Szybki i niezawodny proces analizy transkryptomu bakteryjnego Studium przypadku: Zależna od seryny regulacja genów w Streptococcus pneumoniae

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie przeglądu zmian transkryptomicznych u bakterii występujących w określonych warunkach. Osiąga się to poprzez najpierw wyhodowanie i zebranie komórek bakteryjnych w określonych warunkach. Następnie z pobranych komórek izoluje się całkowite RNA, a z RNA wytwarza się CDNA.

Następnie CDNA są znakowane i hybrydyzowane do samodzielnie wykonanych szkiełek do testów mikrologicznych. Na koniec szkiełko jest myte, po czym szkiełka są skanowane i analizowane. Ostatecznie mikromacierz służy do pokazania zmian transkryptomicznych w komórkach bakteryjnych w określonych warunkach.

Główną przewagą technologii mikromacierzy DNA nad innymi istniejącymi metodami badania ekspresji genów, takimi jak QPCR lub northern blotting, jest to, że zapewnia ona globalny przegląd wszystkich zmian transkryptomicznych zachodzących w określonych warunkach. Jest szybki, niezawodny i stosunkowo tani. Procedurę zademonstrują Mohammed Sal i Airon Manzu, studenci PSD z mojego laboratorium genetyki molekularnej Po rozmrożeniu, s pmo, ED 39 granulek komórkowych i Resus zawieszonych w 400 mikrolitrach te zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj w probówkach bez RNA, 0,5 grama szklanych kulek, 50 mikrolitrów 10% SDS 500 mikrolitrów wcześniej przygotowanego chloroformu fenolowego i zawieszone granulki komórek.

Aby rozbić komórki, umieść probówki w ubijaku do kulek i homogenizuj dwa razy przez 60 sekund każda, umieszczając je na lodzie na jedną minutę między impulsami, a następnie odwiruj próbki w temperaturze 10 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Przenieść górną fazę do świeżej probówki, a przy 500 mikrolitrach chloroformu i a, a i odwirować przez dodatkowe pięć minut. Odpipetować 500 mikrolitrów z górnej fazy do świeżych probówek.

Dodać dwie objętości buforu wiążącego lizę i mieszać, pipetując w górę i w dół. Następnie za pomocą zestawu do izolacji RNA wyizoluj całkowite RNA zgodnie z protokołem producenta, aby usunąć zanieczyszczające DNA z RNA. Dodaj 100 mikrolitrów jednej mieszanki DA i inkubuj w temperaturze od 15 do 25 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut.

Użyj zestawu RN a, aby umyć oczyszczone RNA i Elute do objętości 50 mikrolitrów, aby przeprowadzić reakcję klęczącą w 300 mikrolitrowych probówkach PCR. Wymieszaj całkowite RNA z dwoma mikrolitrami losowych monomerów i w razie potrzeby użyj wody wolnej od nukleazy, aby zwiększyć objętość do 18 mikrolitrów. Inkubuj klęczącą mieszaninę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie schładzaj reakcje w temperaturze pokojowej przez 10 minut i szybko je zakręć przed umieszczeniem probówek na lodzie na co najmniej minutę. Aby odwrócić transkrypcję CDNA, przygotuj mieszaninę do odwrotnej transkrypcji, połącz 18 mikrolitrów mieszanki z 12 mikrolitrami mieszanki głównej i inkubuj reakcję w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez dwie do 16 godzin. Zdegraduj mRNA z reakcji, dodając trzy mikrolitry 2,5 mola i OH i umieść je w temperaturze 37 stopni Celsjusza na około 15 minut.

Następnie dodaj 15 mikrolitrów dwóch molowych stosów wolnego kwasu, aby zneutralizować NAOH. Następnie, po użyciu kolumn czyszczących PCR do oczyszczenia CDNA za pomocą spektrofotometru, zmierz stężenie CDNA, aby oznaczyć CDNA. Dodaj pięć mikrolitrów średnio reaktywnego barwnika do 20 do 60 nanogramów na mikrolitr CDNA.

Umieścić mieszaninę w ciemnej i inkubowanej temperaturze pokojowej na 60 do 90 minut przed użyciem kolumn czyszczących PR do oczyszczenia CDNA znakowanego barwnikiem wydostającego się w 50 mikrolitrach buforu ewolucyjnego za pomocą spektrofotometru, upewnić się, że stężenie znakowanego CDNA wynosi co najmniej 0,5 piko moli na mikrolitr w całkowitej objętości 50 mikrolitrów. Po przygotowaniu nieśmiałego bufora, zgodnie z protokołem tekstowym, należy go podgrzać do 68 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut. Aby przygotować próbkę, połącz równe ilości oznakowanych CDNA, a następnie użyj koncentratorów próżniowych w wysokiej temperaturze, aby zmniejszyć objętość do siedmiu mikrolitrów lub mniej.

W międzyczasie, aby wyczyścić ślizgi podnośnika, aby zmniejszyć sygnał tła, użyj mydła i dużej ilości wody z kranu, a następnie 100% etanolu po wysuszeniu podnośnika, umieść go na zjeżdżalni z białą teflonową wyściółką skierowaną w dół. Następnie rozpuść wysuszone próbki barwnika w siedmiu mikrolitrach H2O i inkubuj w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Natychmiast dodaj 35 mikrolitrów podgrzanego buforu płochliwego, delikatnie wymieszaj i wiruj z maksymalną prędkością przez jedną minutę.

Aby wytrącić osady, rozgrzej sondę w temperaturze 68 stopni Celsjusza przez około pięć minut przed załadowaniem. Aby zmontować zjeżdżalnię i ślizg podnośnika, umieść uchwyt szkiełka hybrydyzacyjnego na bloku grzewczym w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Umieść szkiełka z mikromatrycy DNA z suwakiem podnoszącym na podgrzewanym uchwycie szkiełka hybrydyzacyjnego i podgrzej szkiełko z suwakiem podnośnika przez minutę.

Następnie, tak szybko, jak to możliwe, dodaj 40 mikrolitrów docelowej próbki na końcu szkiełka. Pozwól, aby płyn przepływał między powierzchniami szkła za pomocą siły kapilarnej. Teraz wyjmij wstępnie rozgrzaną kasetę hybrydyzacyjną z pieca do hybrydyzacji i zamknij maszynę.

Następnie umieść bibułę filtracyjną nasączoną trzema mililitrami dwóch XSSC w kasecie hybrydyzacyjnej. Delikatnie umieść uchwyt szkiełka hybrydyzacyjnego ze szkiełkami w kasecie do hybrydyzacji. Zamknij kasetę hybrydyzacyjną i umieść ją z powrotem w piecu do hybrydyzacji i inkubuj przez 16 do 18 godzin.

Do mycia szkiełek przygotuj świeże do mycia jeden, dwa i trzy i umieść je w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Aby upewnić się, że SDS rozpuści się po zakończeniu inkubacji, delikatnie zanurz szkiełka tak szybko, jak to możliwe, w probówce Falcon wypełnionej 50 mililitrami buforu do płukania, jeden, aż szkło spocznie na dnie probówki. Po tym, jak podnośnik zsunie się, opadnie na dno rurki bez zarysowania tablicy, użyj pęsety, aby zdjąć suwak i umieścić go w stojaku stacji myjącej.

Natychmiast użyj 500 mililitrów pierwszego buforu do mycia szkiełka przez pięć minut. Następnie przenieś szkiełka do buforu myjącego dwa przez 20 do 30 minut przed przeniesieniem ich do 500 mililitrów buforu płuczącego trzy na pięć minut. Na koniec wysusz szkiełka z prędkością 2000 obr./min przez dwie minuty przed przeprowadzeniem analizy mikromacierzy.

Zgodnie z protokołem tekstowym do badania wpływu L seryny na cały transkryptom S pneumonia, przeprowadzono analizę mikromacierzy szczepu D 39 typu dzikiego szczepu D 39 wyhodowanego w CDM ze 150 mikromolami L Sekwany, w porównaniu z tym wyhodowanym w 10 milimolowym l Sekwanie w tym samym podłożu. W tej tabeli wymieniono stężenia całkowitego RNA wyizolowanego z każdej kultury, jak pokazano na tym rysunku. Po usunięciu DNA zbadano jakość RNA.

Te dwa pasy reprezentują RNA ze 150 mikromolowych niewodów, a te dwa pasy pochodzą z kultur wyhodowanych z 10-milimolowym niewodem. Obecność dwóch wyraźnych prążków wskazuje na dobrą jakość RNA. Stężenia CDNA syntetyzowanego z całkowitego RNA są rejestrowane w tej kolumnie, a próbki znakowane barwnikiem reaktywnym AM są wymienione tutaj.

Na tym rysunku przedstawiono analizę wykresu rozrzutu średniego współczynnika matryc reaktywnych AM, a dane zostały poddane dalszej analizie w celu zmniejszenia hałasu. Poniższa tabela podsumowuje wyniki badań mikromacierzy po zastosowaniu kryteriów większej lub równej podwójnej różnicy i wartości P mniejszej niż 0,001. Jak widać tutaj, wiele genów ulegało zróżnicowanej ekspresji w obecności minimalnej L-seryny w porównaniu z maksymalną ekspresją Zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak beag, testy elektrocytów, QPCR, nokaut i/lub siła ekspresji, mogą być stosowane w celu udzielenia odpowiedzi na nadchodzące pytania po jego opracowaniu. Technika ta pozwoliła naukowcom z VFR w dziedzinie biologii molekularnej i komórkowej na zbadanie sieci regulacyjnych i mechanizmów w dodatnim RAM.