Name: Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek iPSC w kardiomyocyty z wykorzystaniem małych cząsteczek i głodu glukozy. Protokół umożliwia uzyskanie wysoko oczyszczonej populacji komórek sercowych do modelowania chorób układu krążenia i badań przesiewowych leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez NIH/NHBI (U01 HL099776-5), NIH Director's New Innovator Award (DP2 OD004411-2), California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), American Heart Association (14GRNT18630016) oraz Endowed Faculty Scholar Award od Lucile Packard Foundation for Children i Child Health Research Institute w Stanford (dla SMW). Dziękujemy również za wsparcie finansowe ze strony American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000 oraz National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

UWAGA: Informacje o dostawcach wszystkich odczynników używanych w tym protokole zostały wymienione w Tabeli 1 i Liście Materiałów. Wszystkie roztwory i sprzęt mający kontakt z komórkami muszą być sterylne i należy stosować odpowiednie techniki aseptyki. Wszystkie inkubacje kultur należy przeprowadzić w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 , chyba że określono inaczej. W tym protokole wszystkie różnicowania przeprowadza się na płytkach 6-dołkowych, w których wysiewane są hiPSC. Po różnicowaniu i oczyszczeniu komórki mogą zostać zdysocjowane i ponownie posiane do dalszego użytku.
1. Przygotowanie podłoża
<ol>
	<li>Dla pożywki E8 przygotować roztwór podstawowy dla każdego składnika pożywki (NaHCO3, 2-fosforan kwasu L-askorbinowego, selenin sodu, transferyna, insulina, FGF2, TGFB1) i przechowywać roztwory w temperaturze -20 °C. Dodać odpowiednią ilość roztworów podstawowych do butelki DMEM/F12 i przefiltrować w celu sterylizacji. Stężenie roztworu i układ reakcji dla składników podstawowych i pożywki E8 można znaleźć w Tabeli 1.</li>
	<li>W przypadku roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej należy rozmrozić macierz błony podstawnej (zwykle dostarczaną w dawce 10 mg/ml) w temperaturze 4 °C O/N. Matrigel jest powszechnie stosowany do hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych, ponieważ ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste mogą dobrze przylegać do tego materiału przy użyciu integryny alfa-6-beta-19. Po rozmrożeniu przygotować 2,25 mg (250 μl) podwielokrotności na lodzie za pomocą lodowatych końcówek i probówek do pipet i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
	<ol>
		<li>W przypadku wstępnego powlekania płytek ECMS należy rozmrozić i podsycić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej (ECMS) na lodzie. Wymieszaj ECMS i lodowato zimne podłoże DMEM/F12 w stosunku 1:200 na lodzie. Przechowywać w chłodnym miejscu, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu ECMS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku pożywki RPMI/B27 bez pożywki insulinowej dodać 10 ml witaminy B27 bez insuliny do 500 ml pożywki RPMI.</li>
	<li>W przypadku pożywki RPMI/B27 (z insuliną) dodać 10 ml suplementu B27 (z insuliną) i 5 ml antybiotyku Pen-strep do 500 ml pożywki RPMI.</li>
	<li>W przypadku pożywki o niskim poziomie glukozy dodaj 10 ml suplementu B27 i 5 ml antybiotyku Pen-strep do 500 ml bezglukozowego podłoża RPMI.</li>
	<li>W przypadku pożywki do zamrażania/kriokonserwacji należy zmieszać płodową surowicę bydlęcą razem z dimetylosulfotlenkiem (DMSO) w stosunku 9:1. Podłoże zamrażające można przechowywać do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Wszystkie media należy przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 2 tygodni, chyba że określono inaczej. Wszystkie objętości odczynników/roztworów użyte poniżej są przeznaczone dla pojedynczego dołka w płytce 6-dołkowej, chyba że określono inaczej.</li>
</ol>
2. Wstępne powlekanie płytek 6-dołkowych za pomocą ECMS
<ol>
	<li>Wykonać ECMS, mieszając matrycę membrany podstawnej (np. Matrigel) z lodowatymi pożywkami DMEM/F12 w stosunku 1:200, a następnie nanieść 2 ml świeżo przygotowanego ECMS do każdego dołka na płytkę 6-dołkową. Każda studzienka w płytce 6-dołkowej otrzyma około 90 mg ECMS.</li>
	<li>Inkubować płytki pokryte ECMS przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Bezpośrednio przed posiewem komórek należy odessać roztwór DMEM/F12 z każdej studzienki. Płytki będą wtedy gotowe do przyjęcia komórek.</li>
</ol>
3. Rozmrażanie zamrożonych hiPSC
UWAGA: Uważnie przestrzegaj tej procedury, ponieważ może ona prowadzić do optymalnego hodowania i dalszego różnicowania hiPSC-CM w hiPSC-CM po cyklu zamrażania/rozmrażania.
<ol>
	<li>Rozmrozić jedną fiolkę hiPSC na każdą studzienkę płytki 6-dołkowej. Przygotować stożkową probówkę o pojemności 15 ml z 9 ml zimnego podłoża E8 z inhibitorem ROCK (10 μM) dla każdej fiolki. Inhibitor ROCK poprawia przeżywalność hiPSC po kriokonserwacji10. Przechowywać fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu rozmrożenia komórek do momentu pozostawienia kryształków lodu o średnicy około 5 mm.</li>
	<li>Spryskać zewnętrzną stronę fiolek 70% etanolem. Przetrzeć fiolki bibułką przed przeniesieniem ich do sterylnego kaptura laminarnego.</li>
	<li>Przenieś komórki do przygotowanej stożkowej probówki. Przepłukać fiolkę jednorazowo 500 μl pożywki E8 i przenieść pożywkę zawierającą rozmrożone komórki do tej samej stożkowej probówki. Wirować w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przy 200 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant po odwirowaniu i delikatnie zawiesić osad komórkowy z 2 ml pożywki E8 z inhibitorem ROCK (10 μM). Przenieść zawieszone komórki do jednego dołka na 6-dołkowej płytce wstępnie pokrytej ECMS.</li>
	<li>Zastąp pożywkę pożywką E8 bez inhibitora ROCK po 24 godzinach hodowli. Do tego czasu komórki powinny były przylegać.</li>
</ol>
4. Przekazywanie hiPSC
<ol>
	<li>Zazwyczaj przejście hiPSC następuje po osiągnięciu 75%-80% konfluencji w płytce 6-dołkowej. Odessać pożywkę hodowlaną. Szybko umyj studzienki 1 ml sterylnego RT PBS. Zasysać PBS.
	<ol>
		<li>Dodać 500 μl 0,5 mM EDTA lub 1x roztwór do odrywania komórek (np. Accutase) i inkubować przez 1-7 minut w temperaturze pokojowej. Odpowiedni czas inkubacji EDTA różni się w zależności od linii hiPSC. Spodziewaj się widocznego zwijania się lub pogrubienia kolonii wokół krawędzi, ponieważ będzie to oznaczać, że EDTA lub roztwór do odrywania komórek jest gotowy do usunięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać EDTA lub roztwór do odłączania komórek. Dodać 1 ml pożywki E8 uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK. Przemieszcz kolonie hiPSC w studzience poprzez wielokrotne pipetowanie w górę iw dół oraz rozpylanie kolonii za pomocą pipety P1000. Po zakończeniu kolonie należy rozbić na 5-10 kępek komórek.</li>
	<li>Przenieść kolonie zawieszone w 1 ml pożywki E8 z inhibitorem ROCK do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Rozbij duże grudki komórek na małe grudki w pożywce E8. Dodać odpowiednią objętość pożywki E8 z inhibitorem do zawiesiny komórkowej w celu rozcieńczenia komórek. Objętość pożywki, którą należy dodać do rozcieńczenia, zależy od gęstości komórek i liczby studzienek, które mają zostać wysiane. Idealnie, pojedyncza, 80% zlewająca się studzienka hiPSC powinna być rozcieńczona w stosunku 1:12.
	<ol>
		<li>Dodać 11 ml pożywki E8 z inhibitorem ROCK do istniejącego 1 ml roztworu komórkowego w wyżej wymienionej stożkowej probówce o pojemności 15 ml w celu uzyskania rozcieńczenia 1:12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dalej rozcieraj komórki zbijają się w małe fragmenty komórek (najlepiej około 50-200 komórek w każdym fragmencie). Unikaj nadmiernego rozcierania, ponieważ zmniejsza to przeżycie komórek.</li>
	<li>Odessać ECMS z wstępnie pokrytych płytek i dodać 2 ml zawieszonych komórek do każdej studzienki. Idealne jest około 100 000 komórek na dołek płytki 6-dołkowej. Staraj się równomiernie rozmieścić komórki wokół studzienki, aby uniknąć grupowania komórek w środku studzienki.</li>
	<li>Po 24 godzinach hodowli należy zastąpić pożywkę pożywką E8 bez inhibitora ROCK. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 24 godziny, aż komórki staną się zlewające się w 80%. Następnie komórki są gotowe do ponownego przejścia. Zwykle potrzeba 3-6 dni między przejściami, aby osiągnąć 80% zbieżności.</li>
</ol>
5. Zamrażanie hiPSC
UWAGA: Uważnie przestrzegaj tej procedury, ponieważ może ona prowadzić do optymalnego hodowania i dalszego różnicowania hiPSC-CM w hiPSC-CM po cyklu zamrażania/rozmrażania.
<ol>
	<li>Oznacz probówki kriogeniczne nazwą linii komórkowej, typem komórki, numerem przejścia i datą zamrożenia. Jako ogólną wskazówkę należy użyć jednej fiolki na każdą studzienkę płytki 6-dołkowej. Przygotować stożkową probówkę o pojemności 15 ml wypełnioną 9 ml pożywki E8 z inhibitorem ROCK (10 μM). Przygotuj pożywkę do zamrażania z 90% FBS i 10% DMSO i utrzymuj podłoże w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną, dodać 500 μl 0,5 mM EDTA lub 1x roztwór do odrywania komórek i inkubować przez 2-7 minut w temperaturze pokojowej. Czas ekspozycji na EDTA lub roztwór do odrywania komórek różni się w zależności od linii komórkowej.</li>
	<li>Odessać EDTA lub roztwór do odrywania komórek. Dodać 1 ml pożywki E8.</li>
	<li>Przemieszcz kolonie hiPSC w studzience, pipetując w górę iw dół i spryskując kolonie pipetą P1000. Kolonie nie powinny być rozbijane na mniejsze niż 100 kępek komórek. Przenieść zawieszone komórki do przygotowanej stożkowej probówki zawierającej E8. Wirować w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przy 200 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant i dodać do osadu 500 μl zimnego podłoża do zamrażania. Zawiesić osad przez pipetowanie jeden do dwóch razy. Przeżywalność komórek poprawia się dzięki utrzymywaniu komórek w dużych kępach.</li>
	<li>Przenieś zawieszone komórki do oznakowanej probówki kriogenicznej. Szybko przenieść fiolki do pojemnika do zamrażania zawierającego izopropanol, co pozwoli na stopniowe chłodzenie. Przechowywać pojemnik z komórkami w temperaturze -80 °C przez 24 godziny, a następnie przenieść komórki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
6. Różnicowanie serca ludzkiego iPSC
UWAGA: Wszystkie media powinny być co najmniej w RT po dodaniu.
<ol>
	<li>Po dysocjacji za pomocą EDTA lub roztworu do odrywania komórek 1x, wysiewaj około 100 000 ludzkich iPSC na 6-dołkowych płytkach hodowlanych pokrytych ECMS w celu różnicowania (te same kroki, co procedury pasażowania komórek). Gdy komórki osiągną 85% konfluencji, zmień pożywkę na RPMI/B27 bez pożywki insulinowej z 6 μM CHIR99021 inhibitora GSK3-beta (CHIR) i utrzymuj przez 48 godzin.</li>
	<li>Po 48 godzinach zastąp pożywkę hodowlaną zawierającą CHIR pożywką RPMI/B27 bez pożywki insulinowej i pozostaw w spokoju na 24 godziny (do 3 dnia).</li>
	<li>W 3 dniu zmień pożywkę na RPMI/B27 bez insuliny z inhibitorem 5 μM Wnt IWR1 i utrzymuj przez 48 godzin (do 5 dnia). 
	UWAGA: Hamowanie Wnt można również próbować przy użyciu innych związków małocząsteczkowych, jak opisano we wcześniejszych badaniach11. IWR1 został wybrany spośród innych małocząsteczkowych inhibitorów Wnt ze względu na zwiększony zakres, w którym wykazano, że jest skuteczny w hamowaniu sygnalizacji Wnt11.</li>
	<li>W 5 dniu zmień pożywkę z powrotem na RPMI/B27 bez pożywki insulinowej i pozostaw na 48 godzin (do 7 dnia).</li>
	<li>W dniu 7 należy zastąpić pożywkę pożywką RPMI/B27 (insuliną), a następnie co 3 dni wymieniać pożywkę tą samą pożywką. Spontaniczne bicie kardiomiocytów powinno być najpierw widoczne około 8 do 10 dnia.</li>
</ol>
7. Oczyszczanie ludzkich kardiomiocytów poprzez głód glukozy
<ol>
	<li>W 10 dniu po różnicowaniu zmień pożywkę w każdym dołku płytki 6-dołkowej na 2 ml pożywki o niskiej zawartości glukozy i utrzymuj komórki w tym podłożu przez 3 dni (do dnia 13).</li>
	<li>W 13 dniu zwróć komórki do pożywki RPMI/B27 (z insuliną).</li>
	<li>Opcjonalnie należy ponownie podać kardiomiocyty przed drugą rundą głodu glukozy, aby pomóc rozluźnić niekardiomiocyty z płytki hodowlanej, co pozwala na łatwiejszą dysocjację niekardiomiocytów podczas głodu glukozy.
	<ol>
		<li>W dniu 13 odessać pożywkę, przemyć raz PBS i zdysocjować komórki na pojedyncze komórki za pomocą 500 μl enzymu dysocjacji komórek przez 5 minut w temperaturze 37 °C. W szczególności, po 5 minutach leczenia enzymamicznego, użyj pipety 1,000 μl do ręcznej dysocjacji kardiomiocytów od płytki 6-dołkowej poprzez wielokrotne wyciąganie enzymu dysocjacji komórek i rozpylanie go na monowarstwę kardiomiocytów. Do dysocjacji kardiomiocytów na pojedyncze komórki może być wymagane do 30 powtórzeń pipetowania.</li>
		<li>Po dysocjacji komórek i osiągnięciu formy jednokomórkowej, zebrać wszystkie komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 5 ml pożywki RPMI/B27 z insuliną w celu rozcieńczenia enzymu dysocjacji komórek i odwirować przez 4 minuty przy 200 x g. Odessać i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki za pomocą 2 ml pożywki RPMI/B27 i umieścić je na nowej płytce 6-dołkowej pokrytej ECMS. Zazwyczaj większa konfluencja kardiomiocytów pomaga w przetrwaniu komórek podczas ponownego powlekania. Staraj się ponownie platerować 2 miliony komórek na nowe 6-dołkowe naczynie, aby zapewnić optymalne przeżycie podczas ponownego powlekania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 14 zmień pożywkę z powrotem na 2 ml pożywki o niskim poziomie glukozy, aby uzyskać drugi cykl deprywacji glukozy. Hoduj komórki w tym stanie niskiego poziomu glukozy przez kolejne 3 dni. Większość niekardiomiocytów umrze w tym stanie hodowli o niskim poziomie glukozy.</li>
	<li>W dniu 17 zmień pożywkę na 2 ml pożywki RPMI/B27 z insuliną. Pozostałe komórki będą wysoce oczyszczonymi kardiomiocytami. Te kardiomiocyty mogą być wykorzystywane do analizy ekspresji genów, badań przesiewowych leków, analizy metabolicznej i różnych innych dalszych testów.</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150(2013).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+for+coxsackievirus+B3-induced+myocarditis+and+antiviral+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform.</a> Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).</li>
<li>Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+And+Development%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+de+novo+cardiomyocytes%3A+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują sprzecznych interesów.

Uzyskanie dużej ilości wysoce oczyszczonych kardiomiocytów pochodzących z hiPSC ma kluczowe znaczenie dla podstawowych badań kardiologicznych, a także zastosowań klinicznych i translacyjnych. Protokoły różnicowania serca uległy w ostatnich latach ogromnej poprawie, przechodząc od metod opartych na ciele embrionalnym z wykorzystaniem kardiogennych czynników wzrostu2 do metod kanapkowych z matrycą12 i wreszcie do metod modulowanych małymi cząsteczkami i opartych na monowarstwach5. Spośród w...

Pierwotne ludzkie kardiomiocyty są trudne do uzyskania ze względu na konieczność inwazyjnych biopsji serca, trudności w dysocjacji na pojedyncze komórki oraz z powodu słabej długoterminowej przeżywalności komórek w hodowli. Biorąc pod uwagę brak pierwotnych ludzkich kardiomiocytów, specyficzna dla pacjenta technologia ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM) została uznana za potężne alternatywne źródło kardiomiocytów do badań podstawowych, a także zastosowań klinicznych i translacyjnych, takich jak modelowanie chorób i odkrywanie leków1. Wczesne próby różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty wykorzystywały protokoły różnicowania przy użyciu ciał embrionalnych (EB), ale ta metoda jest nieskuteczna w wytwarzaniu kardiomiocytów, ponieważ często mniej niż 25% komórek w EB pokonuje kardiomiocyty2,3. Dla porównania, monowarstwowy protokół różnicowania wykorzystujący cytokiny aktywinę A i BMP4 wykazał wyższą skuteczność niż EB, ale protokół ten jest nadal stosunkowo nieefektywny, wymaga drogich czynników wzrostu i działa tylko w ograniczonej liczbie ludzkich linii pluripotencjalnych komórek macierzystych4. Niedawno opracowano wysoce skuteczny, oparty na monowarstwie hiPSC protokół różnicowania kardiomiocytów poprzez modulację sygnalizacji Wnt/β-kateniny5. Te hiPSC-CM wyrażają sercową troponinę T i alfa aktyninę, dwa białka sarkomeryczne, które są standardowymi markerami kardiomiocytów6. Opisany tutaj protokół jest adaptacją tej opartej na małych cząsteczkach, bezkomórkowej, jednowarstwowej metody różnicowania5,7. Jesteśmy w stanie uzyskać bijące kardiomiocyty z hiPSC po 7-10 dniach (ryc. 1). Jednak po różnicowaniu kardiomiocytów, w wyniku którego 50% bije komórki, barwienie immunologiczne konsekwentnie pokazuje istnienie populacji niekardiomiocytów, które są ujemne dla markerów specyficznych dla kardiomiocytów, takich jak specyficzna dla serca troponina T i alfa-aktynina. Aby jeszcze bardziej oczyścić kardiomiocyty i wyeliminować niekardiomiocyty, heterogeniczne zróżnicowane populacje komórek poddano głodowi glukozy, traktując je pożywką hodowlaną o wyjątkowo niskim poziomie glukozy przez wiele dni (ryc. 2). Leczenie to selektywnie eliminuje niekardiomiocyty ze względu na zdolność kardiomiocytów, ale nie niekardiomiocytów, do metabolizowania mleczanu jako podstawowego źródła energii w celu przetrwania w środowisku o niskim poziomie glukozy8. Po tym etapie oczyszczania obserwuje się 40% wzrost stosunku kardiomiocytów do niekardiomiocytów (ryc. 3, ryc. 4), a komórki te można wykorzystać do dalszej analizy ekspresji genów, modelowania choroby i testów przesiewowych leków.

<table><tbody><tr><td>Matrigel (9-12 mg / ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>RPMI media</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>Wolne od glukozy pożywki RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>B27 Minus Insulina</td><td>Suplement Invitrogen</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 (z insuliną)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk Pen-strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>BenchMark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Thermo Fisher</td><td>508306</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Podnośnik komórek</td><td>Fisher</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Fisher (probówki NUNC)</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme</td><td>Invitrogen</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stały się ważnym źródłem komórek, aby rozwiązać problem braku podstawowych kardiomiocytów dostępnych do badań podstawowych i zastosowań translacyjnych. Aby zróżnicować hiPSC w kardiomiocyty, opracowano różne protokoły, w tym różnicowanie na podstawie ciała zarodka (EB) i indukcję czynnika wzrostu. Jednak protokoły te są nieefektywne i bardzo zmienne pod względem zdolności do generowania oczyszczonych kardiomiocytów. Niedawno wykazano, że protokół oparty na małych cząsteczkach wykorzystujący modulację sygnalizacji Wnt / β-kateniny promuje różnicowanie serca z wysoką wydajnością. Dzięki temu protokołowi ponad 50%-60% zróżnicowanych komórek było konsekwentnie obserwowanych kardiomiocytów sercowo-troponinowo-dodatnich. Aby jeszcze bardziej zwiększyć czystość kardiomiocytów, zróżnicowane komórki poddano głodowi glukozy w celu specyficznego wyeliminowania niekardiomiocytów w oparciu o różnice metaboliczne między kardiomiocytami a niekardiomiocytami. Stosując tę strategię selekcji, konsekwentnie uzyskiwaliśmy ponad 30% wzrost stosunku kardiomiocytów do niekardiomiocytów w populacji zróżnicowanych komórek. Te wysoce oczyszczone kardiomiocyty powinny zwiększyć wiarygodność wyników badań modelowania in vitro chorób in vitro opartych na iPSC i testach przesiewowych leków.

Zmiany morfologiczne podczas różnicowania hiPSC.
hiPSC hodowane na płytkach bez komórek karmicielskich rosły w postaci płaskich, dwuwymiarowych kolonii. Po osiągnięciu około 85% konfluencji, hiPSC poddano działaniu 6 µM CHIR w celu indukcji różnicowania (Rysunek 1A). Po 24 h traktowania CHIR zaobserwowano znaczne ilości śmierci komórek, co jest zjawiskiem normalnym i częstym. Po dwóch dniach traktowania CHIR, hiPSC nadal różnicowały się w kierunku mezodermalny...

Tutaj opisujemy solidny protokół do pozyskiwania ludzkich kardiomiocytów, który łączy modulowane małymi cząsteczkami różnicowanie serca i oczyszczanie kardiomiocytów za pośrednictwem deprywacji glukozy, umożliwiając produkcję oczyszczonych kardiomiocytów dla celów modelowania chorób sercowo-naczyniowych i badań przesiewowych leków.

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie oczyszczonej populacji kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Najpierw ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste są hodowane w monowarstwie do momentu osiągnięcia około 85% konfluencji. Następnie dodaje się związek małocząsteczkowy aktywujący szlak sygnałowy Wnt, a komórki inkubuje się przez dwa dni, aby indukować tworzenie mezojermy.Następnie do komórek dodaje się związek małocząsteczkowy hamujący szlak sygnalizacyjny Wnt, aby skierować różnicowanie w stronę mezo-dermy serca. Komórki inkubuje się przez kolejne dwa dni. Do siódmego dnia zróżnicowane kardiomiocyty zaczynają bić; następnie heterogenną populację zróżnicowanych komórek inkubuje się w pożywce hodowlanej o niskiej zawartości glukozy w celu selektywnego oczyszczenia kardiomiocytów.Na koniec komórki poddaje się inspekcji wizualnej pod mikroskopem świetlnym oraz analizie metodą cytometrii przepływowej, aby potwierdzić otrzymanie wysoce oczyszczonej populacji bijących kardiomiocytów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi protokołami różnicowania kardiomiocytów wykorzystującymi małe cząsteczki jest zastosowanie dodatkowego etapu deprywacji glukozy. Pozwala to na oczyszczenie kardiomiocytów, które są zdolne do wykorzystywania innych źródeł energii komórkowej niż glukoza.Nie-kardiomiocyty mogą zostać selektywnie usunięte z tej heterogenicznej populacji zróżnicowanych komórek. Kardiomiocyty można następnie wykorzystać w dalszych celach, takich jak modelowanie chorób in vitro lub wysokoprzepustowe poszukiwanie leków. Testy Przygotuj się do tego eksperymentu poprzez powlekanie sześciodołkowych płytek roztworem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz rozmrożenie ampułki z zamrożonymi ludzkimi indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (hiPSCs), zgodnie z opisem w towarzyszącym tekście.Po wirówkowaniu, zawiesić rozmrożone komórki w pożywce E osiem z inhibitorem ROCK. Następnie przenieść zawartość probówki do jednego dołka płytki 6-dołkowej, uprzednio pokrytej ECMS. Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide.Po 24 godzinach komórki powinny przywrzeć do podłoża. Należy wymienić pożywkę na pożywkę E eight bez inhibitora ROCK. Kontynuuj hodowlę komórek, wymieniając pożywkę E eight codziennie.Gdy HI PSCs osiągną 75 do 80% konfluencji, należy przeprowadzić ich pasażowanie. Szybko odessaj pożywkę hodowlaną. Przemyj dołki jednym mililitrem sterylnego PBS w temperaturze pokojowej, a następnie odessaj PBS.Następnie należy dodać 500 µL 0,5 mM EDTA lub innego roztworu do odrywania komórek. Inkubować od jednej do siedmiu minut w temperaturze pokojowej; monitorując proces pod mikroskopem, w momencie gdy widoczne stanie się zwijanie lub pogrubianie kolonii na krawędziach, należy odessać roztwór do odrywania komórek. Następnie należy dodać 1 mL medium E8 uzupełnionego o 10 µM inhibitora ROCK, a za pomocą pipety P 1000 kilkakrotnie pipetować ciecz w górę i w dół, aby całkowicie odseparować kolonie hiPSC od płytki, tworząc od 5 do 10 skupisk komórek.Następnie przenieś zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, aby dodatkowo rozbić duże skupiska komórek; pipetuj w górę i w dół, aż powstaną mniejsze skupiska, jak pokazano tutaj. Następnie rozcieńcz komórki w stosunku 1:12, dodając 11 ml medium E8 z inhibitorem ROCK do 1 ml zawiesiny komórek.Następnie odessać ECMS z wcześniej zakodowanych płytek. Do każdej studzienki dodać dwa mililitry resuspendsowanych komórek; optymalna liczba to około 100 000 komórek na studzienkę w płytce 6-studzienkowej. Należy dążyć do równomiernego rozdzielenia komórek w studzience, aby uniknąć ich gromadzenia się w centrum. Umieścić płytkę w inkubatorze na 24 godziny.Następnego dnia należy wymienić pożywkę na E8 niezawierającą inhibitora ROCK. Pożywkę należy wymieniać co 24 godziny, aż komórki osiągną 80% konfluencji. Zazwyczaj komórki są gotowe do ponownego pasażowania w ciągu trzech do sześciu dni po dysocjacji z użyciem EDTA lub 1× roztworu odrywającego Xcel. W celu dyferencjacji należy wysiać około 100 000 ludzkich hiPSCs na sześciodołkowe płytki hodowlane pokryte ECM.Postępując zgodnie z tymi samymi krokami, które zastosowano w przypadku HI PSCs, gdy komórki osiągną 85% konfluencji, należy zmienić pożywkę na RPMI 1640 B27, medium bez insuliny, lecz z dodatkiem 6 µM inhibitora GSK3β, CHIR99021. Inkubować komórki przez 48 godzin, codziennie badając je pod mikroskopem.Po 24 godzinach traktowania CHIR można zaobserwować znaczną ilość obumarłych komórek. Jest to zjawisko normalne i często występujące po dwóch dniach inkubacji. hPSC zwiększają swoją wielkość oraz liczbę i nadal różnicują się w kierunku mezodermalnym.Zastąp pożywkę hodowlaną zawierającą CHIR pożywką R-P-M-I-B 27 z insuliną i inkubuj do trzeciego dnia. Trzeciego dnia zmień pożywkę na R-P-M-I-B 27 bez insuliny. Dodaj 5 µM inhibitora Wnt IWR-1 i inkubuj komórki przez 48 h.Piątego dnia należy zbadać komórki pod mikroskopem. Komórki mezodermalne powinny być ukierunkowane na linię kardiologiczną i zacząć łączyć się, tworząc charakterystyczne struktury przypominające rozgałęzienia. Należy zmienić pożywkę z powrotem na R-P-M-I-B 27 bez insuliny i inkubować komórki przez 48 godzin.Siódmego dnia wymienić medium na R-P-M-I-B 27 z dodatkiem insuliny. Następnie wymieniać medium na to samo co trzy dni, w tym między ósmym a dziesiątym dniem. Spontaniczne skurcze kardiomiocytów będą widoczne po 10 dniach różnicowania.Ponad 50% obszarów komórkowych wykazuje skurcze. Niemniej jednak, kurczące się arkusze komórek mogą być przemieszane z komórkami niebędącymi kardiomiocytami; w 10. dniu struktury przypominające rozgałęzienia będą bardzo wyraźne. Terminalnie zróżnicowane kardiomiocyty nie będą już proliferować po tym etapie.W 10. dniu po dyferencjacji wymienić medium w każdej studni płytki sześciodołkowej na 2 mL medium z niską zawartością glukozy i utrzymywać komórki w tym medium przez trzy dni, aż do 13. dnia. W 13. dniu przenieść komórki z powrotem do medium R-P-M-I-B 27 z insuliną lub opcjonalnie przeprowadzić reflację komórek, co ułatwia dysocjację niebędących kardiomiocytami komórek podczas głodzenia glukozowego.Odssać medium i przemyć raz roztworem PBS. Dodać 500 µL enzymu do dysocjacji komórek i inkubować komórki przez pięć minut. Po pięciu minutach działania enzymu, użyć pipety P 1000 do ręcznego rozproszenia kardiomiocytów w zawiesinie pojedynczych komórek poprzez pipetowanie w górę i w dół do 30 razy. Po dysocjacji komórek przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.Napełnij probówkę pięcioma mililitrami pożywki R-P-M-I-B 27 z insuliną w celu rozcieńczenia enzymu dysocjującego komórki, a następnie wiruj przez cztery minuty przy 200 Gs. Po wirowaniu odessaj i usuń nadsącz. Następnie zawieś komórki w dwóch mililitrach pożywki R-P-M-I-B 27 i wysiej je na nową płytkę sześciodołkową powleczoną ECMS. Przeżywalność komórek zazwyczaj wzrasta wraz z ich konfluencją, co pozwala na optymalizację przeżywalności komórek.Przesiej 2 milionów komórek na dołek w płytce 6-dołkowej w przypadku komórek, które nie były przesiewane. W 14. dniu zmień pożywkę na 2 ml pożywki o niskiej zawartości glukozy, aby rozpocząć drugi cykl hodowli z deprywacją glukozy. Utrzymuj komórki w tym stanie niskiej zawartości glukozy przez kolejne trzy dni.Większość kardiomiocytów nie będzie przeżywać 17. dnia. Wymień medium na dwa mililitry R-P-M-I-B 27 z insuliną. Pozostałe komórki będą wysoko oczyszczonymi kardiomiocytami.Komórki te można wykorzystać do analizy ekspresji genów, przesiewania leków, analizy metabolicznej oraz różnych innych analiz następczych w celu zbadania czystości kardiomiocytów po różnicowaniu. Aby ocenić czystość komórek po oczyszczaniu metodą głodzenia glukozowego, przeprowadzono barwienie immunologiczne przeciwko markerom kardiomiocytów: troponinie sercowej oraz CTNT. Mikroskopia immunofluorescencyjna nieoczyszczonej populacji zróżnicowanych komórek wykazała, że choć wiele komórek było pozytywnych pod kątem CTNT (zaznaczonych na zielono), wiele z nich nie wykazywało ekspresji CTNT, co sugeruje obecność komórek innych niż kardiomiocyty w 13. dniu. W przeciwieństwie do tego, po trzydniowym głodzeniu glukozowym rozpoczętym w 10. dniu, prawie wszystkie komórki były pozytywne pod kątem CTNT w 13. dniu, co wskazuje na skuteczne oczyszczenie kardiomiocytów w wyniku głodzenia glukozowego.Dane te zostały dodatkowo potwierdzone za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Jak zaznaczono na czerwono, około 50% komórek, które nie zostały poddane głodzeniu glukozowemu, wykazywało pozytywny wynik dla tn NT two. Natomiast 90% komórek poddanych głodzeniu glukozowemu było pozytywnych dla tn NT two.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak różnicować ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste w wysoko oczyszczone populacje kardiomiocytów. Oczyszczone komórki te mogą być wytwarzane w sposób wysokoprzepustowy na potrzeby różnorodnych późniejszych zastosowań in vitro. Podczas hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych należy pamiętać, że przed rozpoczęciem procesu różnicowania nie powinny one osiągnąć stuprocentowej konfluencji.Niektóre linie komórek macierzystych różnicują się najlepiej, gdy początkowa konfluencja pluripotencjalnych komórek macierzystych jest mniejsza niż 85%. Wreszcie, niektóre linie komórek macierzystych mogą reagować szybciej lub gwałtowniej na etap deprywacji glukozy. Zawsze monitoruj te parametry przed rozpoczęciem pracy z nowymi liniami komórek macierzystych.

derivation-highly-purified-cardiomyocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Wyprowadzenie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych komórek pluripotencjalnych metodą różnicowania zmodulowanego małymi cząsteczkami i następczym głodowaniem glukozowym

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy solidny, szybki i skalowalny protokół różnicowania kardiomiocytów dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Kardiomiocyty uzyskane przy użyciu tej metody na dużą skalę mogą zapewnić wystarczającą liczbę komórek do ich skutecznego wykorzystania w modelowaniu chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i potencjalnie zastosowaniach klinicznych.

Produkcja kardiomiocytów na dużą skalę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wysoce powtarzalnego protokołu różnicowania opartego na małych cząsteczkach

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Tutaj opisujemy i sprawdzamy metodę konsekwentnego generowania silnych ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych i charakteryzujemy ich funkcję. Techniki te mogą pomóc w opracowaniu mechanistycznego wglądu w szlaki sygnałowe, zapewnić platformę do badań przesiewowych leków na dużą skalę i niezawodnie modelować choroby serca.

Wytwarzanie podobnych do komór kardiomiocytów pochodzących z HiPSC i wysokiej jakości preparatów komórkowych do charakterystyki obchodzenia się z wapniem

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Ta metoda może być użyta do zbadania skrócenia sarkomeru za pomocą kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych z fluorescencyjnie znakowanymi białkami sarkomerowymi.

Sarkomerowe skracanie pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie białek sarkomerowych.

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek iPSC w kardiomyocyty z wykorzystaniem małych cząsteczek i głodu glukozy. Protokół umożliwia uzyskanie wysoko oczyszczonej populacji komórek sercowych do modelowania chorób układu krążenia i badań przesiewowych leków.

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy (Wideo) | JoVE Journal

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Przeglądaj więcej filmów