Duży zabieg kraniotomii bocznej do mezoskalowego obrazowania optycznego o szerokim polu widzenia aktywności mózgu

Ogólnym celem tej rozległej bocznej kraniotomii jest przeprowadzenie obrazowania w czasie rzeczywistym na rozległym obszarze półkuli korowej. Główną zaletą tej techniki jest odsłonięcie dużych obszarów kory do obserwacji, co umożliwia zastosowanie jej w połączeniu z takimi technologiami jak optogenetyka. Technika ta pozwala na charakterystykę dynamiki neuronalnej zarówno pomiędzy komórkami, jak i pomiędzy różnymi obwodami mózgowymi w różnych rozdzielczościach czasowych i przestrzennych.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa ze względu na zwiększone ryzyko krwotoku i uszkodzeń kory, ponieważ opona twarda często przylega do powierzchni mózgu i naczyń krwionośnych. Metodę tę można zastosować do badania mechanizmów neurobiologicznych leżących u podstaw rozwoju obwodów mózgowych oraz ich zmian w ciągu życia w odpowiedzi na nowe doświadczenia lub patologie, takie jak choroba Alzheimera czy udar. Przed rozpoczęciem procedury należy wysterylizować w autoklawie wszystkie przybory chirurgiczne i zapewnić utrzymanie sterylności przez cały czas trwania operacji.

Upewnij się, że przygotowano wystarczającą ilość buforu do mózgu na potrzeby operacji. Następnie przenieś znieczuloną mysz do uchwytu głowy i umieść ją na termoregulatorycznej podkładce grzewczej ustawionej na 37 °C. Zabezpiecz górne zęby myszy w uchwycie do zębów.

Następnie obróć głowę myszy w lewo o około 30 stopni, aby odsłonić prawą stronę boczną głowy. Następnie utrwal głowę myszy za pomocą tępych końców uchwytów do uszu. Po tym nałóż maść talmiczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki.

Aby zmniejszyć obrzęk mózgu, wstrzyknij deksametazon w dawce 4 mg/kg domięśniowo. Przetrzyj skórę w obrębie pola operacyjnego trzy razy wacikami nasączonymi 4% chlorheksydyną, a następnie trzy razy 70% alkoholem. Wstrzyknij lidokainę podskórnie w miejscu kraniotomii.

Pod mikroskopem stereoskopowym, za pomocą pincety, unieś skórę jeden milimetr na lewo od linii środkowej, tuż za uchem, i wykonaj niewielkie poziome nacięcie nożyczkami chirurgicznymi. Wykonaj nacięcie boczne o długości od pięciu do sześciu milimetrów w kierunku prawego ucha, a następnie przetnij skórę w kierunku rostralnym głowy. W miejscu początkowego nacięcia wprowadź nożyczki i wykonaj cięcie o długości 10 milimetrów w kierunku rostralnym.

Następnie naciąć skórę wokół prawego ucha i w pobliżu prawego oka, aby odsłonić prawą stronę czaszki oraz mięsień skroniowy. Należy upewnić się, że najszersza część odsłoniętego obszaru ma co najmniej siedem milimetrów. Jeśli obszar operacyjny wymaga rozszerzenia, należy dodatkowo przyciąć skórę.

Za pomocą patyczka higienicznego pocieraj powierzchnię czaszki kolistymi ruchami, aby usunąć okostną. Upewnij się, że nie pozostało żadnych fragmentów okostnej i że czaszka jest całkowicie sucha, co jest kluczowe dla prawidłowego przymocowania płytki głownej. Następnie, używając nożyczek sprężynowych i pęsety, oddziel mięsień skroniowy od czaszki.

Przetnij i odsunij mięsień bocznie, aż do momentu dotarcia do kości łuskowatej. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić powierzchownej żyły skroniowej, która przebiega na poziomie kości łuskowatej w pobliżu oka, w przeciwnym razie może dojść do krwotoku. Krwawienie opanuj za pomocą gąbki żelowej uprzednio namoczonej w buforze mózgowym.

W przypadku silnego krwotoku należy użyć kauteryzatora termicznego. Na miejsca krwawienia nanieś kroplę kleju z butylocyjanoakrylanu. Aby rozpocząć tę procedurę, najpierw wyznacz bregma w celu zorientowania obszarów mózgu, a następnie nanieś klej z etylocyjanoakrylanu wokół dolnej krawędzi płytki głowowej i przyklej płytkę nad obszarem kraniotomii.

Następnie wypełnij wolną przestrzeń między czaszką a płytką głowową cementem dentystycznym, pozostawiając odsłonięty jedynie obszar kraniotomii. Odczekaj, aż cement dentystyczny wyschnie i stwardnieje. Następnie wyznacz obszar okna czaszkowego, lekko nacinając powierzchnię czaszki wiertłem dentystycznym.

Ostrożnie prowadź wiertło wzdłuż pierwotnego nacięcia, aby je pogłębić, upewniając się, że wiertło nie przebije się przez czaszkę do mózgu. W międzyczasie co kilka minut przeplataj wiercenie z osuszaniem powierzchni czaszki za pomocą zwilżonych, zwiniętych chusteczek. Ten bardzo wymagający etap wymaga od chirurgów przewiercenia starej czaszki w celu jej uwolnienia do usunięcia, bez uszkodzenia leżącej pod nią kory.

Powolne ruchy są precyzyjne, a płynne ruchy szybkie. Podczas wiercenia okresowo sprawdzaj, czy czaszka nie ugina się, delikatnie naciskając na nią pęsetą lub nieruchomym wiertłem. Gdy kość zacznie się uginać, przerwij wiercenie i zanurz całe okno w buforze mózgowym.

Odczekać co najmniej pięć minut przed usunięciem czaszki, aby zmiękczyć kość i zmniejszyć ryzyko przylegania opony twardej do kości, co ułatwi proces usuwania czaszki. Następnie przeprowadzić proces usuwania czaszki, zaczynając od krawędzi przedniej. Delikatnie oddzielić poluzowaną czaszkę od opony twardej za pomocą pincety.

Gdy kość poluzuje się i będzie swobodnie przesuwać na oponie twardej, mocno chwyć ją pęsetą i unieś znad opony twardej. Upewnij się, że kość nie penetruje mózgu. Za pomocą pęsety i nożyczek sprężynowych delikatnie rozerwij i odetnij oponę twardą.

Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić miąższu mózgu i naczyń krwionośnych. Kontynuuj czynność do momentu usunięcia całej opony twardej z miejsca okna czaszkowego. Po prawidłowym wykonaniu mózg powinien wyglądać na bardzo czysty, z wyraźnie widocznymi naczyniami krwionośnymi i bez żadnych skaz.

Spryskaj szkiełko podstawowe 70% etanolem i delikatnie osusz je za pomocą sprężonego powietrza w sprayu. Upewnij się, że szkło jest całkowicie czyste, bez plam i kurzu. Następnie przygotuj 1,3% agarozę, podgrzewając 200 mg proszku agarozy rozpuszczonego w 15 ml buforu do mózgu.

Wprowadź termometr do gorącej agarozy i schładzaj ją do temperatury nieco powyżej temperatury krzepnięcia, do około 40 stopni Celsiusjusza. Proces schładzania można przyspieszyć, polewając probówkę zimną wodą, dbając o to, aby do agarozy nie dostała się żadna woda. Delikatnie mieszaj roztwór termometrem, monitorując jego temperaturę.

Bezpośrednio przed nałożeniem agaru usuń bufor mózgowy z otworu czaszkowego. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza ani cząsteczek, ponieważ będą one zakłócać obrazowanie. Następnie pobierz agar za pomocą końcówki transferowej i nanieś go bezpośrednio na mózg.

Następnie szybko nałóż szkiełko nakrywkę na powierzchnię i przymocuj je za pomocą kropli agarozy w narożnikach. Przedstawiona tutaj mikrofotografia ukazuje szeroką jednostronną kraniotomię z bregma zaznaczonym białym okręgiem na każdym obrazie. Wzorce aktywacji kory pokazano u myszy znieczulonej 0,5% isofluranem po stymulacji przeciwległego wąsa, stymulacji słuchowej, stymulacji przeciwległej przedniej kończyny, stymulacji przeciwległej tylnej kończyny oraz stymulacji wizualnej przeciwległego oka za pomocą diody emitującej światło.

Wystąpiła aktywacja linii środkowej po wszystkich formach stymulacji sensorycznej w czasie od 10 do 25 milisekund po aktywacji pierwotnej kory sensorycznej. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu trzech do czterech godzin. Podczas próby przeprowadzenia tej procedury ważne jest, aby zminimalizować utratę krwi i upewnić się, że kora nie została uszkodzona.

Stosując tę procedurę, inne techniki obrazowania, takie jak obrazowanie optyczne, mogą pomóc w odpowiedzi na istotne pytania, np. w jaki sposób dynamika neuronalna jest wpływana przez aktywność spontaniczną w mózgu zdrowym i chorobowym. Po opracowaniu ta technika pomogła utorować drogę badaczom z dziedziny neuronauki systemowej w eksplorowaniu interakcji i dynamiki neuronalnej między oddalonymi od siebie obszarami kory u myszy. Ten film pokazuje, jak przeprowadzić rozległą boczną kraniotomię u myszy przy minimalnej utracie krwi i uszkodzeniu kory, co umożliwi zgromadzenie danych niezbędnych do odpowiedzi na najważniejsze pytania naukowe.