Name: Duży zabieg kraniotomii bocznej do mezoskalowego obrazowania optycznego o szerokim polu widzenia aktywności mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę dużej kraniotomii bocznej do szerokopolowego obrazowania aktywności kory mózgowej myszy. Technika umożliwia obserwację dynamiki neuronowej w czasie rzeczywistym oraz badanie interakcji między odległymi obszarami kory.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant #40352, Campus Alberta for Innovation Program Chair, Alberta Alzheimer Research Program dla MHM, oraz NSERC CREATE w ramach stypendium doktoranckiego BIF i stypendium podyplomowego AIHS dla MK. Dziękujemy Pu Min Wang za opracowanie tego protokołu i za szkolenie chirurgiczne, a Behroo Mirza Agha i Di Shao za hodowlę.

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Lethbridge (ACC) i jest prowadzony zgodnie ze standardami Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC).
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>W przypadku dłuższych okresów badania należy autoklawować wszystkie otwarte materiały chirurgiczne i upewnić się, że sterylność jest utrzymana przez cały czas trwania operacji. Jeśli wymagane jest przeprowadzenie wielu operacji, należy przeprowadzić autoklaw między operacjami. </li>
	<li>Upewnij się, że masz pod ręką dużo buforu mózgowego (co najmniej 50 ml). Roztwór składa się ze 134 mM chlorku sodu, 5,4 mM potasu, 1 mM sześciowodnego chlorku magnezu, 1,8 mM dwuwodnego chlorku wapnia i 5 mM HEPES sodu, pH zrównoważonego do 7,4 z 5 M chlorowodorem.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej i znieczulenie 3 - 4% izofluranem. Następnie zastosuj 1,0 - 2,0% izofluranu w celu podtrzymania podczas operacji. Dalsze zmniejszenie do zaledwie 0,4 – 0,8% podczas obrazowania5,13,14,15, pod warunkiem utrzymania odpowiedniego znieczulenia. Te niskie poziomy znieczulenia wymagają czujnego i częstego monitorowania myszy (mniej więcej co 5 minut), aby upewnić się, że pozostaje ona odruchowa na bolesne bodźce. 
	UWAGA: Odwodnienie może stać się problematyczne ze względu na wysoki stosunek powierzchni do objętości myszy i nasilone przez długotrwałe stosowanie izofluranu.
	<ol>
		<li>Stosować podskórne iniekcje soli fizjologicznej, 0,1 ml na 10 g masy ciała, co 1 - 2 godziny. Przy odpowiednim nawodnieniu mysz będzie oddawać mocz raz na 1 - 2 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uważnie monitoruj mysz, aby zapewnić spójne znieczulenie podczas operacji i obrazowania. Nie zostawiaj myszy bez opieki i uważaj, aby nigdy nie odzyskała przytomności.</li>
	<li>Przenieś znieczuloną mysz do zestawu z uchwytem na głowę i umieść na termoregulującej poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C. Zabezpiecz górne zęby w uchwycie na zęby.</li>
	<li>Obróć głowę myszy w lewo o około 30°, aby odsłonić prawą boczną stronę głowy i zabezpiecz głowę myszy końcem nauszników (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>W celu zmniejszenia obrzęku mózgu należy wstrzyknąć deksametazon (4 mg/kg) domięśniowo.</li>
	<li>Przetrzyj skórę na obszarze operacyjnym bawełnianymi wacikami zamoczonymi w 4% chlorheksydynie (3 razy) i 70% etanolu (3 razy). Użyj każdego bawełnianego wacika tylko raz.</li>
	<li>Załóż rękawice chirurgiczne i przykryj zwierzę samoprzylepną folią. Zapewnić znieczulenie miejscowe poprzez wstrzyknięcie lidokainy (8 - 10 mg/kg; 2% epinefryny) podskórnie w miejsce kraniotomii. Odczekaj 3 - 5 minut, aż lek wchłonie się do tkanki.</li>
</ol>
2. Usuwanie skóry i cofanie mięśnia z czaszki
<ol>
	<li>Wykonaj prawie wszystkie te procedury, oglądając czaszkę pod mikroskopem preparacyjnym (np. moc 0,7 - 4,5X, w zależności od sytuacji).</li>
	<li>Podnieś skórę 1 mm na lewo od linii środkowej (tuż za uchem) za pomocą kleszczy i wykonaj małe poziome nacięcie nożyczkami chirurgicznymi.</li>
	<li>Wykonaj boczne nacięcie o średnicy 5 - 6 mm w kierunku prawego ucha, a następnie naciąć w kierunku rostralnego końca głowy.</li>
	<li>W początkowym miejscu nacięcia włóż nożyczki i przytnij 10 mm rostralnie.</li>
	<li>Przetnij skórę wokół prawego ucha i w pobliżu prawego oka, aby odsłonić prawą stronę czaszki i mięsień skroniowy. Upewnij się, że najszersza część odsłoniętego obszaru ma co najmniej 7 mm. Przycinaj skórę dalej, jeśli obszar operacyjny wymaga rozszerzenia.</li>
	<li>Umocuj skórę wokół nacięcia, umieszczając kilka kropli kleju z cyjanoakrylanu butylu między czaszką a skórą. Upewnij się, że tkanka została wcześniej wysuszona za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką lub zwiniętych chusteczek, aby zwiększyć skuteczność kleju.</li>
	<li>Za pomocą bawełnianego wacika przetrzyj powierzchnię czaszki okrężnymi ruchami, aby usunąć okostną z czaszki. Upewnij się, że żaden nie pozostał, całkowicie wysuszając czaszkę.</li>
	<li>Za pomocą sprężynowych nożyczek i kleszczy oddziel mięsień skroniowy od czaszki; odetnij i cofnij mięsień na boki, aż dojdziesz do kości łuskowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić powierzchownej żyły skroniowej, która biegnie wzdłuż poziomu kości łuskowej w pobliżu oka, w przeciwnym razie może dojść do krwotoku.</li>
	<li>Zatamuj krwawienie za pomocą pianki żelowej wstępnie nasączonej buforem mózgu. W przypadku poważnego krwotoku użyj kauteryzatora termicznego. Upuść klej klej z cyjanoakrylanu butylu na miejsca krwawienia po leczeniu kauteryzatorem termicznym. Upewnij się, że obszar został wcześniej wysuszony za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką lub zwijanych chusteczek, aby zwiększyć skuteczność kleju. </li>
</ol>
3. Kraniotomia
UWAGA: Chirurg musi zachować ostrożność podczas usuwania czaszki i opony twardej, aby uniknąć niepotrzebnych komplikacji. W przypadku wystąpienia komplikacji znajdują się kroki rozwiązywania problemów.
<ol>
	<li>Zaznacz położenie bregmy markerem z cienką końcówką lub wytnij mały trójkątny kawałek taśmy i skieruj róg na bregma (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A), aby zorientować leżące poniżej obszary mózgu.</li>
	<li>Przed przymocowaniem płyty na głowę upewnij się, że czaszka jest całkowicie sucha. Czaszka szybko wyschnie na powietrzu po nałożeniu pianki żelowej nasączonej buforem mózgowym, jeśli potrzebne jest dalsze suszenie, użyj wacików z bawełnianymi końcówkami. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla mocowania płyty czołowej (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 1B). 
	UWAGA: Jeśli na czaszce pozostała okostna lub jeśli czaszka nie jest sucha przed przyklejeniem do płyty głowy, prawdopodobnie odklei się. Jeśli tak się stanie, delikatnie zdejmij płytę głowicy i zacznij od nowa. Podczas tego procesu może wystąpić krwawienie; Odczekaj kilka minut, aż zacznie krzepnąć, a następnie delikatnie usuń. Nie zaleca się powtarzania tego procesu więcej niż dwa razy.</li>
	<li>Nałóż klej z cyjanoakrylanu etylu wokół dolnej krawędzi płyty czołowej16 i przyklej płytę głowicy na obszarze kraniotomii (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D i <silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Wypełnij przestrzeń otworu między czaszką a płytą głowy cementem dentystycznym, pozostawiając odsłonięty tylko obszar kraniotomii. Poczekaj, aż cement dentystyczny wyschnie i stwardnieje, zwykle 5 - 10 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).
	<ol>
		<li>Gdy cement stężeje, na krótko napełnij studzienkę buforem mózgowym i pozostaw do namoczenia na 3 - 5 minut. Użyj zwijanej chusteczki, aby usunąć bufor mózgowy przed wierceniem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrysuj obszar chirurgiczny, lekko nacinając powierzchnię czaszki wiertłem dentystycznym. Użyj wiertarki pneumatycznej (ustawionej na maksymalnie 20 PSI), z zadziorem FG 1/4 i sterowanej za pomocą pedału nożnego o zmiennej prędkości.</li>
	<li>Delikatnie prześledź wiertło wzdłuż oryginalnego nacięcia, aby je pogłębić, upewniając się, że wiertło nie przenika przez czaszkę do mózgu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D). Na zmianę co kilka minut między wierceniem a przecieraniem powierzchni czaszki zwilżonymi zwiniętymi chusteczkami. Zmniejszy to nagrzewanie i wysuszanie czaszki w wyniku tarcia mechanicznego i długotrwałego narażenia. 
	UWAGA: Czaszka szybko wyschnie na powietrzu po nałożeniu mokrej pianki żelowej. Jeśli potrzebne jest dalsze suszenie, użyj wacików z bawełnianymi końcówkami. 
	Uwaga: Czaszka ma nierówną grubość. Na przykład grzbiet ciemieniowo-skroniowy jest najgrubszym obszarem, podczas gdy obszary czaszki w pobliżu linii środkowej i punktów orientacyjnych łuskowatych są stosunkowo cienkie.</li>
	<li>Podczas wiercenia należy okresowo sprawdzać, czy czaszka nie jest wyboczona, delikatnie naciskając na nią kleszczami lub nieruchomym wiertłem. Kiedy kość zacznie się wyginać, przerwij wiercenie i zanurz całe okno w buforze mózgu. 
	UWAGA: Jeśli krew wypływa z obszaru, może to sugerować, że opona twarda została uszkodzona. W takim przypadku umieść półmokrą piankę żelową na tym obszarze i spróbuj wchłonąć krew, delikatnie dociskając piankę żelową wacikiem.</li>
	<li>Odczekaj co najmniej 5 minut przed usunięciem czaszki, aby zmiękczyć kość i zmniejszyć ryzyko przyklejenia się opony twardej do kości, co ułatwi proces usuwania czaszki.</li>
	<li>Wykonaj proces usuwania czaszki, gdy czaszka jest zanurzona w buforze mózgu. 
	UWAGA: Jeśli część czaszki pozostaje uparcie przymocowana, można użyć ostrza skalpela #11, aby delikatnie naciąć czaszkę. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie przebić ostrza przez czaszkę i do mózgu.</li>
	<li>Zaczynając od przedniej krawędzi, delikatnie podważ luźną czaszkę od opony twardej za pomocą kleszczy. 
	UWAGA: Jeśli podczas procesu usuwania czaszki wystąpi niewielka ilość krwawienia, należy usunąć bufor za pomocą pipety transferowej lub strzykawki, a następnie zastąpić go nowym buforem.</li>
	<li>Gdy kość jest luźna i "unosi się" na oponie twardej, mocno chwyć kość kleszczami i podnieś kość z opony twardej. Upewnij się, że kość nigdy nie przeniknie do mózgu.</li>
	<li>Aby zatamować krwawienie, zwiń róg tkanki w szpic i usuń większość buforu z dołka czaszki. Szybko nałóż piankę żelową, wstępnie nasączoną buforem, na obszar krwawienia, jednocześnie bardzo lekko dociskając wacikiem z bawełnianą końcówką. 
	UWAGA: Krwawienie zwykle pochodzi z krawędzi kości lub powierzchni opony twardej; Oba przypadki są normalne, a krwawienie szybko ustaje, jeśli nie zostaną uszkodzone żadne główne naczynia krwionośne. Jeśli krwawienie będzie się utrzymywać, krew może wypełnić całe okienko, tworząc warstwę skrzepu na obszarze obrazowania.
	<ol>
		<li>Aby usunąć arkusz skrzepu, ostrożnie podnieś kawałki zakrzepłej krwi z obszaru obrazowania, pozostawiając skrzep krwi nienaruszony wokół źródła pękniętego naczynia krwionośnego. Należy uważać, aby nie usunąć skrzepu krwi ze źródła krwawienia, ponieważ może to spowodować jeszcze większą utratę krwi. Przepłucz powierzchnię mózgu buforem mózgowym, aby zmyć krew.</li>
		<li>Uważaj, aby nie dotykać delikatnej tkanki mózgowej ani nie dodawać do niej ciała obcego; powtarzaj aż do ustania krwawienia, przez około 2 - 5 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E). 
		UWAGA: W tym momencie kraniotomia jest gotowa do przygotowania okna czaszkowego (patrz krok 5). W razie potrzeby usuń oponę twardą przed wszczepieniem okienka czaszkowego (patrz krok 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Usuwanie opony twardej
UWAGA: Usuwanie opony twardej wymaga szczególnej ostrożności i może potrwać ponad 15 minut.
<ol>
	<li>Pobrać nadmiar buforu z kraniotomii. Utrzymując wilgotną powierzchnię, chwyć mały kawałek opony twardej kleszczami i delikatnie rozerwij oponę twardą.</li>
	<li>Użyj kleszczy i nożyczek sprężynowych, aby delikatnie rozerwać i odciąć oponę twardą.</li>
	<li>Upuść więcej bufora mózgowego na powierzchnię mózgu, aby unosić oponę twardą i pomóc jej oddzielić się od mózgu. Kontynuuj, aż cała opona twarda zostanie usunięta z miejsca okna czaszki. Przy prawidłowym wykonaniu mózg będzie wyglądał na bardzo czysty, z wyraźnymi naczyniami krwionośnymi i bez skaz (porównaj <silna klasa="xfig">Rysunek 2E z 2F). 
	Uwaga: Niektóre obszary opony twardej są przyczepione do małych tętniczek na powierzchni mózgu (np. w pobliżu linii środkowej proksymalnie do obszaru asocjacji ciemieniowej), a usunięcie takich może spowodować pęknięcie tętniczki. W takich przypadkach może być lepiej pozostawić mały kawałek opony twardej nienaruszony na szczycie tętniczki. VSD może nie przenikać do tego małego obszaru, ale jest to preferowane niż duże krwawienie.</li>
	<li>Zamocuj powierzchnię mózgu w agarozie tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować ruch spowodowany pulsacją i zapobiec dalszemu obrzękowi (patrz krok 5).</li>
</ol>
5. Przygotowanie okna czaszkowego
<ol>
	<li>Spryskaj szkło nakrywkowe 70% etanolem i delikatnie wysusz za pomocą kanistra z powietrzem. Upewnij się, że szkło jest całkowicie czyste, bez plam i kurzu.</li>
	<li>Przygotuj 1,3% agarozy, podgrzewając 200 mg proszku agarozy rozpuszczonego w 15 ml buforu mózgowego. Ustaw kuchenkę mikrofalową na wysoką temperaturę i podgrzewaj przez 10 - 15 sekund na raz, delikatnie mieszając w międzyczasie, aż cały agar się rozpuści. 
	Uwaga: Upewnij się, że nie ma pęcherzyków ani cząstek, ponieważ będą one zakłócać obrazowanie.</li>
	<li>Umieścić termometr w gorącej agarozie i schłodzić agarozę do temperatury nieco powyżej temperatury krzepnięcia (~ 40 °C). 
	UWAGA: Puszczanie zimnej wody na zewnątrz pojemnika z agarozą może przyspieszyć proces chłodzenia. Delikatnie mieszaj, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków ani cząstek stałych.</li>
	<li>Bezpośrednio przed nałożeniem agaru należy usunąć bufor mózgowy z dołka czaszkowego. Pobrać agarozę za pomocą pipety transferowej i upuścić agarozę bezpośrednio na mózg. Szybko umieść szkiełko nakrywkowe na powierzchni i przymocuj szkiełko nakrywkowe kroplami agarozy na rogach.</li>
</ol>
6. Eutanazja
UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że ta procedura wymaga od doświadczonych chirurgów co najmniej 3 - 4 operacji, aby osiągnąć więcej niż 90% wskaźnik sukcesu. Mniej doświadczeni chirurdzy mogą wymagać jeszcze większej praktyki. Podczas kraniotomii lub durotomii mózg może doznać uszkodzenia, na przykład jeśli wiertło przebije kość do mózgu. Dopuszczalne mogą być drobne uszkodzenia na krawędzi kraniotomii. Jeśli jednak mózg nie wygląda na "czysty" z jaskrawoczerwonymi, nieuszkodzonymi naczyniami krwionośnymi i białą korą, eksperyment może wymagać przerwania. Przykładami złych preparatów są te z martwymi naczyniami krwionośnymi lub gdy kora jest zaznaczona rozerwanymi lub uszkodzonymi naczyniami krwionośnymi. Jeśli którykolwiek z tych objawów jest obecny, eksperyment prawdopodobnie nie przyniesie wysokiej jakości danych. Niezależnie od tego, czy operacja/eksperyment się powiódł, czy nie, humanitarnie poddaj mysz eutanazji po zakończeniu eksperymentu.
<ol>
	<li>Głęboko znieczulić co najmniej 3,5% izofluranem. Następnie należy wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu w dawce 300 mg/kg. Idealnie, jeśli igła zostanie wprowadzona do wątroby, śmierć będzie bardzo szybka (< 1 minuta).</li>
	<li>Jeśli wymagana jest perfuzja, przed przystąpieniem do dalszych czynności sprawdź, czy zwierzę jest głęboko znieczulone (patrz krok 1.3).</li>
	<li>Alternatywnie, jeśli perfuzja nie jest wymagana, odczekaj co najmniej 5 minut, a następnie sprawdź, czy mysz jest martwa. Potwierdź brak oddychania, bicia serca, a także brak odstawienia bólu i odruchów rogówkowych. Obserwuj również bladoniebiesko-białe zabarwienie kończyn i ciemnienie naczyń krwionośnych nad korą.</li>
</ol>

<ol><li>Sigler, A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+rapid+redistribution+of+sensory-evoked+depolarization+through+existing+cortical+pathways+after+targeted+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging rapid redistribution of sensory-evoked depolarization through existing cortical pathways after targeted stroke in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11759-11764 (2009).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (11), 874-885 (2004).</li>
<li>Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+basis+for+the+robust+distribution+of+blood+to+rodent+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12670-12675 (2010).</li>
<li>Mohajerani, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+cortical+activity+alternates+between+motifs+defined+by+regional+axonal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous cortical activity alternates between motifs defined by regional axonal projections.</a> Nat Neurosci. 16 (10), 1426-1435 (2013).</li>
<li>Mohajerani, M. H., McVea, D. A., Fingas, M., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirrored+bilateral+slow-wave+cortical+activity+within+local+circuits+revealed+by+fast+bihemispheric+voltage-sensitive+dye+imaging+in+anesthetized+and+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mirrored bilateral slow-wave cortical activity within local circuits revealed by fast bihemispheric voltage-sensitive dye imaging in anesthetized and awake mice.</a> J Neurosci. 30 (10), 3745-3751 (2010).</li>
<li>Lippert, M. T., Takagaki, K., Xu, W., Huang, X., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+voltage-sensitive+dye+imaging+of+rat+cortical+activity+with+high+signal-to-noise+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Methods for voltage-sensitive dye imaging of rat cortical activity with high signal-to-noise ratio.</a> J Neurophysiol. 98 (1), 502-512 (2007).</li>
<li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+diseased+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the diseased nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 7 (6), 449-463 (2006).</li>
<li>Kerr, J. N., Denk, W. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nrn/journal/v9/n3/full/nrn2338.html">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).</li>
<li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Eur J Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li>
<li>McVea, D. A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dye+imaging+reveals+dynamic+spatiotemporal+properties+of+cortical+activity+after+spontaneous+muscle+twitches+in+the+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dye imaging reveals dynamic spatiotemporal properties of cortical activity after spontaneous muscle twitches in the newborn rat.</a> J Neurosci. 32 (32), 10982-10994 (2012).</li>
<li>Sweetnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+impairs+cortical+plasticity+and+functional+recovery+following+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diabetes impairs cortical plasticity and functional recovery following ischemic stroke.</a> J Neurosci. 32 (15), 5132-5143 (2012).</li>
<li>Yin, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+field+recordings+effectively+monitor+the+mouse+cortex+and+hippocampus+under+isoflurane+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo field recordings effectively monitor the mouse cortex and hippocampus under isoflurane anesthesia.</a> Neural Regeneration Research. 11 (12), 1951-1955 (2016).</li>
<li>Sharp, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+stimulus-evoked+cerebral+hemodynamics+in+the+awake+mouse+and+under+a+novel+anesthetic+regime%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of stimulus-evoked cerebral hemodynamics in the awake mouse and under a novel anesthetic regime.</a> Scientific Reports. 5, 12621(2015).</li>
<li>Kyweriga, M., Mohajerani, M. H. Optogenetics: Methods and Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKyweriga%2C+M+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Kianianmomeni, A. 1408, Humana Press Inc. 251-265 (2016).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrutzendler%2C+J+%22Imaging+in+neuroscience+and+development+%3A+a+laboratory+manual%22">Imaging in neuroscience and development : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
<li>Vanni, M. P., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscale+transcranial+spontaneous+activity+mapping+in+GCaMP3+transgenic+mice+reveals+extensive+reciprocal+connections+between+areas+of+somatomotor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mesoscale transcranial spontaneous activity mapping in GCaMP3 transgenic mice reveals extensive reciprocal connections between areas of somatomotor cortex.</a> J Neurosci. 34 (48), 15931-15946 (2014).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+High-Frequency+Mesoscale+Intracortical+Maps+Using+the+Genetically+Encoded+Glutamate+Sensor+iGluSnFR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR.</a> J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).</li>
<li>Chan, A. W., Mohajerani, M. H., LeDue, J. M., Wang, Y. T., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscale+infraslow+spontaneous+membrane+potential+fluctuations+recapitulate+high-frequency+activity+cortical+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mesoscale infraslow spontaneous membrane potential fluctuations recapitulate high-frequency activity cortical motifs.</a> Nat Commun. 6, 7738(2015).</li>
<li>Lim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Large-Scale+Cortical+Mapping+Using+Channelrhodopsin-2+Stimulation+in+Transgenic+Mice+Reveals+Asymmetric+and+Reciprocal+Relationships+between+Cortical+Areas%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">In vivo Large-Scale Cortical Mapping Using Channelrhodopsin-2 Stimulation in Transgenic Mice Reveals Asymmetric and Reciprocal Relationships between Cortical Areas.</a> Front Neural Circuits. 6, (2012).</li>
<li>Ferezou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+cortical+sensorimotor+integration+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of cortical sensorimotor integration in behaving mice.</a> Neuron. 56 (5), 907-923 (2007).</li>
<li>Mohajerani, M. H., Aminoltejari, K., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mini-strokes+produce+changes+in+interhemispheric+sensory+signal+processing+that+are+indicative+of+disinhibition+within+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted mini-strokes produce changes in interhemispheric sensory signal processing that are indicative of disinhibition within minutes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (22), E183-E191 (2011).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+intersectional+targeting+of+neural+sensors+and+effectors+with+high+specificity+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance.</a> Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten innowacyjny protokół dla dużego okna czaszkowego umożliwia jednoczesne obrazowanie w obszarze skroniowym i ciemieniowym kory mózgowej. W połączeniu z obrazowaniem optycznym może pomóc w ujawnieniu dynamiki neuronalnej w obszarach kory mózgowej podczas spontanicznej i wywołanej bodźcem aktywności. Ta ekspansywna kraniotomia odsłania również duże rozszerzenie sieci naczyń korowych, w tym bliższy koniec środkowej tętnicy mózgowej (MCA), umożliwiając obrazowanie in vivo przepływu krwi i bezpośrednią manipulację ...

Kraniotomia to standardowa procedura stosowana przez neurobiologów do ujawnienia części mózgu. Od zarania elektrofizjologii kraniotomia umożliwiła bezprecedensowe przełomy w dziedzinie neurobiologii. Gęste mapowanie kory mózgowej za pomocą elektrod doprowadziło do eksperymentów testujących hipotezy i teorie oparte na tych mapach. Niedawno wkroczyliśmy w nową erę, w której kraniotomia jest wykorzystywana do obrazowania in vivo przepływu krwi w korze mózgowej1,2,3 i architektura nerwowo-naczyniowa4, umożliwiając wizualizację aktywności kory mózgowej w czasie rzeczywistym w odsłoniętych obszarach5,6,7. Chociaż w wielu badaniach wykorzystuje się kraniotomię w połączeniu z technikami obrazowania optycznego in vivo do badania struktury i funkcji neuronów korowych, gleju i naczyń korowych8,9, dalsze badania są ograniczone przez małe obszary odsłoniętej kory (ale zobacz10).
Celem tego protokołu jest dostarczenie metody tworzenia dużej bocznej kraniotomii, odsłaniającej korę mózgową od linii środkowej do kości łuskowej i wykraczającej poza bregmę i lambdę. Ta duża kraniotomia umożliwia jednoczesne oglądanie kory asocjacyjnej (zaśledzionowej, obręczy i ciemieniowej), motorycznej pierwotnej i wtórnej, somatosensorycznej, wzrokowej i kory słuchowej. Metoda ta została wcześniej połączona z obrazowaniem barwnikowym wrażliwym na napięcie (VSDI) w celu zbadania, w jaki sposób wiele obszarów kory oddziałuje ze sobą podczas spontanicznej i wywołanej bodźcem aktywności korowej5,11,12. Najtrudniejsze aspekty tej procedury obejmują ułożenie głowy zwierzęcia, zamocowanie płytki głowy i uniknięcie krwotoku przy jednoczesnym oddzieleniu mięśnia skroniowego od kości ciemieniowej. Należy również zachować ostrożność podczas procesów wiercenia i usuwania czaszki, ponieważ czaszka zakrzywia się pod kątem.

<table><tbody><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>FHC</td><td>40-90-2</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Zalecane są 2 lub więcej par</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00, 15000-10</td><td>1 para powinna być przeznaczona do usuwania opony twardej&nbsp;</td></tr><tr><td>Jet Tooth Shade Powder</td><td>LANG Dental</td><td>Jet Tooth Shade Powder</td><td>do zmieszania z płynem do</td></tr><tr><td>cieniowania zębów</td> Jet <td>Jet LANG Dental</td><td>Jet Tooth Shade Liquid</td><td>do zmieszania z Jet Powder&nbsp;</td></tr><tr><td>Głowice wiertarskie - wiertła z węglików spiekanych FG 1/4 389</td><td>Midwest Dental</td><td>385201</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Sinclair Dental Canada</td><td>Pfizer Gelfoam</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>124125</td><td></td></tr><tr><td>Lidokaina 2% Epinefryna</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>125299</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon 5&nbsp; mg/ml</td><td>Zachodnie Centrum Dystrybucji Leków Ltd</td><td>125231</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy butylu (VetBond)</td><td>Zachodnie Centrum Dystrybucji Leków Ltd</td><td>12612</td><td></td></tr></tbody></table>

duży zabieg kraniotomii bocznej do mezoskalowego obrazowania optycznego o szerokim polu widzenia aktywności mózgu

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Kraniotomia jest powszechnie wykonywaną procedurą w celu wystawienia mózgu do eksperymentów in vivo. W badaniach na myszach większość laboratoriów wykorzystuje małą kraniotomię, zwykle 3 mm x 3 mm. Protokół ten wprowadza metodę tworzenia znacznie większego okna czaszki o wymiarach 7 mm x 6 mm, odsłaniającego większość półkuli mózgowej nad korą skroniową i ciemieniową myszy (np. bregma 2,5 - 4,5 mm, boczna 0 - 6 mm). Aby wykonać tę operację, głowa musi być pochylona pod kątem około 30°, a znaczna część mięśnia skroniowego musi być cofnięta. Ze względu na dużą ilość usuwanej kości, procedura ta jest przeznaczona wyłącznie do ostrych eksperymentów ze znieczulonym zwierzęciem podczas operacji i eksperymentu.
Główną zaletą tego innowacyjnego dużego bocznego okna czaszkowego jest zapewnienie jednoczesnego dostępu zarówno do przyśrodkowych, jak i bocznych obszarów kory. To duże jednostronne okno czaszkowe może być wykorzystane do badania dynamiki neuronalnej między komórkami, a także między różnymi obszarami kory mózgowej poprzez połączenie wieloelektrodowych zapisów elektrofizjologicznych, obrazowania aktywności neuronalnej (np. obrazowania wewnętrznego lub zewnętrznego) oraz stymulacji optogenetycznej. Dodatkowo, ta duża kraniotomia odsłania również duży obszar korowych naczyń krwionośnych, co pozwala na bezpośrednią manipulację bocznym unaczynieniem korowym.

Aby zbadać interakcje między obszarami kory w obrębie jednej półkuli, zastosowaliśmy szeroką kraniotomię rozciągającą się przez zatokę strzałkową oraz 5 - 6 mm bocznie. Okno czaszkowe to obejmowało korę pierwotną (ruchową, somatosensoryczną, wzrokową, słuchową), wtórną (ruchową, wzrokową) oraz korę asocjacyjną (retrosplenialną, obręczy, asocjacyjną ciemieniową) prawej półkuli mózgu (Ryc. 3A). W niniejszej pracy wykorzystaliśmy obrazowanie barwnikami wrażliwym...

Ten protokół przedstawia metodę tworzenia dużej jednostronnej kraniotomii nad obszarami skroniowymi i ciemieniowymi kory mózgowej myszy. Jest to szczególnie przydatne do obrazowania w czasie rzeczywistym rozległego obszaru półkuli korowej.

Duży zabieg kraniotomii bocznej do mezoskalowego obrazowania optycznego o szerokim polu widzenia aktywności mózgu

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Ogólnym celem tej rozległej bocznej kraniotomii jest przeprowadzenie obrazowania w czasie rzeczywistym na rozległym obszarze półkuli korowej. Główną zaletą tej techniki jest odsłonięcie dużych obszarów kory do obserwacji, co umożliwia zastosowanie jej w połączeniu z takimi technologiami jak optogenetyka. Technika ta pozwala na charakterystykę dynamiki neuronalnej zarówno pomiędzy komórkami, jak i pomiędzy różnymi obwodami mózgowymi w różnych rozdzielczościach czasowych i przestrzennych.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa ze względu na zwiększone ryzyko krwotoku i uszkodzeń kory, ponieważ opona twarda często przylega do powierzchni mózgu i naczyń krwionośnych. Metodę tę można zastosować do badania mechanizmów neurobiologicznych leżących u podstaw rozwoju obwodów mózgowych oraz ich zmian w ciągu życia w odpowiedzi na nowe doświadczenia lub patologie, takie jak choroba Alzheimera czy udar. Przed rozpoczęciem procedury należy wysterylizować w autoklawie wszystkie przybory chirurgiczne i zapewnić utrzymanie sterylności przez cały czas trwania operacji.Upewnij się, że przygotowano wystarczającą ilość buforu do mózgu na potrzeby operacji. Następnie przenieś znieczuloną mysz do

a-large-lateral-craniotomy-procedure-for-mesoscale-wide-field-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Duża boczna kraniektomia jako procedura szerokopolanej optycznej obrazowej analizy aktywności mózgu w skali mezo

Niniejszy film i protokół demonstrują sposób implantacji pokrytego szkłem okna czaszkowego u gryzoni. Preparaty te mogą być wykorzystywane do przewlekłego obrazowania dwufotonowego neocortex in vivo w skalach czasowych obejmujących wiele miesięcy. Mogą one być również stosowane w innych rodzajach obrazowania, w tym w obrazowaniu sygnałów optycznie immanentnych.

Procedura kraniotomii w celu przewlekłego obrazowania mózgu

Opisano metodę znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi w określonych funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Po pierwsze, obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego służy do uzyskania mapy funkcjonalnej. Następnie mikroskopia dwufotonowa jest używana do oznaczania i obrazowania neuronów w mikrodomenie mapy.

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Prezentujemy metodę tworzenia okna korowego z cieńszą czaszką (TSCW) w modelu mysim do obrazowania in vivo OCT kory mózgowej.

Technika cienkiego okienka korowego czaszki do obrazowania w optycznej tomografii koherentnej in vivo

Tutaj opisujemy metodę wielofotonowego obrazowania poklatkowego komórek mózgu w wysokiej rozdzielczości przed i po inwazyjnej interwencji chirurgicznej (np. biopsji) u tego samego żywego zwierzęcia. Metoda ta pozwala na badanie wpływu tych inwazyjnych zabiegów chirurgicznych na zachowanie migracyjne, inwazyjne i proliferacyjne komórek nowotworowych na poziomie pojedynczej komórki.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe zachowania komórek guza mózgu w odpowiedzi na inwazyjną biopsję chirurgiczną

Prezentujemy protokół integracji dyfuzyjnej trakografii MRI w pracy z pacjentami do endoskopowej operacji endoskopowej guza podstawy czaszki. Opisano metody adaptacji tych badań neuroobrazowych w fazie przed- i śródoperacyjnej.

Rola dyfuzyjnej traktatografii MRI w endoskopowej chirurgii endoskopowej podstawy czaszki

Ten artykuł demonstruje przygotowanie specjalnego okna obrazowania uzupełnionego o kaniulę infuzyjną i jej implantację w regionie CA1 hipokampa u myszy.

Procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.

Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Wprowadziliśmy nowatorską technikę obrazowania zwaną Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), która umożliwia bezstronne obrazowanie wszystkich komórek w próbkach mózgu na mezoskali i może być płynnie zintegrowana z procesem obrazowania taśmowej szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej na tej samej próbce.

Metoda optycznego obrazowania zgodna z mikroskopią skaningową do mezoskopowego mapowania mózgu w całych komórkach

Protokół ten opisuje dwufazową metodę chirurgiczną mającą na celu stworzenie dużego, ponownie zamykalnego, oszczędzającego dura okno czaszkowe u myszy. Technika ta umożliwia przewlekłe, wielomodalne zapisy elektrofizjologiczne z rozproszonych, głębokich sieci mózgowych, takich jak Sieć Trybu Domyślnego, przez kilka tygodni.

Protokół chirurgiczny dla dużego, zamykalnego okna czaszkowego umożliwiającego podłużne, wielomodalne rejestrowanie elektrofizjologii sieci domyślnej myszy

Poznaj metodę dużej kraniotomii bocznej do szerokopolowego obrazowania aktywności kory mózgowej myszy. Technika umożliwia obserwację dynamiki neuronowej w czasie rzeczywistym oraz badanie interakcji między odległymi obszarami kory.

Duży zabieg kraniotomii bocznej do mezoskalowego obrazowania optycznego o szerokim polu widzenia aktywności mózgu

Przeglądaj więcej filmów