Prosta i niedroga metoda określania wrażliwości na zimno i adaptacji u myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar reakcji myszy na zimno. Osiąga się to poprzez wstępne schłodzenie lub ogrzanie szkła do pożądanej temperatury. Drugim krokiem jest aklimatyzacja myszy aż do momentu, gdy znajdą się one w spoczynku.

Trzecim krokiem jest sprasowanie proszku z suchego lodu w granulkę w strzykawce. Ostatnim etapem jest przetestowanie myszy przy użyciu granulki z suchego lodu oraz stopera w celu pomiaru czasu latencji wycofania. Ostatecznie test zimnej płytki służy do pomiaru reaktywności na zimno oraz adaptacji u myszy w warunkach swobodnego zachowania.

Główną zaletą naszego testu w porównaniu z obecnie stosowanymi metodami, takimi jak test acetonowy i test zimnej płyty, jest możliwość badania zarówno nadwrażliwości, jak i analgezji w stanie spoczynkowym w różnych warunkach środowiskowych. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w reakcję myszy na zimno, może być ona również stosowana w innych układach, takich jak małpy, szczury oraz ludzie. Procedurę zademonstruje Daniel Brenner, doktorant w moim laboratorium.

Po oczyszczeniu szklanej powierzchni przymocuj sondę termopary typu T do środka szklanej płyty za pomocą taśmy laboratoryjnej. Ustaw klatki dla zwierząt na szklanej płycie w jednej linii wzdłuż środka. Następnie przeprowadź sondę termopary przez środkową klatkę dla zwierząt i podłącz ją do rejestratora danych.

Włącz rejestrator danych i dezaktywuj funkcję automatycznego wyłączania. Podłącz rejestrator danych do komputera za pomocą dołączonego kabla. Oddziel klatki dla zwierząt czarnymi wkładkami, aby zapobiec interakcjom wizualnym między myszami, a pod szkłem umieść lustra, aby umożliwić obserwację spodu klatek.

Aby rozpocząć testy, umieść aluminiowe pojemniki na szklanej płycie po obu stronach zwierzęcia, w stałej odległości od klatek. W przypadku przeprowadzania testów w temperaturze 30 °C, podłącz cyrkulatory wody grzejącej do aluminiowych pojemników umieszczonych w odległości 0,25 cala od klatki ze zwierzęciem. Wypełnij pojemniki wodą do połowy, upewniając się, że otwory odpływowe są zatkane.

Ustaw cyrkulatory w taki sposób, aby gorąca woda z aluminiowych pojemników spływała bezpośrednio z powrotem do zbiornika cyrkulatora po każdej ze stron. Należy dolać wody do każdego z cyrkulatorów. Po napełnieniu metalowych pojemników ustaw cyrkulatory na temperaturę od 45 do 60 °C i napełnij aluminiowe pojemniki ciągłym strumieniem gorącej wody.

Gdy szkiełka osiągną pożądany zakres temperatur, umieść myszy w komorach na płytce. Pozostaw myszy do aklimatyzacji do aparatury i temperatury. Czas aklimatyzacji myszy wynosi 2,5 godziny.

Pod koniec okresu aklimatyzacji napełnij wiadro z lodem w połowie suchym lodem, a następnie za pomocą młotka lub pobijaka rozkrusz go na proszek. Czynność tę należy przeprowadzić poza pomieszczeniem behawioralnym, aby nie płoszyć myszy. Następnie, używając żyletki lub nożyczek, odetnij górną część strzykawki o pojemności 3 ml.

Następnie za pomocą igły 21 G wykonaj dwa zestawy po trzy otwory po przeciwległych stronach strzykawki, aby zmniejszyć ciśnienie powstające w wyniku sublimacji podczas ponownego zagęszczania suchego lodu w pomieszczeniu behawioralnym, i wypełnij komorę strzykawki w połowie proszkiem z suchego lodu. Przyciśnij odcięty koniec strzykawki do płaskiego przedmiotu i mocno zagęść proszek za pomocą tłoka. Wypchnij czubek zagęszczonego pelletu z suchego lodu poza krawędź strzykawki.

Następnie należy przetestować te myszy, które mają wszystkie cztery łapy w szkle i nie poruszają się, ale nie są w pełni uśpione. Wykorzystując lustra do celowania, delikatnie, lecz stanowczo, dociśnij płaski pelet do powierzchni szkła pod tylną łapą myszy. Jednocześnie uruchom stoper.

Gdy mysz odsunie się od schłodzonego szkła, w pionie lub w poziomie, należy zatrzymać stoper i usunąć pellet suchego lodu. Jeśli jednak mysz jedynie krótko poruszy łapą, a następnie ponownie przyłoży ją do chłodzącej powierzchni, należy kontynuować pomiar czasu i stymulację do momentu, aż mysz trwale odsunie łapę. Jeśli mysz nie odsunie się od schłodzonego szkła, należy przerwać stymulację po 20 sekundach.

Powtarzaj tę procedurę testową, aż zostanie zebranych co najmniej trzy wartości z każdej łapy zwierzęcia, aby przetestować myszy w temperaturze 17 °C. Powtórz eksperyment w sposób przedstawiony powyżej, jednak zamiast napełniać aluminiowe pojemniki podgrzaną wodą, użyj kruszonego lodu i ustaw pojemniki w odległości około 0,25 cala od klatek, aby przetestować myszy. W temperaturze 12 °C stosuje się suchy lód, przy czym pojemniki są umieszczone w odległości 1,25 cala od klatek.

Ten alternatywny protokół polega na badaniu myszy w trakcie obniżania temperatury płytki, a nie po jej ustabilizowaniu. Pozwala to na badanie adaptacji myszy w czasie rzeczywistym, po przygotowaniu aparatury. Podobnie jak wcześniej, należy przeprowadzić eksperyment zgodnie z wcześniejszym opisem, aby dokonać pomiarów w temperaturze pokojowej.

Po zmierzeniu bazowych opóźnień w temperaturze pokojowej, korzystając z wcześniej przedstawionej procedury, należy wypełnić puste aluminiowe pojemniki suchym lodem i umieścić je w odległości 1,25 cala od obudów po obu stronach. Na koniec należy powtórzyć eksperyment, aby dokonać pomiarów opóźnień podczas chłodzenia szklanej płytki.

Wykonywanie pomiarów tak często, jak to możliwe. Wykres ten przedstawia średni czas utajenia odruchu wycofania u myszy rozpoczynających pomiar w temperaturze 12 °C, 17 °C, 23 °C lub 30 °C. Czas utajenia wycofania jest spójny dla wszystkich temperatur.

Efekty przeciwbólowe można zmierzyć za pomocą testu zimnej płytki, jak pokazano tutaj. Podskórny wtrysk morfiny w dawce 1,5 mg/kg zwiększa czas latencji odruchu wycofania u myszy 30 minut po iniekcji, co zmierzono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji z testem post-hoc Bonferroniego 60 minut po iniekcji. Nie ma istotnej różnicy między grupą otrzymującą morfinę a grupą otrzymującą roztwór soli fizjologicznej.

Tutaj można również zmierzyć nadwrażliwość myszy. Iniekcja podeszwowa 10 µL pełnego adiuwantka Freunda znacząco skraca czas latencji wycofania u myszy dwie i trzy godziny po iniekcji, co wykazano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji ANOVA z testem post-hoc Bonferroniego. Tym samym myszom podano podskórne iniekcje morfiny w czwartej godzinie, a wszystkie czasy latencji wycofania w 4,5 godzinie były znacząco wyższe w porównaniu z trzecią godziną, co wykazano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA z testem post-hoc Dunnetta.

Po zmetabolizowaniu morfiny w 5,5 godziny po wstrzyknięciu, myszy, którym podano CFA, nadal wykazywały krótszy czas latencji wycofania niż myszy wstrzyknięte solą fizjologiczną, co wykazano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z post-hoc testem Bonferroniego. Adaptacja do zmian ochłodzenia środowiska może być mierzona w czasie rzeczywistym za pomocą tego testu. Myszy typu dzikiego wykazują taki sam czas latencji wycofania w miarę ochładzania się szklanej płyty, co sugeruje, że adaptują one do obniżających się temperatur szybciej, niż można to zmierzyć za pomocą CPA, w którym nie stwierdzono istotnych różnic pomiędzy żadną z grup.

Jednakże, gdy myszy zostaną wstrzyknięte związkiem U 7 3 1 2 2 w celu zablokowania hydrolizy PIP two, ich czas latencji ulega skróceniu wraz ze spadkiem temperatury płytki, co sugeruje upośledzenie adaptacji. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu pięciu godzin, wliczając w to czas aklimatyzacji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu pomiaru odczuwania zimna i adaptacji u budzących się myszy zachowujących swobodną aktywność. Należy pamiętać, że praca z suchym lodem może być wyjątkowo niebezpieczna i konieczne jest zapewnienie odpowiedniej wentylacji oraz cyrkulacji powietrza podczas stosowania tej metody.