Szybki i niezawodny proces analizy transkryptomu bakteryjnego Studium przypadku: Zależna od seryny regulacja genów w Streptococcus pneumoniae

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie przeglądu zmian transkrypcyjnych zachodzących w bakteriach w określonych warunkach. Osiąga się to poprzez uprawę i zbiór komórek bakteryjnych w określonych warunkach, a następnie izolację całkowitego RNA z zebranych komórek i syntezę cDNA z wyizolowanego RNA.

Następnie cDNA są znakowane i hybrydyzowane z przygotowanymi wewnętrznie płytkami do mikroanaliz. Na koniec płytkę przemywa się, po czym zostaje ona zeskanowana i poddana analizie. Ostatecznie mikromacierze służą do wykazania zmian transkrypcyjnych w komórkach bakteryjnych w określonych warunkach.

Główną zaletą technologii mikromacierzy DNA w stosunku do innych istniejących metod badania ekspresji genów, takich jak QPCR czy northern blotting, jest to, że zapewnia ona globalny przegląd wszystkich zmian transkryptomicznych zachodzących w określonych warunkach. Jest ona szybka, niezawodna i stosunkowo tania. Procedurę zaprezentują Mohammed Sal i Airon Manzu, doktoranci z mojego laboratorium genetyki molekularnej. Po rozmrożeniu pelletów komórek s pmo, ED 39 i resuspendowaniu ich w 400 µL te zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować w probówkach z nakrętką śrubową wolnych od RNA: 0,5 g kulek szklanych, 50 µL 10% SDS, 500 µL wcześniej przygotowanego fenolu i chloroformu oraz resuspendowane pellety komórek.

Aby rozbić komórki, umieść probówki w homogenizatorze kulkowym i homogenizuj dwukrotnie po 60 sekund, umieszczając je pomiędzy impulsami na lodzie na jedną minutę, a następnie odwiruj próbki z prędkością 10 000 Gs w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza przez 10 minut. Przenieś górną fazę do nowej probówki, dodaj 500 µL chloroformu i odwiruj przez kolejne pięć minut. Pipetuj 500 µL z górnej fazy do nowych probówek.

Dodaj dwie objętości buforu do lizy i wiązania, a następnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Następnie, używając zestawu do izolacji RNA, wyizoluj całkowite RNA zgodnie z protokołem producenta, aby usunąć zanieczyszczający RNA DNA. Dodaj 100 µL mieszaniny D a's one i inkubuj w temperaturze od 15 do 25 °C przez 20 do 30 minut.

Użyj zestawu RN a's do przemycia oczyszczonego RNA i przeprowadź elucję do objętości 50 µL, aby wykonać reakcję an kneeling w probówkach PCR o pojemności 300 µL. Wymieszaj całkowite RNA z dwoma mikrolitrami random monomers i w razie potrzeby użyj wody wolnej od nukleaz, aby zwiększyć objętość do 18 µL. Inkubuj mieszaninę an kneeling w temperaturze 70 °C przez pięć minut.

Następnie schłodzić reakcje w temperaturze pokojowej przez 10 minut i poddać je krótkiemu wirowaniu przed umieszczeniem probówek na lodzie na co najmniej jedną minutę. Aby przeprowadzić odwrotną transkrypcję cDNA, przygotować mieszaninę do odwrotnej transkrypcji, połączyć 18 µL mieszaniny z 12 µL master mixu i inkubować reakcję w temperaturze 42 °C od dwóch do 16 godzin. Zdegradować mRNA z reakcji, dodając 3 µL 2,5 M NaOH i inkubując w temperaturze 37 °C przez około 15 minut.

Następnie dodaj 15 µL 2 M kwasu HEPES w celu neutralizacji NaOH. Po oczyszczeniu cDNA za pomocą koluminek do oczyszczania produktów PCR, zmierz stężenie cDNA spektrofotometrem, aby móc je znakować. Dodaj 5 µL barwnika reaktywnego aminowego do 20–60 ng/µL cDNA.

Umieść mieszaninę w ciemności i inkubuj w temperaturze pokojowej od 60 do 90 minut, a następnie użyj kolumienek do oczyszczania PR w celu puryfikacji znakowanego barwnikiem cDNA, elując go w 50 µL buforu elucyjnego; za pomocą spektrofotometru upewnij się, że stężenie znakowanego cDNA wynosi co najmniej 0,5 pmol/µL w całkowitej objętości 50 µL. Po przygotowaniu buforu shy zgodnie z protokołem tekstowym, podgrzej bufor do 68 °C przez co najmniej 30 minut. Aby przygotować próbkę, połącz równe ilości znakowanych cDNA, a następnie użyj koncentratorów próżniowych w wysokiej temperaturze, aby zredukować objętość do 7 µL lub mniej.

W międzyczasie, aby oczyścić szkiełka do podnoszenia (lifter slips) w celu zmniejszenia sygnału tła, należy użyć mydła i dużej ilości wody z kranu, a następnie 100% etanolu. Po wysuszeniu szkiełek strumieniem powietrza, należy położyć jedno z nich na preparacie, kierując białą wyściółkę teflonową do dołu. Następnie wysuszone próbki barwnika rozpuścić w 7 µL H2O i inkubować w temperaturze 94 °C przez dwie minuty. Bezzwłocznie dodać 35 µL podgrzanego buforu shy, delikatnie wymieszać i wirować z maksymalną prędkością przez jedną minutę.

Aby osadzić precypitaty, należy wstępnie podgrzać sondę do 68 °C przez około pięć minut przed załadowaniem. W celu przygotowania preparatu na szkiełku z przekładką podnoszącą, należy umieścić uchwyt do szkiełek hybrydyzacyjnych na bloku grzewczym ustawionym na 50 °C. Należy umieścić szkiełka do mikromacierzy DNA wraz z przekładką podnoszącą w podgrzanym uchwycie do szkiełek hybrydyzacyjnych i wstępnie podgrzewać szkiełko z przekładką przez jedną minutę.

Następnie, tak szybko jak to możliwe, nanieś 40 µL próbki docelowej na koniec szkiełka. Pozostaw płyn, aby rozprzestrzenił się między powierzchniami szkła siłami kapilarnymi. Teraz wyjmij wstępnie podgrzaną kasetę do hybrydyzacji z pieca do hybrydyzacji i zamknij urządzenie.

Następnie w kasecie do hybrydyzacji należy umieścić papier filtracyjny nasączony 3 mL 2X SSC. Ostrożnie włóż uchwyt z szkiełkami do hybrydyzacji do kasety. Zamknij kasetę do hybrydyzacji, umieść ją z powrotem w inkubatorze do hybrydyzacji i inkubuj przez 16 do 18 godzin.

Do mycia slajdów należy przygotować świeże bufory do mycia jeden, dwa i trzy, a następnie ogrzać je do 30 °C. Aby zapewnić rozpuszczenie SDS po zakończeniu inkubacji, należy jak najszybciej i delikatnie zanurzyć slajdy w probówce Falcon wypełnionej 50 ml buforu do mycia jeden, aż szkło oprze się o dno probówki. Po tym, jak folia ochronna (lifter slip) opadnie na dno probówki, nie rysując matrycy, należy za pomocą pincety wyjąć slajd i umieścić go w statywie stacji myjącej.

Natychmiast użyj 500 mililitrów buforu do płukania jeden, aby płukać preparaty przez pięć minut. Następnie przenieś preparaty do buforu do płukania dwa na 20 do 30 minut, a następnie przenieś je do 500 mililitrów buforu do płukania trzy na pięć minut. Na koniec wysusz preparaty przy 2000 RPM przez dwie minuty przed przeprowadzeniem analizy mikromacierzy.

Zgodnie z protokołem tekstowym, w celu zbadania wpływu L-seryny na cały transkryptom S. pneumoniae, przeprowadzono analizę mikromacierzy szczepu D 39 Wildtype hodowanego w CDM z 150 µM L-seryny w porównaniu do szczepu hodowanego w 10 mM L-seryny w tym samym medium. W poniższej tabeli wymieniono stężenia całkowitego RNA wyizolowanego z każdej hodowli, jak pokazano na tej rycinie. Po usunięciu DNA sprawdzono jakość RNA.

Te dwie ścieżki reprezentują RNA z 150 µM Seine, a te dwie ścieżki pochodzą z kultur hodowanych w obecności 10 mM seine. Obecność dwóch wyraźnych prążków wskazuje na dobrą jakość RNA. Stężenia cDNA zsyntetyzowanego z całkowitego RNA zapisano w tej kolumnie, a stężenia próbek znakowanych barwnikiem reaktywnym AM mean wyszczególniono tutaj.

Na tej rycinie przedstawiono analizę wykresu punktowego średniego stosunku barwników reaktywnych AM, a dane zostały dodatkowo poddane analizie w celu redukcji szumów. Niniejsza tabela podsumowuje wyniki badań mikromacierzy po zastosowaniu kryteriów różnicy większej niż lub równej dwukrotności oraz wartości P mniejszej niż 0,001. Jak widać, szereg genów wykazywało różnicową ekspresję w obecności minimalnej ilości L-seryny w porównaniu z maksymalną po zastosowaniu tej procedury.

W celu uzyskania odpowiedzi na dalsze pytania po opracowaniu tej metody można zastosować inne techniki, takie jak testy beag, analizy elektrocytów, qPCR, nokaut genowy i/lub badanie siły ekspresji. Technika ta umożliwiła badaczom VFR w dziedzinie biologii molekularnej i komórkowej zbadanie sieci i mechanizmów regulacyjnych w komórkach RAM-dodatnich.