Synchronizacja Caulobacter crescentus w celu zbadania cyklu komórkowego bakterii

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek roju Coob w celu ustanowienia zsynchronizowanej hodowli komórek. Osiąga się to najpierw poprzez wyhodowanie mieszanej kultury komórek podkładowych koobów, a następnie krótkie zatrzymanie wzrostu przez Resus zawieszający komórki w zimnym podłożu. Drugim krokiem jest oddzielenie komórek roju poprzez wirowanie o różnej gęstości.

Następnym krokiem jest ponowne zawieszenie komórek roju w ciepłym podłożu, co pozwala komórkom wejść w cykl komórkowy. Wreszcie, izolowane komórki roju można śledzić przez cały cykl komórkowy za pomocą testów biochemicznych lub mikroskopii. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak maszyna do komórek dziecięcych, jest to, że komórki można szybko wyizolować i zwiększyć ich ilość wystarczającą do badań biochemicznych.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, takie jak to, co kontroluje segregację chromosomów i asymetryczny cykl podziału komórki. Na początek zaszczepij pięć mililitrów pożywki PYE bakteriami z płytki szczepu CSIS o podkładzie colo, NA 1000. Hodować kulturę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza z wytrząsaniem następnego dnia, przenieść 0,5 mililitra kultury przez noc do kolby zawierającej 25 mililitrów pożywki M two G i wstrząsać kolbą w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aż kultura osiągnie gęstość optyczną między 0,5 a 0,6.

Następnie rozcieńczyć kulturę do jednego litra pożywki M two G, aby uzyskać pożądaną początkową gęstość optyczną i wstrząsnąć kolbą w temperaturze 28 stopni Celsjusza, gdy gęstość optyczna kultury osiągnie 0,5 pipety jeden mikrolitr kultury na szkiełku, a następnie przykryć płyn szkiełkiem nakrywkowym. Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopii fazowej, aby potwierdzić obecność szybko pływających komórek roju. Przenieś kulturę do sterylnej probówki wirówkowej, a następnie obracaj komórki w temperaturze 7 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wyrzuć luźno granulowane komórki podczas wylewania supernatantu i dodaj 180 mililitrów zimnego M dwa podłoża. Użyj pipety serologicznej, aby delikatnie zawiesić komórki. Następnie dodaj 60 mililitrów zimnego roztworu krzemionki koloidalnej do zawiesiny komórek i dobrze wymieszaj.

Wlej zawiesinę komórkową do ośmiu 30-mililitrowych probówek i odwiruj je w temperaturze 6 400 razy G przez 30 minut. Ustaw cztery stopnie Celsjusza. Delikatnie wyjmij probówki z wirówki i sprawdź, czy w probówce nie ma dwóch odrębnych pasm.

Dolne pasmo zawiera komórki roju, a komórki przed podziałem znajdują się w górnym paśmie. Następnie ostrożnie zassaj górną wstęgę i płyn do około jednego centymetra powyżej dolnego pasma. Użyj pipety do pasty, aby usunąć pasmo roju i przenieś je do czystej probówki.

Napełnij probówkę zimnym medium M2, a następnie odwiruj probówkę, aby zmyć krzemionkę koloidalną. Następnie ostrożnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 20 mililitrach zimnej wirówki M two medium. Ponownie, aby zagnieździć komórki, ponownie zawieś granulki w 30 mililitrach zimnego podłoża M two, a następnie zmierz gęstość optyczną zawiesiny.

Umieść jeden mikrolitr zawiesiny komórek na szkiełku mikroskopowym i użyj obrazowania fazowego, aby sprawdzić, czy nie ma komórek roju. Następnie odwirować komórki i ponownie zawiesić je w pożywce M two G do gęstości optycznej od 0,3 do 0,4. Inkubuj kulturę, wstrząsając w temperaturze 28 stopni Celsjusza dla zachodnich testów powierzchniowych lub ekspresji genów.

Usuwać podwielokrotności mililitra co 10 do 30 minut przez około 140 minut, aż gęstość optyczna kultury podwoi się. Użyj wirówki stołowej, aby odwirować komórki przez 30 sekund, a następnie szybko zassać pożywkę. Zamroź granulki komórek w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza dla synchronicznej na małą skalę, zaszczep pięć mililitrów pożywki M two G komórkami NA 1000 i hoduj komórki przez noc z wytrząsaniem w temperaturze 28 stopni Celsjusza następnego dnia.

Rozcieńczyć kulturę w 15 mililitrach pożywki M2G i hodować komórki, aż gęstość optyczna wyniesie od 0,5 do 0,6. Odwirować komórki, a następnie ponownie zawiesić je w jednym mililitrze zimnego M dwa podłoża. Przenieś komórki do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej, osadź komórki przez odwirowanie i odessaj sup natant.

Następnie umieść probówkę na lodzie i ponownie zawieś osad komórkowy w 900 mikrolitrach zimnego podłoża M dwa. Następnie dodaj 900 mikrolitrów zimnej krzemionki koloidalnej pokrytej PVP i odwiruj probówkę przez 20 minut. Ostrożnie zaaspiruj górne pasmo komórek przed podziałem, a następnie zbierz dolne pasmo roju do nowej probówki mikrowirówkowej.

Umyj komórki roju dwa razy w jednym mililitrze zimnego podłoża M dwa, wirując przez trzy minuty między każdym myciem tuż przed ostatnim wirowaniem. Umieść zawiesinę komórek we wstępnie schłodzonej szklanej probówce o pojemności jednego mililitra i zmierz gęstość optyczną komórek. Następnie przenieś komórki do mikroprobówki fuge i odwiruj po odwirowaniu.

Reese, zawiesić ostatnią osadkę komórkową w podłożu Prewarm M two G o gęstości optycznej między 0,3 a 0,4 i wstrząsnąć komórkami w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Jeśli pożądana jest mikroskopia, umieść jeden mikrolitr kultury na podkładce aerodynamicznej M two G w odpowiednich punktach czasowych. Wirowanie kultury asynchronicznej o różnej gęstości daje dwa pasma komórek.

Dolne pasmo zawiera komórki roju, które mają większą gęstość, a górne pasmo zawiera komórki zmagazynowane i przed podziałem, które mają mniejszą gęstość. Gęstość optyczna kultury wzrasta około dwukrotnie w trakcie cyklu komórkowego. W tym czasie komórki roju różnicują się w komórki zaopatrzone, a następnie komórki zaopatrzone replikują się i ulegają asymetrycznemu podziałowi komórkowemu.

Przy każdym podziale dającym nową komórkę roju i komórkę rodzicielską, western blot dla głównego regulatora cyklu komórkowego CTRA jest przydatną kontrolą do weryfikacji synchronizacji, CTRA blokuje replikację DNA w komórkach roju i ulega degradacji podczas replikacji DNA. CTRA jest następnie syntetyzowane w późniejszej fazie cyklu komórkowego, zapobiegając ponownej inicjacji replikacji DNA i aktywując transkrypcję wielu genów rozwojowych. Ten oscylacyjny wzorzec poziomów białka CTRA wskazuje na udaną synchronizację.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zsynchronizować komórki wywołania zwrotnego lub NA 1000 w celu zbadania cyklu komórkowego bakterii. Ta procedura synchronizacji komórek może zostać wykonana w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana poprawnie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o szybkiej pracy.