Name: Synchronizacja Caulobacter crescentus w celu zbadania cyklu komórkowego bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Naucz się synchronizacji Caulobacter crescentus w celu badania cyklu komórkowego bakterii. Ta metoda izolacji komórek swarmer poprzez różnicową wirówkę gęstościową umożliwia przeprowadzanie badań biochemicznych i mikroskopowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują członkom laboratorium Shapiro i Erin Schrader za komentarze do manuskryptu. Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od: stypendium podoktorskiego NIH F32 GM100732 dla JMS oraz granty NIH R01 GM51426 i R01 GM32506 dla LS.

1. Synchronizacja na dużą skalę - optymalna dla Western Blot, mikromacierzy/sekwencjonowania RNA i innych intensywnych testów materiałowych
<ol>
	<li>Z bulionu zamrażarskiego lub talerza wyhoduj 5 ml kultury O/N szczepu NA1000, wstrząsając w temperaturze 28 °C w pożywce PYE.</li>
	<li>Zaszczepić 0,5 ml komórek z etapu 1 w 25 ml M2G (tabele 1-2) i wstrząsać w temperaturze 28 °C, aż kultura osiągnie OD600 między 0,5 a 0,6.</li>
	<li>Zaszczepić komórki w 1 l M2G i wstrząsnąć w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Gdy OD600 osiągnie 0,5 do 0,6, potwierdź obecność komórek roju za pomocą mikroskopii fazowej zamontowanej w cieczy. Umieścić 1 μl komórek na szkiełku podstawowym, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i zobrazować za pomocą mikroskopii fazowej. Potwierdź obecność komórek roju, wizualizując szybko pływające komórki w populacji.</li>
	<li>Wirować komórki przez 15 minut w temperaturze 7 k x g w temperaturze 4 °C w wirniku JA-10.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad i dodać 180 ml zimnego M2 (tabele 1-2) i delikatnie zawiesić wszystkie komórki za pomocą pipety serologicznej. Wyrzuć luźno granulowane komórki; Są to komórki przedpodziałowe i szypułkowe.</li>
	<li>Dodać 60 ml zimnego roztworu krzemionki koloidalnej (należy dobrze wymieszać zawiesinę krzemionki koloidalnej przed dodaniem do komórek) i dobrze wymieszać zawiesinę komórkową.</li>
	<li>Wlać zawiesinę komórek do ośmiu probówek o pojemności 30 ml i wirować przez 30 minut w temperaturze 6,4 k x g w temperaturze 4 °C w rotorze JA-20. 
	UWAGA: Powinny być widoczne dwa wyraźne pasma; pasmo roju jest dolnym pasmem, podczas gdy komórki szypułkowe/przedpodziałowe znajdują się w górnym paśmie (ryc. 1B).</li>
	<li>Ostrożnie odessać górną opaskę i usunąć płyn do ~1 cm powyżej opaski roju (dolna wstęga).</li>
	<li>(Krytyczne) Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie usuń opaskę roju i umieść ją w czystej probówce. Aby zmyć krzemionkę koloidalną, uzupełnij probówkę zimnym M2 i wiruj przez 10 minut w temperaturze 6,4 k x g w 4 °C w wirniku JA-20.</li>
	<li>Ostrożnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 20 ml zimnego M2 i wirować przez 10 minut w temperaturze 6,4 k x g w temperaturze 4 °C w wirniku JA-20.</li>
	<li>Ponownie zawiesić wszystkie granulki w 30 ml zimnego M2 i zmierzyć OD600 za pomocą spektrofotometru i ślepej próby za pomocą zimnego podłoża M2. Zaoszczędź 1 μl na obrazowanie fazowe, aby sprawdzić, czy nie ma komórek roju; 90-95% komórek powinno być rojami.</li>
	<li>Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 6,4 k x g w temperaturze 4 °C w wirniku JA-20. Ponownie zawieś ogniwa w podłożu M2G o temperaturze 28 °C, tak aby A600 miało temperaturę ~0,3-0,4 i zacznij wstrząsać w temperaturze 28 °C. 
	UWAGA: Typowe plony wynoszą od 30 do 60 ml hodowli komórek roju z 1 litra niezsynchronizowanych komórek.</li>
	<li>Zacznij zbierać punkty czasowe (podział kultury typu dzikiego zajmie około 135-140 minut) 8,9. W każdym punkcie czasowym zmierz średnicę zewnętrzną600. Sprawdź, czy średnica zewnętrzna600 po podzieleniu jest około 2 razy większa od początkowej średnicy zewnętrznej600.</li>
	<li>W przypadku testów western blot lub ekspresji genów należy usunąć 1 ml podwielokrotności kultury w żądanych punktach czasowych, odwirować z maksymalną prędkością w wirówce stołowej przez 30 sekund, szybko zdekantować lub zassać pożywkę i błyskawicznie zamrozić osad komórkowy w ciekłym azocie. Przechowywać komórki w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.</li>
</ol>
2. Synchronizacja na małą skalę – optymalna dla mikroskopii
<ol>
	<li>Z bulionu zamrażarskiego lub talerza wyhoduj 5 ml kultury O/N wytrząsającej w temperaturze 28 °C w M2G.</li>
	<li>Rozcieńczyć w 15 ml M2G (tabele 1-2) i rosnąć do połowy log (OD600 = 0,5-0,6).</li>
	<li>Wirować w temperaturze 6,4 k x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirniku JA-20, ponownie zawiesić w 1 ml zimnego M2 (tabele 1-2) i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Wirować z prędkością 15 k x g przez 3 minuty w probówce do mikrowirówki, aby osad był granulowany, odessać z supernatantu, umieścić osad na lodzie i ponownie zawiesić w 900 μl zimnego M2.</li>
	<li>Dodać 900 μl zimnej krzemionki koloidalnej pokrytej PVP i wirować przez 20 minut w temperaturze 15 k x g w temperaturze 4 °C w probówce mikrowirówkowej.</li>
	<li>(Krytyczne) Odessać lub odpipetować górną grupę komórek szypułkowych/predivisional i zebrać dolną grupę roju do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Umyj komórki roju dwa razy w 1 ml zimnego M2, wirując przy 15 k x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Przed ostatnim wirowaniem przenieś komórki do wstępnie schłodzonej szklanej probówki o pojemności 1 ml i zmierz OD600 komórek w porównaniu z ślepą próbą M2.</li>
	<li>Zawiesić końcową osadkę komórkową w temperaturze 28 °C M2G przy średnicy zewnętrznej między 0,3 – 0,4 i wstrząsnąć/zwinąć komórki w temperaturze 28 °C. 
	UWAGA: Typowe plony wynoszą od 2 do 4 ml hodowli komórek roju.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów mikroskopowych w żądanych punktach czasowych umieść 1 μl komórek na podkładce agarozowej M2G w celu obrazowania.</li>
</ol>

<ol><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+design+of+bacterial+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">System-level design of bacterial cell cycle control.</a> FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+and+conservation+pattern+of+whole-cell+control+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry.</a> J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+cell-cycle+regulatory+network+operating+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space.</a> Science. 301, 1874-1877 (2003).</li>
<li>Ptacin, J. L., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiating+bacterial+mitosis%3A+understanding+the+mechanism+of+ParA-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation.</a> Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).</li>
<li>Evinger, M., Agabian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Envelope-associated+nucleoid+from+Caulobacter+crescentus+stalked+and+swarmer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells.</a> J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).</li>
<li>Tsai, J. W., Alley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+of+the+Caulobacter+McpA+chemoreceptor+is+cell+cycle+regulated+by+a+ClpX-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway.</a> J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).</li>
<li>Marks, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+laboratory+adaptation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus.</a> J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).</li>
<li>Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetics of Caulobacter crescentus.</a> Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).</li>
<li>Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP+and+ClpAP+proteolytic+activity+on+divisome+substrates+is+differentially+regulated+following+the+Caulobacter+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division.</a> Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).</li>
<li>Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+control+of+bacterial+DNA+replication+by+a+cell+cycle+regulatory+protein+that+binds+at+the+chromosome+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).</li>
<li>Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+directly+controlled+by+CtrA%2C+a+master+regulator+of+the+Caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).</li>
<li>Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+an+essential+bacterial+two-component+signal+transduction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein.</a> Cell. 84, 83-93 (1996).</li>
<li>Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+Escherichia+coli+using+the+stringent+response%2C+with+fluorescence+labeling+assays+for+DNA+content+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication.</a> Methods. 48, 8-13 (2009).</li>
<li>Degnen, S. T., Newton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+replication+during+development+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus.</a> J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).</li>
<li>Bates, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+baby+cell+column%3A+a+novel+cell+synchronization+method+provides+new+insight+into+the+bacterial+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle.</a> Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).</li>
<li>Abel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-modal+distribution+of+the+second+messenger+c-di-GMP+controls+cell+fate+and+asymmetry+during+the+caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle.</a> PLoS Genet. 9, e1003744(2013).</li>
<li>Johnson, R. C., Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+spontaneously+derived+mutants+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus.</a> Genetics. 86, 25-32 (1977).</li>
<li>Britos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+response+to+carbon+starvation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus.</a> PLoS One. 6, e18179(2011).</li>
<li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+logic+of+stringent+response+regulation+in+Caulobacter+crescentus%3A+starvation+signalling+in+an+oligotrophic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment.</a> Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Bakteryjny cykl komórkowy jest podstawowym procesem w życiu i jest ważny dla badań nad wzrostem oraz jako cel dla antybiotyków nowej generacji. W tym miejscu szczegółowo opisaliśmy procedury szybkiej synchronizacji dla C. crescentus NA1000, organizmu modelowego do badania cyklu komórkowego bakterii i asymetrycznego podziału komórek. Metoda ta jest modyfikowana do western blot, profilowania ekspresji genów i testów mikroskopii fluorescencyjnej w celu zbadania czasoprzestrzennej regulacji cyklu komórkowego bakter...

Bakteryjny cykl komórkowy kontroluje zarówno replikację genomu, jak i podział komórek potomnych. Co ważne, ponieważ oporność na antybiotyki stanowi coraz większe zagrożenie dla zdrowia publicznego, cykl komórkowy bakterii stanowi niewykorzystany cel dla rozwoju antybiotyków.
U bakterii Caulobacter crescentus każdy cykl komórkowy prowadzi do asymetrycznego podziału, w wyniku którego powstają dwie komórki potomne o różnych losach (Rysunek 1A) 1,2. Jedna komórka potomna dziedziczy wić i jest ruchliwa, podczas gdy druga córka dziedziczy łodygę i jest siedząca. Zintegrowany obwód genetyczny kontroluje progresję cyklu komórkowego i los komórki poprzez regulację transkrypcji, sygnalizację fosfo i regulację proteolizy 3. Ponadto replikacja chromosomów i jednoczesna segregacja dają komórki potomne, które zawierają dokładnie jedną kopię chromosomu 4. Co ważne, te dwa typy komórek można szybko rozdzielić przez wirowanie gęstości cząstek krzemionki koloidalnej w synchronizowalnym szczepie NA1000 5-7, co pozwala na izolację komórek roju od reszty populacji z wysoką wydajnością (Figura 1B). Izolowane komórki roju przechodzą następnie synchronicznie przez asymetryczny podział komórek. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół używany do synchronizacji szczepu Caulobacter NA1000. Udostępniamy protokoły i typowe wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów zarówno dla synchronizacji na dużą, jak i małą skalę. Ta eksperymentalna procedura dostarcza potężnego narzędzia do badania czasoprzestrzennej kontroli cyklu komórkowego Caulobacter i losu komórki.

<table><tbody><tr><td>Krzemionka koloidalna powlekana PVP (percoll)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td></td></tr><tr><td>Krzemionka koloidalna (Ludox AS-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>420840</td><td></td></tr><tr><td>JA10 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>JA20 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>roztwór chelatu siarczanu żelazawego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0518</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 30 ml</td><td>Corning</td><td>8445</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

synchronizacja caulobacter crescentus w celu zbadania cyklu komórkowego bakterii

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Cykl komórkowy jest ważny dla wzrostu, replikacji genomu i rozwoju we wszystkich komórkach. W przypadku bakterii badania cyklu komórkowego koncentrowały się głównie na niezsynchronizowanych komórkach, co utrudnia uporządkowanie zdarzeń czasowych wymaganych do postępu cyklu komórkowego, replikacji i podziału genomu. Caulobacter crescentus stanowi doskonały system modelowy dla bakteryjnego cyklu komórkowego, dzięki któremu komórki mogą być szybko synchronizowane w stanie G0 przez wirowanie gęstości. Eksperymenty z synchronizacją cyklu komórkowego wykorzystano do ustalenia zdarzeń molekularnych rządzących replikacją i segregacją chromosomów, do mapowania genetycznej sieci regulacyjnej kontrolującej postęp cyklu komórkowego oraz do zidentyfikowania ustanowienia biegunowych kompleksów sygnalizacyjnych wymaganych do asymetrycznego podziału komórki. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół szybkiej synchronizacji komórek Caulobacter NA1000. Synchronizację można przeprowadzić w formacie na dużą skalę do profilowania ekspresji genów i testów western blot, a także w formacie na małą skalę do testów mikroskopowych lub FACS. Szybka synchronizacja i wysoka wydajność komórek Caulobacter sprawiają, że organizm ten jest potężnym systemem modelowym do badań cyklu komórkowego bakterii.

Synchronizacja zazwyczaj prowadzi do powstania dwóch pasm komórek (Rysunek 1B): pasma komórek swarmer o wyższej gęstości oraz pasma komórek z łodyżką/predivisional o niższej gęstości. Aby zapewnić efektywną synchronizację, powszechnie stosowane kontrole obejmują monitorowanie OD600 oraz pomiar poziomu białka CtrA metodą western blot w określonych punktach czasowych cyklu komórkowego. Wartość OD600 powinna wzrosnąć około 2-krotnie w trakcie cyklu komórkowego (Rysunek 2</stron...

Synchronizacja komórek bakteryjnych jest niezbędna do badań nad cyklem komórkowym i rozwojem bakterii. Caulobacter crescentus można synchronizować poprzez wirowanie gęstości, co pozwala na szybkie i skuteczne narzędzie do badań cyklu komórkowego bakterii. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół synchronizacji komórek Caulobacter.

Synchronizacja Caulobacter crescentus w celu zbadania cyklu komórkowego bakterii

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja komórek swarmer Coob backer w celu ustanowienia zsynchronizowanej kultury komórkowej. Osiąga się to najpierw poprzez hodowlę mieszanej kultury komórek coob backer, a następnie krótkotrwałe zahamowanie wzrostu poprzez resuspensję komórek w zimnym medium. Drugim krokiem jest oddzielenie komórek swarmer za pomocą różnicowego wirowania gęstościowego.Kolejnym krokiem jest resuspensja komórek rojowych w ciepłym medium, co umożliwia komórkom wejście w cykl komórkowy. Ostatecznie, wyizolowane komórki rojowe mogą być monitorowane przez cały cykl komórkowy przy użyciu testów biochemicznych lub mikroskopii. Główną zaletą tej techniki w stosunku do innych metod, takich jak baby cell machine, jest możliwość szybkiej izolacji komórek i uzyskania ilości wystarczająco dużych do badań biochemicznych.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii komórki, takie jak mechanizmy kontrolujące segregację chromosomów oraz asymetryczny cykl podziału komórkowego. Aby rozpocząć, zaszczep 5 mL medium PYE bakteriami z płytki szczepu colo backer CSIS, NA 1000. Hoduj kulturę przez noc w temperaturze 28 °C przy potrząsaniu; następnego dnia przenieś 0,5 mL kultury nocnej do kolby zawierającej 25 mL medium M two G i potrząsaj kolbą w temperaturze 28 °C, aż kultura osiągnie gęstość optyczną między 0,5 a 0,6.Następnie rozcieńcz kulturę w jednym litrze pożywki M2G, aby uzyskać pożądaną początkową gęstość optyczną, i inkubuj kolbę z wytrząsaniem w temperaturze 28 °C. Gdy gęstość optyczna kultury osiągnie 0.5, nanieś jeden 1 µL kultury na szkiełko i przykryj ciecz szkiełkiem nakrywkowym. Wykonaj obrazowanie komórek za pomocą mikroskopii fazowej, aby potwierdzić obecność szybko pływających komórek swarmowych. Przenieś kulturę do sterylnej probówki wirówkowej, a następnie wiruj komórki z prędkością 7 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.Następnie, podczas odlewania nadsączu, należy usunąć luźny osad komórek i dodać 180 ml zimnego medium M two. Do delikatnego resuspensowania komórek należy użyć pipety serologicznej. Następnie do zawiesiny komórkowej należy dodać 60 ml zimnego roztworu krzemionki koloidalnej i dokładnie wymieszać.Przenieś zawiesinę komórkową do ośmiu probówek o pojemności 30 ml i wiruj je przy 6 400 ×g przez 30 minut. Ustaw temperaturę na 4 °C. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki i sprawdź, czy w probówce widoczne są dwa wyraźne pasma.Dolna warstwa zawiera komórki swarmerów, a komórki przedpodziałowe znajdują się w górnej warstwie. Następnie ostrożnie odessaj górną warstwę oraz ciecz do poziomu około jednego centymetra nad dolną warstwą. Użyj pipety Pasteura, aby usunąć warstwę swarmerów i przenieść ją do czystej probówki.Napełnij probówkę zimnym podłożem M2, a następnie odwiruj ją, aby wypłukać krzemionkę koloidalną. Następnie ostrożnie odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 20 mililitrach zimnego podłoża M2. Ponownie odwiruj zawiesinę, aby uzyskać osad komórkowy, resuspenduj osad w 30 mililitrach zimnego podłoża M2, a następnie zmierz gęstość optyczną zawiesiny.Nanieś jeden µL zawiesiny komórkowej na szkiełko przedmiotowe i za pomocą obrazowania w fazie sprawdź obecność komórek rojących. Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś je w medium M2G do uzyskania gęstości optycznej w zakresie od 0,3 do 0,4. Inkubuj kulturę z wytrząsaniem w temperaturze 28 °C w celu przeprowadzenia analiz western blot lub badań ekspresji genów.Pobieraj alikwoty o objętości 1 mL co 10 do 30 minut przez około 140 minut, aż gęstość optyczna hodowli wzrośnie dwukrotnie. Użyj wirówki stołowej, aby odwirować komórki przez 30 sekund, a następnie szybko odessij nadsącz medium. Zamroź osady komórkowe w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze -80 °C. W celu inokulacji w małej skali dla synchronizacji, zaszczep 5 mL medium M2G komórkami NA1000 i hoduj je przez noc w warunkach wytrząsania w temperaturze 28 °C. Następnego dnia.Rozcieńczyć kulturę w 15 mililitrach pożywki M2G i hodować komórki do momentu, aż gęstość optyczna osiągnie wartość od 0,5 do 0,6. Odwirupować komórki, a następnie zawiesić je ponownie w jednym mililitrze zimnej pożywki M2. Przenieść komórki do probówki do mikrocentryfugi o pojemności dwóch mililitrów, osadzić komórki poprzez wirowanie i odessać nadsącz.Następnie umieść probówkę w lodzie i resuspenduj pellet komórkowy w 900 µL zimnej pożywki M2. Następnie dodaj 900 µL zimnej koloidalnej krzemionki powlekanej PVP i wiruj probówkę przez 20 minut. Ostrożnie odessij górny pas komórek przedpodziałowych, a następnie zbierz dolny pas komórek typu swarmer do nowej probówki do mikrocentryfugi.Przemyć komórki swarmery dwukrotnie w 1 mL zimnego medium M2, wirując przez 3 minuty pomiędzy każdym płukaniem, bezpośrednio przed ostatnim wirowaniem. Przenieść zawiesinę komórkową do schłodzonej wcześniej szklanej probówki o pojemności 1 mL i zmierzyć gęstość optyczną komórek. Następnie przenieść komórki do probówki do mikrowirówki i poddać wirowaniu.Reese, zawieś końcowy osad komórkowy w podgrzanym do odpowiedniej temperatury medium M two G do uzyskania gęstości optycznej między 0,3 a 0,4, a następnie inkubuj komórki z wytrząsaniem w temperaturze 28 °C. W przypadku chęci przeprowadzenia analizy mikroskopowej, nanieś 1 µL hodowli na podkładkę M two G aeros w odpowiednich punktach czasowych. Centryfugacja różnicowa niezsynchronizowanej hodowli pozwala na uzyskanie dwóch pasm komórek.Dolny prążek zawiera komórki swarmer, które charakteryzują się wyższą gęstością, a górny prążek zawiera komórki stokowane i przedpodziałowe, które mają niższą gęstość. Gęstość optyczna kultury wzrasta około dwukrotnie w trakcie cyklu komórkowego. W tym czasie komórki swarmer różnicują się w komórki stokowane, które następnie replikują się i przechodzą asymetryczny podział komórkowy.Ponieważ każdy podział prowadzi do powstania nowej komórki swarmera oraz komórki macierzystej (stocked cell), western blot dla głównego regulatora cyklu komórkowego CTRA stanowi przydatną kontrolę w celu weryfikacji synchronizacji; CTRA blokuje replikację DNA w komórkach swarmera i ulega degradacji podczas replikacji DNA. Następnie CTRA jest syntetyzowane w późniejszej fazie cyklu komórkowego, co zapobiega ponownemu zainicjowaniu replikacji DNA i aktywuje transkrypcję wielu genów rozwojowych. Ten oscylujący wzorzec poziomów białka CTRA świadczy o pomyślnej synchronizacji.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak synchronizować komórki callback lub NA 1000 w celu zbadania cyklu komórkowego bakterii. Ta procedura synchronizacji komórek może zostać przeprowadzona w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby pracować szybko.

synchronization-caulobacter-crescentus-for-investigation-bacterial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Synchronizacja Caulobacter Crescentus w celu badania cyklu komórkowego bakterii

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Opisano projekt syntetycznego operonu kodującego zarówno aparat sekrecyjny, jak i monomery strukturalne włókien curli. Nadprodukcja tych amyloidów i polimerów adhezyjnych pozwala na mierzalny wzrost adhezji chassis E. coli1. Wyjaśniono proste sposoby wizualizacji i kwantyfikacji adhezji.

Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Źródło: Murata, K. i wsp., Wizualizacja zagęszczenia DNA u cyjanobakterii za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje synchroniczną hodowlę cyjanobakterii w cyklach światła i ciemności w celu zbadania regulowanego okołodobowo zagęszczenia DNA. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia skondensowane DNA w określonych punktach czasowych, potwierdzając wyrównanie cyklu komórkowego w całej populacji.

Synchronizacja kultur sinic i zagęszczenie DNA napędzane przez cykle światło-ciemność

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Komórki bakteryjne są przestrzennie wysoce zorganizowane. Aby śledzić tę organizację w czasie w wolno rosnących komórkach Myxococcus xanthus, opracowano zestaw do fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną przez kilka pokoleń. Za pomocą tej metody można było określić czasoprzestrzenną dynamikę białek ważnych dla segregacji chromosomów i podziału komórek.

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Ta praca przedstawia metodę mikroskopową, która umożliwia obrazowanie na żywo pojedynczej komórki Escherichia coli w celu analizy i kwantyfikacji stochastycznego zachowania obwodów syntetycznych genów.

Ciągły pomiar szumu biologicznego u Escherichia coli za pomocą mikroskopii poklatkowej

Wiele bakterii wykorzystuje ruchliwość sterowaną wiciami do poruszania się po swoim środowisku i kolonizowania korzystnego otoczenia, zarówno indywidualnie, jak i zbiorowo. Zademonstrowano tutaj zastosowanie trzech uznanych metod, które wykorzystują ruchliwość jako narzędzie selekcyjne do identyfikacji składników/ścieżek przyczyniających się do pływania i ruchliwości roju.

Badanie ruchliwości sterowanej wiciami u Escherichia coli poprzez zastosowanie trzech ustalonych technik w serii

Trwałość antybiotyku opisuje zdolność małych subpopulacji we wrażliwej populacji izogenicznej do przejściowego tolerowania wysokich dawek antybiotyków bakteriobójczych. Niniejszy protokół łączy podejścia do scharakteryzowania fenotypu trwałości antybiotyku na poziomie molekularnym i komórkowym po wystawieniu Escherichia coli na działanie śmiertelnych dawek ofloksacyny.

Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli

Jednym z wyzwań związanych z analizą eksperymentów z synchronizowanymi szeregami czasowymi jest to, że eksperymenty często różnią się długością powrotu do zdrowia po synchronizacji i okresem cyklu komórkowego. W związku z tym pomiary z różnych eksperymentów nie mogą być analizowane zbiorczo ani łatwo porównywane. W tym miejscu opisujemy metodę dopasowywania eksperymentów, aby umożliwić porównania specyficzne dla fazy.

Wyrównanie zsynchronizowanych danych szeregów czasowych przy użyciu modelu charakteryzowania utraty synchronizacji cyklu komórkowego do porównań między eksperymentami

Naucz się synchronizacji Caulobacter crescentus w celu badania cyklu komórkowego bakterii. Ta metoda izolacji komórek swarmer poprzez różnicową wirówkę gęstościową umożliwia przeprowadzanie badań biochemicznych i mikroskopowych.

Synchronizacja Caulobacter crescentus w celu zbadania cyklu komórkowego bakterii

Przeglądaj więcej filmów