Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie oczyszczonej populacji kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Najpierw ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste są hodowane w monowarstwie do momentu osiągnięcia około 85% konfluencji. Następnie dodaje się związek małocząsteczkowy aktywujący szlak sygnałowy Wnt, a komórki inkubuje się przez dwa dni, aby indukować tworzenie mezojermy.

Następnie do komórek dodaje się związek małocząsteczkowy hamujący szlak sygnalizacyjny Wnt, aby skierować różnicowanie w stronę mezo-dermy serca. Komórki inkubuje się przez kolejne dwa dni. Do siódmego dnia zróżnicowane kardiomiocyty zaczynają bić; następnie heterogenną populację zróżnicowanych komórek inkubuje się w pożywce hodowlanej o niskiej zawartości glukozy w celu selektywnego oczyszczenia kardiomiocytów.

Na koniec komórki poddaje się inspekcji wizualnej pod mikroskopem świetlnym oraz analizie metodą cytometrii przepływowej, aby potwierdzić otrzymanie wysoce oczyszczonej populacji bijących kardiomiocytów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi protokołami różnicowania kardiomiocytów wykorzystującymi małe cząsteczki jest zastosowanie dodatkowego etapu deprywacji glukozy. Pozwala to na oczyszczenie kardiomiocytów, które są zdolne do wykorzystywania innych źródeł energii komórkowej niż glukoza.

Nie-kardiomiocyty mogą zostać selektywnie usunięte z tej heterogenicznej populacji zróżnicowanych komórek. Kardiomiocyty można następnie wykorzystać w dalszych celach, takich jak modelowanie chorób in vitro lub wysokoprzepustowe poszukiwanie leków. Testy Przygotuj się do tego eksperymentu poprzez powlekanie sześciodołkowych płytek roztworem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz rozmrożenie ampułki z zamrożonymi ludzkimi indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (hiPSCs), zgodnie z opisem w towarzyszącym tekście.

Po wirówkowaniu, zawiesić rozmrożone komórki w pożywce E osiem z inhibitorem ROCK. Następnie przenieść zawartość probówki do jednego dołka płytki 6-dołkowej, uprzednio pokrytej ECMS. Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide.

Po 24 godzinach komórki powinny przywrzeć do podłoża. Należy wymienić pożywkę na pożywkę E eight bez inhibitora ROCK. Kontynuuj hodowlę komórek, wymieniając pożywkę E eight codziennie.

Gdy HI PSCs osiągną 75 do 80% konfluencji, należy przeprowadzić ich pasażowanie. Szybko odessaj pożywkę hodowlaną. Przemyj dołki jednym mililitrem sterylnego PBS w temperaturze pokojowej, a następnie odessaj PBS.

Następnie należy dodać 500 µL 0,5 mM EDTA lub innego roztworu do odrywania komórek. Inkubować od jednej do siedmiu minut w temperaturze pokojowej; monitorując proces pod mikroskopem, w momencie gdy widoczne stanie się zwijanie lub pogrubianie kolonii na krawędziach, należy odessać roztwór do odrywania komórek. Następnie należy dodać 1 mL medium E8 uzupełnionego o 10 µM inhibitora ROCK, a za pomocą pipety P 1000 kilkakrotnie pipetować ciecz w górę i w dół, aby całkowicie odseparować kolonie hiPSC od płytki, tworząc od 5 do 10 skupisk komórek.

Następnie przenieś zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, aby dodatkowo rozbić duże skupiska komórek; pipetuj w górę i w dół, aż powstaną mniejsze skupiska, jak pokazano tutaj. Następnie rozcieńcz komórki w stosunku 1:12, dodając 11 ml medium E8 z inhibitorem ROCK do 1 ml zawiesiny komórek.

Następnie odessać ECMS z wcześniej zakodowanych płytek. Do każdej studzienki dodać dwa mililitry resuspendsowanych komórek; optymalna liczba to około 100 000 komórek na studzienkę w płytce 6-studzienkowej. Należy dążyć do równomiernego rozdzielenia komórek w studzience, aby uniknąć ich gromadzenia się w centrum. Umieścić płytkę w inkubatorze na 24 godziny.

Następnego dnia należy wymienić pożywkę na E8 niezawierającą inhibitora ROCK. Pożywkę należy wymieniać co 24 godziny, aż komórki osiągną 80% konfluencji. Zazwyczaj komórki są gotowe do ponownego pasażowania w ciągu trzech do sześciu dni po dysocjacji z użyciem EDTA lub 1× roztworu odrywającego Xcel. W celu dyferencjacji należy wysiać około 100 000 ludzkich hiPSCs na sześciodołkowe płytki hodowlane pokryte ECM.

Postępując zgodnie z tymi samymi krokami, które zastosowano w przypadku HI PSCs, gdy komórki osiągną 85% konfluencji, należy zmienić pożywkę na RPMI 1640 B27, medium bez insuliny, lecz z dodatkiem 6 µM inhibitora GSK3β, CHIR99021. Inkubować komórki przez 48 godzin, codziennie badając je pod mikroskopem.

Po 24 godzinach traktowania CHIR można zaobserwować znaczną ilość obumarłych komórek. Jest to zjawisko normalne i często występujące po dwóch dniach inkubacji. hPSC zwiększają swoją wielkość oraz liczbę i nadal różnicują się w kierunku mezodermalnym.

Zastąp pożywkę hodowlaną zawierającą CHIR pożywką R-P-M-I-B 27 z insuliną i inkubuj do trzeciego dnia. Trzeciego dnia zmień pożywkę na R-P-M-I-B 27 bez insuliny. Dodaj 5 µM inhibitora Wnt IWR-1 i inkubuj komórki przez 48 h.

Piątego dnia należy zbadać komórki pod mikroskopem. Komórki mezodermalne powinny być ukierunkowane na linię kardiologiczną i zacząć łączyć się, tworząc charakterystyczne struktury przypominające rozgałęzienia. Należy zmienić pożywkę z powrotem na R-P-M-I-B 27 bez insuliny i inkubować komórki przez 48 godzin.

Siódmego dnia wymienić medium na R-P-M-I-B 27 z dodatkiem insuliny. Następnie wymieniać medium na to samo co trzy dni, w tym między ósmym a dziesiątym dniem. Spontaniczne skurcze kardiomiocytów będą widoczne po 10 dniach różnicowania.

Ponad 50% obszarów komórkowych wykazuje skurcze. Niemniej jednak, kurczące się arkusze komórek mogą być przemieszane z komórkami niebędącymi kardiomiocytami; w 10. dniu struktury przypominające rozgałęzienia będą bardzo wyraźne. Terminalnie zróżnicowane kardiomiocyty nie będą już proliferować po tym etapie.

W 10. dniu po dyferencjacji wymienić medium w każdej studni płytki sześciodołkowej na 2 mL medium z niską zawartością glukozy i utrzymywać komórki w tym medium przez trzy dni, aż do 13. dnia. W 13. dniu przenieść komórki z powrotem do medium R-P-M-I-B 27 z insuliną lub opcjonalnie przeprowadzić reflację komórek, co ułatwia dysocjację niebędących kardiomiocytami komórek podczas głodzenia glukozowego.

Odssać medium i przemyć raz roztworem PBS. Dodać 500 µL enzymu do dysocjacji komórek i inkubować komórki przez pięć minut. Po pięciu minutach działania enzymu, użyć pipety P 1000 do ręcznego rozproszenia kardiomiocytów w zawiesinie pojedynczych komórek poprzez pipetowanie w górę i w dół do 30 razy. Po dysocjacji komórek przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.

Napełnij probówkę pięcioma mililitrami pożywki R-P-M-I-B 27 z insuliną w celu rozcieńczenia enzymu dysocjującego komórki, a następnie wiruj przez cztery minuty przy 200 Gs. Po wirowaniu odessaj i usuń nadsącz. Następnie zawieś komórki w dwóch mililitrach pożywki R-P-M-I-B 27 i wysiej je na nową płytkę sześciodołkową powleczoną ECMS. Przeżywalność komórek zazwyczaj wzrasta wraz z ich konfluencją, co pozwala na optymalizację przeżywalności komórek.

Przesiej 2 milionów komórek na dołek w płytce 6-dołkowej w przypadku komórek, które nie były przesiewane. W 14. dniu zmień pożywkę na 2 ml pożywki o niskiej zawartości glukozy, aby rozpocząć drugi cykl hodowli z deprywacją glukozy. Utrzymuj komórki w tym stanie niskiej zawartości glukozy przez kolejne trzy dni.

Większość kardiomiocytów nie będzie przeżywać 17. dnia. Wymień medium na dwa mililitry R-P-M-I-B 27 z insuliną. Pozostałe komórki będą wysoko oczyszczonymi kardiomiocytami.

Komórki te można wykorzystać do analizy ekspresji genów, przesiewania leków, analizy metabolicznej oraz różnych innych analiz następczych w celu zbadania czystości kardiomiocytów po różnicowaniu. Aby ocenić czystość komórek po oczyszczaniu metodą głodzenia glukozowego, przeprowadzono barwienie immunologiczne przeciwko markerom kardiomiocytów: troponinie sercowej oraz CTNT. Mikroskopia immunofluorescencyjna nieoczyszczonej populacji zróżnicowanych komórek wykazała, że choć wiele komórek było pozytywnych pod kątem CTNT (zaznaczonych na zielono), wiele z nich nie wykazywało ekspresji CTNT, co sugeruje obecność komórek innych niż kardiomiocyty w 13. dniu. W przeciwieństwie do tego, po trzydniowym głodzeniu glukozowym rozpoczętym w 10. dniu, prawie wszystkie komórki były pozytywne pod kątem CTNT w 13. dniu, co wskazuje na skuteczne oczyszczenie kardiomiocytów w wyniku głodzenia glukozowego.

Dane te zostały dodatkowo potwierdzone za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Jak zaznaczono na czerwono, około 50% komórek, które nie zostały poddane głodzeniu glukozowemu, wykazywało pozytywny wynik dla tn NT two. Natomiast 90% komórek poddanych głodzeniu glukozowemu było pozytywnych dla tn NT two.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak różnicować ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste w wysoko oczyszczone populacje kardiomiocytów. Oczyszczone komórki te mogą być wytwarzane w sposób wysokoprzepustowy na potrzeby różnorodnych późniejszych zastosowań in vitro. Podczas hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych należy pamiętać, że przed rozpoczęciem procesu różnicowania nie powinny one osiągnąć stuprocentowej konfluencji.

Niektóre linie komórek macierzystych różnicują się najlepiej, gdy początkowa konfluencja pluripotencjalnych komórek macierzystych jest mniejsza niż 85%. Wreszcie, niektóre linie komórek macierzystych mogą reagować szybciej lub gwałtowniej na etap deprywacji glukozy. Zawsze monitoruj te parametry przed rozpoczęciem pracy z nowymi liniami komórek macierzystych.