Name: Wytwarzanie mikrocząstek limfocytarnych i wykrywanie ich proapoptotycznego wpływu na komórki nabłonka dróg oddechowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania mikrocząstek limfocytarnych z linii komórek T limfocytów i ich proapoptotyczny wpływ na komórki nabłonka dróg oddechowych. Technika umożliwia badanie mechanizmów apoptozy in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (178918), Fonds de recherche en santé du Québec - Vision Health Research Network.

UWAGA: Samce myszy C57BL/6 (w wieku 5–7 tygodni) pochodzą z Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Kanada) i były traktowane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami CHU Sainte-Justine. Eksplanty tkanki oskrzelowej myszy stanowią dobre źródło pierwotnych komórek nabłonka oskrzelowego do badania proapoptotycznego działania LMP na komórki nabłonkowe. Niniejszy protokół opisuje generowanie LMP in vitro, a także metodę wykrywania apoptotycznych komórek nabłonkowych w eksplantach tkanki oskrzelowej traktowanych LMP. Protokół składa się z 3 sekcji.
1. Produkcja i charakterystyka LMP
UWAGA: Aby zapobiec kontaminacji, należy upewnić się, że wszystkie materiały użyte w tym eksperymencie są sterylne lub poddane autoklawowaniu. Wszystkie kroki należy przeprowadzać w RT w komorze bezpieczeństwa biologicznego w warunkach sterylnych, chyba że wskazano inaczej.
1.1) Stymulacja i pobieranie MP9
<ol>
	<li>Rozmrozić alikwot 10 milionów komórek T CEM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć w 10 ml uprzednio ogrzanego, wolnego od surowicy medium do komórek hematopoetycznych (np. X-VIVO) w sterylnej probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 g przez 5 min. Odessać nadsącz i resuspendować komórki w 5 ml ogrzanego medium.</li>
	<li>Przenieść komórki do kolby hodowlanej T75 (do komórek w zawiesinie) z 15 ml ogrzanego medium hematopoetycznego (np. X-VIVO) i inkubować przez 4 dni w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .</li>
	<li>Po 4 dniach przenieść całe medium hodowlane wraz z komórkami do kolby hodowlanej T175 zawierającej 100 ml świeżego medium. Kontynuować inkubację komórek przez około 72 h w tych samych warunkach, aż osiągną gęstość 2 milionów komórek/ml.</li>
	<li>Równomiernie rozdzielić komórki pomiędzy cztery kolby T175, z których każda zawiera 150 ml świeżego medium, i kontynuować hodowlę, aż komórki urosną (około 48 h inkubacji) do gęstości 2 milionów/ml.</li>
	<li>Zebrać komórki z każdej kolby poprzez wirowanie przy 200 x g przez 5 min i resuspendować 300 x 106 komórek w nowej kolbie T175 zawierającej 150 ml świeżego medium, aby utrzymać gęstość komórek na poziomie 2 milionów/ml.</li>
	<li>Dodać do medium aktynomycynę D (rozpuszczoną w DMSO w stężeniu 2 mg/ml) do końcowego stężenia 0,5 µg/ml i inkubować przez 24 h.</li>
	<li>Przenieść całe medium hodowlane do probówek stożkowych o pojemności 50 ml i odwirować komórki przy 750 x g przez 5 min. Przenieść nadsącz do probówek stożkowych 50 ml i wirować przy 1 500 x g przez 15 min w celu usunięcia dużych fragmentów komórek.</li>
	<li>Przenieść nadsącz do butelki o pojemności 250 ml i poddać ultrawirowaniu przy 12 000 x g przez 50 min. Odlać nadsącz i zebrać osady.</li>
	<li>Przemyć osady wzbogacone w LMP 40 ml sterylnego PBS w probówce 50 ml poprzez wirowanie przy 12 000 x g przez 50 min. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Zebrać nadsącz z ostatniego przemywania; zostanie on wykorzystany jako kontrola nośnika. Resuspendować osady LMP w 1 ml PBS i przenieść do sterylnej mikroprobówki 1,5 ml. Podzielić na alikwoty i przechowywać wyizolowane LMP w temperaturze -80 °C (aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania).</li>
</ol>
1.2) Charakterystyka MP za pomocą analizy FACS 4
<ol>
	<li>Przygotuj 2 próbki buforu do aneksyny, jedną z dodatkiem $\text{CaCl}_2$ i drugą bez $\text{CaCl}_2$2Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, plus lub minus 5 mM CaCl22.</li>
	<li>Przefiltruj bufor do anneksyny oraz płyn osłonowy do analizy FACS za pomocą 0.22 µm filtr w celu usunięcia cząstek.</li>
	<li>Rozcieńczyć 1 µl białek błony mitochondrialnej (LMP) w 44 µl buforu do aneksyny z 5 mM CaCl22 do probówki do FACS. Przygotować inną probówkę z 1 µl białek błony komórkowej w 44 µl buforu do aneksyny bez CaCl22 (kontrola negatywna).</li>
	<li>Dodaj 5 µl anneksyny V-Cy5 do każdej probówki i dokładnie wymieszać. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Przerwać reakcję, rozcieńczając mieszaninę za pomocą 400 µl płynu osłonowego do FACS w każdej probówce.</li>
	<li>Dodać 10 µl (200 000 kulek) 7 µm zawiesinę kulek liczonych jako standard wewnętrzny w każdej probówce w celu uzyskania bezwzględnej liczby komórek.</li>
	<li>Wyznacz bramki na wykresie kropkowym wielkości względnej (FSC-H, PMT E00, skala logarytmiczna) oraz granulacji względnej (SSC-H, PMT 325, skala logarytmiczna) w cytometrze przepływowym, wykorzystując kalibrowane rozmiarowo koraliki fluorescencyjne o 1 µm (bramka 1) i bramka dla kulek liczących na poziomie 7 µm (bramka 2).</li>
	<li>Przeanalizuj próbkę LMP na wykresie FSC-H / SSC-H przy użyciu ustalonych bramek oraz kanał FL-4 dla aneksyny (PMT 765, skala logarytmiczna) na wykresie kropkowym, rejestrując sygnał do momentu uzyskania 20 000 kulek zliczających w bramce 2.</li>
	<li>Wyznacz liczbę zdarzeń dodatnich dla anneksyny V w przypadku LMPs w buforze do anneksyny zawierającym CaCl22a następnie odjąć liczbę zdarzeń LMP w buforze z anneksyną bez dodatku CaCl22 (kontrola negatywna).</li>
	<li>Oblicz bezwzględną liczbę MP, korzystając z następującego równania: 
	<img alt="MP count formula: equation showing microplastic quantification for volumetric analysis." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52651/52651eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>
1.3) Oznaczanie stężenia białka MP (metoda Bradforda)
<ol>
	<li>Przygotować 5 rozcieńczeń seryjnych standardu białka w zakresie od 1,25 do 20 µg/ml. Do czystych probówek pipetować po 800 µl każdego roztworu standardu i próbki w dwóch powtórzeniach. Do każdej probówki dodać 200 µl odczynnika barwiącego Bradforda. Wymieszać dokładnie, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy 595 nm. Wyznaczyć stężenie białek LMPs, korzystając z regresji liniowej krzywej wzorcowej.</li>
</ol>
2. Eksplanty tkanki oskrzelowej i traktowanie LMP
UWAGA: Należy zwrócić szczególną uwagę na sterylność środowiska pracy oraz aseptycznie przygotować roztwory i podłoża wykorzystywane w poniższych doświadczeniach. Aby przygotować Pełne Podłoże do Gojenia, należy dodać 1 ml Suplementów do Podłoża do Gojenia Tkankowego z surowicą (rozmrożonych na lodzie) do 100 ml Podłoża do Gojenia Tkankowego i dokładnie wymieszać.
2.1) Przygotowanie eksplantów tkanki oskrzelowej
<ol>
	<li>Przed hodowlą, za pomocą ostrza skalpela wykonaj zadrapania w 6 obszarach o powierzchni 1 cm2 każdy na krawędzi powierzchni każdej szalki hodowlanej do tkanek o średnicy 100 mm. Pokryj każdą zadrapaną szalkę hodowlaną 2 ml roztworu do powlekania szalek i inkubuj w wilgotnym inkubatorze CO2 przez noc w temperaturze 37 °C. Odessij nadmiar roztworu za pomocą aspiratora próżniowego i napełnij szalkę 15 ml Medium do Płukania Tkanek.</li>
	<li>Uśmierć myszy C57BL/6 (w wieku od 5 do 7 tygodni) poprzez inhalację CO2 zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez komisję etyki ds. opieki nad zwierzętami.</li>
	<li>Aseptycznie wypreparuj tkankę płucną za pomocą skalpela, superprecyzyjnej pęsety Dumont i nożyczek chirurgicznych. Ostrożnie usuń miąższ i naczynia krwionośne. W celu transportu do laboratorium umieść tkankę płucną w lodowatym Medium do Płukania Tkanek, jeśli jest to wymagane.</li>
	<li>Dalej preparuj oskrzela zanurzone w Medium do Płukania Tkanek i oddziel oskrzela o średnicy od 1 do 2,5 mm od obwodowych tkanek płucnych. Za pomocą skalpela pokrój tkanki oskrzelowe na pierścienie oskrzelowe o grubości ~5 mm.</li>
	<li>Używając ruchu czerpiącego sterylną zakrzywioną pęsetą mikrodissekcyjną, pobierz fragmenty oskrzeli i umieść je na zadrapanych obszarach szalek.</li>
	<li>Usuń Medium do Płukania Tkanek i inkubuj fragmenty w RT przez ~5 min, aby pozwolić im przywrzeć do szalek.</li>
	<li>Dodaj 10 ml Pełnego Medium do Gojenia do każdej szalki i umieść je w modułowej komorze inkubacyjnej z kontrolowaną atmosferą. Przepłucz komorę mieszaniną gazów o wysokiej zawartości O2 (70% O2, 25% N2 i 5% CO2). Umieść komorę w laboratoryjnym inkubatorze orbitalnym i wytrząsaj w temperaturze 37 °C. Wytrząsaj komorę przez 24 hr z częstotliwością 10 cykli na minutę, aby umożliwić przerywany przepływ medium nad fragmentami.</li>
	<li>Po 24 hr inkubacji obejrzy eksplanty tkankowe pod odwróconym mikroskopem świetlnym w kontraście fazowym. Wybierz eksplanty oskrzelowe z pełnym, drobnym ruchem rzęsek i żywym nabłonkiem oskrzelowym do późniejszej obróbki LMP.</li>
</ol>
2.2) Obróbka LMP
<ol>
	<li>Przygotować pełną pożywkę wzrostową w następujący sposób: rozmrozić suplementy do pożywki wzrostowej z surowicą oraz inhibitor fibroblastów na lodzie. Dodać 1 ml suplementów do pożywki wzrostowej z surowicą oraz 200 μl inhibitora fibroblastów do 100 ml pożywki wzrostowej; dokładnie wymieszać. Przed użyciem ogrzać pełną pożywkę wzrostową w temperaturze 37 °C przez 10 min.</li>
	<li>Rozcieńczyć wyizolowane LMPs w nowej sterylnej probówce typu eppendorf za pomocą PBS, aby przygotować roztwór stok LMPs o stężeniu 800 µg/ml.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml pełnej pożywki wzrostowej do każdego dołka 12-dołkowej płytki do hodowli tkanek.</li>
	<li>Przenieść wybrane eksplanty oskrzela za pomocą zakrzywionej pincety mikrodysekcyjnej z poprzedniego protokołu (sekcja 2.1) do każdego dołka płytki do hodowli tkanek.</li>
	<li>Odpowiednio oznakować płytkę hodowlaną, aby zidentyfikować dołki z traktowaniem LMPs oraz dołki kontrolne. Dodać 25 µl roztworu stok LMPs do każdego dołka z traktowaniem LMPs (aby uzyskać stężenie końcowe 40 μg/ml) oraz 25 µl nośnika kontrolnego (patrz produkcja LMPs) do dołków kontrolnych.</li>
	<li>Kontynuować inkubację w modularnej komorze inkubacyjnej o kontrolowanej atmosferze w temperaturze 37 °C przy łagodnym wstrząsaniu.</li>
	<li>Po 24 h przemyć eksplanty 3 razy PBS i przejść do następnego kroku (utrwalanie w 4% paraformaldehydzie [PFA]).</li>
</ol>
3. Badanie histopatologiczne
3.1) Przed przejściem do kolejnych etapów przygotować następujące roztwory
<ol>
	<li>Przygotować bufor 1x PBS, mieszając 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4, pH 7.4.</li>
	<li>Aby przygotować 4% PFA, rozpuścić 20 g PFA w 400 ml wody, podgrzewając do 60 °C przy ciągłym mieszaniu; dodać kilka kropli 10 M NaOH, aby klarownie zaprowadzić roztwór. Następnie dodać bufor 1x PBS i doprowadzić objętość do 500 ml oraz pH do 7.4. Przefiltrować i podzielić na alikwoty; przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować następujące odczynniki do dehydratacji lub rehydratacji: etanol 100%, 90%, 70%, 50% oraz ksylen.</li>
</ol>
3.2) Fixacja eksplantów i deparafinizacja skrawków tkankowych
<ol>
	<li>Każdy eksplant umieścić w oznakowanej probówce do mikrocentryfugi z 1,5 ml 4% PFA i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Eksplanty przemyć dwukrotnie w 1x PBS.</li>
	<li>Odwodnić eksplanty w serii alkoholi (70% etanol: 3 razy po 30 min; 90% etanol: 2 razy po 30 min; 100% etanol: 3 razy po 30 min; następnie ksylen: 3 razy po 20 min). Wszystkie etapy przeprowadzać w temperaturze pokojowej (RT) w dygestorium.</li>
	<li>Zatopić eksplanty tkankowe w parafinie w temperaturze 58 °C w inkubatorze/piecu. Przygotować skrawki tkanek o grubości 5 µm za pomocą mikrotomu obrotowego.</li>
	<li>Skrawki wypłynąć w kąpieli wodnej o temperaturze 56 °C, a następnie nanieść je na oznakowane szkiełka histologiczne. Szkiełka umieścić w ręcznych kasetach do barwienia i suszyć w temperaturze 65 °C przez 1 h. Pozostawić szkiełka do ostygnięcia w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Zanurzyć kasety w 4 kolejnych naczyniach z ksylenem na 10 min każde w celu usunięcia parafiny. Zanurzyć kasety w serii etanolu, aby usunąć ksylen: 100%, następnie 95%, 80%, 70% i 50% etanolu (każdy etap po 5 min). Przemyć kasety wodą z kranu przez 5 min w celu usunięcia etanolu.</li>
</ol>
3.3) Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&amp;E)
<ol>
	<li>Kontynuuj pracę z utrwalonymi skrawkami tkanek; umieść kasetę w kuwecie barwiącej wypełnionej hematoksyliną Mayera na 15 min. Płucz kasetę pod bieżącą wodą przez 20 min, aby usunąć hematoksylinę.</li>
	<li>Umieść w wodzie destylowanej na 30 sec. Przenieś do 95% etanolu na 30 sec. Umieść w kuwecie z roztworem eozyny Y na 1 min. Odwodnij, przeprowadzając po dwie wymiany 95% etanolu, 100% etanolu oraz ksylenu, po 2 min każdorazowo.</li>
	<li>Wykonaj szybką kontrolę pod mikroskopem, aby upewnić się, że nadmiar eozyny został usunięty. Nanieś 2 do 3 kropli medium montażowego (Fisher SP15-100) na każdy preparat, a następnie przykryj szkiełkiem nakrywką.</li>
</ol>
3.4) Wykrywanie śmierci komórek in situ: test TUNEL
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem przygotować roztwór roboczy proteinazy K: 20 µg/ml w 10 mM Tris/HCl, pH 7.4.</li>
	<li>Powtórzyć kroki od 1 do 5 z sekcji 3.2 (Fiksacja eksplantatów i deparafinizacja skrawków tkanek). Przepłukać preparaty dejonizowaną H2O.</li>
	<li>Zanurzyć preparaty w 1x PBS na 10 min. Odlać nadmiar PBS. Inkubować skrawki tkanek przez 30 min w temperaturze pokojowej z roztworem roboczym proteinazy K. Przepłukać preparaty dwukrotnie w 1x PBS.</li>
	<li>Wykonać test TUNEL zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu do wykrywania śmierci komórek. Zamontować preparaty, używając medium montażowego, i przykryć ręcznie szkiełkami podstawowymi.</li>
	<li>Przeanalizować próbki pod mikroskopem świetlnym. Użyć oprogramowania Image Pro 4.5 do analizy komórek apoptotycznych wybarwionych na kolor brązowy.</li>
</ol>

<ol><li>Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+microparticles+in+the+pathogenesis+of+cardiovascular+disease%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).</li>
<li>Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles%3A+targets+and+tools+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microparticles: targets and tools in cardiovascular disease.</a> Trends Pharmacol Sci. 32 (11), 659-665 (2011).</li>
<li>Benameur, T., Andriantsitohaina, R., Martinez, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+plasma+membrane-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rep%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of plasma membrane-derived microparticles.</a> Pharmacol Rep. 61 (1), 49-57 (2009).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytic+microparticles+inhibit+angiogenesis+by+stimulating+oxidative+stress+and+negatively+regulating+VEGF-induced+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphocytic microparticles inhibit angiogenesis by stimulating oxidative stress and negatively regulating VEGF-induced pathways.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 294 (2), 467-476 (2008).</li>
<li>Yang, C., Gagnon, C., Hou, X., Hardy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+lipoprotein+receptor+mediates+anti-VEGF+effect+of+lymphocyte+T-derived+microparticles+in+Lewis+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Low density lipoprotein receptor mediates anti-VEGF effect of lymphocyte T-derived microparticles in Lewis lung carcinoma cells.</a> Cancer Biol Ther. 10 (5), 448-456 (2010).</li>
<li>Angelillo-Scherrer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-derived+microparticles+in+vascular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-derived microparticles in vascular homeostasis.</a> Circ Res. 110 (2), 356-369 (2012).</li>
<li>Maeno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+Cells+are+required+for+inflammation+and+destruction+in+cigarette+smoke-induced+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice.</a> J Immunol. 178 (12), 8090-8096 (2007).</li>
<li>Qiu, Q., Xiong, W., Yang, C., Gagnon, C., Hardy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte-derived+microparticles+induce+bronchial+epithelial+cells%27+pro-inflammatory+cytokine+production+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte-derived microparticles induce bronchial epithelial cells' pro-inflammatory cytokine production and apoptosis.</a> Mol Immunol. 55 (3-4), 220-230 (2013).</li>
<li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shed+membrane+particles+from+T+lymphocytes+impair+endothelial+function+and+regulate+endothelial+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression.</a> Circulation. 109 (13), 1653-1659 (2004).</li>
<li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li>
<li>Mause, S. F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles%3A+protagonists+of+a+novel+communication+network+for+intercellular+information+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange.</a> Circ Res. 107 (9), 1047-1057 (2010).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-proliferative+and+anti-tumour+effects+of+lymphocyte-derived+microparticles+are+neither+species-+nor+tumour-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Anti-proliferative and anti-tumour effects of lymphocyte-derived microparticles are neither species- nor tumour-type specific.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Soleti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles+harboring+Sonic+Hedgehog+promote+angiogenesis+through+the+upregulation+of+adhesion+proteins+and+proangiogenic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors.</a> Carcinogenesis. 30 (4), 580-588 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

MP są aktywnymi mediatorami wzajemnych przesłuchów międzykomórkowych, a ich badania są obiecujące w wielu dziedzinach nauki. 11 W badaniu tym przedstawiono szczegółowy protokół wytwarzania in vitro na dużą skalę LMP pochodzących z apoptotycznej linii komórek T. Te MP wyrażają duży repertuar cząsteczek limfocytów i są biologicznie zaangażowane w regulację homeostazy komórkowej i tkankowej. Jednak LMP pochodzące z różnych źródeł mogą różnić się biologicznie. 4,9,12,13
<p class="jove_conte...

Mikrocząsteczki (MPs) to biologicznie aktywne submikronowe pęcherzyki błonowe uwalniane po aktywacji lub apoptozie komórek. MP pochodzą zarówno ze zdrowych, jak i uszkodzonych komórek i biorą udział w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych. 1 MP wykryto nie tylko w ludzkim osoczu, ale także w tkance zapalnej i apoptotycznej. Biologiczna użyteczność MP pochodzących z błony komórkowej została zademonstrowana w różnych warunkach, w tym w modelach sygnalizacji komórkowej i jako narzędzia farmakologiczne. 2,3 Wcześniej wykazaliśmy, że LMP pochodzące z limfocytów T po stymulacji aktynomycyną D (w celu wywołania apoptozy) hamują angiogenezę i hamują przeżycie i proliferację komórek śródbłonka. 4,5 Antyangiogenne działanie LMP może się znacznie różnić w zależności od bodźców stosowanych do aktywacji limfocytów T in vitro. 6
Nabłonek dróg oddechowych funkcjonuje jako ochronna fizyczna i funkcjonalna bariera. Zwiększona liczba limfocytów T w drogach oddechowych może przyczyniać się do uszkodzenia komórek i zapalenia dróg oddechowych. 7 Wykazaliśmy, że LMP indukują apoptozę ludzkich komórek nabłonka oskrzeli,8 co wskazuje, że LMP mogą zmieniać funkcję barierową nabłonka oskrzeli in vivo. Komórki apoptotyczne można zidentyfikować za pomocą metody TUNEL, która wykrywa fragmentację DNA in situ. 
Ogólnym celem tego protokołu jest zilustrowanie produkcji in vitro LMP z linii komórkowej limfocytów T oraz zademonstrowanie ich proapoptotycznego wpływu na komórki nabłonka dróg oddechowych. Wykrywanie śmierci komórki in situ wykazało, że LMP silnie indukują śmierć komórek nabłonka oskrzeli dróg oddechowych, co sugeruje, że uszkodzenie nabłonka dróg oddechowych za pośrednictwem LMP może wpływać na funkcję barierową uszkodzonego nabłonka.

<table><tbody><tr><td>Produkcja i charakterystyka LMP</td> limfocytów <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T CEM&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 średni&nbsp;</td><td>Cambrex, Walkersville</td><td>04-744Q</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T75</td><td>Sarstedt</td><td>83.1813.502</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.502</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin&nbsp; D&nbsp;</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>A9415-2mg</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lifetechnologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m filtr</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Załącznik-VCy5</td><td>BD Pharmagen&nbsp;</td><td></td><td></td>559933</tr><tr><td>Rozwiązanie przepływowe FACS</td><td>BD Bio-sciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokulki fluorescencyjne (1 &mikro; m)</td><td>Sondy molekularne&nbsp;</td><td>T8880</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki do liczenia z polistyrenu (7 &mikro; m)</td> <td>Bangs laboratories</td><td>PS06N/6994</td><td></td></tr><tr><td>Probówki polipropylenowe FACS</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipeta</td><td>Fisher</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>pipeta 5 ml</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>pipeta 25 ml</td><td>Ultident</td><td>DL-357551</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml stożkowa mikroprobówka polipropylenowa</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa probówka polipropylenowa 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowa rurka polipropylenowa</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>50 ml szybka rurka z kopolimeru polipropylenowego</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>Butelka polipropylenowa o dużej prędkości 250 ml</td><td>Beckman</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Test białka (test Bradforda)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Norma oznaczania białek II</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0007</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 16 x 100</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 12 x 75</td><td>Ultident</td><td>170-14100005B</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator komórek&nbsp;</td><td>Mandel</td><td>Heracell 150</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka wolnoobrotowa</td><td>IEC</td><td>Centra8R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka szybkoobrotowa</td><td>Beckman</td><td>Avanti J8</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik wysokoobrotowy do butelki 250ml</td><td>Beckman</td><td>JLA16.250</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik szybkoobrotowy do probówki 50ml</td><td>Beckman</td><td>JA30.50</td><td></td></tr><tr><td>Cytometria Fow&nbsp;</td><td>BD Bio-sciences</td><td>FACS Spektrofotometr Calibur</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>Series 600</td><td></td></tr><tr><td>Eksplantaty i sekcje tkanki oskrzeli&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6 (5-7 tygodni)&nbsp; &nbsp;</td><td>Charles River Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysie drogi oddechowe PrimaCell&trade; System:</td> <td>CHI Scientific, Inc.</td><td>2-82001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ostrza skalpela ze stali węglowej Becton</td><td>Dickinson AcuteCare</td><td>371310</td><td>#10</td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>10003-12</td><td>#7</td></tr> mikroskop <tr><td>odwrócony z kontrastem fazowym</td><td>Olympus Optical CO., LTD.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>mieszanina gazów o wysokiej zawartości O2&nbsp;</td><td>VitalAire Kanada Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>modułowa komora inkubatora</td><td>Billups-Rothenberg Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 inkubowana wytrząsarka orbitalna</td><td>Barnstead Lab-Line,&nbsp;</td><td>SHKA4000-7</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe szalki do hodowli tkanek (100 mm)</td><td>Sarstedt, Inc.</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>14060-09</td><td>Proste, ostre, 9 cm długości</td></tr><tr><td>Półzakrzywione kleszcze Graefe</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>nawilżany inkubator CO2</td><td>Mandel Scientific Company Inc.&nbsp;</td><td>SVH-51023421</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Badanie histopatologiczne&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>formalina formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>parafina</td><td>Fisher scientific&nbsp; Międzynarodowy, Inc.</td>Alkohol etylowy <td>T555</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merck KGaA, Darmstadt</td><td>EX0278-1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Aldehyd glutarowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>31533</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR Scientific Inc.&nbsp;</td><td>48300-025</td><td>25x75 mm</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher naukowy&nbsp; Międzynarodowy, Inc.</td><td>X5-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina Mayera</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>MHS16</td><td>Lejek z bibułą filtracyjną&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Fisher naukowy&nbsp; Międzynarodowa, Inc.&nbsp; &nbsp;</td><td>A144s-500</td><td></td></tr><tr><td>eosin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>HT110116</td><td>Lejek z bibułą filtracyjną&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Permount i handel; Średni montaż</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>szklane szkiełko nakrywkowe</td><td>surgipath medical industries, Inc.</td><td>84503</td><td>24 razy; 24&nbsp;#1&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania</td><td>śmierci komórek TUNEL In situ, POD</td><td>11 684 817 910</td><td></td></tr><tr><td>piekarnik</td><td>Despatch Industries Inc.</td><td>LEB-1-20</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom obrotowy</td><td>Leica Microsystems Inc.</td>Bibuła filtracyjna <td>RM2145</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Whatman International Ltd.</td><td>1003150</td><td>#3</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Imaging Japan Inc.</td>Naczynie do barwienia <td>E800</td><td></td></tr><tr><td></td><td>kompletne Wheaton Industries, Inc.</td><td>900200</td><td>wraz z naczyniem, stojakiem, pokrywą</td></tr><tr><td>1,5 ml probówka eppendorf</td><td>Sarstedt Inc.&nbsp;</td><td>72.69</td><td>39x10 mm</td></tr><tr><td>Orbitalna i posuwisto-zwrotna kąpiel wodna</td><td>ExpotechUSA</td><td>ORS200</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanem&nbsp; &nbsp;</td><td>Wyciąg GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nicram RD Service</td><td>3707E</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie mikrocząstek limfocytarnych i wykrywanie ich proapoptotycznego wpływu na komórki nabłonka dróg oddechowych

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Zainteresowanie biologicznymi rolami pęcherzyków pochodzących z błony komórkowej w komunikacji między komórkami wzrosło w ostatnich latach. Mikrocząstki (MP) są jednym z takich rodzajów pęcherzyków o średnicy od 0,1 μm do 1 μm i zwykle wydalane z błony plazmatycznej komórek eukariotycznych poddawanych aktywacji lub apoptozie. Tutaj opisujemy wytwarzanie mikrocząstek pochodzących z limfocytów T (LMP) z apoptotycznych limfocytów T CEM stymulowanych aktynomycyną D. LMP są izolowane w wieloetapowym procesie wirowania różnicowego i charakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten przedstawia również metodę wykrywania śmierci komórki in situ w celu wykazania proapoptotycznego wpływu LMP na komórki nabłonka oskrzeli pochodzące z pierwotnych eksplantatów tkanki oskrzelowej układu oddechowego myszy. Metody opisane w niniejszym dokumencie zapewniają powtarzalną procedurę izolowania obfitych ilości LMP z limfocytów apoptotycznych in vitro. Uzyskane w ten sposób LMP mogą być wykorzystywane do oceny charakterystyki różnych modeli chorób oraz do badań farmakologicznych i toksykologicznych. Biorąc pod uwagę, że nabłonek dróg oddechowych stanowi ochronną fizyczną i funkcjonalną barierę między środowiskiem zewnętrznym a leżącą pod nim tkanką, zastosowanie eksplantatów tkanki oskrzelowej zamiast unieśmiertelnionych linii komórkowych nabłonka stanowi skuteczny model do badań wymagających tkanki dróg oddechowych.

Charakterystykę LMP przeprowadzono za pomocą barwienia anneksyną V10 przy użyciu analizy FACS (fluorescence-activated cell sorting), a bramkowanie wykonano z wykorzystaniem kulek 1 µm, w której 97% MP (≤1 µm) było dodatnich pod kątem anneksyny-V-Cy5 (Rycina 1A i 1B). Zgodnie z tym protokołem uzyskiwano zazwyczaj około 2,5 mg LMP. Eksplanty tkanki oskrzelowej myszy C57BL/6 poddano działaniu nośnika oraz LMP. Analiza histopatologiczna przekrojów oskrzeli wykazała wpływ LMP na integralność strukt...

Mikrocząsteczki (MPs) z błoną komórkową są aktywnymi pęcherzykami biologicznymi, które można izolować, a ich patofizjologiczne efekty badać w różnych modelach. W tym miejscu opisano metodę generowania MP pochodzących z limfocytów T (LMP) i wykazywania ich proapoptotycznego działania na komórki nabłonka dróg oddechowych.

Wytwarzanie mikrocząstek limfocytarnych i wykrywanie ich proapoptotycznego wpływu na komórki nabłonka dróg oddechowych

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie in vitro produkcji mikrocząsteczek limfocytarnych (LMPs) z linii komórkowej limfocytów T oraz wykazanie ich proapoptotycznego działania na komórki nabłonka dróg oddechowych. W pierwszej kolejności otrzymuje się LMPs, a następnie poddaje się wyizolowane mikrocząsteczki charakterystyce za pomocą analizy FACS.Następnie hodowane są eksplanty tkanki oskrzeli. W końcowej fazie przeprowadzana jest terapia LMP na eksplantach oskrzeli. Ostatecznie, w celu wykazania indukowanego przez LMP uszkodzenia warstwy nabłonka oskrzeli oraz apoptozy komórek nabłonkowych, stosuje się badania histopatologiczne, takie jak barwienie hematoksyliną i eozyną oraz detekcję śmierci komórkowej NC two.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak izolacja mikrocząsteczek z ludzkiej krwi obwodowej, jest możliwość prowadzenia wielkoskalowej generacji mikrocząsteczek pochodzących z linii komórkowej w warunkach in vitro. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ krytyczne etapy hodowli oskrzeli są trudne do przygotowania. Aby rozpocząć hodowlę.Komórki CEMT w czterech kolbach T 1 75, z których każd

generation-lymphocytic-microparticles-detection-their-proapoptotic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Generowanie mikrocząstek limfocytarnych i wykrywanie ich proapoptotycznego wpływu na komórki nabłonka dróg oddechowych

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokoły izolacji makrofagów pęcherzykowych myszy, które są rezydującymi w płucach komórkami odporności wrodzonej, oraz badania ich aktywacji w odpowiedzi na kokulturę z nanocząsteczkami polianhydrydowymi.

Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych myszy oraz ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząsteczki polianhydrydu

Ten film pokazuje wytwarzanie i izolację mikrocząsteczek pochodzących z limfocytów T, LMP, z limfocytów T po leczeniu aktynomycyną-D.

Izolacja mikrocząstek pochodzących z apoptotycznych limfocytów T in vitro

Opisujemy metodę generowania precyzyjnie wycinanych plastrów płuc (PCLS) i ich barwienia immunologicznego, aby zobrazować lokalizację różnych typów komórek odpornościowych w płucach. Nasz protokół można rozszerzyć w celu wizualizacji lokalizacji i funkcji wielu różnych typów komórek w różnych warunkach.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc

Nowe protokoły są tutaj opisane do izolowania i charakteryzowania mikrocząsteczek pochodzących z neutrofili ludzkich i mysich. Protokoły te wykorzystują techniki ultrawirowania, cytometrii przepływowej i immunoblottingu do analizy zawartości mikrocząstek i mogą być wykorzystywane do badania roli mikrocząstek pochodzących z różnych typów komórek w funkcjonowaniu komórek.

Izolacja i charakterystyka mikrocząstek pochodzących z neutrofili do badań funkcjonalnych

Opisujemy wykrywanie aktywacji inflamasomu NLRP3 na bazie komórkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i barwienia dla aktywnej kaspazy-1 i adaptera, ASC. Przedstawiono test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia lizy piroptotycznej w skali populacji. Techniki te można dostosować do badania wielu aspektów biologii inflamasomów.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Ten manuskrypt opisuje protokół określający, czy narażenie na ozon, podstawowe zanieczyszczenie powietrza, upośledza efferocytozę makrofagów pęcherzykowych in vivo. Protokół ten wykorzystuje powszechnie stosowane odczynniki i techniki i może być dostosowany do wielu modeli uszkodzenia płuc w celu określenia wpływu na efferocytozę makrofagów pęcherzykowych.

Ocena in vivo efferocytozy makrofagów pęcherzykowych po ekspozycji na ozon

Opisujemy protokół dla trójwymiarowego modelu kohodowli zakażonych dróg oddechowych, wykorzystującego komórki CFBE41o, makrofagi THP-1 i Pseudomonas aeruginosa, ustalony na granicy powietrze-ciecz. Model ten zapewnia nową platformę do jednoczesnego testowania skuteczności antybiotyków, funkcji bariery nabłonkowej i markerów stanu zapalnego.

P. aeruginosa (P. aeruginosa) Zakażona kohodowla 3D komórek nabłonka oskrzeli i makrofagów na granicy faz powietrze-ciecz w celu przedklinicznej oceny środków przeciwinfekcyjnych

Myszy narażone na działanie ozonu i endotoksyn bakteryjnych wykazują rozległą śmierć komórek, w tym neutrofili. Zaobserwowaliśmy adaptacje komórkowe, takie jak zakłócenie blaszek cytoszkieletu, zwiększona ekspresja komórkowa podjednostki syntazy ATP kompleksu V β i angiostatyny w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym, supresja odpowiedzi immunologicznej płuc i opóźniona rekrutacja neutrofili.

Wizualizacja adaptacji komórek płuc podczas połączonego ozonu i ostrego mysiego uszkodzenia płuc wywołanego ozonem i LPS

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Poznaj metodę wytwarzania mikrocząstek limfocytarnych z linii komórek T limfocytów i ich proapoptotyczny wpływ na komórki nabłonka dróg oddechowych. Technika umożliwia badanie mechanizmów apoptozy in vitro.

Wytwarzanie mikrocząstek limfocytarnych i wykrywanie ich proapoptotycznego wpływu na komórki nabłonka dróg oddechowych

Przeglądaj więcej filmów