Pozwól, aby krew wniknęła w strukturę filtra wyłącznie dzięki siłom kapilarnym.</li>
		<li>Pozwól, aby na opuszku palca uformowała się kolejna duża kropla krwi kapilarnej i zbierz ją w następnym kółku. Kontynuuj tę procedurę, aż wszystkie niezbędne kółka zostaną wypełnione lub dopóki przepływ krwi nie ustanie.</li>
		<li>Nie ściskaj i nie „doj” palca zbyt mocno, jeśli przepływ krwi jest niewystarczający do wypełnienia wszystkich wymaganych kółek karty filtracyjnej. Jeśli przepływ krwi ustanie, nałóż plaster na opuszek palca. W razie potrzeby pobrania większej ilości krwi do badania wykonaj drugie nakłucie skóry na innym palcu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Suszenie plam krwi
<ol>
	<li>Aby wysuszyć plamki krwi, umieścić karty filtracyjne na czystym ręczniku papierowym w komorze bezpieczeństwa biologicznego i pozostawić do wyschnięcia, najlepiej przez noc (ale przez co najmniej 4 hrs), w RT, bez dostępu zewnętrznego źródła ciepła. Po zakończeniu procesu suszenia plamki krwi mają jednolity ciemnobrązowy kolor, a czerwone obszary nie są już widoczne (Rycyna 1D)13, 15, 16.</li>
</ol>
4. Przechowywanie i transport wysuszonych plamek krwi (DBS)
UWAGA: Przetwarzanie plamek krwi można przerwać po wysuszeniu. Karty filtracyjne można teraz przechowywać13 - 16, 23.
<ol>
	<li>Do przechowywania włóż kartę z papieru filtracyjnego do pojedynczej, gazoszczelnej torby strunowej, zawierającej od 1 do 2 saszetek z osuszaczem, aby chronić próbki przed wilgocią (Rysunek 1E). Opcjonalnie dodaj kartę wskaźnika wilgotności.</li>
	<li>Jak najszybciej przenieś tę torbę do zamrażarki o temperaturze -20 °C lub niższej. Jeśli w warunkach terenowych zamrażarki nie są dostępne, dopuszczalne jest przechowywanie w temperaturze -4 °C lub nawet w temperaturze otoczenia przez maksymalnie 14 dni.</li>
	<li>Mrożone próbki DBS transportuj w suchym lodzie. W przypadku kart filtracyjnych przechowywanych początkowo w temperaturze otoczenia zastosuj potrójny system opakowań, składający się z torby/toreb strunowych jako pojemnika/pojemników wewnętrznych oraz koperty wewnętrznej i zewnętrznej. W przypadku wysyłki pocztą zwykłą na kopercie zewnętrznej nie są wymagane żadne oznaczenia zawartości, jednak do podstawowego pojemnika wewnętrznego należy przymocować międzynarodowy symbol zagrożenia biologicznego16.</li>
	<li>Wyklucz karty filtracyjne z dalszego przetwarzania, jeśli saszetki z osuszaczem i/lub dodatkowa karta wskaźnika wilgotności zmienią kolor na różowy.</li>
</ol>
5. Elucja z wysuszonych plam krwi13, 15, 16, 23
<ol>
	<li>Wypuść po jednym wycinku o średnicy 6 mm przy użyciu jednorazowego urządzenia z każdego kręgu nasączonego krwią na karcie filtracyjnej Grade 903 (Rysunek 1F). Przenieś wszystkie wycięte suche plamki krwi od jednego pacjenta do jednego dołka płytki 12-dołkowej.</li>
	<li>Wypełnij dołek solą fizjologiczną buforowaną fosforanem zawierającą 0,05% Tween 20 i 0,08% azotku sodu (Rysunek 1G). Dostosuj objętość dodanego buforu do minimalnych wymagań analizy stosowanej do późniejszego badania eluatów suchych plamek krwi.</li>
	<li>Powtórz te kroki, aby uzyskać drugą serię eluatów suchych plamek krwi w celu przeprowadzenia analiz molekularnych.</li>
	<li>Umieść płytkę do hodowli komórkowych na wytrząsacie laboratoryjnym i pozwól wyciętym suchym plamkom krwi delikatnie eluować przez minimum 4 hr lub, najlepiej, przez noc (O/N) (Rysunek 1H).</li>
	<li>Następnego dnia plamki są niemal całkowicie wolne od krwi, a w dołkach utworzyły się hemolityczne nadsączniki (Rysunek 1I). Przenieś te eluaty do probówek do mikrocentryfugi. Następnie poddaj je wirowaniu przez 2 min przy 10 500 x g (Rysunek 1J), aby oczyścić nadsączniki z wszelkich zanieczyszczeń, które powstały podczas elucji (Rysunek 1K).</li>
</ol>
6. Analiza eluatów
<ol>
	<li>Odwirukowane eluaty są teraz gotowe do zaplanowanych analiz. Należy przebadać eluaty pod kątem markerów wirusa zapalenia wątroby typu B, wirusa zapalenia wątroby typu C oraz zakażenia HIV, używając dostępnych komercyjnie zestawów i ściśle stosując się do instrukcji producentów (Rysunek 1L).</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu hodowli komórkowej z płytkami wielodołkowymi, inkubacją i sprzętem skanującym w ciągu 3 dni." src="/files/ftp_upload/52619/52619fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Graficzne podsumowanie protokołu zaproponowanego w niniejszej komunikacji w celu przygotowania i przetwarzania suchych plamek krwi do zastosowania w testach immunoologicznych i technikach molekularnych. Całokrwista żylna oraz krew kapilarna pobrana poprzez wenipunkcję lub nakłucie skóry lancetem (A) mogą służyć jako próbki do analizy suchych plamek krwi. Po przeniesieniu krwi do kół na karcie filtracyjnej klasy 903 (B, C), próbki powinny być suszone najlepiej przez noc (O/N) w temperaturze otoczenia w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utworzyć plamki o jednolitym brązowym kolorze, bez przeplatających się obszarów czerwonych (D). Po całkowitym wysuszeniu plamek krwi, w przypadku konieczności ich przechowywania, karty filtracyjne można zapakować do gazoszczelnych worków strunowych zawierających 1 – 2 saszetki z osuszaczem (E). Dalsze przetwarzanie laboratoryjne DBS obejmuje wycinanie krążków za pomocą jednorazowego urządzenia 6 mm z centrum kół (F, G), elucję krążków w buforze na bazie PBS przez minimum 4 hr lub najlepiej przez noc (O/N) na wytrząsarce (H), odzyskiwanie eluatów (I) i na koniec wirowanie probówek laboratoryjnych (J) w celu oczyszczenia eluatów DBS z zanieczyszczeń, które mogły powstać podczas procesu elucji (K). Następnie eluaty DBS są gotowe do analiz, które zostały wykonane na w pełni zautomatyzowanej platformie (L) w celu wykrycia markerów serologicznych zakażeń HBV, HCV i HIV odpowiednio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

W przeszłości RSR otrzymał honorarium za wygłaszanie wykładów i wsparcie finansowe dla swojej pracy naukowej od Abbott Diagnostics. NG i OM oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

DBS są używane od 100 lat2 Ale, co zaskakujące, nadal nie ma ogólnego konsensusu co do ich przygotowania i przetwarzania. Do tej pory wystarczająca standaryzacja tej ważnej fazy przedanalitycznej została osiągnięta jedynie w dziedzinie badań przesiewowych noworodków14, podczas gdy istnieje wiele różnych protokołów dla wszystkich innych zastosowań testów DBS5, 16, 23. Aby przezwyciężyć tę niezwykłą niejednorodność, w niniejszym komunikacie przedstawiono obszerną instrukcję krok po kroku dotyczącą przygotowania i przetwarzania DBS do wykorzystania w testach immunologicznych i technikach molekularnych oraz oceniono jej skuteczność w wykrywaniu markerów zakażeń HBV, HCV i HIV. Poniższa dyskusja skupia się przede wszystkim na różnych etapach proponowanego protokołu.
W historii testów DBS używano wielu różnych kart bibułowych z filtracją2 , ale obecnie tylko dwa komercyjne źródła są zatwierdzone przez FDA jako urządzenia medyczne klasy II do pobierania krwi5, 16. Te systemy kart filtracyjnych są wysoce jednorodne i mają bardzo podobne charakterystyki absorpcji, dzięki czemu wyniki analityczne uzyskane z krwi włośniczkowej przygotowanej na którymkolwiek z nich nie różnią się o więcej niż 4% – 5%28. Nic dziwnego, że Masciotra i współpracownicywykryli RNA HIV-1 równie dobrze za pomocą testu jakościowego po wyluceniu z kart pobierania krwi z różnych źródeł. Biorąc pod uwagę te dane, można praktycznie wykluczyć, że którakolwiek z rozbieżności zaobserwowanych podczas testowania sprzężonych par surowica/DBS pod kątem markerów zakażeń HBV, HCV i HIV17 była spowodowana wyborem samej karty filtracyjnej. Jeżeli jednak niezbędne jest dokładne oznaczanie ilościowe analitu, różnice między źródłami mogą nie być już nieistotne i konieczne może być zastosowanie bardziej wyrafinowanych technik, np. perforowanego DBS (PDBS) jako metody mikropobierania próbek30 lub przygotowania wysuszonych plamek surowicy (DSS)31 zamiast konwencjonalnego badania DBS10.
Ponieważ do badania DBS wykorzystuje się tylko niewielkie ilości krwi (jedna kropla krwi włośniczkowej składa się z około 50 μl)5, 16, różnice w objętości próbki są kluczowe i trzeba przyznać, że przynajmniej część rozbieżności między wynikami serologicznymi a zgłaszanym przez uczestników statusem HBV i HCV zarejestrowanym podczas pilotażu "Badania DRUCK" można przypisać tej zmiennej. Najważniejszym czynnikiem minimalizującym "wahania" objętości próbki jest bez wątpienia prawidłowa technika pobierania krwi włośniczkowej, którą można osiągnąć tylko dzięki starannemu i ciągłemu szkoleniu personelu technicznego22. Ponadto, w ramach kontroli jakości, wszystkie laboratoria pracujące z DBS powinny już zainicjować procedury identyfikacji, a następnie wykluczenia próbek DBS, które należy uznać za niezadowalające lub nieważne16.
Badania przeprowadzone głównie w kontekście HIV32 i badań przesiewowych noworodków33 wykazały, że wysoka wilgotność może prowadzić do degradacji analitów, ale do tej pory nie osiągnięto konsensusu co do tego, jak długo DBS powinien być suszony na powietrzu. W niniejszym komunikacie zaproponowano odstęp co najmniej 4 godzin lub najlepiej O/N, w związku z czym przyjęto warunki, które zastosowano w zdecydowanej większości wszystkich odnośnych publikacji32, 34 Dane dotyczące przechowywania DBS, które mają być następnie wykorzystywane do badań na obecność wirusa HBV i HCV, są sprzeczne. W 1981 roku Villa iwspółpracownicy, którzy zastosowali współczesne techniki analityczne, stwierdzili, że przechowywanie w RT nie wpłynęło na wyniki analiz HBV przez cały okres obserwacji wynoszący 180 dni, jeśli miano przeciwciał wynosiło > 1/1000, ale że DBS stał się graniczny dodatni lub nawet ujemny po 15 dniach, gdy miano w surowicy wynosiło tylko 1/100. Przechowywanie w temperaturze -20 °C lub 4 °C nie przyniosło znaczącej poprawy. Natomiast w badaniu przeprowadzonym trzydzieści lat później36 testowano powtórzenia próbki dodatniej pod względem HBV, a autorzy odkryli, że przeciwciała anty-HBc, jak również przeciwciała anty-HBs były stabilne do 183 dni w RT, podczas gdy HBsAg w tych samych warunkach stawały się fałszywie ujemne już po 63 dniach. Jeśli chodzi o wykrywanie DNA HBV z eluatów DBS, stężenie wirusowego kwasu nukleinowego było stabilne przez co najmniej siedem dni w temperaturze 37 °C37 lub okazało się "odporne" na przechowywanie w temperaturze pokojowej przez okres do trzech tygodni38. Testy na obecność przeciwciał anty-HCV przy użyciu dwóch dostępnych na rynku testów immunologicznych trzeciej generacji39 dostarczyły dokładnych wyników przez okres 117 dni przy użyciu próbek DBS przechowywanych odpowiednio w temperaturze -20 °C, 2 – 8 °C i 20 – 25 °C. Przechowywanie w temperaturze -20 °C skutkowało jednak najmniejszą zmiennością gęstości optycznej. Stosując test ELISA anty-HCV czwartej generacji, tj. Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, w kontekście testów DBS, Larrat i wsp.40 zaobserwowało gwałtowny spadek swoistości analitycznej po przechowywaniu próbek DBS przez ponad trzy dni w RT. Z drugiej strony, precyzyjne wyniki testów uzyskano za pomocą tego samego zestawu, wykorzystując próbki zdeponowane przez 60 dni w różnych warunkach (-20 °C, 2 – 8 °C i 22 – 26 °C) przez Brandao i współpracowników41. Obserwacje dotyczące spadku stężeń RNA HCV w DBS w różnych warunkach przechowywania wahają się od braku znaczących zmian w RT przez okres do jednego roku42 do dziesięciokrotnej zmiany po czterech tygodniach w temperaturze otoczenia43. Biorąc pod uwagę te dość sprzeczne dane dotyczące stabilności antygenów HBV i HCV, kwasów nukleinowych i przeciwciał, rozsądne wydawało się wycofanie się w proponowanym protokole do konsensusu, który został wcześniej określony w odniesieniu do przechowywania próbek DBS, które mają być wykorzystywane do testów na obecność wirusa HIV15, 30: Dla krótkotrwałego odkładania (do dwóch tygodni) antygenów, wirusowy kwas nukleinowy i przeciwciała są uważane za stabilne w RT, podczas gdy optymalne przechowywanie przez dłuższy czas odbywa się w warunkach zamrożenia.
Z reguły przy projektowaniu protokołu elucji należy wziąć pod uwagę trzy parametry: (1) bufor elucyjny; (2) czas trwania i temperaturę elucji; oraz (3) objętość elucji23. W zdecydowanej większości wszystkich istotnych publikacji do elucji DBS stosowano sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a większość autorów dodawała białko, np. albuminę surowicy bydlęcej (BSA) lub Tween 20, środek powierzchniowo czynny, w celu poprawy sygnału testu poprzez stabilizację białek w miarę ich przechodzenia do roztworu i jednoczesne blokowanie niespecyficznych miejsc wiązania23. Dostępnych jest tylko kilka raportów, które bezpośrednio porównują różne elucyjne w kontekście badań DBS. Villar i wsp.36, na przykład, zarejestrowało prawie równoważne zdolności elucyjne dla wszystkich zastosowanych, ale PBS/BSA 0,5% skutkowało najniższym poziomem reaktywności nieswoistej. Bardzo podobne spostrzeżenie zostało poczynione przez Crooma i współpracowników44 podczas stosowania rozcieńczalnika próbki rLAV EIA do elucji przeciwciał anty-HCV z DBS. Ponieważ ryzyko degradacji próbki jest niezwykle niskie w pierwszych godzinach po przygotowaniu DBS (patrz wyżej), zdecydowano się na inkubację plam O/N w temperaturze otoczenia i wspomaganie procesu elucji poprzez delikatne mieszanie od końca do końca. Takie podejście ma tę zaletę, że próbki wybite poprzedniego dnia mogą być bezpośrednio przekazane do rutynowej diagnostyki wcześnie następnego dnia rano. Objętość buforu elucyjnego powinna być dostosowana do minimalnych odpowiednich wymagań dotyczących testów stosowanych do kolejnych analiz w celu utrzymania współczynnika rozcieńczenia na możliwie najniższym poziomie. Jednak staranna optymalizacja warunków elucji dla każdego pojedynczego analitu nie była możliwa w poprzedniej ocenie, ponieważ podczas "badania DRUCK" trzeba było zagwarantować wysoką przepustowość próbki w stosunkowo krótkim czasie17. W związku z tym wykorzystano raczej niekorzystną objętość 1000 μl buforu na bazie PBS w celu zakończenia całego procesu elucji dla wszystkich parametrów w dwóch oddzielnych operacjach.
Podejście to, z jednej strony, zawodzi "całkowicie w systemie anty-HBc/anty-HBs u osób zakażonych wirusem HIV z powodu niskich stężeń przeciwciał; ... i wymagało to procedur biologii molekularnej z optymalną czułością analityczną w odniesieniu do testów DNA HBV i RNA HCV."17 Z drugiej strony, wysoka objętość elucji nie okazała się w żaden sposób niekorzystna dla oznaczania HBsAg, anty-HCV i anty-HIV przez zestawy używane podczas całej oceny. "Wykrycie materiałów HBsAg dodatnich w euatach krwi pełnej powiodło się z czułością 98,6% w podobnie wysokim stopniu, jak w poprzednich badaniach, w których częściowo wykorzystano znacznie mniejszą objętość elucji wynoszącą 100 μl, 250 μl lub 600 μl lub 500 μl"17, 36, 45, 46. Czułość 97,8% określona w badaniu 179 par surowica/DBS dla przeciwciał anty-HCV odpowiadała wynikom już istniejących doniesień24, 44, 47, 48, 49, które pracowały z objętością elucji mniejszą od 5 do 10 razy. "Ponadto protokoły wykrywania anty-HCV zostały odpowiednio zoptymalizowane ... poprzez określenie własnych punktów odcięcia"17, 24, 48, 49 "lub poprzez zwiększenie objętości próbki z 20 μl do 100 μl."17, 49 Wreszcie, swoistość analityczna i czułość (po 100% każdy) ustalone dla wykrywania anty-HIV były równe lub lepsze od charakterystyki działania innych testów immunologicznych specjalnie przystosowane do testowania DBS50, 51 "lub procedury etapowej z łącznym zastosowaniem kilku testów anty-HIV"17, 52. "Rzeczywiście, przekroczyły one również rekord wydajności testu, który został specjalnie opracowany i zoptymalizowany do wykrywania przeciwciał anty-HIV w eluatach DBS (zestaw Q-Prevent HIV 1 + 2 DBS)".
Podsumowując, kompleksowy protokół krok po kroku przedstawiony w niniejszym komunikacie okazał się wykonalnym i przyjaznym dla użytkownika narzędziem do przygotowywania i przetwarzania DBS, a tym samym może być niezawodnie stosowany w diagnostyce wirusologicznej. Pozwala on na stosowanie podejść wykorzystujących automatyzację 54 , a ze względu na swoje doskonałe właściwości użytkowe ma potencjał, aby służyć jako rodzaj kamienia węgielnego dla przyszłego, ogólnie akceptowanego protokołu konsensusu w globalnej dziedzinie testowania DBS w medycynie laboratoryjnej.

Pomysł wykorzystania krwi zebranej na papierowej karcie wykonanej z celulozy przypisuje się Ivarowi Christianowi Bangowi (1869 - 1918), ojcu nowoczesnej mikroanalizy klinicznej1, 2. W 1913 roku Bang oznaczył glukozę z eluatów wysuszonych plam krwi (DBS)3, a później przeprowadził również pomiary azotu metodą Kjeldahla z tą techniką bibuły filtracyjnej2. Następnie kilku badaczy poinformowało o zastosowaniu DBS do testów serologicznych w celu zdiagnozowania kiły2. Już w 1924 roku Chapman podsumował zalety badania DBS, zwracając szczególną uwagę na cztery elementy, które są nadal aktualne: (1) w porównaniu z konwencjonalnym nakłuciem żyły wymagana jest mniejsza objętość krwi i fakt ten był najważniejszy w diagnostyce dziecięcej; (2) pobieranie krwi jest proste, nieinwazyjne i niedrogie; (3) ryzyko skażenia bakteryjnego lub hemolizy jest minimalne; oraz (4) DBS może być przechowywany przez długi czas prawie bez pogorszenia jakości analitów2, 4. Oprócz zastosowania w testach na kiłę, dalsze wczesne zastosowania techniki DBS obejmowały, np. wykrycie przeciwciał przeciwko odrze, śwince, wirusowi polio, wirusowi paragrypy i syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV) w 1953 r.2, identyfikację Shigella w kale wysuszonym na bibule filtracyjnej i wysłanym zwykłą pocztą z Indonezji do Lejdy w Holandii, a także wykrycie przeciwciał przeciwko Schistosoma w DBS pobranych na obszarach endemicznych i przeanalizowanych ponad Trzy miesiące później5. W 1963 roku, pięćdziesiąt lat po pierwotnym komunikacie Banga, Guthrie w końcu opublikował swoją słynną metodę diagnozowania fenyloketonurii na podstawie DBS uzyskanej przez nakłucie pięty u noworodków7, 8.
Chociaż od tego czasu DBS były uważane za powszechnie stosowaną metodę zbierania, przechowywania, transportu i analizowania różnych płynów ustrojowych5, ich użycie w diagnostyce nadal koncentrowało się głównie na diagnozowaniu infekcji, zwłaszcza w warunkach ograniczonych zasobów i systematycznym badaniu noworodków pod kątem dziedzicznych zaburzeń metabolicznych przez dziesięciolecia9, Rozdział 10. Jednak od 2005 roku zaczęło pojawiać się wiele nowych i innowacyjnych aplikacji DBS. Spowodowało to niemal wykładniczy wzrost liczby publikacji naukowych na temat DBS z około 50 do prawie 450 rocznie obecnie. Wśród pojawiających się zastosowań znajdują się tak różnorodne dziedziny, jak badania toksyko- i farmakokinetyczne, profilowanie metaboliczne, monitorowanie leków terapeutycznych, toksykologia sądowa czy kontrola skażenia środowiska10, 11.
Testy DBS w ciągu ostatnich 100 lat triumfalnie przeszły przez kliniczną diagnostykę laboratoryjną2. Jednak, podobnie jak w przypadku chemii klinicznej12, podczas tego marszu zmienne przedanalityczne nie były odpowiednio uwzględniane przez wiele lat. Rzeczywiście, nawet dzisiaj, po tak wybitnych działaniach, jak projekt oceny bibuły filtracyjnej CDC13 lub sformułowanie krajowego standardu pobierania krwi na bibule filtracyjnej w ramach badań przesiewowych noworodków14, faza przedanalityczna jest nadal w dużej mierze niedoceniana w większości innych dziedzin, w których stosuje się testy DBS5, Rozdział 10.
Biorąc pod uwagę to tło, proponowany jest kompleksowy protokółkrok po kroku 14 - 16 do stosowania w testach immunologicznych i technikach molekularnych, który obejmuje wszystkie niezbędne kroki, do przygotowania i przetwarzania DBS w następującej komunikacji: (1) pobieranie krwi; (2) przygotowanie plam krwi; (3) wysuszanie plam krwi; 4) przechowywanie i transport; 5) wymywanie DBS; i wreszcie (6) analizy eluatów DBS. Skuteczność protokołu została po raz pierwszy oceniona za pomocą 1 762 sprzężonych par surowica/DBS do wykrywania antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) (HBsAg), przeciwciał przeciwko antygenowi rdzeniowemu HBV (anty-HBc), przeciwciał przeciwko antygenowi powierzchniowemu HBV (anty-HBs), DNA HBV, przeciwciał przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV) (anty-HCV), HCV RNA i ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) 1-p24-antygen/anty-HIV 1/2 przy użyciu w pełni zautomatyzowanej platformy lub czułych jakościowych testów kwasów nukleinowych. 17. W drugim etapie protokół został wykorzystany w badaniu pilotażowym "Leki i przewlekłe choroby zakaźne" (zwanym dalej "badaniem DRUCK"), które zostało przeprowadzone przez Instytut Roberta Kocha w ścisłej współpracy z Krajowym Ośrodkiem Referencyjnym ds. Wirusowego Zapalenia Wątroby typu C na aktywnych użytkownikach narkotyków w niemieckich miastach Berlinie i Essen18.

<table><tbody><tr><td>Rękawice lateksowe gumowe</td><td>Hartmann</td><td>#4049500041515</td><td></td></tr><tr><td>70% alkohol izopropylowy</td><td>Bode Chemie</td><td>#9768050</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula bezpieczeństwa Mulifly</td><td>Sarstedt</td><td>#85.1638</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do pobierania krwi EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>#02.1066.001</td><td></td></tr><tr><td>Bandaż samoprzylepny</td><td>Hartmann</td><td>#2994163</td><td></td></tr><tr><td>Sucha gaza</td><td>Hartmann</td><td>#143213</td><td></td></tr><tr><td>Bezpieczny lancet do użytku w Singelu</td><td>Owen Mumford</td><td>#3802421</td><td></td></tr><tr><td>Karta z bibuły filtracyjnej</td><td>Whatman/sigmaaldrich</td><td>#10534612</td><td>Karta z bibuły filtracyjnej klasa 903</td></tr><tr><td>Jednorazowe końcówki do pipet</td><td>Starlab</td><td>#S1126-7810, #S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>Torba na zamek błyskawiczny</td><td>Flexico</td><td>#20219</td><td></td></tr><tr><td>Mini torba ze środkiem osuszającym</td><td>Tropack</td><td>#-</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy dziurkacz</td><td>pfmmedical</td><td>#48601</td><td>6,0 mm Jednorazowy dziurkacz do biopsji</td></tr><tr><td>Jednorazowe kleszcze</td><td>Servoprax</td><td>#H7301</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Greiner</td><td>#665180</td><td></td></tr><tr><td>Bufor PBS</td><td>Gibco</td><td>#14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Applichem</td><td>#A1389.0500</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Merck</td><td>#66880250</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Safe-Lock, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>#30120086</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT HBsAg (ilościowe)</td><td>Abbott</td><td>#6C3642</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT anty-HBc II</td><td>Abbott</td><td>#8L4425</td> ARCHITECT anty-HBs Abbott#7C1825 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT anty-HCV</td><td>Abbott</td><td>#6C3725</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo</td><td>Abbott</td><td>#4J2727</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit</td><td>Roche</td><td>#6374891001</td><td></td></tr><tr><td>artus HBV LC PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>#4506063 (24 testy), #4506065 (96 testów)</td><td></td></tr><tr><td>Test VERSANT HCV TMA IVD</td><td>Siemens Healthcare</td><td>#2554311</td><td></td></tr></tbody></table>

suszone plamy krwi - przygotowanie i przetwarzanie do stosowania w testach immunologicznych i technikach molekularnych

Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

Pomysł zbierania krwi na papierowej kartce, a następnie używania wysuszonych plam krwi (DBS) do celów diagnostycznych powstał sto lat temu. Od tego czasu testy DBS przez dziesięciolecia koncentrowały się głównie na diagnozowaniu chorób zakaźnych, zwłaszcza w warunkach ograniczonych zasobów, lub na systematycznych badaniach przesiewowych noworodków pod kątem dziedzicznych zaburzeń metabolicznych, a dopiero niedawno zaczęło pojawiać się wiele nowych i innowacyjnych zastosowań DBS. Przez wiele lat zmienne przedanalityczne były brane pod uwagę w dziedzinie badań DBS tylko w niewłaściwy sposób i nawet dzisiaj, z wyjątkiem badań przesiewowych noworodków, cała faza przedanalityczna, która obejmuje przygotowanie i przetwarzanie DBS do ich końcowej analizy, nie została ustandaryzowana. W tym kontekście proponuje się kompleksowy protokół krok po kroku, który obejmuje wszystkie podstawowe fazy, tj. pobieranie krwi; przygotowanie plam krwi; suszenie plam krwi; magazynowanie i transport DBS; elucja DBS, a na końcu analizy eluatów DBS. Skuteczność tego protokołu została po raz pierwszy oceniona za pomocą 1 762 sprzężonych par surowica/DBS do wykrywania markerów zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu B, wirusem zapalenia wątroby typu C i ludzkim wirusem niedoboru odporności na zautomatyzowanej platformie analitycznej. W drugim etapie protokół został wykorzystany podczas badania pilotażowego, które zostało przeprowadzone na aktywnych użytkownikach narkotyków w niemieckich miastach Berlinie i Essen.

Skuteczność protokołu zaproponowanego do przygotowania i przetwarzania DBS oceniono w pierwszej kolejności poprzez analizę 1 762 par sprzęganych surowica/DBS pod kątem markerów zakażenia HBV, HCV i HIV17. W tym celu DBS przygotowano ze 100 µl pełnej krwi żylnej (por. pkt 2.1.1 – 2.1.6 poprzedniego protokołu) i eluowano każdy z nich przy użyciu 1 000 µl buforu na bazie PBS (por. pkt 5.1 – 5.5 wspomnianego protokołu), aby zrealizować proces dla wszystkich siedmiu parametrów w dwóch oddzielnych operacjach. Takie podejście, bez dokładnej optymalizacji warunków elucji dla każdego anality z osobna, wydawało się nieuniknione, ponieważ podczas nadchodzącego badania terenowego „Leki i Przewlekłe Choroby Zakaźne” („Badanie DRUCK”) spodziewano się stosunkowo wysokiej przepustowości próbek w krótkim czasie.
Wszystkie pomiary podczas analiz DBS były wykonywane zgodnie z zaleceniami producenta, jednak w przypadku oznaczeń HBsAg i anty-HBs musiały zostać zmodyfikowane, aby skompensować efekt hemolizy lub wynik rozcieńczenia. Przy wartości odcięcia 0,05 IU/ml badanie HBsAg w eluatach DBS doprowadziło do odsetka wyników fałszywie dodatnich na poziomie 14,7% (52 z 354) w porównaniu z próbkami surowicy (Rysunek 2A). Analiza charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC)25, 26 danych wskazała, że podniesienie progu do 0,15 IU/ml pozwoliłoby na idealne oddzielenie wyników HBsAg-dodatnich od HBsAg-ujemnych (0,986 [czułość], 0,000 [1- specyficzność], Rysunek 2B). Z drugiej strony, przy wartości odcięcia 10 IU/l dla ilościowego oznaczenia przeciwciał anty-HBs odnotowano odsetek pomiarów fałszywie ujemnych wynoszący 14,2% (47 z 331) (Rysunek 2C). W związku z tym, po ponownej analizie ROC, wartość odcięcia tę obniżono do 1,5 IU/l, aby osiągnąć optymalną dyskryminację wartości (0,917 [czułość], 0,007 [1- specyficzność], Rysunek 2D).
<img alt="Wykresy rozkładu HBsAg i anty-HBs; wyniki serologii; analiza punktu odcięcia; IU/ml; częstotliwość N." src="/files/ftp_upload/52619/52619fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Oznaczanie HBsAg i anty-HBs w eluatach DBS (zmodyfikowano na podstawie17). Zwiększenie wartości punktu odcięcia dla ilościowego oznaczania HBsAg na podstawie analizy ROC z 0,05 IU/ml (A) do 0,15 IU/ml (B) zredukowało odsetek wyników fałszywie dodatnich z 14,7 % do 0 %. Podobnie analiza ROC stężeń anty-HBs zasugerowała obniżenie odpowiedniego progu z 10 IU/l (C) do 1,5 IU/l (D), co całkowicie wyeliminowało wyniki fałszywie ujemne, które początkowo stanowiły 14,2 % wszystkich oznaczeń. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wyniki połączonych analiz surowicy/DBS zestawiono w Tabeli 117. W trakcie testów DBS dla każdego z siedmiu analitów nie odnotowano braku specyficzności.
Podczas badania eluatów z DBS pod kątem obecności HBsAg, czyli kluczowego parametru serologicznego zarówno dla ostrej, jak i chronicznej infekcji HBV, stwierdzono czułość analityczną na poziomie 98,6 %. Stężenia HBsAg w dwóch surowicach fałszywie ujemnych wynosiły odpowiednio 749 IU/ml i 6 IU/ml. Przeciwciała anty-HBc zostały pomyślnie wykryte w 176 z 204 (tj. 86,3 %) eluatów DBS. Dwudziestu dwóch z 28 próbek, w których nie wykryto przeciwciał, pochodziło od osób współzakażonych HIV. Zatem po wykluczeniu z obliczeń osób HIV-dodatnich osiągnięto czułość 97,1 % w odzyskiwaniu przeciwciał anty-HBc z eluatów wysuszonej pełnej krwi żylnej. Podobne obserwacje odnotowano przy oznaczaniu przeciwciał anty-HBs. Nawet po skorygowaniu wartości odcięcia w teście do 1,5 IU/l wystąpiło dziewięć rozbieżnych wyników między surowicą a DBS. U pacjentów bez współzakażenia HIV stwierdzono stężenia anty-HBs w surowicy na poziomie 11 – 26 IU/l, co było wartością zbyt niską, aby umożliwić detekcję po elucji z wysuszonej krwi.
Przeciwciała anty-HCV świadczą o infekcji ostrej, przewlekłej lub wyleczonej. Tylko cztery (tj. 2,2 %) wyniki anty-HCV fałszywie ujemne uzyskano z eluatów DBS, a dalsze analizy serologiczne i molekularne wyraźnie wykazały, że odpowiednie surowice prawdopodobnie pobrano od pacjentów, których infekcje zostały wyleczone znacznie wcześniej.
Wykrywanie przeciwciał przeciwko HIV w eluatach DBS za pomocą w pełni zautomatyzowanego systemu było procesem całkowicie sprawnym, który pozwolił na uzyskanie czułości analitycznej na poziomie 100 %.
„Średnie stężenie HBV DNA w eluatach z krwi pełnej określono w 100 próbkach (średnie stężenie DNA: 1 573 898 IU/ml, zakres: &lt; 357 - &gt; 17 860 000 IU/ml), co dało wartość 93,0 %. W konsekwencji siedem próbek z niskim stężeniem HBV DNA w surowicy, mieszczącym się w przedziale od 409 do 3 643 IU/ml, nie zostało wykrytych podczas badania DBS. W przypadku 100 próbek surowicy, które okazały się dodatnie pod kątem HCV RNA (średnie stężenie HCV RNA: 1 415 944 IU/ml, zakres: 2 479 - &gt;7 692 000 IU/ml), dostępne były odpowiadające im alikwoty krwi pełnej. Badanie porównawcze wykazało analityczną czułość na poziomie 100 % dla oznaczeń HCV RNA z eluatów DBS”.17
Aby przetestować opisany protokół przygotowywania i przetwarzania DBS w warunkach terenowych, zastosowano go w ścisłej współpracy z Instytutem Roberta Kocha (Berlin, Niemcy) podczas fazy pilotażowej badania „Drugs and Chronic Infectious Diseases”, przeprowadzonego wśród aktywnych użytkowników narkotyków w niemieckich miastach Berlin i Essen18. Wszyscy 534 zakwalifikowani uczestnicy (433 mężczyzn i 101 kobiet) zostali poddani pobraniu krwi kapilarnej zgodnie ze szczegółowym opisem w sekcjach 2.2.1 – 2.2.3 poprzedniego protokołu, a DBS ponownie eluowano poprzez dodanie 1 000 µl buforu na bazie PBS.
U dwóch osób zdiagnozowano przewlekłą infekcję HBV, a u 39 stwierdzono serologiczny obraz wyleczonej infekcji HBV. Ponadto piętnastu uczestników było seropozytywnych pod kątem przeciwciał anty-HBs (status po szczepieniu), a u ośmiu osób stwierdzono obecność wyłącznie przeciwciał anty-HBc. Częstość występowania przeciwciał anty-HCV wśród uczestników wynosiła 57,3 % (N = 193) w Berlinie i 73,0 % (N = 144) w Essen. Z próbek dodatnich pod kątem przeciwciał, 65 % (N = 125) i 62 % (N = 89) wykazywało również wiremię. Dwadzieścia pięć z 534 badanych osób uzyskało wynik dodatni w testach na obecność anty-HIV. Dziewiętnaście z tych infekcji było wcześniej znanych, a 24 z tych osób miało koinfekcję z HCV.
Wyniki uzyskane w badaniu DBS starannie porównano z danymi anamnezy uczestników badania dotyczącymi samoopisanego statusu HBV i HCV. Porównanie to, w połączeniu z wynikami testowania powiązanych par surowica/DBS, doprowadziło do niewielkich modyfikacji algorytmu testowania dla głównej fazy „Badania DRUCK”, w którym udział wezmą aktywni użytkownicy narkotyków w sześciu dodatkowych dużych niemieckich miastach: „Osoby zakażone HIV zawsze będą badane pod kątem obecności HBV DNA. Uczestnicy, których eluaty DBS są dodatnie pod kątem przeciwciał anty-HBc lub anty-HBs, powinni zostać poddani wenipunkcji podczas drugiej konsultacji w celu ostatecznego wyjaśnienia ich statusu anty-HBc/anty-HBs, a na koniec wszystkie eluaty DBS zostaną przebadane w kierunku HCV RNA, niezależnie od wyników testów na anty-HCV”.17
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametry</td>
			<td>Sprzężone eluaty z surowic/DBS (N)</td>
			<td>Rozbieżne wyniki (N)</td>
			<td>Przyczyny rozbieżności między surowicą testową a eluatami z DBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBsAg</td>
			<td>299</td>
			<td>2</td>
			<td>Dwoje pacjentów z przewlekłym zakażeniem HBV. Oboje znajdowali się w trakcie leczenia przeciwwirusowego, a jeden z nich był współzakażony HIV. Stężenia HBsAg w surowicy wynosiły odpowiednio: 749 IU/ml i 6 IU/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>przeciwciała anty-HBc</td>
			<td>305</td>
			<td>28</td>
			<td>W surowicy u dwudziestu dwóch pacjentów stwierdzono ustąpienie zakażenia HBV. U sześciu osób odnotowano wynik serologiczny „wyłącznie przeciwciała anty-HBc”. Dwudziestu dwóch pacjentów miało koinfekcję HIV. W grupie osób z ustąpieniem zakażenia HBV u dwudziestu oceniono wynik testu DBS jako „wyłącznie dodatni wynik anty-HBs”, przez co błędnie zaklasyfikowano ich do grupy „stanu po szczepieniu”.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>przeciwciała anty-HBs</td>
			<td>310</td>
			<td>9</td>
			<td>U czterech pacjentów bez koinfekcji HIV stężenia przeciwciał anty-HBs w surowicy wynosiły 11–26 IU/l, co było wartością zbyt niską, aby umożliwić wykrycie przeciwciał po elucji z suchych kropli krwi.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBV DNA</td>
			<td>150</td>
			<td>7</td>
			<td>Odpowiednie surowice pobrano od siedmiu pacjentów z niskimi stężeniami HBV DNA w surowicy, wynoszącymi od 409 IU/ml do 3 643 IU/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wirus zapalenia wątroby C (HCV)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>przeciwciała przeciwko HCV</td>
			<td>339</td>
			<td>4</td>
			<td>Te cztery próbki surowicy pobrano od pacjentów z HCV, u których infekcja została wyleczona już dawno temu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA HCV</td>
			<td>150</td>
			<td>0</td>
			<td> –</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV 1-p24/anty-HIV 1/2</td>
			<td>209</td>
			<td>0</td>
			<td> –</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wyniki uzyskane z 1 762 DBS, które przygotowano i przetworzono z krwi żylnej zgodnie z protokołem zaproponowanym w niniejszej publikacji, w porównaniu z wynikami w powiązanych próbkach surowicy jako referencji.

Przygotowanie i przetwarzanie wysuszonych plam krwi (DBS) do ich końcowej analizy jest nadal słabo ustandaryzowane dla większości zastosowań diagnostycznych. Aby przezwyciężyć to niedociągnięcie, sugeruje się kompleksowy protokół krok po kroku, a następnie ocenia się go pod kątem jego skuteczności w wykrywaniu markerów infekcji wirusowych.

Suszone plamy krwi - przygotowanie i przetwarzanie do stosowania w testach immunologicznych i technikach molekularnych

The idea of collecting blood on a paper card and subsequently using the dried blood spots (DBS) for diagnostic purposes originated a century ago. Since ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie zestandaryzowanego protokołu przygotowania i przetwarzania wysuszonych plam krwi (dried blood spots), które zostaną następnie wykorzystane w testach immunoenzymatycznych oraz technikach molekularnych. Proces ten polega najpierw na pobraniu krwi kapilarnej i naniesieniu jej na kartę filtracyjną. Drugim krokiem jest suszenie plam krwi przez noc, a następnie wycięcie wycinków o średnicy sześciu milimetrów z okręgów karty filtracyjnej.Następnie przeprowadza się elucję wysuszonej krwi z wyciętych fragmentów poprzez zanurzenie w buforze na wytrząsarce przez minimum cztery godziny. Następnie hemolityczne EIT są oczyszczane z zanieczyszczeń poprzez wirowanie. Ostatnim krokiem jest analiza oczyszczonych EIT pod kątem serologicznych i molekularnych markerów zakażeń wirusami zapalenia wątroby typu B, zapalenia wątroby typu C oraz wirusem niedoboru odporności u ludzi przy użyciu dostępnych komercyjnie testów immunoologicznych i technik molekularnych.Koncepcja wykorzystania plamek krwi zebranych na kartoniku filtracyjnym wykonanym z celulozy powstała wiek temu. Niemniej jednak osoby po raz pierwszy stosujące tę metodę często napotykają trudności nawet dzisiaj, ponieważ cała faza przedanalityczna, obejmująca przygotowanie i przetwarzanie wysuszonych plamek krwi przed ich końcową analizą, nie została ustandaryzowana dla niemal wszystkich zastosowań testów z wysuszonej krwi. W związku z tym proponujemy kompleksowy, ustandaryzowany protokół krok po kroku dotyczący przygotowania i przetwarzania wysuszonych plamek krwi do późniejszego wykorzystania w testach immunologicznych i technikach molekularnych.Wizualna demonstracja tej metodologii wydaje się kluczowa, ponieważ etapy takie jak pobieranie krwi kapilarnej, przenoszenie jej na karty filtracyjne czy przygotowanie odpowiednich wycinków z kart nie są łatwe do opanowania; w konsekwencji osoby stosujące tę technikę po raz pierwszy z pewnością skorzystają z reprezentacji wizualnej.Krew kapilarna zostanie pobrana z palca Nico przez technika z naszego laboratorium, który zaprezentuje procedurę przetwarzania. Uzyskane plamki krwi zostaną opracowane przez technika ko, który od wielu lat pracuje w naszym laboratorium diagnostyki biologii molekularnej. W celu wykonania nakłucia skóry najpierw załóż parę jednorazowych rękawiczek lateksowych.Przed nakłuciem skóry pacjent powinien ogrzać dłonie. Palec należy intensywnie masować, aby zwiększyć przepływ krwi w kierunku miejsca nakłucia. Następnie należy oczyścić skórę od strony dłoniowej na koniuszku paliczka dalszego trzeciego lub czwartego palca ręki niedominującej za pomocą odpowiedniego środka odkażającego, a następnie nakłuć skórę jednorazowym lancetem bezpieczeństwa.Palce należy trzymać w takiej pozycji, aby grawitacja ułatwiała spływanie krwi na opuszkę palca. Pierwszą kroplę krwi należy wytrzeć gazikiem, ponieważ może ona zawierać nadmiar płynów tkankowych. Po ponownym masowaniu palca w celu zwiększenia przepływu krwi w miejscu nakłucia, kolejną kroplę należy przenieść do jednego z kółek na karcie filtracyjnej, nie dotykając bezpośrednio jej powierzchni opuszką palca.Pozostaw kolejną dużą kroplę krwi kapilarnej na opuszku palca i zbierz ją w następnym okręgu. Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie niezbędne okręgi zostaną wypełnione lub do momentu ustania krwawienia podczas pobierania. Pozwól, aby krew wniknęła w strukturę filtra wyłącznie dzięki siłom kapilarnym.Nie należy nadmiernie uciskać ani wyżymać palca, jeśli przepływ krwi jest niewystarczający do wypełnienia wszystkich wymaganych okręgów na karcie filtracyjnej. W przypadku zatrzymania przepływu krwi należy założyć opatrunek na opuszkę palca i, jeśli do badania potrzeba więcej krwi, wykonać drugie nakłucie skóry innego palca. Aby wysuszyć plamy krwi, należy umieścić karty filtracyjne na czystym ręczniku papierowym w komorze bezpieczeństwa biologicznego i pozostawić je do wyschnięcia, najlepiej przez noc w temperaturze pokojowej. W przypadku braku zewnętrznego źródła ciepła, po zakończeniu procesu suszenia plamy krwi mają jednolity, ciemnobrązowy kolor, a czerwone obszary nie są już widoczne; takie próbki są gotowe do przechowywania.Umieść kartonowy papier filtracyjny w pojedynczej, nieprzepuszczalnej dla gazów torbie strunowej zawierającej jeden lub dwa saszetki z osuszaczem, aby chronić próbki przed wilgocią. Jak najszybciej przenieś torbę do zamrażarki o temperaturze -20 °C lub niższej. Jeśli w warunkach terenowych zamrażarki nie są dostępne, dopuszczalne jest przechowywanie w temperaturze -4 °C lub nawet w temperaturze otoczenia przez okres do 14 dni.Za pomocą jednorazowego wycinaka o średnicy 6 mm wyciąć jedną próbkę z każdego nasączonego krwią kręgu na karcie filtracyjnej grade 9 0 3; wszystkie wycięte suche plamy krwi od jednego pacjenta przenieść do jednego dołka płytki 12-dołkowej i wypełnić dołek solą fizjologiczną z buforem fosforanowym zawierającą 0,05% tween 20 i 0,08% azotku sodu. Powtórzyć te kroki, aby uzyskać drugą serię EIT z suchych plam krwi w celu przeprowadzenia analiz molekularnych.Następnie należy umieścić płytkę hodowlaną na wytrząsarce laboratoryjnej i pozostawić wycięcia z wysuszonych plam krwi do łagodnej elucji przez minimum cztery godziny, a najlepiej przez noc. Następnego dnia plamy są niemal całkowicie oczyszczone z krwi i uformowały się nadyzytany hemolityczne. Przenieś te EIT do probówek do mikrocentryfugi, a następnie poddaj je wirowaniu przez dwie minuty przy 10 500 ×g w celu uwolnienia.Nadolista z wszelkich osadów, które powstały podczas wirowania EIT w wirówce Ellucian, jest teraz gotowa do planowanych analiz. Pierwsza seria EIT zostaje przeniesiona do naczyń do testów serologicznych. Druga seria zostaje przeniesiona do probówek mikroskopowych do analizy PCR.Przeprowadzić badania EIT w kierunku markerów wirusa zapalenia wątroby typu B, wirusa zapalenia wątroby typu C oraz zakażenia HIV, wykorzystując dostępne komercyjnie testy i ściśle przestrzegając instrukcji producenta. Ostatecznie wyniki badań serologicznych wykonanych na w pełni zautomatyzowanym analizatorze są wyświetlane na ekranie systemu. Skuteczność protokołu sugerowanego do przygotowania i przetwarzania suchych kropli krwi oceniono początkowo poprzez analizę 1 762 sparowanych zestawów suchych kropli krwi i surowicy pod kątem oznaczenia antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B.Protokół analizy został zmodyfikowany, ponieważ przy wartości odcięcia wynoszącej 0,05 jednostek międzynarodowych na mililitr, 56,2% EIT okazało się reaktywnych w porównaniu z wynikami otrzymanymi od Sarah. Odpowiadało to wskaźnikowi wyników fałszywie dodatnich na poziomie 14,7% w badaniu antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby B. Analiza charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) danych wykazała, że podniesienie progu do 0,15 jednostek międzynarodowych na mililitr pozwoliłoby na idealne oddzielenie próbek dodatnich od ujemnych pod kątem antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby B; podczas badania par surowica i wysuszona plamka krwi pod kątem obecności antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby B uzyskano tylko dwa wyniki rozbieżne.Dwa fałszywie ujemne wyniki w przypadku Sarah pochodziły od pacjentów leczonych przeciw wirusowo. Jakościowe oznaczenie H-B-V-D-N-A metodą real-time PCR z EIT z krwi pełnej wykazało czułość na poziomie 93%. W związku z tym nie wykryto siedmiu próbek z niskimi stężeniami H-B-V-D-N-A w surowicy. Tylko cztery fałszywie ujemne wyniki przeciwciał anty-HCV określono na podstawie EIT z wysuszonych plamek krwi.Odpowiednie próbki kontrolne prawdopodobnie pobrano od pacjentów, u których infekcje dawno ustąpiły. Czułość analityczna wynosząca 100% dla oznaczeń H-C-V-R-N-A z EIT z wysuszonych kropli krwi wskazała na doskonałą czułość metody izotermicznej amplifikacji wspomaganej transkrypcją, która została wykorzystana do amplifikacji H-C-V-R-N-A. Wykrywanie przeciwciał przeciwko HIV w EIT z wysuszonych kropli krwi przy użyciu w pełni zautomatyzowanego systemu również pozwoliło uzyskać czułość analityczną na poziomie 100%. Niniejszy materiał wideo pokazuje, że obecnie możliwe jest niezawodne wykrywanie markerów serologicznych i molekularnych zakażeń wirusowym zapaleniem wątroby B, C oraz HIV w próbkach z wysuszonych kropli krwi, nawet przy zastosowaniu stosunkowo dużej objętości elucji i bez wprowadzania znaczących zmian w protokołach badań opracowanych dla surowicy lub osocza.Jednak przekazane wyniki potwierdziły również immanentne ograniczenia techniki suchych plam krwi. W niektórych przypadkach protokół ten został przetestowany w warunkach terenowych u 534 aktywnych użytkowników narkotyków w niemieckich miastach Berlin i Essen podczas fazy pilotażowej badania dotyczącego narkotyków i przewlekłych chorób zakaźnych.Uzyskane wyniki doprowadziły do niewielkiej modyfikacji algorytmu testowego dla głównej fazy badania nad lekiem w sześciu dodatkowych dużych miastach niemieckich.

dried-blood-spots-preparing-processing-for-use-immunoassays-molecular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Plamy krwi suszonej – przygotowanie i przetwarzanie do zastosowania w immunotestach i technikach molekularnych

Identyfikacja mikrobiologicznych celów odporności adaptacyjnej w chorobach idiopatycznych może zostać przeprowadzona przy użyciu testu ELISpot (enzyme-linked immunospot assay).

Test immunospot z enzymatycznym sprzężeniem (ELISPOT): Ilościowe oznaczenie komórkowych odpowiedzi immunologicznych Th-1 przeciwko antygenom mikrobiologicznym

Opisano prosty protokół przygotowania ekstraktów z ludzkich tkanek, które służą jako źródło antygenów w funkcjonalnych testach limfocytów T. Metoda ta pozwala na pomiar odpowiedzi limfocytów T na antygeny pochodzące z tkanek in vitro.

Ekstrakcja antygenów tkankowych do analiz funkcjonalnych

Opisujemy nową metodę izolacji DNA genomowego z krwi pełnej pobranej do badań osocza/serologii. Po pobraniu osocza zagęszczona krew jest zazwyczaj utylizowana. Nasza nowatorska metoda stanowi znaczną poprawę w stosunku do istniejących sposobów i umożliwia uzyskanie DNA oraz osocza z jednego pobrania, bez konieczności pobierania dodatkowej krwi.

Praktyczna i nowatorska metoda izolacji genomowego DNA z zestawów do pobierania krwi służących do konserwacji białek osocza

Biomarkery są bezpośrednio mierzonymi biologicznymi wskaźnikami choroby lub zdrowia. W naukach populacyjnych i społecznych biomarkery muszą być łatwe do uzyskania, transportu i analizy. Pobieranie suszonych plam krwi (DBS) spełnia tę potrzebę, może być zbierane w terenie z wysokimi wskaźnikami odpowiedzi i analizowane pod kątem różnych biomarkerów.

Pobieranie biomarkerów zdrowotnych z wysuszonej kropli krwi w celu maksymalizacji udziału w badaniach populacyjnych

Tutaj opisujemy test wysokiej wydajności chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-MS/MS) do ilościowego oznaczania immunosupresyjnego takrolimusu w wysuszonych plamach krwi przy użyciu prostego ręcznego etapu wytrącania białka i ekstrakcji kolumnowej online.

Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS

Opisana jest prosta, ale skuteczna metoda, która wykorzystuje magnetyczne nanocząstki do wykrywania i wzbogacania komórek B reagujących na antygen do analizy funkcjonalnej i fenotypowej.

Wykrywanie i wzbogacanie rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu w celu analizy fenotypu i funkcji

Ten protokół opisuje prostą i użyteczną metodę przechowywania krwi obwodowej i surowicy/osocza do dalszych analiz, takich jak ocena polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) i test ELISA.

Wysuszone plamy krwi i surowicy jako przydatne narzędzie do przechowywania próbek w celu oceny biomarkerów raka

Ten protokół szczegółowo opisuje klinicznie możliwe do wdrożenia przygotowanie wysokiej jakości PBMC i biopróbek osocza w ośrodku badań klinicznych, które mogą być wykorzystane do translacyjnej analizy biomarkerów.

Przygotowanie granulek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i osocza z pojedynczego pobrania krwi w ośrodkach badań klinicznych do analizy biomarkerów

Uchwycenie dynamicznych zmian w aktywacji białek wyłuszczonych czerwonych krwinek stanowi wyzwanie metodologiczne, takie jak zachowanie dynamicznych zmian w ostrych bodźcach do późniejszej oceny. Prezentowany protokół opisuje techniki przygotowania i barwienia próbek, które umożliwiają zachowanie i analizę istotnych zmian białkowych, a następnie ich wykrycie.

Immunologiczne wykrywanie dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych

Testy immunologiczne oparte na krwi pełnej dostarczają łatwego i zasobooszczędnego narzędzia do analizy odporności specyficznej dla antygenu do celów diagnostycznych i badawczych. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół oparty na krwi pełnej z podwójną kostymulacją do kompleksowej analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe, w tym wersję o małej objętości dla pacjentów pediatrycznych i małych zwierząt.

Test krwi pełnej z podwójną kostymulacją do specyficznej dla antygenu analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe

Opisujemy niedawno opracowaną platformę testów immunologicznych opartą na zasadach bezkomórkowej biologii syntetycznej i technice dot-blot do konfigurowalnego wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych.

Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych

Poznaj standaryzowany protokół przygotowania suszonych plam krwi do testów immunologicznych i technik molekularnych. Metoda umożliwia wykrywanie markerów wirusowych zakażeń HBV, HCV i HIV.

Suszone plamy krwi - przygotowanie i przetwarzanie do stosowania w testach immunologicznych i technikach molekularnych

Przeglądaj więcej filmów