Name: Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek iPSC w kardiomyocyty z wykorzystaniem małych cząsteczek i głodu glukozy. Protokół umożliwia uzyskanie wysoko oczyszczonej populacji komórek sercowych do modelowania chorób układu krążenia i badań przesiewowych leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez NIH/NHBI (U01 HL099776-5), NIH Director's New Innovator Award (DP2 OD004411-2), California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), American Heart Association (14GRNT18630016) oraz Endowed Faculty Scholar Award od Lucile Packard Foundation for Children i Child Health Research Institute w Stanford (dla SMW). Dziękujemy również za wsparcie finansowe ze strony American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000 oraz National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

UWAGA: Informacje o dostawcach wszystkich odczynników używanych w tym protokole zostały wymienione w Tabeli 1 i Liście Materiałów. Wszystkie roztwory i sprzęt mający kontakt z komórkami muszą być sterylne i należy stosować odpowiednie techniki aseptyki. Wszystkie inkubacje kultur należy przeprowadzić w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 , chyba że określono inaczej. W tym protokole wszystkie różnicowania przeprowadza się na płytkach 6-dołkowych, w których wysiewane są hiPSC. Po różnicowaniu i oczyszczeniu komórki mogą zostać zdysocjowane i ponownie posiane do dalszego użytku.
1. Przygotowanie podłoża
<ol>
	<li>Dla pożywki E8 przygotować roztwór podstawowy dla każdego składnika pożywki (NaHCO3, 2-fosforan kwasu L-askorbinowego, selenin sodu, transferyna, insulina, FGF2, TGFB1) i przechowywać roztwory w temperaturze -20 °C. Dodać odpowiednią ilość roztworów podstawowych do butelki DMEM/F12 i przefiltrować w celu sterylizacji. Stężenie roztworu i układ reakcji dla składników podstawowych i pożywki E8 można znaleźć w Tabeli 1.</li>
	<li>W przypadku roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej należy rozmrozić macierz błony podstawnej (zwykle dostarczaną w dawce 10 mg/ml) w temperaturze 4 °C O/N. Matrigel jest powszechnie stosowany do hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych, ponieważ ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste mogą dobrze przylegać do tego materiału przy użyciu integryny alfa-6-beta-19. Po rozmrożeniu przygotować 2,25 mg (250 μl) podwielokrotności na lodzie za pomocą lodowatych końcówek i probówek do pipet i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
	<ol>
		<li>W przypadku wstępnego powlekania płytek ECMS należy rozmrozić i podsycić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej (ECMS) na lodzie. Wymieszaj ECMS i lodowato zimne podłoże DMEM/F12 w stosunku 1:200 na lodzie. Przechowywać w chłodnym miejscu, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu ECMS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku pożywki RPMI/B27 bez pożywki insulinowej dodać 10 ml witaminy B27 bez insuliny do 500 ml pożywki RPMI.</li>
	<li>W przypadku pożywki RPMI/B27 (z insuliną) dodać 10 ml suplementu B27 (z insuliną) i 5 ml antybiotyku Pen-strep do 500 ml pożywki RPMI.</li>
	<li>W przypadku pożywki o niskim poziomie glukozy dodaj 10 ml suplementu B27 i 5 ml antybiotyku Pen-strep do 500 ml bezglukozowego podłoża RPMI.</li>
	<li>W przypadku pożywki do zamrażania/kriokonserwacji należy zmieszać płodową surowicę bydlęcą razem z dimetylosulfotlenkiem (DMSO) w stosunku 9:1. Podłoże zamrażające można przechowywać do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Wszystkie media należy przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 2 tygodni, chyba że określono inaczej. Wszystkie objętości odczynników/roztworów użyte poniżej są przeznaczone dla pojedynczego dołka w płytce 6-dołkowej, chyba że określono inaczej.</li>
</ol>
2. Wstępne powlekanie płytek 6-dołkowych za pomocą ECMS
<ol>
	<li>Wykonać ECMS, mieszając matrycę membrany podstawnej (np. Matrigel) z lodowatymi pożywkami DMEM/F12 w stosunku 1:200, a następnie nanieść 2 ml świeżo przygotowanego ECMS do każdego dołka na płytkę 6-dołkową. Każda studzienka w płytce 6-dołkowej otrzyma około 90 mg ECMS.</li>
	<li>Inkubować płytki pokryte ECMS przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Bezpośrednio przed posiewem komórek należy odessać roztwór DMEM/F12 z każdej studzienki. Płytki będą wtedy gotowe do przyjęcia komórek.</li>
</ol>
3. Rozmrażanie zamrożonych hiPSC
UWAGA: Uważnie przestrzegaj tej procedury, ponieważ może ona prowadzić do optymalnego hodowania i dalszego różnicowania hiPSC-CM w hiPSC-CM po cyklu zamrażania/rozmrażania.
<ol>
	<li>Rozmrozić jedną fiolkę hiPSC na każdą studzienkę płytki 6-dołkowej. Przygotować stożkową probówkę o pojemności 15 ml z 9 ml zimnego podłoża E8 z inhibitorem ROCK (10 μM) dla każdej fiolki. Inhibitor ROCK poprawia przeżywalność hiPSC po kriokonserwacji10. Przechowywać fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu rozmrożenia komórek do momentu pozostawienia kryształków lodu o średnicy około 5 mm.</li>
	<li>Spryskać zewnętrzną stronę fiolek 70% etanolem. Przetrzeć fiolki bibułką przed przeniesieniem ich do sterylnego kaptura laminarnego.</li>
	<li>Przenieś komórki do przygotowanej stożkowej probówki. Przepłukać fiolkę jednorazowo 500 μl pożywki E8 i przenieść pożywkę zawierającą rozmrożone komórki do tej samej stożkowej probówki. Wirować w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przy 200 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant po odwirowaniu i delikatnie zawiesić osad komórkowy z 2 ml pożywki E8 z inhibitorem ROCK (10 μM). Przenieść zawieszone komórki do jednego dołka na 6-dołkowej płytce wstępnie pokrytej ECMS.</li>
	<li>Zastąp pożywkę pożywką E8 bez inhibitora ROCK po 24 godzinach hodowli. Do tego czasu komórki powinny były przylegać.</li>
</ol>
4. Przekazywanie hiPSC
<ol>
	<li>Zazwyczaj przejście hiPSC następuje po osiągnięciu 75%-80% konfluencji w płytce 6-dołkowej. Odessać pożywkę hodowlaną. Szybko umyj studzienki 1 ml sterylnego RT PBS. Zasysać PBS.
	<ol>
		<li>Dodać 500 μl 0,5 mM EDTA lub 1x roztwór do odrywania komórek (np. Accutase) i inkubować przez 1-7 minut w temperaturze pokojowej. Odpowiedni czas inkubacji EDTA różni się w zależności od linii hiPSC. Spodziewaj się widocznego zwijania się lub pogrubienia kolonii wokół krawędzi, ponieważ będzie to oznaczać, że EDTA lub roztwór do odrywania komórek jest gotowy do usunięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać EDTA lub roztwór do odłączania komórek. Dodać 1 ml pożywki E8 uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK. Przemieszcz kolonie hiPSC w studzience poprzez wielokrotne pipetowanie w górę iw dół oraz rozpylanie kolonii za pomocą pipety P1000. Po zakończeniu kolonie należy rozbić na 5-10 kępek komórek.</li>
	<li>Przenieść kolonie zawieszone w 1 ml pożywki E8 z inhibitorem ROCK do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Rozbij duże grudki komórek na małe grudki w pożywce E8. Dodać odpowiednią objętość pożywki E8 z inhibitorem do zawiesiny komórkowej w celu rozcieńczenia komórek. Objętość pożywki, którą należy dodać do rozcieńczenia, zależy od gęstości komórek i liczby studzienek, które mają zostać wysiane. Idealnie, pojedyncza, 80% zlewająca się studzienka hiPSC powinna być rozcieńczona w stosunku 1:12.
	<ol>
		<li>Dodać 11 ml pożywki E8 z inhibitorem ROCK do istniejącego 1 ml roztworu komórkowego w wyżej wymienionej stożkowej probówce o pojemności 15 ml w celu uzyskania rozcieńczenia 1:12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dalej rozcieraj komórki zbijają się w małe fragmenty komórek (najlepiej około 50-200 komórek w każdym fragmencie). Unikaj nadmiernego rozcierania, ponieważ zmniejsza to przeżycie komórek.</li>
	<li>Odessać ECMS z wstępnie pokrytych płytek i dodać 2 ml zawieszonych komórek do każdej studzienki. Idealne jest około 100 000 komórek na dołek płytki 6-dołkowej. Staraj się równomiernie rozmieścić komórki wokół studzienki, aby uniknąć grupowania komórek w środku studzienki.</li>
	<li>Po 24 godzinach hodowli należy zastąpić pożywkę pożywką E8 bez inhibitora ROCK. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 24 godziny, aż komórki staną się zlewające się w 80%. Następnie komórki są gotowe do ponownego przejścia. Zwykle potrzeba 3-6 dni między przejściami, aby osiągnąć 80% zbieżności.</li>
</ol>
5. Zamrażanie hiPSC
UWAGA: Uważnie przestrzegaj tej procedury, ponieważ może ona prowadzić do optymalnego hodowania i dalszego różnicowania hiPSC-CM w hiPSC-CM po cyklu zamrażania/rozmrażania.
<ol>
	<li>Oznacz probówki kriogeniczne nazwą linii komórkowej, typem komórki, numerem przejścia i datą zamrożenia. Jako ogólną wskazówkę należy użyć jednej fiolki na każdą studzienkę płytki 6-dołkowej. Przygotować stożkową probówkę o pojemności 15 ml wypełnioną 9 ml pożywki E8 z inhibitorem ROCK (10 μM). Przygotuj pożywkę do zamrażania z 90% FBS i 10% DMSO i utrzymuj podłoże w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną, dodać 500 μl 0,5 mM EDTA lub 1x roztwór do odrywania komórek i inkubować przez 2-7 minut w temperaturze pokojowej. Czas ekspozycji na EDTA lub roztwór do odrywania komórek różni się w zależności od linii komórkowej.</li>
	<li>Odessać EDTA lub roztwór do odrywania komórek. Dodać 1 ml pożywki E8.</li>
	<li>Przemieszcz kolonie hiPSC w studzience, pipetując w górę iw dół i spryskując kolonie pipetą P1000. Kolonie nie powinny być rozbijane na mniejsze niż 100 kępek komórek. Przenieść zawieszone komórki do przygotowanej stożkowej probówki zawierającej E8. Wirować w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przy 200 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant i dodać do osadu 500 μl zimnego podłoża do zamrażania. Zawiesić osad przez pipetowanie jeden do dwóch razy. Przeżywalność komórek poprawia się dzięki utrzymywaniu komórek w dużych kępach.</li>
	<li>Przenieś zawieszone komórki do oznakowanej probówki kriogenicznej. Szybko przenieść fiolki do pojemnika do zamrażania zawierającego izopropanol, co pozwoli na stopniowe chłodzenie. Przechowywać pojemnik z komórkami w temperaturze -80 °C przez 24 godziny, a następnie przenieść komórki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
6. Różnicowanie serca ludzkiego iPSC
UWAGA: Wszystkie media powinny być co najmniej w RT po dodaniu.
<ol>
	<li>Po dysocjacji za pomocą EDTA lub roztworu do odrywania komórek 1x, wysiewaj około 100 000 ludzkich iPSC na 6-dołkowych płytkach hodowlanych pokrytych ECMS w celu różnicowania (te same kroki, co procedury pasażowania komórek). Gdy komórki osiągną 85% konfluencji, zmień pożywkę na RPMI/B27 bez pożywki insulinowej z 6 μM CHIR99021 inhibitora GSK3-beta (CHIR) i utrzymuj przez 48 godzin.</li>
	<li>Po 48 godzinach zastąp pożywkę hodowlaną zawierającą CHIR pożywką RPMI/B27 bez pożywki insulinowej i pozostaw w spokoju na 24 godziny (do 3 dnia).</li>
	<li>W 3 dniu zmień pożywkę na RPMI/B27 bez insuliny z inhibitorem 5 μM Wnt IWR1 i utrzymuj przez 48 godzin (do 5 dnia). 
	UWAGA: Hamowanie Wnt można również próbować przy użyciu innych związków małocząsteczkowych, jak opisano we wcześniejszych badaniach11. IWR1 został wybrany spośród innych małocząsteczkowych inhibitorów Wnt ze względu na zwiększony zakres, w którym wykazano, że jest skuteczny w hamowaniu sygnalizacji Wnt11.</li>
	<li>W 5 dniu zmień pożywkę z powrotem na RPMI/B27 bez pożywki insulinowej i pozostaw na 48 godzin (do 7 dnia).</li>
	<li>W dniu 7 należy zastąpić pożywkę pożywką RPMI/B27 (insuliną), a następnie co 3 dni wymieniać pożywkę tą samą pożywką. Spontaniczne bicie kardiomiocytów powinno być najpierw widoczne około 8 do 10 dnia.</li>
</ol>
7. Oczyszczanie ludzkich kardiomiocytów poprzez głód glukozy
<ol>
	<li>W 10 dniu po różnicowaniu zmień pożywkę w każdym dołku płytki 6-dołkowej na 2 ml pożywki o niskiej zawartości glukozy i utrzymuj komórki w tym podłożu przez 3 dni (do dnia 13).</li>
	<li>W 13 dniu zwróć komórki do pożywki RPMI/B27 (z insuliną).</li>
	<li>Opcjonalnie należy ponownie podać kardiomiocyty przed drugą rundą głodu glukozy, aby pomóc rozluźnić niekardiomiocyty z płytki hodowlanej, co pozwala na łatwiejszą dysocjację niekardiomiocytów podczas głodu glukozy.
	<ol>
		<li>W dniu 13 odessać pożywkę, przemyć raz PBS i zdysocjować komórki na pojedyncze komórki za pomocą 500 μl enzymu dysocjacji komórek przez 5 minut w temperaturze 37 °C. W szczególności, po 5 minutach leczenia enzymamicznego, użyj pipety 1,000 μl do ręcznej dysocjacji kardiomiocytów od płytki 6-dołkowej poprzez wielokrotne wyciąganie enzymu dysocjacji komórek i rozpylanie go na monowarstwę kardiomiocytów. Do dysocjacji kardiomiocytów na pojedyncze komórki może być wymagane do 30 powtórzeń pipetowania.</li>
		<li>Po dysocjacji komórek i osiągnięciu formy jednokomórkowej, zebrać wszystkie komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 5 ml pożywki RPMI/B27 z insuliną w celu rozcieńczenia enzymu dysocjacji komórek i odwirować przez 4 minuty przy 200 x g. Odessać i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki za pomocą 2 ml pożywki RPMI/B27 i umieścić je na nowej płytce 6-dołkowej pokrytej ECMS. Zazwyczaj większa konfluencja kardiomiocytów pomaga w przetrwaniu komórek podczas ponownego powlekania. Staraj się ponownie platerować 2 miliony komórek na nowe 6-dołkowe naczynie, aby zapewnić optymalne przeżycie podczas ponownego powlekania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 14 zmień pożywkę z powrotem na 2 ml pożywki o niskim poziomie glukozy, aby uzyskać drugi cykl deprywacji glukozy. Hoduj komórki w tym stanie niskiego poziomu glukozy przez kolejne 3 dni. Większość niekardiomiocytów umrze w tym stanie hodowli o niskim poziomie glukozy.</li>
	<li>W dniu 17 zmień pożywkę na 2 ml pożywki RPMI/B27 z insuliną. Pozostałe komórki będą wysoce oczyszczonymi kardiomiocytami. Te kardiomiocyty mogą być wykorzystywane do analizy ekspresji genów, badań przesiewowych leków, analizy metabolicznej i różnych innych dalszych testów.</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150(2013).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+for+coxsackievirus+B3-induced+myocarditis+and+antiviral+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform.</a> Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).</li>
<li>Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+And+Development%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+de+novo+cardiomyocytes%3A+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują sprzecznych interesów.

Uzyskanie dużej ilości wysoce oczyszczonych kardiomiocytów pochodzących z hiPSC ma kluczowe znaczenie dla podstawowych badań kardiologicznych, a także zastosowań klinicznych i translacyjnych. Protokoły różnicowania serca uległy w ostatnich latach ogromnej poprawie, przechodząc od metod opartych na ciele embrionalnym z wykorzystaniem kardiogennych czynników wzrostu2 do metod kanapkowych z matrycą12 i wreszcie do metod modulowanych małymi cząsteczkami i opartych na monowarstwach5. Spośród w...

Pierwotne ludzkie kardiomiocyty są trudne do uzyskania ze względu na konieczność inwazyjnych biopsji serca, trudności w dysocjacji na pojedyncze komórki oraz z powodu słabej długoterminowej przeżywalności komórek w hodowli. Biorąc pod uwagę brak pierwotnych ludzkich kardiomiocytów, specyficzna dla pacjenta technologia ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM) została uznana za potężne alternatywne źródło kardiomiocytów do badań podstawowych, a także zastosowań klinicznych i translacyjnych, takich jak modelowanie chorób i odkrywanie leków1. Wczesne próby różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty wykorzystywały protokoły różnicowania przy użyciu ciał embrionalnych (EB), ale ta metoda jest nieskuteczna w wytwarzaniu kardiomiocytów, ponieważ często mniej niż 25% komórek w EB pokonuje kardiomiocyty2,3. Dla porównania, monowarstwowy protokół różnicowania wykorzystujący cytokiny aktywinę A i BMP4 wykazał wyższą skuteczność niż EB, ale protokół ten jest nadal stosunkowo nieefektywny, wymaga drogich czynników wzrostu i działa tylko w ograniczonej liczbie ludzkich linii pluripotencjalnych komórek macierzystych4. Niedawno opracowano wysoce skuteczny, oparty na monowarstwie hiPSC protokół różnicowania kardiomiocytów poprzez modulację sygnalizacji Wnt/β-kateniny5. Te hiPSC-CM wyrażają sercową troponinę T i alfa aktyninę, dwa białka sarkomeryczne, które są standardowymi markerami kardiomiocytów6. Opisany tutaj protokół jest adaptacją tej opartej na małych cząsteczkach, bezkomórkowej, jednowarstwowej metody różnicowania5,7. Jesteśmy w stanie uzyskać bijące kardiomiocyty z hiPSC po 7-10 dniach (ryc. 1). Jednak po różnicowaniu kardiomiocytów, w wyniku którego 50% bije komórki, barwienie immunologiczne konsekwentnie pokazuje istnienie populacji niekardiomiocytów, które są ujemne dla markerów specyficznych dla kardiomiocytów, takich jak specyficzna dla serca troponina T i alfa-aktynina. Aby jeszcze bardziej oczyścić kardiomiocyty i wyeliminować niekardiomiocyty, heterogeniczne zróżnicowane populacje komórek poddano głodowi glukozy, traktując je pożywką hodowlaną o wyjątkowo niskim poziomie glukozy przez wiele dni (ryc. 2). Leczenie to selektywnie eliminuje niekardiomiocyty ze względu na zdolność kardiomiocytów, ale nie niekardiomiocytów, do metabolizowania mleczanu jako podstawowego źródła energii w celu przetrwania w środowisku o niskim poziomie glukozy8. Po tym etapie oczyszczania obserwuje się 40% wzrost stosunku kardiomiocytów do niekardiomiocytów (ryc. 3, ryc. 4), a komórki te można wykorzystać do dalszej analizy ekspresji genów, modelowania choroby i testów przesiewowych leków.

<table><tbody><tr><td>Matrigel (9-12 mg / ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>RPMI media</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>Wolne od glukozy pożywki RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>B27 Minus Insulina</td><td>Suplement Invitrogen</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 (z insuliną)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk Pen-strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>BenchMark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Thermo Fisher</td><td>508306</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Podnośnik komórek</td><td>Fisher</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Fisher (probówki NUNC)</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme</td><td>Invitrogen</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stały się ważnym źródłem komórek, aby rozwiązać problem braku podstawowych kardiomiocytów dostępnych do badań podstawowych i zastosowań translacyjnych. Aby zróżnicować hiPSC w kardiomiocyty, opracowano różne protokoły, w tym różnicowanie na podstawie ciała zarodka (EB) i indukcję czynnika wzrostu. Jednak protokoły te są nieefektywne i bardzo zmienne pod względem zdolności do generowania oczyszczonych kardiomiocytów. Niedawno wykazano, że protokół oparty na małych cząsteczkach wykorzystujący modulację sygnalizacji Wnt / β-kateniny promuje różnicowanie serca z wysoką wydajnością. Dzięki temu protokołowi ponad 50%-60% zróżnicowanych komórek było konsekwentnie obserwowanych kardiomiocytów sercowo-troponinowo-dodatnich. Aby jeszcze bardziej zwiększyć czystość kardiomiocytów, zróżnicowane komórki poddano głodowi glukozy w celu specyficznego wyeliminowania niekardiomiocytów w oparciu o różnice metaboliczne między kardiomiocytami a niekardiomiocytami. Stosując tę strategię selekcji, konsekwentnie uzyskiwaliśmy ponad 30% wzrost stosunku kardiomiocytów do niekardiomiocytów w populacji zróżnicowanych komórek. Te wysoce oczyszczone kardiomiocyty powinny zwiększyć wiarygodność wyników badań modelowania in vitro chorób in vitro opartych na iPSC i testach przesiewowych leków.

Zmiany morfologiczne podczas różnicowania hiPSC.
hiPSC hodowane na płytkach bez komórek karmicielskich rosły w postaci płaskich, dwuwymiarowych kolonii. Po osiągnięciu około 85% konfluencji, hiPSC poddano działaniu 6 µM CHIR w celu indukcji różnicowania (Rysunek 1A). Po 24 h traktowania CHIR zaobserwowano znaczne ilości śmierci komórek, co jest zjawiskiem normalnym i częstym. Po dwóch dniach traktowania CHIR, hiPSC nadal różnicowały się w kierunku mezodermalny...

Tutaj opisujemy solidny protokół do pozyskiwania ludzkich kardiomiocytów, który łączy modulowane małymi cząsteczkami różnicowanie serca i oczyszczanie kardiomiocytów za pośrednictwem deprywacji glukozy, umożliwiając produkcję oczyszczonych kardiomiocytów dla celów modelowania chorób sercowo-naczyniowych i badań przesiewowych leków.

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie oczyszczonej populacji kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Najpierw ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste są hodowane w monowarstwie do momentu osiągnięcia około 85% konfluencji. Następnie dodaje się związek małocząsteczkowy aktywujący szlak sygnałowy Wnt, a komórki inkubuje się przez dwa dni, aby indukować tworzenie mezojermy.Następnie do komórek dodaje się związek małocząsteczkowy hamujący szlak sygnalizacyjny Wnt, aby skierować różnicowanie w stronę mezo-dermy serca. Komórki inkubuje się przez kolejne dwa dni. Do siódmego dnia zróżnicowane kardiomiocyty zaczynają bić; następnie heterogenną populację zróżnicowanych komórek inkubuje się w pożywce hodowlanej o niskiej zawartości glukozy w celu selektywnego oczyszczenia kardiomiocytów.Na koniec komórki poddaje się inspekcji wizualnej pod mikroskopem świetlnym oraz analizie metodą cytometrii przepływowej, aby potwierdzić otrzymanie wysoce oczyszczonej populacji bijących kardiomiocytów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi protokołami różnicowania kardiomiocytów wykorzystującymi małe cząsteczki jest zastos

derivation-highly-purified-cardiomyocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Wyprowadzenie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych komórek pluripotencjalnych metodą różnicowania zmodulowanego małymi cząsteczkami i następczym głodowaniem glukozowym

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy solidny, szybki i skalowalny protokół różnicowania kardiomiocytów dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Kardiomiocyty uzyskane przy użyciu tej metody na dużą skalę mogą zapewnić wystarczającą liczbę komórek do ich skutecznego wykorzystania w modelowaniu chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i potencjalnie zastosowaniach klinicznych.

Produkcja kardiomiocytów na dużą skalę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wysoce powtarzalnego protokołu różnicowania opartego na małych cząsteczkach

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Tutaj opisujemy i sprawdzamy metodę konsekwentnego generowania silnych ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych i charakteryzujemy ich funkcję. Techniki te mogą pomóc w opracowaniu mechanistycznego wglądu w szlaki sygnałowe, zapewnić platformę do badań przesiewowych leków na dużą skalę i niezawodnie modelować choroby serca.

Wytwarzanie podobnych do komór kardiomiocytów pochodzących z HiPSC i wysokiej jakości preparatów komórkowych do charakterystyki obchodzenia się z wapniem

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Ta metoda może być użyta do zbadania skrócenia sarkomeru za pomocą kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych z fluorescencyjnie znakowanymi białkami sarkomerowymi.

Sarkomerowe skracanie pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie białek sarkomerowych.

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek iPSC w kardiomyocyty z wykorzystaniem małych cząsteczek i głodu glukozy. Protokół umożliwia uzyskanie wysoko oczyszczonej populacji komórek sercowych do modelowania chorób układu krążenia i badań przesiewowych leków.

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy (Wideo) | JoVE Journal

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Przeglądaj więcej filmów