Name: Szybki i niezawodny proces analizy transkryptomu bakteryjnego Studium przypadku: Zależna od seryny regulacja genów w Streptococcus pneumoniae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Poznaj analizę transkryptomu bakteryjnego przy użyciu mikromacierzy DNA i dedykowanego oprogramowania. Metoda ta pozwala na globalne badanie zmian ekspresji genów w Streptococcus pneumoniae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Anne de Jong i Siger Holsappel za pomoc w produkcji preparatów do mikromacierzy DNA. Doceniane jest również wsparcie Anne de Jong dla analizy bioinformatycznej. Dziękujemy również Jelle Slagerowi za zrecenzowanie artykułu. Muhammad Afzal i Irfan Manzoor są wspierani przez GC University, Faisalabad, Pakistan w ramach programu rozwoju wydziału HEC Pakistan.

1. Przygotowanie pożywek i hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Uprawiaj S. pneumoniae D39 odmiana typu dzikiego21, jak opisano wcześniej11. Zaszczepić komórki przechowywane w temperaturze -80 oC w 10% glicerolu (w stosunku 1/100 w 50 ml sterylnych probówkach) w 50 ml chemicznie zdefiniowanej pożywce (CDM) o końcowym pH 6,4 15, ale pominąć L-serynę w mieszaninie aminokwasów. 
	Uwaga: użyto dwóch różnych CDM; jeden zawierający minimalne stężenie L-seryny (150 μM), a drugi zawierający maksymalne stężenie L-seryny (10 mM). To minimalne stężenie jest w zasadzie stężeniem L-seryny w ludzkim osoczu krwi, a celem jest porównanie ekspresji genu szczepu S. pneumoniae D39 w tych dwóch warunkach.</li>
</ol>
2. Izolacja całkowitego RNA
<ol>
	<li>Materiałów
	<ol>
		<li>Użyj kwaśnego fenolu, klasy RNA do izolacji całkowitego RNA.</li>
		<li>Makaron:
		<ol>
			<li>Zawiesić 2 gramy makaronu w 100 ml TE i gotować przez 5 minut. Schłodzić do RT i sonikować do uzyskania żelu makaloidalnego. Odwirować roztwór o stężeniu 2 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, ponownie zawiesić w 50 ml TE pH 8 i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozwiązania:
		<ol>
			<li>Potraktuj wszystkie roztwory pirowęglanem dietylu (DEPC). Dodać 100 μl DEPC/100 ml roztworu, inkubować O/N w temperaturze 37 °C i sterylizować w autoklawie przez 15 minut.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>metodologia
	<ol>
		<li>Hodować 50 ml hodowli komórkowej S. pneumoniae D39 w probówkach o pojemności 50 ml w temperaturze 37 oC (bez wstrząsania) do połowy fazy wykładniczej (OD ~ 0,3). Odwirować kultury w temperaturze 4 °C na 10 000 × g przez 2 min. Wyrzuć pożywkę i natychmiast zamroź granulki komórek w ciekłym azocie.</li>
		<li>Premiks 300 μl chloroformu: IAA (24:1) i 300 μl fenolu (fenol kwasowy, klasa RNA). Użyć 500 μl fazy organicznej w kroku 2.2.3.</li>
		<li>Przygotuj wcześniej następującą mieszaninę w probówkach z nakrętką bez RNA: 0,5 g kulek szklanych, 50 μl 10% SDS, 500 μl fenolu/chloroformu: IAA (jak przygotowano w kroku 2.2.2), warstwa mackaloidalna (150-175 μl, niedokładnie, ponieważ jest bardzo lepka). Ponownie zawiesić granulki komórek w 400 μl TE (DEPC) i dodać zawieszone komórki do zakręcanych probówek.</li>
		<li>Aby rozbić komórki, umieść rurki z nakrętką w ubijaku do kulek na 2x 60-calowe impulsy ("homogenizować") w odstępie 1 minuty na lodzie. Odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 10 000 × g (4 °C).</li>
		<li>Przenieść górną fazę do świeżej probówki, dodać 500 μl chloroformu:IAA (24:1) i wirować przez 5 minut w temperaturze 10 000 × g (4 °C).</li>
		<li>Przenieść 500 μl górnej fazy do świeżych probówek, dodać 2 objętości (1 ml) buforu do lizy/wiązania i mieszać pipetując w górę i w dół. Wyizoluj całkowite RNA za pomocą zestawu do izolacji RNA i postępuj zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Oczyszczanie RNA
<ol>
	<li>Aby usunąć zanieczyszczenie DNA z całkowitego RNA, dodać 100 μl mieszanki DNAseI (90 μl buforu DNAseI i 10 μl DNAseI) i inkubować przez 20-30 minut w temperaturze 15-25 ºC.</li>
	<li>Umyj oczyszczone RNA za pomocą zestawu RNAse. Uzyskać 50 μl eluowanej objętości.</li>
</ol>
4. Analiza RNA
<ol>
	<li>Określ stężenie RNA na spektrofotometrze. Określ jakość RNA za pomocą testu w następujący sposób (ryc. 2).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 1 μl próbki w 50 μl wody DEPC, aby uzyskać stężenie 20-200 ng/μl.</li>
		<li>Użyj 1 μl rozcieńczonej próbki RNA, aby sprawdzić jakość w bioanalizatorze zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uwaga: stosunek 23S:16S wynoszący około 2,0 jest uważany za dobry. 1 jednostka RNA A260 odpowiada 40 μg/ml. Zalecana ilość do etykietowania to 10-20 μg.</li>
</ol>
5. Przygotowanie i znakowanie cDNA
UWAGA: Do przygotowania i znakowania cDNA zastosowano następujący protokół.
<ol>
	<li>Wyżarzanie
	<ol>
		<li>Przeprowadzić reakcję wyżarzania w probówkach PCR o pojemności 300 μl, utrzymując stężenie całkowitego RNA na poziomie 10-15 μg w przypadku szkiełek domowych lub 5 μg w przypadku szkiełek firmowych. Wymieszać RNA z 2 μl losowych nieamerów (1,6 μg/μl) i w razie potrzeby dodać wodę wolną od nukleaz, aby utrzymać końcową objętość mieszaniny wyżarzania na poziomie 18 μl.</li>
		<li>Mieszaninę do wyżarzania należy utrzymywać w temperaturze 70 °C przez 5 minut. Następnie schłodzić mieszaninę do temperatury RT przez 10 minut (wyżarzanie) i w razie potrzeby odwirować reakcje na dno probówki. Umieść probówki reakcyjne na lodzie na co najmniej 1 minutę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwrotna transkrypcja
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę odwrotnej transkryptazy w następujący sposób: do 18 μl mieszanki do wyżarzania dodać 12 μl mieszanki Master (składającej się z 6 μl 5x buforu pierwszej nici, 3 μl 0,1 M DDT, 1,2 μl 25x mieszanki AA-dUTP / nukleotydów i 1,8 μl odwrotnej transkryptazy (1 μl dla szkiełek firmowych). Mieszaninę reakcyjną przechowywać przez 2-16 godzin w temperaturze 42 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Degradacja mRNA i oczyszczanie cDNA
<ol>
	<li>Aby zdegradować mRNA z mieszaniny reakcyjnej, należy dodać 3 μl 2,5 M NaOH i umieścić w temperaturze 37 °C na około 15 minut. Następnie dodaj 15 μl 2M wolnego kwasu HEPES, aby zneutralizować NaOH.</li>
	<li>Oczyść mieszaninę cDNA za pomocą kolumn czyszczących PCR i postępuj zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
7. Pomiar stężenia cDNA
<ol>
	<li>Zmierz stężenie cDNA na spektrofotometrze. Aby kontynuować etykietowanie, sprawdź, czy stężenie cDNA wynosi co najmniej 60 ng/μl (szkiełka domowe) lub 20 ng/μl (szkiełka firmowe).</li>
</ol>
8. Znakowanie cDNA barwnikiem aminowo-reaktywnym i oczyszczanie
<ol>
	<li>Użyj barwnika reagującego z aminami, aby oznaczyć cDNA. Bezpośrednio wymieszać cDNA z jedną podwielokrotnością (5 μl) barwnika reagującego z aminami.</li>
	<li>Mieszaninę inkubować w temperaturze pokojowej, w ciemności, przez 60 do 90 minut i przejść bezpośrednio do oczyszczania cDNA znakowanego barwnikiem. Oczyść cDNA znakowane barwnikiem za pomocą kolumn czyszczących PCR i postępuj zgodnie z protokołem producenta. Eluować cDNA w 50 μl buforu elucyjnego.</li>
</ol>
9. Pomiar znakowanego cDNA
<ol>
	<li>Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć włączenie barwników reagujących aminami do cDNA. Sprawdzić, czy stężenie barwników reagujących z aminami wynosi co najmniej 0,5 pmol/μl w całkowitej objętości 50 μl.</li>
</ol>
10. Mieszanie znakowanych próbek cDNA
<ol>
	<li>W przypadku preparatów domowej roboty użyj całego znakowanego cDNA do hybrydyzacji z nie większą niż 30% różnicą w stężeniu cDNA. W przypadku preparatów produkowanych przez firmę należy używać cDNA o nie większej niż 2-krotnej różnicy w stężeniu cDNA. 
	Uwaga: zwykle do preparatów wykonanych przez firmę potrzeba około 300 ng cDNA, co jest bardzo mało w porównaniu z wymaganą ilością cDNA w przypadku preparatów wykonanych w domu.</li>
</ol>
11. Hybrydyzacja i mycie
<ol>
	<li>Należy użyć następujących odczynników: demi woda, etanol 99%, SHY Buffer (domowej roboty; z 40 μl drożdżowego RNA). Przygotuj maksymalnie 1 ml SHY.</li>
	<li>Przygotowanie aparatury i roztworów
	<ol>
		<li>Włącz koncentratory próżniowe i grzałkę co najmniej 1 godzinę przed suszeniem. Włączyć piec do hybrydyzacji z nastawą dostosowaną do prawidłowej temperatury hybrydyzacji (dla mikromacierzy DNA S. pneumoniae należy użyć 45 °C). Podobnie rozgrzej kasetę hybrydyzacyjną i piekarnik przez 30-60 minut.</li>
		<li>Rozgrzej bufor SHY w temperaturze 68 °C przez co najmniej 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki (znakowanej cDNA)
	<ol>
		<li>Połącz równe ilości znakowanych cDNA (maks. 30% różnicy). Wysuszyć próbkę za pomocą koncentratorów próżniowych w wysokiej temperaturze (ok. 40 min), aż objętość będzie mniejsza niż 7 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poślizg podnośnika
	<ol>
		<li>Używaj czystych ślizgaczy do podnośników. Uwaga: Na szkiełko można załadować ± 30 μl.</li>
		<li>Wyczyść ślizgi podnośnika mydłem, dużą ilością wody z kranu i 100% etanolem. Uwaga: Brudne ślizgi podnośnika dają wysokie tło.</li>
		<li>Wysuszyć ślizgi podnośnika na powietrzu za pomocą pistoletu pneumatycznego, aby zdmuchnąć cząsteczki kurzu. Umieść czysty ślizg podnośnika na zjeżdżalni z białą teflonową wyściółką po bokach skierowaną w dół.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodawanie buforu hybrydyzacyjnego (do znakowanego cDNA)
	<ol>
		<li>Rozpuścić wysuszone próbki barwnika w 7 μlH2Oi inkubować w temperaturze 94 °C przez 2 minuty.</li>
		<li>Natychmiast dodać 35 μl podgrzanego buforu SHY (68 °C), delikatnie wymieszać i wirować na maksymalnych obrotach przez 1 minutę, aby pozbyć się osadów. Rozgrzej sondę w temperaturze 68 °C przez około 5 minut, aż do załadowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż ślizgowo-podnośnikowo-ślizgowy i podgrzewanie.
	<ol>
		<li>Umieścić uchwyt szkiełka hybrydyzacyjnego na bloku grzewczym w temperaturze 50 °C. Umieścić szkiełka do mikromacierzy DNA z szkiełkiem podnoszącym na podgrzewanym uchwycie szkiełka do hybrydyzacji i podgrzać szkiełko z szkiełkiem do podnoszenia, przez minutę. Wykonaj kolejne kroki tak szybko, jak to możliwe.</li>
		<li>Dodać 40 μl próbki docelowej na końcu szkiełka. Pozwól, aby płyn przepływał między powierzchniami szkła za pomocą siły kapilarnej. Pipetowanie należy wykonywać powoli i ostrożnie.</li>
		<li>Utrzymuj prowadnice z poślizgiem podnośnika w pozycji poziomej przez cały czas i poruszaj się powoli, aby upewnić się, że ślizg podnośnika się nie poruszył.</li>
		<li>Wyjmij wstępnie podgrzaną kasetę do hybrydyzacji z piekarnika do hybrydyzacji i zamknij maszynę. Umieścić bibułę filtracyjną nasączoną 3 ml 2x SSC (standardowy cytrynian soli fizjologicznej) w kasecie hybrydyzacyjnej.</li>
		<li>Delikatnie umieść uchwyt szkiełka hybrydyzacyjnego ze szkiełkami w kasecie do hybrydyzacji. Zamknij kasetę do hybrydyzacji i ponownie włóż do pieca do hybrydyzacji (na około 16-18 godzin).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie szkiełek
	<ol>
		<li>Przygotować świeże płuczące I, II i III (750 ml na każdy etap mycia). W przypadku 500 ml buforu płuczącego I należy użyć 2 x SSC / 0,5 % SDS. W przypadku 500 ml buforu płuczącego II należy użyć 1 x SSC / 0,25 % SDS. W przypadku 500 ml buforu płuczącego III należy użyć 1 x SSC / 0,1 % SDS (opcjonalnie)</li>
		<li>Umieścić myjące w temperaturze 30 °C (aby upewnić się, że SDS jest rozpuszczony).</li>
		<li>Zanurz szkiełka tak szybko, jak to możliwe, ale bardzo delikatnie, w probówce sokoła wypełnionej 50 ml buforem do płukania I, aż szkło oprze się na stożkowym dnie probówki.</li>
		<li>Po kilku sekundach, gdy ślizg podnośnika opadnie na dno rury, wyjmij szkiełko pęsetą bez rysowania matrycy i włóż do stojaka stacji myjącej. Kontynuuj pranie bez przerwy czasowej.</li>
		<li>Myć szkiełka przez 5 min w 500 ml buforze do płukania I (w stacji myjącej). Poddać go drugiemu płukaniu przez 20-30 minut w 500 ml buforu myjącego II (w stacji myjącej). Podobnie myć szkiełka przez 5 minut w 500 ml buforze myjącym III (opcjonalnie) (w stacji myjącej).</li>
		<li>Suszyć szkiełka przez 2 minuty przy 2 000 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
12. Analiza mikromacierzy
<ol>
	<li>Skanuj obrazy o odpowiednich długościach fal w skanerze i zapisz w folderze "Jove Project".</li>
	<li>Użyj oprogramowania, aby wstępnie przeanalizować zeskanowane pliki zgodnie z wcześniejszym opisem 22. Po uruchomieniu tego oprogramowania wybierz zakładkę "Otwórz obraz", aby załadować czerwony plik obrazu (-.550) jako "Czerwony" i zielony plik obrazu (-.635) jako "Zielony". Prześlij plik gal (.gal) z listą tablic S. pneumoniae w pliku obrazu, wybierając zakładkę "Załaduj listę tablic" 22. 
	Uwaga: ta lista tablic składała się z 48 siatek, na każdej siatce znajdowało się 16 wierszy i 15 kolumn. Każde miejsce na siatce reprezentuje pojedynczy gen, a informacje o plamie, w tym nazwa genu, są dodawane za pomocą pliku opisu plamki. Numery spotów są podane od lewej do prawej i od góry do dołu.</li>
	<li>Po dokładnym dostrzeżenie siatek wybierz zakładkę "Znajdź tablicę, Znajdź bloki, Wyrównaj obiekty", aby wyrównać miejsca. Po wyrównaniu wszystkich obiektów przeanalizuj obraz, wybierając zakładkę "Analizowanie". Utwórz nowy plik z wynikami, histogramem i wykresem punktowym. Zapisz ten plik z zakładki "Zapisz wyniki jako" jako plik .gpr do dalszej analizy.</li>
	<li>Wykonaj dalszą normalizację i przetwarzanie danych za pomocą opracowanego przez nas pakietu oprogramowania Microprep, zgodnie z opisem9.</li>
	<li>Używaj niezależnych replik biologicznych dla danych z mikromacierzy DNA, które są wymieniane barwnikami. Wykonaj implementację CyberT wariantu testu t-test1 i oblicz współczynniki fałszywych wykryć (FDR) zgodnie z opisem9.</li>
	<li>W przypadku genów o zróżnicowanej ekspresji przyjmij jako standard p < 0,001 i FDR < 0,05.</li>
	<li>Prześlij dane z mikromacierzy DNA na stronę składania NCBI, aby uzyskać numer dostępu GEO (Gene Expression Omnibus).</li>
</ol>

<ol><li>Kayala, M. A., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyber-T+web+server%3A+differential+analysis+of+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data.</a> Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).</li>
<li>Chang, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+cells+to+matrixes+of+distinct+antibodies+coated+on+solid+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface.</a> J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).</li>
<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li>
<li>Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+procedure+for+the+isolation+of+RNA+from+high-phenolic-containing+tissues+of+pecan%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan.</a> 27 (12), 1316-1318 (1992).</li>
<li>Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extraction+of+intact+RNA+from+fruits+rich+in+polysaccharides+using+ripe+mango+mesocarp%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp.</a> (5), 440-442 (1992).</li>
<li>Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+improved+RNA+isolation+method+for+plant+tissues+containing+high+levels+of+phenolic+compounds+or+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Report%22%5BJournal%5D)">A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates.</a> Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).</li>
<li>Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+protocol+for+isolation+of+functional+RNA+from+plant+tissues+rich+in+secondary+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol.+Report%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites.</a> Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).</li>
<li>Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+isolating+high-quality+RNA+from+leaves+of+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Enol.+Vitic%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine.</a> Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).</li>
<li>Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroPreP%3A+a+cDNA+microarray+data+pre-processing+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework.</a> Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).</li>
<li>Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors+in+host+respiratory+colonization+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease.</a> Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).</li>
<li>Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LacR+is+a+repressor+of+lacABCD+and+LacT+is+an+activator+of+lacTFEG%2C+constituting+the+lac+gene+cluster+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).</li>
<li>Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UlaR+activates+the+expression+of+the+ula+operon+in+Streptococcus+pneumoniae+in+the+presence+of+ascorbic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Read.+Engl%22%5BJournal%5D)">UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid.</a> Microbiol. Read. Engl. , (2014).</li>
<li>Hendriksen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+contributions+of+glutamine-dependent+regulator+GlnR+and+GlnR-regulated+genes+to+virulence+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae.</a> Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).</li>
<li>Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+arginine+acquisition+and+virulence+gene+expression+in+the+human+pathogen+Streptococcus+pneumoniae+by+transcription+regulators+ArgR1+and+AhrC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC.</a> J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).</li>
<li>Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+have+neighbour%27s+fare%3A+extending+the+molecular+toolbox+for+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Read.+Engl%22%5BJournal%5D)">To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).</li>
<li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIVA%3A+Functional+Information+Viewer+and+Analyzer+extracting+biological+knowledge+from+transcriptome+data+of+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinforma.+Oxf.+Engl%22%5BJournal%5D)">FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes.</a> Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).</li>
<li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prosecutor%3A+parameter-free+inference+of+gene+function+for+prokaryotes+using+DNA+microarray+data%2C+genomic+context+and+multiple+gene+annotation+sources%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources.</a> BMC Genomics. 9, 495(2008).</li>
<li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DISCLOSE+%3A+DISsection+of+CLusters+Obtained+by+SEries+of+transcriptome+data+using+functional+annotations+and+putative+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites.</a> BMC Bioinformatics. 9, 535(2008).</li>
<li>Baerends, R. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome2D%3A+a+visualization+tool+for+the+rapid+analysis+of+bacterial+transcriptome+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data.</a> Genome Biol. 5 (5), R37(2004).</li>
<li>De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PePPER%2C+a+webserver+for+prediction+of+prokaryote+promoter+elements+and+regulons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons.</a> BMC Genomics. 13, 229(2012).</li>
<li>Lanie, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+Avery%27s+virulent+serotype+2+strain+D39+of+Streptococcus+pneumoniae+and+comparison+with+that+of+unencapsulated+laboratory+strain+R6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6.</a> J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).</li>
<li>Molecular Devices, Corp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GenePix+Pro+6.0+Microarray+Acquisition+and+Analysis+Software+for+GenePix+Microarray+Scanners-Use%27s+Guide+and+Tutorial%22">GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial</a>. , Molecular Devices, Corp. (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisujemy przyjazny dla użytkownika protokół, który można zastosować do przeprowadzenia pełnej analizy transkryptomu bakterii. Kluczową kwestią dotyczącą tej konkretnej techniki jest to, że warunki, w których komórki są zbierane, będą się różnić. Po zebraniu komórek i wyizolowaniu RNA, technika ta staje się równa dla wszystkich rodzajów próbek bakteryjnych i przebiega dokładnie identycznie kroki, a zatem może być stosowana do każdego rodzaju kultury bakteryjnej. Protokół jest bardzo prosty i wygodny i zaczyna się od izol...

Badanie całego zestawu obfitości mRNA (transkryptomu) kodowanego przez genom organizmu jednokomórkowego lub komórki eukariotycznej w określonym czasie lub w określonym stanie, w tym nadekspresji lub nokautu genów, nazywa się transkryptomiką. Transkryptomika pozwala nam zaobserwować, w jakim stopniu geny ulegają ekspresji w określonych warunkach w punkcie czasowym X i daje nam informacje o tym, jak silnie geny są wyrażane w stosunku do odniesienia.
Mikrotablica to dwuwymiarowa tablica na stałym podłożu (zwykle szkiełko podstawowe lub cienkowarstwowa komórka krzemowa), która może być używana do oznaczania dużych ilości materiału biologicznego za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych oraz zminiaturyzowanych, multipleksowanych i równoległych metod przetwarzania i wykrywania. Mikromacierze występują w różnych typach, w tym mikromacierze DNA, mikromacierze białkowe, mikromacierze peptydowe, mikromacierze tkankowe, mikromacierze przeciwciał, mikromacierze komórkowe i inne. Mikromacierz DNA to w zasadzie zespół mikroskopijnych plamek DNA przymocowanych do stałej powierzchni, zwykle szkła. Mikromacierze DNA są używane do pomiaru poziomów ekspresji genu lub zestawu genów jednocześnie lub do genotypowania wielu regionów genomu2,3. Pikomole (10-12 moli) sondy są obecne w każdej plamce DNA, która reprezentuje określoną sekwencję DNA, znaną również jako reporter. Znakowane cząsteczki mRNA z próbek nazywane są "tarczami". Fluorofory są używane do pomiaru hybrydyzacji sonda-cel, a wykrywanie celów znakowanych fluoroforem określa względną obfitość sekwencji kwasów nukleinowych w celu. Eksperyment z mikromacierzą może wykonywać wiele testów genetycznych równolegle, ponieważ tablica może zawierać dziesiątki tysięcy sond. Układ prostego eksperymentu z mikromacierzą pokazano na rysunku 1. Niedawno ustalono w naszych i innych laboratoriach, że te macierze są wielokrotnego użytku, co czyni tę technikę dość opłacalną.
Na przestrzeni lat opracowano różne techniki izolacji i oczyszczania RNA, w tym metody C-TAB, SDS i GT 4–8. Ponadto dostępnych jest również kilka zestawów komercyjnych. Dla ekspresji genów bardzo ważna jest wysoka jakość RNA. Dlatego metody izolacji RNA są modyfikowane w celu uzyskania maksymalnej ilości RNA. Podobnie, etapy przygotowania cDNA i znakowania cDNA są zminimalizowane. Normalizacja danych po skanowaniu jest również wykonywana wydajnie przy użyciu własnych pakietów oprogramowania i narzędzi9.
Streptococcus pneumoniae to ludzki patogen Gram-dodatni, który kolonizuje nosogardziel i jest przyczyną wielu infekcji, takich jak zapalenie płuc, sepsa, zapalenie ucha środkowego i zapalenie opon mózgowych10. Bakteria może wykorzystywać szeroką gamę składników odżywczych niezbędnych do wzrostu i przetrwania 11,12. Przeprowadzono szereg badań nad metabolizmem i regulacją azotu w pneumokokach, podkreślając znaczenie aminokwasów i ich rolę w wirulencji13,14. W tym badaniu odpowiedź transkryptomiczna S. pneumoniae na zmieniające się stężenia L-seryny, aminokwasu obficie występującego w ludzkim osoczu krwi, jest opisana za pomocą mikromacierzy DNA. Odpowiedź transkryptomiczną S. pneumoniae hodowanych w minimalnym stężeniu L-seryny (150 μM) porównano z odpowiedzią wyhodowaną w maksymalnym stężeniu (10 mM) seryny. W tym badaniu użyto chemicznie zdefiniowanego podłoża (CDM lub pożywki minimalnej)15 w celu kontrolowania stężenia seryny. Celem tego badania jest uczynienie tej techniki przyjazną dla użytkownika oraz zapewnienie różnych narzędzi do normalizacji i analizy danych. W związku z tym opracowano szereg narzędzi do analizy i interpretacji danych. FIVA (Functional Information Viewer and Analyzer) stanowi platformę do przetwarzania informacji zawartych w klastrach genów o podobnych wzorcach ekspresji genów oraz do konstruowania profili funkcjonalnych16. PROSECUTOR to kolejny pakiet oprogramowania, który ułatwia identyfikację przypuszczalnych funkcji i adnotacji genów 17. Wykorzystując metody grupowania, DISCLOSE zapewnia algorytm wykrywania miejsca wiązania DNA. Za pomocą tego algorytmu można rzutować motywy cis-regulatorowe genów 18. Genome2D oferuje platformę opartą na systemie Windows do wizualizacji i analizy danych transkryptomu, oferując różne zakresy kolorów w celu scharakteryzowania zmian w poziomach ekspresji genów na mapie genomu19. Serwer internetowy PePPER oferuje, oprócz metody analizy typu "wszystko w jednym", zestaw narzędzi do poszukiwania regulonów, promotorów i miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych 20. Za pomocą tego pakietu można uzyskać pełną adnotację regionów międzygenowych w genomie bakteryjnym. Biolodzy mogą odnieść ogromne korzyści z projektu PePER, ponieważ oferuje im on platformę do projektowania eksperymentów, dzięki czemu hipotetyczne informacje mogą zostać potwierdzone in vitro20. Te pakiety oprogramowania w znacznym stopniu przyczyniają się do analizy mikromacierzy, ponieważ większość z nich jest swobodnie dostępna i sprawia, że normalizacja i analiza danych są bardzo niezawodne.

<table><tbody><tr><td>Kwaśny fenol</td><td>SigmaAldrich</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA Roche</td><td>Applied Science</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki</td><td></td> szklane <td>105015</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Boom</td><td>92013505.1000.</td><td></td></tr><tr><td>IAA</td><td></td><td>106630</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Nanodrop</td><td>ND-100</td><td></td></tr><tr><td>Agilent BioAnalyser</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny III</td><td>Technologie życia Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>AA-dUTP</td><td>Technologie życia Invitrogen</td><td>AM8439</td><td></td></tr><tr><td>DDT</td><td>Technologie życia Invitrogen</td><td></td><td></td>18080044</tr><tr><td>Bufor First Strand</td><td>Life Technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SigmaAldrich</td><td>S8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-550</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62262</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-650</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62265</td><td></td></tr><tr><td>SHY Buffer</td><td>SigmaAldrich</td><td>H7033-125ML</td><td></td></tr><tr><td>Chłodnica Speedvac</td><td>Eppendorf</td><td>RUGNE3140</td><td>Koncentrator Speedvac plus</td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>Grant Boekel</td><td>Iso-20</td><td></td></tr><tr><td>Lifter-slips</td><td>Erie Scientific</td><td>25x60I-M-5439</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczka</td><td>KIMTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>SigmaAldrich</td><td>L3771-100g</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>SigmaAldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Genpix autoloader 4200A1</td><td>MSD technologie</td><td></td> analityczne <td>Skaner mikrotablicowy</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>SigmaAldrich</td><td>104766</td><td></td></tr></tbody></table>

szybki i niezawodny proces analizy transkryptomu bakteryjnego studium przypadku: zależna od seryny regulacja genów w streptococcus pneumoniae

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

Ekspresja genów i jej regulacja są bardzo ważne dla zrozumienia zachowania komórek w różnych warunkach. Obecnie stosuje się różne techniki do badania ekspresji genów, ale większość z nich jest ograniczona pod względem zapewnienia ogólnego obrazu ekspresji całego transkryptomu. Mikromacierze DNA oferują szybką i ekonomiczną technologię badawczą, która daje pełny przegląd globalnej ekspresji genów i ma ogromną liczbę zastosowań, w tym identyfikację nowych genów i miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych, charakterystykę aktywności transkrypcyjnej komórek, a także pomaga w analizie tysięcy genów (w jednym eksperymencie). W niniejszym badaniu zoptymalizowano warunki analizy transkryptomu bakteryjnego od pobrania komórek do analizy mikromacierzy DNA. Biorąc pod uwagę czas, koszty i dokładność eksperymentów, ta platforma technologiczna okazuje się bardzo przydatna i ma uniwersalne zastosowanie do badania transkryptomów bakteryjnych. Tutaj przeprowadzamy analizę mikromacierzy DNA z Streptococcus pneumoniae jako studium przypadku, porównując odpowiedzi transkrypcyjne S. pneumoniae hodowanych w obecności różnych stężeń L-seryny w pożywce. Całkowite RNA wyizolowano metodą Macaloida przy użyciu zestawu do izolacji RNA, a jakość RNA sprawdzono za pomocą zestawu do kontroli jakości RNA. cDNA przygotowano przy użyciu odwrotnej transkryptazy, a próbki cDNA znakowano przy użyciu jednego z dwóch aminowo-reaktywnych barwników fluorescencyjnych. Do hybrydyzacji znakowanych próbek cDNA użyto domowych preparatów z mikromacierzy DNA, a dane z mikromacierzy przeanalizowano przy użyciu struktury wstępnego przetwarzania danych z mikromacierzy cDNA (Microprep). Wreszcie, Cyber-T wykorzystano do analizy danych wygenerowanych za pomocą Microprep w celu identyfikacji statystycznie istotnych genów o zróżnicowanej ekspresji. Ponadto do analizy danych wykorzystano autorskie pakiety oprogramowania (PePPER, FIVA, DISCLOSE, PROSECUTOR, Genome2D).

Izolacja i analiza RNA oraz cDNA
L-seryna jest jednym z niezbędnych aminokwasów, a jej stężenie w ludzkiej osoczu krwi waha się od 60-150 µM u dzieci i dorosłych. Jej rola w biosyntezie puryn i pyrymidyn podkreśla jej znaczenie w metabolizmie; stanowi ona również prekursor kilku aminokwasów (glicyny, cysteiny i tryptofanu). Aby zbadać wpływ L-seryny na cały transkryptom szczepu dzikiego S. pneumoniae D39, przeprowadzono analizę mikromacierzową szczepu D39 hodowanego w...

Ten manuskrypt opisuje użycie najnowocześniejszej technologii dostarczanej przez mikromacierze DNA. Mikromacierze zapewniają przegląd zmian transkryptomicznych u bakterii powstałych w określonych warunkach. Ponadto podkreślamy łatwość, z jaką można analizować duże ilości danych za pomocą wygodnych, opracowanych przez nas pakietów oprogramowania.

Szybki i niezawodny proces analizy transkryptomu bakteryjnego Studium przypadku: Zależna od seryny regulacja genów w Streptococcus pneumoniae

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie przeglądu zmian transkrypcyjnych zachodzących w bakteriach w określonych warunkach. Osiąga się to poprzez uprawę i zbiór komórek bakteryjnych w określonych warunkach, a następnie izolację całkowitego RNA z zebranych komórek i syntezę cDNA z wyizolowanego RNA.Następnie cDNA są znakowane i hybrydyzowane z przygotowanymi wewnętrznie płytkami do mikroanaliz. Na koniec płytkę przemywa się, po czym zostaje ona zeskanowana i poddana analizie. Ostatecznie mikromacierze służą do wykazania zmian transkrypcyjnych w komórkach bakteryjnych w określonych warunkach.Główną zaletą technologii mikromacierzy DNA w stosunku do innych istniejących metod badania ekspresji genów, takich jak QPCR czy northern blotting, jest to, że zapewnia ona globalny przegląd wszystkich zmian transkryptomicznych zachodzących w określonych warunkach. Jest ona szybka, niezawodna i stosunkowo tania. Procedurę zaprezentują Mohammed Sal i Airon Manzu, doktoranci z mojego laboratorium genetyki molekularnej. Po rozmrożeniu pelletów komórek s pmo, ED 39 i resuspendowaniu ich w 400 µL te zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować w probówkach z nakrętką śrubową wolnych od RNA: 0,5 g kulek szklanych, 50 µL 10% SDS, 500 µL wcześniej przygotowanego fenolu i chloroformu oraz resuspendowane pellety komórek.Aby rozbić komórki, umieść probówki w homogenizatorze kulkowym i homogenizuj dwukrotnie po 60 sekund, umieszczając je pomiędzy impulsami na lodzie na jedną minutę, a następnie odwiruj próbki z prędkością 10 000 Gs w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza przez 10 minut. Przenieś górną fazę do nowej probówki, dodaj 500 µL chloroformu i odwiruj przez kolejne pięć minut. Pipetuj 500 µL z górnej fazy do nowych probówek.Dodaj dwie objętości buforu do lizy i wiązania, a następnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Następnie, używając zestawu do izolacji RNA, wyizoluj całkowite RNA zgodnie z protokołem producenta, aby usunąć zanieczyszczający RNA DNA. Dodaj 100 µL mieszaniny D a's one i inkubuj w temperaturze od 15 do 25 °C przez 20 do 30 minut.Użyj zestawu RN a's do przemycia oczyszczonego RNA i przeprowadź elucję do objętości 50 µL, aby wykonać reakcję an kneeling w probówkach PCR o pojemności 300 µL. Wymieszaj całkowite RNA z dwoma mikrolitrami random monomers i w razie potrzeby użyj wody wolnej od nukleaz, aby zwiększyć objętość do 18 µL. Inkubuj mieszaninę an kneeling w temperaturze 70 °C przez pięć minut.Następnie schłodzić reakcje w temperaturze pokojowej przez 10 minut i poddać je krótkiemu wirowaniu przed umieszczeniem probówek na lodzie na co najmniej jedną minutę. Aby przeprowadzić odwrotną transkrypcję cDNA, przygotować mieszaninę do odwrotnej transkrypcji, połączyć 18 µL mieszaniny z 12 µL master mixu i inkubować reakcję w temperaturze 42 °C od dwóch do 16 godzin. Zdegradować mRNA z reakcji, dodając 3 µL 2,5 M NaOH i inkubując w temperaturze 37 °C przez około 15 minut.Następnie dodaj 15 µL 2 M kwasu HEPES w celu neutralizacji NaOH. Po oczyszczeniu cDNA za pomocą koluminek do oczyszczania produktów PCR, zmierz stężenie cDNA spektrofotometrem, aby móc je znakować. Dodaj 5 µL barwnika reaktywnego aminowego do 20–60 ng/µL cDNA.Umieść mieszaninę w ciemności i inkubuj w temperaturze pokojowej od 60 do 90 minut, a następnie użyj kolumienek do oczyszczania PR w celu puryfikacji znakowanego barwnikiem cDNA, elując go w 50 µL buforu elucyjnego; za pomocą spektrofotometru upewnij się, że stężenie znakowanego cDNA wynosi co najmniej 0,5 pmol/µL w całkowitej objętości 50 µL. Po przygotowaniu buforu shy zgodnie z protokołem tekstowym, podgrzej bufor do 68 °C przez co najmniej 30 minut. Aby przygotować próbkę, połącz równe ilości znakowanych cDNA, a następnie użyj koncentratorów próżniowych w wysokiej temperaturze, aby zredukować objętość do 7 µL lub mniej.W międzyczasie, aby oczyścić szkiełka do podnoszenia (lifter slips) w celu zmniejszenia sygnału tła, należy użyć mydła i dużej ilości wody z kranu, a następnie 100% etanolu. Po wysuszeniu szkiełek strumieniem powietrza, należy położyć jedno z nich na preparacie, kierując białą wyściółkę teflonową do dołu. Następnie wysuszone próbki barwnika rozpuścić w 7 µL H2O i inkubować w temperaturze 94 °C przez dwie minuty. Bezzwłocznie dodać 35 µL podgrzanego buforu shy, delikatnie wymieszać i wirować z maksymalną prędkością przez jedną minutę.Aby osadzić precypitaty, należy wstępnie podgrzać sondę do 68 °C przez około pięć minut przed załadowaniem. W celu przygotowania preparatu na szkiełku z przekładką podnoszącą, należy umieścić uchwyt do szkiełek hybrydyzacyjnych na bloku grzewczym ustawionym na 50 °C. Należy umieścić szkiełka do mikromacierzy DNA wraz z przekładką podnoszącą w podgrzanym uchwycie do szkiełek hybrydyzacyjnych i wstępnie podgrzewać szkiełko z przekładką przez jedną minutę.Następnie, tak szybko jak to możliwe, nanieś 40 µL próbki docelowej na koniec szkiełka. Pozostaw płyn, aby rozprzestrzenił się między powierzchniami szkła siłami kapilarnymi. Teraz wyjmij wstępnie podgrzaną kasetę do hybrydyzacji z pieca do hybrydyzacji i zamknij urządzenie.Następnie w kasecie do hybrydyzacji należy umieścić papier filtracyjny nasączony 3 mL 2X SSC. Ostrożnie włóż uchwyt z szkiełkami do hybrydyzacji do kasety. Zamknij kasetę do hybrydyzacji, umieść ją z powrotem w inkubatorze do hybrydyzacji i inkubuj przez 16 do 18 godzin.Do mycia slajdów należy przygotować świeże bufory do mycia jeden, dwa i trzy, a następnie ogrzać je do 30 °C. Aby zapewnić rozpuszczenie SDS po zakończeniu inkubacji, należy jak najszybciej i delikatnie zanurzyć slajdy w probówce Falcon wypełnionej 50 ml buforu do mycia jeden, aż szkło oprze się o dno probówki. Po tym, jak folia ochronna (lifter slip) opadnie na dno probówki, nie rysując matrycy, należy za pomocą pincety wyjąć slajd i umieścić go w statywie stacji myjącej.Natychmiast użyj 500 mililitrów buforu do płukania jeden, aby płukać preparaty przez pięć minut. Następnie przenieś preparaty do buforu do płukania dwa na 20 do 30 minut, a następnie przenieś je do 500 mililitrów buforu do płukania trzy na pięć minut. Na koniec wysusz preparaty przy 2000 RPM przez dwie minuty przed przeprowadzeniem analizy mikromacierzy.Zgodnie z protokołem tekstowym, w celu zbadania wpływu L-seryny na cały transkryptom S. pneumoniae, przeprowadzono analizę mikromacierzy szczepu D 39 Wildtype hodowanego w CDM z 150 µM L-seryny w porównaniu do szczepu hodowanego w 10 mM L-seryny w tym samym medium. W poniższej tabeli wymieniono stężenia całkowitego RNA wyizolowanego z każdej hodowli, jak pokazano na tej rycinie. Po usunięciu DNA sprawdzono jakość RNA.Te dwie ścieżki reprezentują RNA z 150 µM Seine, a te dwie ścieżki pochodzą z kultur hodowanych w obecności 10 mM seine. Obecność dwóch wyraźnych prążków wskazuje na dobrą jakość RNA. Stężenia cDNA zsyntetyzowanego z całkowitego RNA zapisano w tej kolumnie, a stężenia próbek znakowanych barwnikiem reaktywnym AM mean wyszczególniono tutaj.Na tej rycinie przedstawiono analizę wykresu punktowego średniego stosunku barwników reaktywnych AM, a dane zostały dodatkowo poddane analizie w celu redukcji szumów. Niniejsza tabela podsumowuje wyniki badań mikromacierzy po zastosowaniu kryteriów różnicy większej niż lub równej dwukrotności oraz wartości P mniejszej niż 0,001. Jak widać, szereg genów wykazywało różnicową ekspresję w obecności minimalnej ilości L-seryny w porównaniu z maksymalną po zastosowaniu tej procedury.W celu uzyskania odpowiedzi na dalsze pytania po opracowaniu tej metody można zastosować inne techniki, takie jak testy beag, analizy elektrocytów, qPCR, nokaut genowy i/lub badanie siły ekspresji. Technika ta umożliwiła badaczom VFR w dziedzinie biologii molekularnej i komórkowej zbadanie sieci i mechanizmów regulacyjnych w komórkach RAM-dodatnich.

a-fast-reliable-pipeline-for-bacterial-transcriptome-analysis-case

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybka i niezawodna metoda analizy transkryptomu bakterii Studium przypadku: regulacja genu zależna od seryny w Streptococcus pneumoniae

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.

Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Ten film demonstruje różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego - techniki systematycznego, wysokoprzepustowego badania przesiewowego białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydów wewnątrzkomórkowych. Technika ta pozwala na bezpośrednie wiązanie przekaźników z nadekspresyjnym białkiem docelowym w lizacie komórkowym - z pominięciem konieczności oczyszczania białka.

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego: wysokoprzepustowa technika identyfikacji wewnątrzkomórkowych białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydu bakteryjnego

Ten film demonstruje test in vivo na bakteriach w celu zbadania interakcji białek wiążących RNA (RBP) z RNA. Komórki bakteryjne są przekształcane za pomocą dwóch konstruktów plazmidowych - plazmidu miejsca wiązania kodującego mRNA zawierającego fluorescencyjny gen reporterowy za miejscem wiązania RBP - podczas gdy plazmid RBP ulega ekspresji białek RBP pod kontrolą induktora. Po wzroście produkcji RBP za pośrednictwem induktora, RBP wiążą się z mRNA, powodując translacyjną represję reportera...

Test represji genu reporterowego w celu zbadania regulacji translacyjnej genu docelowego

Tutaj prezentujemy fenomiczne podejścia do funkcjonalnej charakterystyki domniemanych genów fagowych. Techniki obejmują opracowany test zdolny do monitorowania metabolizmu anabolicznego gospodarza, płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP), oprócz uznanej metody metabolomiki, zdolnej do pomiaru wpływu na metabolizm kataboliczny.

Fenomika fagów: fizjologiczne podejścia do charakterystyki nowych białek wirusowych

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Immunoprecypitacja chromatyny w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (ChIP-seq) to metoda stosowana do ustalania interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi a kontrolowanymi przez nie sekwencjami genomowymi. Protokół ten przedstawia techniki wykonywania sekwencji ChIP-seq z biofilmami bakteryjnymi, na przykładzie biofilmu bakteryjnego Salmonella enterica Typhimurium serovar.

Odkrywanie celów regulatorowych CsgD w biofilmie Salmonelli przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Technologia MAPS została opracowana w celu zbadania celu określonego regulatorowego RNA in vivo. Interesujący sRNA jest znakowany aptamerem MS2, który umożliwia wspólne oczyszczanie partnerów RNA i ich identyfikację za pomocą sekwencjonowania RNA. Ten zmodyfikowany protokół jest szczególnie odpowiedni dla bakterii Gram-dodatnich.

Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA u bakterii Gram-dodatnich

Tutaj opisujemy etapy pobierania próbek i przygotowania do sekwencji RIBO u bakterii. Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z tymi wytycznymi daje wystarczające dane do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest prosty, wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i od lizy do uzyskania bibliotek mija siedem dni.

RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS

Ten protokół szczegółowo opisuje ulepszoną metodę syntezy wysokiej wydajności białek rekombinowanych z systemu transkrypcyjno-translacyjnego bezkomórkowego Streptomyces (TX-TL).

Wysokowydajny zestaw narzędzi do transkrypcji i translacji Streptomyces do zastosowań w biologii syntetycznej i produktach naturalnych

Poznaj analizę transkryptomu bakteryjnego przy użyciu mikromacierzy DNA i dedykowanego oprogramowania. Metoda ta pozwala na globalne badanie zmian ekspresji genów w Streptococcus pneumoniae.

Szybki i niezawodny proces analizy transkryptomu bakteryjnego Studium przypadku: Zależna od seryny regulacja genów w Streptococcus pneumoniae (Wideo) | JoVE Journal

Szybki i niezawodny proces analizy transkryptomu bakteryjnego Studium przypadku: Zależna od seryny regulacja genów w Streptococcus pneumoniae

Przeglądaj więcej filmów