Prosta i niedroga metoda określania wrażliwości na zimno i adaptacji u myszy

Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie reakcji myszy na zimno. Osiąga się to poprzez uprzednie schłodzenie lub podgrzanie szkła do żądanej temperatury. Drugim krokiem jest zaaklimatyzowanie myszy do momentu spoczynku.

Trzecim krokiem jest sprasowanie suchego lodu w proszku w granulkę w strzykawce. Ostatnim krokiem jest przetestowanie myszy za pomocą granulek suchego lodu i stopera w celu zmierzenia opóźnienia odstawienia. Ostatecznie test sadzarki na zimno służy do pomiaru reakcji na zimno i adaptacji u swobodnie zachowujących się myszy.

Główną przewagą naszego testu nad obecnie istniejącymi testami, takimi jak test acetonowy i test zimnej płyty, jest to, że możemy testować zarówno nadwrażliwość, jak i analgezję na początku badania w różnych warunkach środowiskowych. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w reakcję myszy na zimno. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak małpa i szczur oraz ludzie. Procedurę zademonstruje Daniel Brenner, doktorant w moim laboratorium.

Po oczyszczeniu szklanej powierzchni przymocuj sondę termopary z żarnikiem typu T do powierzchni pośrodku szklanej płytki za pomocą taśmy laboratoryjnej. Umieść pomieszczenia dla zwierząt na szklanej płycie w jednej linii wzdłuż środka. Następnie przeciągnij sondę termopary przez centralną obudowę dla zwierząt i podłącz ją do rejestratora danych.

Włącz rejestrator danych i wyłącz funkcję automatycznego wyłączania. Podłącz rejestrator danych do komputera za pomocą dostarczonego. Oddziel pomieszczenia dla zwierząt czarnymi wkładkami, aby zapobiec interakcjom wizualnym między myszami, i umieść lustra pod szkłem, aby umożliwić view spód pomieszczeń.

Aby rozpocząć badanie, umieść aluminiowe pudełka na szklanej płycie po obu stronach zwierzęcia, wybiegi w ustalonej odległości. W przypadku testowania w temperaturze 30 stopni Celsjusza podłącz podgrzane cyrkulatory wodne do aluminiowych skrzynek umieszczonych w odległości 0.25 cala od wybiegu dla zwierząt. Napełnij pudełka wodą do połowy pełną, podczas gdy otwory odpływowe są zatkane.

Ustawić cyrkulatory w taki sposób, aby gorąca woda z aluminiowych skrzynek spływała bezpośrednio z powrotem do zbiornika cyrkulatora z każdej strony. Będziesz musiał dodać wodę do każdej pompy cyrkulacyjnej. Po napełnieniu metalowych skrzynek ustaw cyrkulatory na 45 do 60 stopni Celsjusza i napełnij aluminiowe pojemniki stałym strumieniem gorącej wody.

Gdy okulary osiągną żądany zakres temperatur, umieść myszy w obudowach na płycie. Pozwól myszom przyzwyczaić się do aparatu i temperatury. Myszy te aklimatyzują się przez 2,5 godziny.

Gdy zbliżasz się do końca okresu aklimatyzacji, napełnij wiadro z lodem mniej więcej do połowy suchym lodem i za pomocą młotka lub młotka rozdrobnij suchy lód na proszek. Zrób to poza pokojem behawioralnym, aby nie przeszkadzać myszom. Następnie użyj żyletki lub nożyczek, aby odciąć górną część trzymililitrowej strzykawki.

Następnie użyj igły o rozmiarze 21, aby przebić dwa zestawy po trzy otwory po przeciwnych stronach strzykawki, aby zmniejszyć ciśnienie generowane przez sublimację, jednocześnie ściskając suchy lód z powrotem w pomieszczeniu behawioralnym, napełnij komorę strzykawki do połowy suchym lodem w proszku. Przytrzymać odcięty koniec strzykawki przy płaskim przedmiocie i mocno ścisnąć proszek za pomocą tłoka. Wysunąć końcówkę palety sprasowanego suchego lodu poza krawędź strzykawki.

Teraz przetestuj te myszy, które mają wszystkie cztery łapy w szklance i nie poruszają się, ale nie śpią całkowicie. Używając lusterek do delikatnego, ale zdecydowanego celowania, dociśnij płaską kulkę równo z szklaną powierzchnią pod tylną łapą myszy. Jednocześnie naciśnij start na timerze.

Gdy mysz odsunie się od schłodzonej szyby, w pionie lub poziomie, zatrzymaj minutnik i usuń granulki suchego lodu. Jeśli jednak mysz bardzo krótko poruszy łapą, a następnie zwróci ją na powierzchnię chłodzącą, kontynuuj odmierzanie czasu i stymulację, aż mysz wykona trwały ruch. Jeśli mysz nie odsunie się od schłodzonej szyby, zatrzymaj bodziec po 20 sekundach.

Powtarzaj tę procedurę testową, aż zostaną zebrane co najmniej trzy wartości na każdej łapie zwierzęcia, aby przetestować myszy w temperaturze 17 stopni Celsjusza. Powtórz eksperyment, jak pokazano, ale zamiast napełniać aluminiowe pudełka podgrzaną wodą, użyj mokrego lodu i umieść pudełka w odległości około 0,25 cala od obudów, aby przetestować myszy. W temperaturze 12 stopni Celsjusza używany jest suchy lód, ale pudełka są umieszczone w odległości 1,25 cala od obudów.

Ten alternatywny protokół testuje myszy, gdy temperatura płytki spada, a nie po jej ustabilizowaniu. To pozwala nam przetestować adaptację myszy w trakcie jej trwania po ustawieniu aparatury. Tak jak poprzednio, wykonaj eksperyment zgodnie z wcześniejszymi opisami, aby wykonać pomiary w temperaturze pokojowej.

Po zmierzeniu opóźnień linii bazowej w temperaturze pokojowej. Korzystając z wcześniej pokazanej procedury, napełnij puste aluminiowe pudełka suchym lodem i umieść je 1.25 cala od obudów po obu stronach. Na koniec powtórz eksperyment, aby wykonać pomiary opóźnienia, gdy szklana płytka stygnie.

Wykonywanie pomiarów tak często, jak to możliwe. Ten wykres pokazuje średnie opóźnienie odstawienia dla myszy zaczynające się od 12 stopni Celsjusza, 17 stopni Celsjusza, 23 stopni Celsjusza lub 30 stopni Celsjusza. Opóźnienia wypłat są spójne we wszystkich temperaturach.

Efekty przeciwbólowe można zmierzyć za pomocą testu sadzarki na zimno, jak pokazano tutaj. Podskórne wstrzyknięcie 1,5 miligrama na kilogram morfiny zwiększa opóźnienie odstawienia myszy 30 minut po wstrzyknięciu, mierzone za pomocą dwukierunkowego testu post-hoc Innova z Bonferroni 60 minut po wstrzyknięciu. Nie ma istotnej różnicy między morfiną wstrzykiwaną a wstrzykiwaną solą fizjologiczną.

Można tu również zmierzyć nadwrażliwość myszy. Wstrzyknięcie do sadzarki 10 mikrolitrów kompletnego adiuwantu fros znacznie zmniejsza opóźnienie odstawienia myszy dwie i trzy godziny po wstrzyknięciu, mierzone za pomocą dwukierunkowego testu post-hoc Innova z bonferroni. Tym samym myszom podawano podskórne zastrzyki morfiny po czterech godzinach, a wszystkie opóźnienia odstawienia po 4,5 godziny były znacznie wyższe w porównaniu z trzema godzinami, mierzonymi za pomocą jednokierunkowego testu Innova z wykonanym testem post hoc.

Gdy morfina została zmetabolizowana w 5,5 godziny po wstrzyknięciu, myszy, którym wstrzyknięto CFA, nadal miały niższe opóźnienia odstawienia niż myszy, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, mierzoną dwukierunkowym testem post-hoc inova z Bonferroni. Za pomocą tego testu można zmierzyć adaptację do zmian środowiska chłodzącego w czasie rzeczywistym. Myszy typu dzikiego mają takie samo opóźnienie odstawienia, gdy szklana płytka ochładza się, co sugeruje, że przystosowują się do temperatur chłodzenia szybciej niż można to zmierzyć za pomocą CPA, który nie miał znaczących różnic między żadnymi grupami.

Jednakże, gdy myszom wstrzyknięto U 7 3 1 2 2 w celu zablokowania hydrolizy dwa, ich opóźnienie zmniejsza się wraz ze spadkiem temperatury płytki, co sugeruje upośledzoną adaptację Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu pięciu godzin, w tym czas aklimatyzacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć odczuwanie zimna i adaptację u obudzonych, swobodnie zachowujących się myszy. Nie zapominaj, że praca z suchym lodem może być wyjątkowo niebezpieczna i że podczas tej metody musisz zapewnić odpowiednią wentylację i odstęp powietrza.