Barwienie owadów do testów behawioralnych: zachowanie godowe znieczulonych Drosophila
22 kwietnia 2015
Ten protokół opisuje prosty, ekonomiczny sposób indywidualnej identyfikacji Drosophila lub innych owadów. Dane demonstracyjne badające sukces godowy trzech gatunków Drosophila pokazują, że metoda ta jest porównywalna lub lepsza niż zastosowanie znieczulenia CO2 .
Ogólnym celem tej procedury jest sprawienie, aby owady widocznie różniły się od siebie w sposób nieinwazyjny w celu ich identyfikacji w eksperymentach behawioralnych. Osiąga się to poprzez najpierw widoczne zabarwienie powierzchni normalnego pokarmu dla muszek w standardowej fiolce na muchy kilkoma kroplami barwnika spożywczego. Następnie muchy dodaje się do fiolki na trzy godziny, po czym muszki powinny wykazywać silne zabarwienie brzucha.
Eksperymenty godowe można przeprowadzić, na przykład, aby zaobserwować, czy samice uważają samce farbowane na określony kolor za bardziej atrakcyjne. Ostatecznie ta technika barwienia jest szybkim, prostym i nieinwazyjnym sposobem oznaczania owadów w celu łatwej identyfikacji eksperymentalnej. Główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak usunięcie części skrzydła muchy, jest to, że jest ona szybsza, mniej inwazyjna i mniej podatna na późniejsze zachowanie.
Ta metoda może być przydatna w wielu różnych eksperymentach, w których ważna jest identyfikacja osobników lub klas much. Jest również dość łatwy do wykorzystania w prostych eksperymentach w szkołach lub na uczelniach. Zademonstrują tę technikę Rudy Verse Bo i Chloe Hayes, oboje doktoranci na Uniwersytecie w Liverpoolu Po wywołaniu i zestaleniu żywności zacznij od dodania 0,5 do jednego mililitra niebieskiego barwnika spożywczego na wierzchu żywności, rozprowadź barwnik na całej powierzchni fiolki.
Następnie przechowuj żywność w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa dni, aby dieta mogła zostać wchłonięta przez wierzchnią warstwę żywności. Następnie przenieś muchy na pokarm zgodnie z potrzebami eksperymentu. W ciągu jednego dnia muchy dietetyczne można łatwo odróżnić od much niefarbowanych, aby przeprowadzić próbę godową z farbowanymi muchami.
Użyj aspiratora, aby przenieść poszczególne dziewicze samce do standardowych plastikowych fiolek o wymiarach 75 na 20 milimetrów zawierających 20 mililitrów żywności. W przypadku wykonywania próby krycia z dwoma samcami, umieść połowę samców w każdej grupie leczonej w fiolkach z kolorowym pokarmem. Następnie przenieś nowo powstałe samice do fiolek ze świeżą żywnością w grupach po 10 sztuk.
Teraz pozwól obu płciom dojrzeć do wieku godowego w odpowiedniej dla gatunku temperaturze. Kiedy drosophila będzie gotowa, wystaw eksperymentalne samce na pożądane leczenie. Na przykład, inne muszki są znieczulane dwutlenkiem węgla i oznaczają fiolki, aby zidentyfikować zarówno leczenie, jak i status koloru much w dniu poprzedzającym badanie.
Przenieś samice do pojedynczych fiolek zawierających 20 mililitrów pokarmu, aby zaaklimatyzować muchy do fiolki godowej i oznacz fiolki neutralnymi etykietami, aby zaślepić eksperyment. Następnie dodaj jednego lub dwa samce much do każdej fiolki godowej zawierającej pojedynczą samicę muchy. W stosownych przypadkach.
Rozpocznij próbę krycia tak, aby zbiegła się w czasie z zapaleniem się świateł w inkubatorze dla dwóch prób krycia samców. Zadbaj o to, aby każdy samiec pochodził z innego leczenia i aby jedna mucha wykazywała przebarwienia na brzuchu. Zapisz leczenie i ubarwienie każdego samca muchy.
Jeśli kopulacja nastąpi w ciągu dwóch godzin, zapisz status kostki samca, który łączy się w pary w próbach godowych z pojedynczym samcem. Zapisz czas rozpoczęcia i zakończenia krycia. Następnie oblicz dane dotyczące opóźnienia i czasu trwania zakończenia krycia dla próby.
Najlepszy znaleziony model wyjaśniający zmienność wpływu dwutlenku węgla. Znieczulenie zawiera gatunki jako czynnik. Na przykład w tych reprezentatywnych eksperymentach znieczulenie dwutlenkiem węgla nie wykazało znaczącego wpływu na sukces godowy drosophila.
Muchy pseudo obscure i drosophila sub obscure w dwóch próbach samców dla Drosophila melanogaster, jednak znacznie niższy sukces godowy zaobserwowano u samców wystawionych na znieczulenie dwutlenkiem węgla z jeszcze większym efektem, gdy Drosophila melanogaster były wystawione na działanie gazu podczas pobierania lub dzień przed próbami. Nie zaobserwowano istotnych różnic w kojarzeniu much barwionych w kolorze spożywczym dla żadnego z trzech gatunków, ani nie zaobserwowano uwzględnienia leczenia w analizie lub statusu krycia owadów w pojedynczych próbach krycia. Nie ma różnicy w kryciu.
Opóźnienie zaobserwowano dla każdego z trzech gatunków, gdy znieczulenie dwutlenkiem węgla zostało użyte do zebrania niedawno wyłonionych dorosłych. Wpływ na czas krycia wykazywały tylko muchy Drosophila sub obscure, gdy zostały wystawione na działanie dwutlenku węgla dwa dni przed próbami godowymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak używać barwienia jelit jako nieinwazyjnej techniki oznaczania much podczas eksperymentów.
Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby przetestować wpływ barwnika, który Cię interesuje, na gatunki ogniskowe. Niektóre barwniki mogą być toksyczne, a niektóre kolory mogą bezpośrednio wpływać na sukces krycia. Na przykład czerwony barwnik spożywczy może być preferowany u niektórych gatunków.
Tutaj użyliśmy tej techniki barwienia do rozróżnienia much w konkurencyjnych próbach godowych. Jednak może być również stosowany w wielu innych eksperymentach, w których muchy muszą być indywidualnie identyfikowane, takich jak testy oceniające agresję, obronę terytorialną, aktywność preferencji żywieniowych lub zachowania społeczne.
Przegląd
Ten protokół opisuje nieinwazyjną metodę identyfikacji poszczególnych muszek owocowych Drosophila i innych owadów za pomocą barwników spożywczych. Technika ta umożliwia łatwą identyfikację podczas eksperymentów behawioralnych, demonstrując porównywalne lub lepsze wyniki niż tradycyjne metody, takie jak narażenie na dwutlenek węgla.
Kluczowe elementy badania
Dział neurologii
- Neurobiologia
- Biologia behawioralna
- Entmologia
Tło
- Identyfikacja poszczególnych owadów jest kluczowa dla badań behawioralnych.
- Tradycyjne metody mogą być inwazyjne i wpływać na zachowanie.
- Barwniki spożywcze stanowią szybką i prostą alternatywę.
- Ta metoda jest odpowiednia dla różnych ustawień eksperymentalnych, w tym instytucji edukacyjnych.
Cel badania
- Opracowanie nieinwazyjnej techniki identyfikacji owadów.
- Ocena atrakcyjności samców o różnym kolorze dla samic.
- Porównanie skuteczności tej metody z narażeniem na dwutlenek węgla.
Metody wykorzystane
- Barwienie pokarmu Drosophila barwnikami spożywczymi.
- Pozwolenie muchom na karmienie się zabarwionym pokarmem przez trzy godziny.
- Przeprowadzanie prób godowych z muchami zabarwionymi i nieobarwionymi.
- Rejestrowanie sukcesu godowego i zachowania w kontrolowanych warunkach.
Główne wyniki
- Brak istotnych różnic w sukcesie godowym między muchami zabarwionymi i nieobarwionymi.
- Narażenie na dwutlenek węgla negatywnie wpłynęło na sukces godowy u niektórych gatunków.
- Technika barwienia okazała się skuteczna do identyfikacji poszczególnych osobników.
- Wpływ koloru barwnika na zachowanie powinien być testowany dla konkretnych gatunków.
Wnioski
- Metoda barwienia barwnikami spożywczymi jest wykonalną alternatywą dla identyfikacji owadów.
- Ta technika jest mniej inwazyjna i szybsza niż tradycyjne metody.
- Może być stosowana w różnych kontekstach eksperymentalnych poza próbami godowymi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Non-invasive labeling methods are critical for maintaining behavioral assay integrity in early-stage target validation and phenotypic screening workflows. This food dye technique reduces confounding variables from invasive procedures, supporting more reliable compound screening and mechanistic de-risking in neurobehavioral discovery. The approach enables scalable, reproducible individual identification across species, aligning with enterprise needs for standardized preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables hypothesis testing in mating behavior assays without introducing behavioral artifacts from invasive labeling.
- Operational Value: Provides rapid, low-cost individual identification compatible with high-throughput screening designs.
- Predictive Value: Supports target validation by isolating genetic or pharmacological effects on behavior through minimized procedural noise.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable behavioral readouts (mating success, latency, duration) with reduced technical variability.
- Operational Value: Facilitates assay standardization across laboratories through simple, transferable food-based staining.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and automated tracking systems for compound library screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports cross-species behavioral comparison (D. melanogaster, D. pseudoobscura, D. subobscura) for target conservation studies.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of gene or compound effects on behavior without anesthesia-induced confounds.
- Predictive Confidence: Enables longitudinal behavioral tracking in disease-relevant models where repeated sampling is required.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows as a preprocessing step for behavioral phenotyping, preceding compound exposure and readout collection in lead identification cascades.
- Discovery Biology: Supports isolation of independent variables (e.g., genotype, treatment) by ensuring consistent individual tracking across experimental conditions.
- Screening: Enables reproducible baseline measurements essential for detecting subtle behavioral shifts in compound screens.
- Analytics: Produces categorical and temporal behavioral data (mating status, latency, duration) suitable for statistical modeling and effect size calculation.
- Translational Research: Facilitates biomarker-aligned behavioral endpoints in preclinical models of neuropsychiatric disorders.
- Enterprise Reuse: Represents a platform-agnostic labeling capability applicable across insect-based behavioral assays in academic and industrial settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by eliminating behavioral confounds from traditional labeling methods.
- Operational Value: Enhances reproducibility and cross-lab comparability through standardized, non-invasive identification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in early discovery by increasing assay signal-to-noise ratio.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization through cleaner phenotypic data in validation cascades.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral assay design and species-specific dye tolerance testing.
- Depends on standard laboratory equipment (vials, food coloring, aspirators) with no specialized instrumentation needed.
- Necessitates cross-team protocol standardization for dye concentration, exposure time, and color selection across model systems.
- Involves adaptation considerations for cuticle permeability and pigment absorption across insect species and developmental stages.
- Includes practical limitations such as potential dye toxicity or species-specific color preferences requiring empirical validation.
