Protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych do badania regulacji wczesnego rozwoju zarodka w modelu rośliny strączkowej Medicago truncatula

Ogólnym celem poniższych procedur jest wykazanie, ile zarodków cargo tula można uzyskać na różnych etapach rozwoju, aby zbadać genetyczną regulację embriogenezy u roślin, można to osiągnąć poprzez powiązanie morfologii strąków z różnymi etapami rozwoju zarodka zygotycznego oraz poprzez hodowlę eksplanu liści w celu uzyskania zarodków somatycznych na różnych etapach. Ostatecznie ilościowa reakcja PCR i beta glukuronidaza mogą być wykorzystane do oceny ekspresji genów podczas embriogenezy na określonych etapach rozwoju. Zaletą tych technik jest to, że znakowanie pojedynczych kwiatów nie jest wymagane w eksperymentach in vivo i są zoptymalizowane procedury in vitro, zapewniają uzupełniające podejścia eksperymentalne.

Wizualna demonstracja procedury hodowli jest ważna, ponieważ pozwala na dokładniejsze śledzenie szczegółów manipulacji. Procedurę in vivo zademonstruje Wang, a procedurę in vitro zademonstruje Kim Nolan. Aby ułatwić rozwój zarodka zygotycznego, przebij powierzchnię okrywy nasiennej nasion z trójokularowej rośliny Monte cargo i namocz nasiona przez noc, całkowicie pokryte wodą.

Następnego dnia zasiej trzy nasiona w każdej z 10 doniczek o średnicy 15 centymetrów w mieszance doniczkowej i przenieś doniczki do szklanego domu. Uprawiaj rośliny pod 14-godzinnym okresem fotograficznym w temperaturze od 23 do 19 stopni Celsjusza w ciągu dnia i nocy, zachowując najzdrowsze sadzonki po wykiełkowaniu, tak aby w doniczce była jedna roślina i otaczając sadzonki kratą, aby łodygi roślin mogły się wspinać, gdy pojawią się strąki. Zbierz na odpowiednich etapach opisanych w tabeli pierwszej i rysunku pierwszym, aby uzyskać pożądane wczesne stadium rozwoju zarodka.

Następnie użyj kleszczy, aby odizolować les od strąków. Alternatywnie, w przypadku bardziej wyrafinowanej mikroskopii, całkowicie przezroczystej w roztworze Hoyera, stadia zarodka można potwierdzić poprzez obrazowanie zarodków pod standardowym mikroskopem złożonym. Następnie należy zebrać liczbę UL wymaganą do eksperymentu z centralnego obszaru kapsuły i przechowywać je w odpowiedniej temperaturze do dalszej analizy w celu rozwoju zarodka somatycznego.

Ulotki do zbioru in vitro z najnowszego, prawie w pełni rozwiniętego liścia tate o wydłużonej łodydze odmiany tran atula, która jest zdolna do łatwego tworzenia zarodków w hodowli. Trzymaj liście tate na wilgotnym ręczniku papierowym w doniczce hodowlanej, aby uniknąć odwodnienia. Następnie, pracując w sterylizowanej promieniami UV komorze bezpieczeństwa biologicznego, umieściłem liście w siatkowej kulce autoklawu zaparzacza do herbaty wiosennej.

Zaparzacz zanurzony w 70% etanolu w autoklawie 250 mililitrowa nakrętka. Doniczka z poliwęglanu po 30 sekundach osusz tkankę liścia, a następnie zanurz zaparzacz w roztworze wybielacza rozcieńczonym od jednego do ośmiu na 10 minut. Od czasu do czasu delikatnie wirując, delikatnie zakręć garnkiem i spuść nadmiar wody.

Następnie opłucz zaparzacz. Jeszcze raz w świeżej wodzie dejonizowanej w nowym doniczce. Teraz użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść liście z zaparzacza do herbaty do świeżej kultury, dzbanek sterylnej dejonizowanej wody destylowanej przykręć sterylną nakrętkę.

Następnie opłucz liście przez odwrócenie i wirowanie. Następnie pozwól ulotkom unosić się na sterylnej wodzie, aby pokryć implanty. Przytnij krawędzie poszczególnych wysterylizowanych listków przy użyciu sterylnej techniki.

Następnie pokrój pozostały prostokąt na dwa lub trzy, osiem do 10 na trzy do pięciu milimetrów prostokątny explan z żyłą środkową pośrodku każdej płytki X explan. Sześć x eksplantaty na agar zestalone podłoże hodowlane o średnicy dziewięciu centymetrów. szalki Petriego z uszczelką ABA skierowaną do dołu, aby zachować zwykłą orientację liści.

Następnie uszczelnij szalki Petriego perfilem i inkubuj płytki w ciemności w temperaturze 28 stopni Celsjusza w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze. Po trzech tygodniach użyj sterylnej szpatułki ze stali nierdzewnej i kleszczyków, aby subkulturować eksplantaty z otworu różnicującego na świeże podłoże. Pierwsze zarodki powinny być obserwowane za około cztery tygodnie, gdy pojawi się modzel, a kalus przekracza rozmiar największego pokazanego tutaj eksplanu.

Przenieś tylko 50% indywidualnego modzela podczas subkultury na świeże podłoże. Na koniec użyj mikroskopu stereoskopowego, aby zebrać różne stadia zarodka w okresie inkubacji od czterech do ośmiu tygodni, przetwarzając eksplantaty zgodnie z celami eksperymentalnymi. Po zebraniu zarodków zygotycznych, jak właśnie wykazano w dół rzeki C, można zastosować hybrydyzację lub inne odpowiednie strategie, które są szczególnie interesujące, jak pokazano na tych obrazach, odrębność SSIS i Spencera można zaobserwować, postępując zgodnie z planami platerowanymi X.

W ciągu czterech do ośmiu tygodni można zlokalizować od czterech do ośmiu zarodków somatycznych w dyskretnych stadiach i pobrać je do natychmiastowej analizy. Na przykład, dane te ilustrują, w jaki sposób zarodki we wczesnym stadium Oleiny wykazują ekspresję jednego typu genu medicago Tula eoin, ale nie innego. Szczególną zaletą somatycznego układu zarodkowego jest to, że transformacja kalusa może być przeprowadzona bez regeneracji całej rośliny.

Rzeczywiście, jak wykazano tutaj. Beta glukuronidaza może być stosowana do wizualizacji ekspresji genów na różnych etapach embriogenezy. Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wybrać i rozłożyć kapsułę, aby uzyskać Andresa.

Powinieneś również dobrze zrozumieć, jak przygotować i płytkę sterylnego planu do embriogenezy somatycznej Po ich rozwoju. Techniki te umożliwiły zbadanie regulacji transkrypcji we wczesnych stadiach embriogenezy w odniesieniu do wzrostu zarodka, rozwoju i przechowywania składników odżywczych.