Name: Protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych do badania regulacji wczesnego rozwoju zarodka w modelu rośliny strączkowej Medicago truncatula (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych u modelowej rośliny strączkowej Medicago truncatula. Metoda umożliwia badanie regulacji genetycznej embriogenezy roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez CEO348212 grantowe Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych oraz Uniwersytet w Newcastle. Doceniamy pomoc dr Sama Zhanga.

1. Rozwój zarodka zygotycznego
<ol>
	<li>Materiał roślinny
	<ol>
		<li>Hoduj dziką odmianę Medicago truncatula Jemalong lub jej prawie izogeniczny, wysoce regenerowalny genotyp Jemalong 2HA13 (znany jako 2HA) w szklarni o 14-godzinnym fotoperiodzie i temperaturze 23 °C/19 °C w dzień / w nocy.
		<ol>
			<li>Przed wysiewem nasion przebić powierzchnię okrywy nasiennej (igłą 23 G) tak, aby woda mogła dostać się do nasion i zanurzyć się w wodzie przez noc. Dodaj tyle wody, aby całkowicie przykryć nasiona.</li>
			<li>Wysiewaj 3 nasiona w każdej doniczce o średnicy 15 cm (łącznie 10 doniczek) w mieszance doniczkowej (gruboziarnisty piasek, perlit, torf kokosowy (1:1:1) plus 5 g Osmocote Exact Standard: nawóz o powolnym uwalnianiu) i przenieś do szklarni. Zachowaj najzdrowszą sadzonkę po wykiełkowaniu, tak aby w doniczce była 1 roślina i otoczona kratą, po której łodygi roślin mogą się wspinać.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór strąków
	<ol>
		<li>Zebrać strąki z dzikiego typu Jemalong lub 2HA, aby uzyskać odpowiednie wczesne stadia zarodka, jak opisano po raz pierwszy9. 
		UWAGA: Różne stadia zarodka są pokazane na rysunku 1, a odpowiadające im stadia zarodka są pokazane na rysunku 2.</li>
		<li>Należy sprawdzić różne etapy strąków podczas zbioru, stosując kryteria zgodnie z tabelą 1. Zmierz czas, jaki upłynął od etapu 6, aby pomóc oddzielić etapy 6 i 7 (tabela 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparowanie zalążków ze strąków i sprawdzenie stadium zarodka
	<ol>
		<li>W razie potrzeby wyizoluj zalążki ze strąków za pomocą samych cienkich kleszczy lub stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego i kleszczy. W razie potrzeby stadium zarodkowe można szybko sprawdzić za pomocą standardowego mikroskopu złożonego (ryc. 3B).</li>
		<li>Przygotować zmodyfikowany roztwór Hoyera zawierający 7,5 g gumy arabskiej, 100 g hydratu chloralu, 5 ml glicerolu, 60 ml dejonizowanej wody destylowanej. Rozpuść mieszając przez 3-5 godzin lub przez noc.</li>
		<li>Aby uzyskać bardziej wyrafinowaną mikroskopię, wyczyść wypreparowane zalążki w zmodyfikowanym roztworze Hoyera15,16. Ostrożnie zebrać nienaruszone zalążki i umieścić w niewielkiej objętości roztworu Hoyera (wystarczającej do pokrycia zalążka) w temperaturze pokojowej, aż będzie klarowna.</li>
		<li>Zobacz próbki z optyką z kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC). Zrób zdjęcia za pomocą cyfrowego aparatu fotograficznego9 (Rysunek 2).</li>
		<li>Uzyskaj najbardziej jednolite zalążki z centralnej części strąka i zgromadź wymaganą liczbę. Przykład pokazano na rysunku 3A. Zebrać zalążki na lodzie i przechowywać w wymaganej temperaturze (-80 °C dla kwasów nukleinowych) do dalszej analizy. 
		UWAGA: Szczegółowe informacje na temat analizy przekrojów histologicznych, transmisyjnej mikroskopii elektronowej i hybrydyzacji in situ znajdują się w artykułach8,9.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Somatyczny rozwój zarodka in vitro
<ol>
	<li>Użyj odmiany M. truncatula, która jest w stanie łatwo tworzyć zarodki w hodowli. Do tego protokołu dla eksplantatów liściowych użyj roślin 2HA13,17, które mają 2-4 miesiące.</li>
	<li>Weź ulotki z najnowszego, prawie w pełni rozwiniętego trójlistkowego liścia o wydłużonej łodydze.</li>
	<li>Trzymaj liście trójlistkowe na wilgotnym ręczniku papierowym w doniczce hodowlanej, aby uniknąć odwodnienia. 
	UWAGA: Po zebraniu trójlistkowych liści należy je zutylizować z minimalnym opóźnieniem.</li>
	<li>Przygotowanie pożywki hodowlanej
	<ol>
		<li>Użyj pożywki P4 10:4:1:5 w agarze (0,8% w:v) na 9 cm szalkach Petriego. 
		UWAGA: Pożywka P4 10:4:1:5 składa się z podłoża bazowego P418 plus 10 μM kwasu 1-naftalenooctowego (NAA), 4 μM 6-benzyloaminopuryny (BAP), 1 μM kwasu abscysynowego (ABA) i 5 μM kwasu giberelinowego (GA). Stosowanie GA + ABA przyspiesza tworzenie się zarodków i powoduje znaczny wzrost liczby zarodków14.</li>
		<li>Uzupełnić podłoże podstawowe P4 w 1 l, składające się z soli głównych (wapnia należy uzupełniać oddzielnie), soli o mniejszym stopniu zawartości i witamin (tabela 3), żelaza schelatowanego (uzupełniać oddzielnie), kazaaminokwasów (hydrolizat kazeiny), 30 g sacharozy, 8 g agaru.</li>
		<li>Roztwory podstawowe soli głównych, wapnia, kasaminokwasów, soli drugorzędnych i witamin przechowywać w temperaturze -20 °C w odpowiednich podwielokrotnościach. Żelazo chelatowane przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Uzupełnić chelatowane żelazo (200x) rozpuszczając 7,44 g Na2EDTA•2H2O w około 900 ml dejonizowanej wody destylowanej, mieszając, następnie doprowadzić roztwór do temperatury 98-99 °C, dodając 1,853 g FeSO4•7H2O. Na koniec uzupełnić do 1 l, gdy składniki się rozpuszczą. Przechowywać w bursztynowych butelkach w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Uzupełnić podłoże podstawowe P4 roztworami podstawowymi, jak w tabeli 4. Hormony w pożywce to 10 μM NAA, 4 μM BAP, 1 μM ABA, 5 μM GA (patrz Tabela 4 i Tabela Specyficznych Materiałów). Dodać NAA i BAP przed autoklawowaniem i dodać ABA i GA po autoklawowaniu i schłodzeniu do około 55 °C, stosując sterylizację filtra z filtrem 0,22 μm dołączonym do strzykawki. Dobrze wymieszaj, delikatnie mieszając.</li>
		<li>Dostosuj pożywkę do pH 5,8 za pomocą 1 M KOH przed autoklawowaniem. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 20 min.</li>
		<li>Po sterylizacji w autoklawie dodać wysterylizowane przez filtr ABA i GA i wlać około 25 ml pożywki do sterylnych 9 cm szalek Petriego w okapie z przepływem laminarnym lub komorze zagrożenia biologicznego. Ostudzić i pozostawić agar ze zdjętą pokrywką. Następnie załóż pokrywkę i upewnij się, że na pokrywie nie ma kondensatu. Oznaczyć zgodnie z wymaganiami i przechowywać w temperaturze 4 °C (w kartonowym pudełku, aby zapobiec kondensacji pokrywki).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sterylizacja tkanek liści
	<ol>
		<li>Pracuj w wysterylizowanym promieniami UV okapie z przepływem laminarnym lub szafie na zagrożenia biologiczne.</li>
		<li>Umieść liście w kulce siatkowej wcześniej autoklawizowanego zaparzacza do herbaty wiosennej.</li>
		<li>Zanurz zaparzacz do herbaty zawierający liście w 70% (v:v) etanolu w doniczku do hodowli na 30 sek. 
		UWAGA: Do wszystkich etapów tej procedury należy używać zakrętek z poliwęglanu o pojemności 250 ml, które są sterylizowane w autoklawie.</li>
		<li>Odcedź, a następnie przenieś i zanurz tkankę liścia w rozcieńczonym w stosunku 1:8 (v:v) wybielaczu (0,5% chloru) na 10 minut. Od czasu do czasu delikatnie mieszaj.</li>
		<li>Odcedź wybielacz i przenieś zaparzacz do herbaty do garnka zawierającego sterylną dejonizowaną wodę destylowaną. Delikatnie zakręć i spuść nadmiar wody. Powtórz jeszcze raz ze świeżym garnkiem hodowlanym sterylnej dejonizowanej wody destylowanej.</li>
		<li>Usuń liście z zaparzacza do herbaty za pomocą sterylnych kleszczyków do świeżego garnka z kulturą ze sterylnej dejonizowanej wody destylowanej. Zakręć sterylną nakrętkę i spłucz, odwracając i obracając. Pozostaw liście unoszące się na sterylnej wodzie, aż będą gotowe do przygotowania eksplantatów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i posiewanie eksplantatów
	<ol>
		<li>Stosując sterylne techniki, przytnij pojedyncze wysterylizowane listki od krawędzi skalpelem, a pozostały prostokąt pokrój na dwa lub trzy prostokątne eksplantaty (8-10 x 3-5 mm) z żyłką środkową pośrodku każdego eksplantatu (ryc. 5A). 
		UWAGA: Wielkość eksplantatu jest bardzo ważna w inicjowaniu pierwszego modzelenia. Wykonaj cięcie na sterylnych pokrywkach z pojemników na żywność na wynos.</li>
		<li>Tabliczka 6 eksplantuje się na zestalonej agarze pożywce hodowlanej na szalkach Petriego o średnicy 9 cm (ryc. 5B). Ułóż eksplantaty akwaisalną stroną do dołu, aby zachować zwykłą orientację liści.</li>
		<li>Uszczelnić szalki Petriego za pomocą Parafilmu (Ryc. 5C) rozciągniętego wokół szalki. Tkanka jest teraz gotowa do inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja tkanek
	<ol>
		<li>Inkubować płytki w ciemności w temperaturze 28 °C w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze lub w komorze wzrostowej przez cały okres hodowli. 
		UWAGA: Eksplantaty zainicjują dedyferencjację, ulegną podziałowi komórek, proliferacji (tworzenie kalusa) i embriogenezie (różnicowaniu).</li>
		<li>Subkulturuj różnicujące eksplantaty po 3 tygodniach na świeże podłoże. W tej subkulturze przenieś cały eksplant za pomocą sterylnej szpatułki ze stali nierdzewnej i kleszczy, w okapie z przepływem laminarnym lub komorze na wypadek zagrożenia biologicznego. W miarę pojawiania się modzeli, a kalus przekracza rozmiar największego z nich na rysunku 5C, przenieś 50% pojedynczego kalusa podczas subkulturowania na świeże podłoże.</li>
		<li>Obserwuj pierwsze zarodki za około 4 tygodnie. Chociaż istnieje pewien stopień synchronizacji, należy zebrać różne stadia zarodka w ciągu 4-8 tygodniowego okresu inkubacji (ryc. 6A, B). Zbierz pod mikroskopem preparacyjnym i przetwarzaj zgodnie z celami eksperymentalnymi.</li>
		<li>Subkulturuj co 3 tygodnie i okresowo usuwaj zarodki, aby eksplantaty nadal produkowały zarodki przez 3 miesiące.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li>
<li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legumes%3A+importance+and+constraints+to+greater+use%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li>
<li>Young, N. D., Udvardi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Medicago+truncatula+genomics+to+crop+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insights+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li>
<li>Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+Medicago+truncatula+seed+development+establishes+the+time+frame+of+diverse+metabolic+processes+related+to+reserve+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation.</a> Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).</li>
<li>Verdier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+M.+truncatula+transcription+factors+identifies+putative+regulators+of+grain+legume+seed+filling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling.</a> Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li>
<li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li>
<li>Wang, X. -D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies%3A+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li>
<li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li>
<li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Botany%22%5BJournal%5D)">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li>
<li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+regulation+of+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs.</a> Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).</li>
<li>Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slicing+across+kingdoms%3A+regeneration+in+plants+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals.</a> Cell. 132 (4), 697-710 (2008).</li>
<li>Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li>
<li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis%2C+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908(2014).</li>
<li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li>
<li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+%28SERK1%29+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li>
<li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIantcheva%2C+A+%22The+Medicago+truncatula+handbook%22">The Medicago truncatula handbook</a>. Mathesius, U. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.noble.org/MedicagoHandbook">http://www.noble.org/MedicagoHandbook</a> (2006).</li>
<li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+interspecific+somatic+hybrids+of+Medicago+by+using+Agrobacterium+transformed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues.</a> Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).</li>
<li>Ochatt, S. J. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOchatt%2C+SJ+%22Plant+Embryo+Culture%3A+Methodsand+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22">Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology</a>. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Springer protocols, Humana press. 39-52 (2011).</li>
<li>Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Opisane protokoły są stosunkowo proste i pozwalają na badanie embriogenezy roślin strączkowych za pomocą wszystkich współczesnych technik komórkowych i molekularnych. Zdajemy sobie sprawę, że zarówno metody in vivo , jak i in vitro mają swoje zalety i wady. Oba pozwalają bardziej skupić się na wczesnej embriogenezie w porównaniu z hodowlą niedojrzałych nasion19.
W przypadku badań in vivo opisuje się głównie izolację zalążka ze strąka, co nadaje się do wiel...

Rośliny strączkowe to trzecia co do wielkości rodzina roślin wyższych z około 20 000 gatunków, a rodzina Leguminosae (lub Fabaceae) zajmuje drugie miejsce po zbożach pod względem powierzchni zbiorów i całkowitej produkcji1. Soja jest trzecią co do wielkości uprawą roślinną. Rośliny strączkowe dostarczają około jednej trzeciej białka w diecie i jednej trzeciej oleju roślinnego przeznaczonego do spożycia przez ludzi2. Rośliny strączkowe ze swoją zdolnością wiązania azotu2 również przyczyniają się do zrównoważonych systemów rolniczych. Medicago truncatula, podobnie jak soja, magazynuje białko i olej w liścieniach swoich nasion i jest genetycznym i genomowym modelem roślin strączkowych o znacznych zasobach genetycznych i genomicznych3,4. Podczas gdy M. truncatula umożliwiła postępy w zrozumieniu symbiozy roślin strączkowych i rhizobium4, jest ona coraz częściej wykorzystywana do badania biologii nasion roślin strączkowych5-7 i embriogenezy8,9. Embriogeneza rzodkiewnika była szeroko badana10,11, ale nie jest to roślina strączkowa, a szczegóły embriogenezy nie są identyczne jak w przypadku Medicago8,10. Embriogeneza zygotyczna u M. truncatula ma interesujące cechy, z charakterystyczną wielokomórkową przysadką mózgową, endoployploidalnym suspensorem i podstawową komórką transferową8.
Embriogeneza somatyczna (SE) jest powszechnie stosowana do regeneracji roślin12. W modelu roślin strączkowych M. truncatula, linia nasienna Jemalong 2HA (2HA) została rozwinięta z rodzica Jemalong w celu uzyskania wysokich wskaźników embriogenezy somatycznej13. Liczba produkowanych zarodków została ostatnio znacznie zwiększona poprzez dodanie zarówno kwasu giberelinowego (GA), jak i kwasu abscysynowego (ABA) do dawno ustalonej pożywki14. W tym przypadku GA i ABA działają synergistycznie, co jest niezwykłe, biorąc pod uwagę, że GA i ABA zwykle działająantagonistycznie14. Zarodki wytworzone z kalusa rozwijają się na powierzchni, co pozwala na łatwe wizualne określenie etapu embriogenezy i łatwe pobranie. Posiadanie linii blisko izogenicznych, które są embriogenne (2HA) i nieembriogenne (Jemalong), ułatwia badanie embriogenezy somatycznej, a posiadanie systemów zarówno in vivo, jak i in vitro zapewnia różne możliwości eksperymentalne.
Zrozumienie komórkowych i molekularnych mechanizmów rozwoju zarodków jest niezbędne do zrozumienia rozwoju nasion i roślin. W roślinach strączkowych, podobnie jak w innych roślinach dwuliściennych, to liścienie zarodka przechowują produkty używane do żywienia człowieka. Wczesna embriogeneza obejmuje szybki podział komórek i prawidłowe tworzenie wzorów zarodków. Po około 8 dniach od zapłodnienia zarodek M. truncatula osiąga wczesne stadium liścienia. Charakterystyka morfologiczna nie jest dokładnie wskazywana przez dni po zapłodnieniu w warunkach szklarniowych. W związku z tym skuteczne ustandaryzowane podejście do wskazywania etapu rozwoju zarodków jest cenne w badaniu genetycznej regulacji wczesnej embriogenezy zygotycznej.
W tym artykule przedstawiamy dwa standardowe protokoły pobierania rozwijających się zarodków do biologicznych badań embriogenezy w modelu M. truncatula. Pierwszym z nich jest zbieranie zarodków zygotycznych poprzez powiązanie embriogenezy i morfologii strąków, podczas gdy drugim jest embriogeneza somatyczna poprzez hodowlę eksplantatów liści w celu zapewnienia łatwo dostępnej dużej liczby zarodków.

<table><tbody><tr><td>P4 podłoże</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Użyj Sigma-Aldrich Chemicals lub innego dostawcy klasy analitycznej</td></tr><tr><td>Sole</td><td></td><td></td><td></td>główne</tr><tr><td>Sole drugorzędne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Witaminy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bacto Laboratories</td><td>214010</td><td>Agar Bacto</td></tr><tr><td>Hormony roślinne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1- Kwas naftalenooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>Rozpuścić w niewielkiej ilości 1 M NaOH</td></tr><tr><td>Kwas abscysynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td>Rozpuścić w niewielkiej ilości 1 M NaOH</td></tr><tr><td>6-Benzylaminopuryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3274</td><td>Rozpuścić w wodzie MQ z ogrzewaniem i kilkoma kroplami 1N HCl</td></tr><tr><td>Kwas giberelinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7645</td><td>Rozpuścić w niewielkiej ilości etanolu</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>Lub podobny</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Zeiss</td><td>Axiophot</td><td>Lub podobny, z odpowiednią optyką</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam HRc</td><td>Lub podobny</td></tr><tr><td>Liście</td><td></td><td></td><td></td>sterylizujące</tr><tr><td>250 ml zakrętka pojemnik z poliwęglanu z pokrywką polipropylenową</td><td>SARSTEDT</td><td>75.9922.519</td> Można <td>sterylizować w autoklawie</td></tr></tbody></table>

protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych do badania regulacji wczesnego rozwoju zarodka w modelu rośliny strączkowej medicago truncatula

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Wczesna embriogeneza zaczynająca się od pojedynczej komórki zygoty przechodzi przez szybki podział i morfogenezę komórki, a morfologicznie charakteryzuje się stadiami przedglobularnymi, kulistymi, sercowymi, torpedowymi i liścieniowymi. Ten postępujący rozwój odbywa się pod ścisłą regulacją złożonej sieci molekularnej. Zebranie wystarczającej liczby wczesnych zarodków na podobnym etapie rozwoju jest niezbędne do zbadania komórkowej i molekularnej regulacji wczesnej embriogenezy. Nie jest to proste, ponieważ wczesna embriogeneza ulega szybkiej morfogenezie w krótkim czasie, np. w ciągu 8 dni, aby Medicago truncatula osiągnęła wczesne stadium liścienia. W tym miejscu zajmiemy się tą kwestią na dwa sposoby. Pierwsza z nich ustanawia związek między rozwojem zarodka a morfologią strąków, pomagając wskazać stadium zarodka zygotycznego. Jest to szczególnie oparte na liczbie spiral strąków i rozwoju kolców. Alternatywnym sposobem uzupełnienia badań in vivo jest hodowla eksplantatów liści w celu wytworzenia zarodków somatycznych. Pożywka zawiera niezwykłą kombinację hormonów - auksynę (kwas 1-naftalenooctowy), cytokininę (6-benzyloaminopurynę), kwas abscysynowy i kwas giberelinowy. Można dostrzec różne etapy wyrastania z kalusa bez rozwarstwienia.

W przypadku embriogenezy zygotycznej różne struktury strąków odpowiadające poszczególnym stadiom rozwoju embrionu przedstawiono na Ryc. 1A-F, natomiast poszczególne stadia rozwoju embrionu pokazano na Ryc. 2A-F. Poprzez wybór strąków w tym samym stadium można uzyskać bardzo jednorodne próbki zalążków (Ryc. 3A). Dzięki zastosowaniu RT-qPCR można łatwo wykryć geny specyficzne dla embrionu i przeprowadzić badania przebiegu czasowego9</...

Celem jest zilustrowanie, że modelowa roślina strączkowa Medicago truncatula może być łatwo wykorzystana do zbadania regulacji wczesnej embriogenezy roślin, aby uzupełnić model rzodkiewnika nie-strączkowego. Morfologia strąków jest powiązana z etapami embriogenezy zygotycznej, a także opracowano protokół pobierania zarodków za pomocą hodowli tkankowej.

Protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych do badania regulacji wczesnego rozwoju zarodka w modelu rośliny strączkowej Medicago truncatula

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Ogólnym celem poniższych procedur jest wykazanie, ile embrionów cargo tula można uzyskać na różnych etapach rozwoju w celu zbadania regulacji genetycznej embriogenezy u roślin; można to osiągnąć poprzez powiązanie morfologii strąka z różnymi etapami rozwoju embrionu zygotycznego oraz poprzez hodowlę eksplantatów liści w celu uzyskania embrionów somatycznych na różnych etapach. W ostateczności można zastosować ilościową PCR oraz beta-glukuronidazę, aby ocenić ekspresję genów podczas embriogenezy na konkretnych, interesujących badacza etapach rozwoju. Zaletą tych technik jest to, że w eksperymentach in vivo nie jest wymagane znakowanie poszczególnych kwiatów, a zoptymalizowane procedury in vitro zapewniają komplementarne podejścia eksperymentalne.Wizualna prezentacja procedury hodowli jest istotna, ponieważ pozwala na dokładniejsze śledzenie szczegółów przeprowadzanych manipulacji. Procedurę in vivo zademonstruje ing Wang, natomiast procedurę in vitro zaprezentuje Kim Nolan. Aby ułatwić rozwój embrionów zygotycznych, należy przebić powierzchnię łupin nasion rośliny Monte cargo trinocular i namoczyć nasiona przez noc, całkowicie zakrywając je wodą.Następnego dnia wysiej po trzy nasiona do każdej z 10 doniczek o średnicy 15 centymetrów wypełnionych mieszanką do doniczek i przenieś doniczki do szklarni. Hoduj rośliny w cyklu fotoperiodu 14 godzin przy temperaturze dzień-noc od 23 do 19 stopni Celsius, pozostawiając po kiełkowaniu najzdrowsze siewki tak, aby w każdej doniczce znajdowała się jedna roślina, i otocz siewki kratownicą, po której będą piąć się łodygi roślin po pojawieniu się strąków. Zbiory przeprowadź w odpowiednich etapach opisanych w tabeli 1 i na rysunku 1, aby uzyskać pożądany stopień wczesnego rozwoju zarodka.Następnie za pomocą pęsety oddziel okrywy nasienne od strąków. Alternatywnie, w celu uzyskania dokładniejszych obrazów mikroskopowych, można przeprowadzić pełne przejaśnianie w roztworze Hoyera, a stadia rozwoju zarodka potwierdzić poprzez obrazowanie pod standardowym mikroskopem świetlnym. Następnie pobierz z centralnej części strąka odpowiednią liczbę UL wymaganą do eksperymentu i przechowuj je w odpowiedniej temperaturze do dalszych analiz rozwoju embrionów somatycznych.W warunkach in vitro pobierz listki z najmłodszego, niemal w pełni rozwiniętego liścia tate z wydłużającego się pędu odmiany tran atula, która wykazuje łatwą zdolność do tworzenia embrionów w kulturze. Przechowuj liście tate na wilgotnym ręczniku papierowym w naczyniu hodowlanym, aby zapobiec ich odwodnieniu. Następnie, pracując w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza z lampą UV, umieść liście w siateczkowej kuli autoklawowalnego zaparzacza do herbaty z blaszką sprężynującą.Zanurz infuzor w 70% etanolu w autoklawowanej probówce z nakrętką o pojemności 250 ml. Po 30 sekundach odlej tkankę liściową z poliwęglanowej doniczki do kultur, a następnie zanurz infuzor w ośmiokrotnie rozcieńczonym roztworze wybielacza na 10 minut. Delikatnie zakręć doniczką, wykonując co jakiś czas łagodne ruchy okrężne, a następnie odlej nadmiar wody.Następnie wypłucz zaparzacz. Powtórz tę czynność w świeżej wodzie dejonizowanej w nowym naczyniu. Teraz za pomocą sterylnej pęsety przenieś liście z zaparzacza do nowej hodowli w naczyniu ze sterylną destylowaną wodą dejonizowaną i zakręć sterylną zakrętką.Następnie wypłucz liście, odwracając je i delikatnie potrząsając. Pozostaw listki do swobodnego unoszenia się na wodzie sterylnej w celu przeniesienia implantów na pożywkę. Przycięte brzegi poszczególnych wysterylizowanych listków opracuj z zachowaniem zasad aseptyki.Następnie pozostały prostokąt należy pociąć na dwa lub trzy prostokątne eksplanty o wymiarach 8–10 na 3–5 mm, tak aby żyłka środkowa znajdowała się w centrum każdego z nich. Sześć eksplantów umieszcza się w szalkach Petriego o średnicy 9 cm z utwardzonym agarem jako podłożem hodowlanym z ABA, kładąc je stroną przyciętą do dołu, aby zachować naturalną orientację liścia.Następnie szczelnie zamknąć szalki Petriego za pomocą Parafilmu i inkubować płytki w ciemności w temperaturze 28°C w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze. Po trzech tygodniach, używając sterylnej szpatułki ze stali nierdzewnej i pincety, przenieść różnicujące się eksplanty do subkultury na świeżą pożywkę. Pierwsze embriony powinny być widoczne po około czterech tygodniach w miarę powstawania kalusa i gdy kalus przekroczy rozmiar największego eksplantu pokazanego tutaj.Podczas pasażowania na świeże podłoże przenieś tylko 50% pojedynczego kalusa. Na koniec użyj stereomikroskopu, aby zebrać zarodki na różnych etapach rozwoju w okresie inkubacji od czterech do ośmiu tygodni, przetwarzając eksplantaty zgodnie z celami doświadczenia. Po zbiorze zarodków zygotycznych, zgodnie z zaprezentowaną procedurą, w dalszej kolejności można zastosować hybrydyzację C2 lub inne odpowiednie strategie. Szczególnie interesujące, jak pokazano na tych obrazach, jest to, że różnice między SSIS a Spencerem można zaobserwować, śledząc wysiane eksplantaty.Od czwartego do ósmego tygodnia można zlokalizować i pobrać zarodki somatyczne na poszczególnych etapach rozwoju do natychmiastowej analizy. Na przykład powyższe dane ilustrują, jak zarodki we wczesnym stadium Olein wykazują ekspresję jednego typu genu medicago Tula eoin, ale nie drugiego. Szczególną zaletą systemu zarodków somatycznych jest to, że transformację kalusa można przeprowadzić bez konieczności regeneracji całej rośliny.Rzeczywiście, jak wykazano w niniejszym materiale, beta-glukuronidazę można wykorzystać do wizualizacji ekspresji genów na różnych etapach embriogenezy. Po obejrzeniu filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat sposobu wyboru i preparowania zarodków w celu uzyskania odpowiednich próbek.Należy również posiadać dobrą wiedzę na temat przygotowania i wysiewania sterylnych eksplantatów do embriogenezy somatycznej po ich wykształceniu. Techniki te umożliwiły badanie regulacji transkrypcji wczesnych etapów embriogenezy w odniesieniu do wzrostu, rozwoju embrionów oraz gromadzenia substancji odżywczych.

protocols-for-obtaining-zygotic-somatic-embryos-for-studying

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Protokoły uzyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych do badania regulacji wczesnego rozwoju zarodków w modelowej roślinie strączkowej Medicago truncatula

Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.

Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana

Zięba zebry (Taeniopygiaguttata) jest cennym organizmem modelowym; jednak wczesne etapy rozwoju zeberki nie zostały dokładnie zbadane. Protokół opisuje, w jaki sposób przeprowadzać preparację wczesnych zarodków do zastosowań rozwojowych i molekularnych.

Sekcja i dalsza analiza zarodków zięby zeberki we wczesnych stadiach rozwoju

Metody tworzenia morfujących zarodków są niezbędne do badania mechanizmów rozwojowych i sieci regulacji genów.  Gwiazda morska Patiria miniata jest wyłaniającym się systemem modelowym dla tych badań.  W tym miejscu przedstawiamy protokół pozyskiwania gamet, produkcji kultur zarodków oraz szybkiej mikroiniekcji zygot tego gatunku.

Metoda mikroiniekcji zygot Patiria minata

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

Ten manuskrypt opisuje metodę hodowli jajników in vitro, która umożliwia obrazowanie żywych komórek zygot i zarodków Arabidopsis. Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji dynamiki wewnątrzkomórkowej podczas polaryzacji zygoty i specyfikacji losu komórki w rozwijających się zarodkach.

In vitro Hodowla zalążków do obrazowania żywymi komórkami polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana

Geny morfogeniczne roślin mogą być wykorzystane do poprawy genetycznej transformacji opornych genotypów. Opisano tutaj protokół transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium (QuickCorn) dla trzech ważnych publicznych linii wsobnych kukurydzy.

Transformacja niedojrzałych zarodków opornych linii wsobnych kukurydzy za pośrednictwem Agrobacterium przy użyciu genów morfogennych

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Opisujemy metody wizualizacji początkowej transkrypcji podczas aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach we wczesnej embriogenezie.

Wizualizacja aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków

Opisujemy metodę fizycznego zwężania do tworzenia mini embrionów z zarodków Xenopus laevis o jednokomórkowej liczbie komórek.

Manipulacja fizyczna w celu generowania mini embrionów Xenopusa

Poznaj protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych u modelowej rośliny strączkowej Medicago truncatula. Metoda umożliwia badanie regulacji genetycznej embriogenezy roślin.

Protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych do badania regulacji wczesnego rozwoju zarodka w modelu rośliny strączkowej Medicago truncatula (Wideo) | JoVE Journal

Protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych do badania regulacji wczesnego rozwoju zarodka w modelu rośliny strączkowej Medicago truncatula

Przeglądaj więcej filmów