Barwienie owadów do testów behawioralnych: zachowanie godowe znieczulonych Drosophila

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapewnienie widocznego rozróżnienia między owadami w sposób nieinwazyjny, aby umożliwić ich identyfikację w eksperymentach behawioralnych. Osiąga się to poprzez wstępne zabarwienie powierzchni standardowej pożywki dla drosophila w fiolce za pomocą kilku kropli barwnika spożywczego. Następnie do fiolki dodaje się muchy na trzy godziny, po których drosophila powinny wykazywać intensywne zabarwienie odwłoka.

Można przeprowadzić eksperymenty kojarzenia, na przykład w celu zaobserwowania, czy samice uważają samce zabarwione na określony kolor za bardziej atrakcyjne. W ostateczności technika barwienia ta stanowi szybki, prosty i nieinwazyjny sposób znakowania owadów w celu łatwej identyfikacji eksperymentalnej. Główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak usuwanie części skrzydła muchy, jest to, że jest ona szybsza, mniej inwazyjna i z mniejszym prawdopodobieństwem wpłynie na późniejsze zachowanie.

Metoda ta może być przydatna w szerokim zakresie eksperymentów, w których istotna jest identyfikacja poszczególnych osobników lub klas muszek. Jest ona również na tyle prosta, że może być wykorzystana w prostych doświadczeniach w szkołach lub na uczelniach. Technikę tę zaprezentują Rudy Verse Bo i Chloe Hayes, oboje doktoranci na Uniwersytecie w Liverpoolu. Po przygotowaniu i zestaleniu pożywki, należy dodać od 0,5 do 1 ml niebieskiego barwnika spożywczego na powierzchnię pożywki, a następnie rozprowadzić barwnik po całej powierzchni fiolki.

Następnie przechowywać pożywkę w temperaturze 4 °C przez dwa dni, aby barwnik został wchłonięty przez wierzchnią warstwę pożywki. Następnie przenieść muchy na pożywkę zgodnie z wymogami eksperymentu. W ciągu jednego dnia muchy zabarwione można łatwo odróżnić od much niezabarwionych, co pozwala na przeprowadzenie prób kojarzenia z muchami zabarwionymi.

Za pomocą aspiratora przenieś poszczególne dziewicze samce do standardowych plastikowych probówek o wymiarach 75 by 20 milimetrów zawierających 20 mililitrów pożywki. W przypadku przeprowadzania prób kopulacyjnych z dwoma samcami, umieść połowę samców z każdej grupy badawczej w probówkach z kolorową pożywką. Następnie przenieś nowo wyklute samice do probówek ze świeżą pożywką w grupach po 10 osobników.

Następnie należy pozwolić obu płciom dojrzeć do wieku rozrodczego w temperaturze odpowiedniej dla danego gatunku. Gdy drosophila będą gotowe, poddaj samce eksperymentalne wybranej procedurze. Na przykład, pozostałe muchy należy poddać anestezji dwutlenkiem węgla, a probówki opisać w celu zidentyfikowania rodzaju zabiegu oraz statusu kolorystycznego much w dniu poprzedzającym badanie.

Przenieś samice do oddzielnych fiolek zawierających 20 mililitrów pożywki, aby aklimatyzować muchy do fiolek kopulacyjnych, a następnie oznacz fiolki neutralnymi etykietami w celu przeprowadzenia badania metodą ślepej próby. Następnie dodaj jedną lub dwie samce do każdej fiolki kopulacyjnej zawierającej jedną samicę, zgodnie z potrzebami.

Rozpocznij próbę kojarzenia w momencie zapalenia się świateł w inkubatorze dla dwóch prób kojarzenia samców. Upewnij się, że każdy samiec pochodzi z innej grupy badawczej i że jedna mucha wykazuje zabarwienie odwłoka. Odnotuj grupę badawczą i kolorystykę każdego samca muchy.

Jeśli kopulacja nastąpi w ciągu dwóch godzin, odnotuj status dice samca, który kopuluje, w przypadku prób kopulacji z pojedynczym samcem. Zapisz czas rozpoczęcia i zakończenia kopulacji. Następnie oblicz dane dotyczące czasu utajenia sukcesu kopulacyjnego oraz czasu trwania kopulacji dla danej próby.

Najlepszy model wyjaśniający zmienność efektu anestezji dwutlenkiem węgla uwzględnia gatunki jako czynnik. Na przykład, w tych reprezentatywnych eksperymentach anestezja dwutlenkiem węgla nie wywarła istotnego wpływu na sukces kopulacyjny drosophila.

Muchy Pseudo obscure i drosophila sub obscure uczestniczyły w dwóch próbach z samcami drosophila melanogaster; jednakże zaobserwowano znacznie niższy sukces kopulacyjny u samców poddanych znieczuleniu dwutlenkiem węgla, przy czym efekt ten był jeszcze silniejszy, gdy drosophila melanogaster były narażone na gaz podczas zbierania lub na jeden dzień przed próbami. Nie odnotowano istotnych różnic w kopulacji u much barwionych pokarmem dla żadnego z trzech gatunków, podobnie jak w przypadku uwzględnienia zabiegu w analizie lub statusu kopulacyjnego owadów w pojedynczych próbach kopulacyjnych. Brak różnic w kopulacji.

W przypadku każdego z trzech gatunków zaobserwowano opóźnienie, gdy do zbierania świeżo wyklutych osobników dorosłych stosowano znieczulenie dwutlenkiem węgla. Wpływ na czas trwania kopulacji wykazano wyłącznie u much drosophila sub obscure, gdy zostały one poddane działaniu dwutlenku węgla na dwa dni przed próbami kopulacyjnymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre wyobrażenie o tym, jak wykorzystać barwienie jelit jako nieinwazyjną technikę znakowania much podczas przeprowadzania eksperymentów.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest sprawdzenie wpływu badanego barwnika na analizowany gatunek. Niektóre barwniki mogą być toksyczne, a niektóre kolory mogą bezpośrednio wpływać na sukcesywność kopulacji. Na przykład w niektórych gatunkach czerwony barwnik spożywczy może być preferowany.

W niniejszym przypadku zastosowano tę technikę barwienia w celu rozróżnienia much w konkurencyjnych próbach kojarzenia. Może ona być jednak wykorzystana również w szeregu innych eksperymentów wymagających indywidualnej identyfikacji osobników, takich jak testy oceniające agresję, obronę terytorialną, preferencje pokarmowe lub zachowania społeczne.