Wytwarzanie mikrocząstek limfocytarnych i wykrywanie ich proapoptotycznego wpływu na komórki nabłonka dróg oddechowych

Ogólnym celem tej procedury jest zilustrowanie produkcji in vitro mikrocząstek limfocytarnych lub LMP z linii komórek limfocytów T oraz wykazanie ich proapoptotycznego działania na komórki nabłonka dróg oddechowych. Osiąga się to poprzez wyprodukowanie najpierw LMP. Następnie izolowane LMP są charakteryzowane przez analizę faksu.

Następnie hoduje się eksplantaty tkanki oskrzelowej. Na koniec przeprowadza się leczenie LMP na eksplantatach oskrzeli. Ostatecznie badania histopatologiczne, takie jak wykrywanie hematu, toiny i eozyny oraz NC dwóch komórek, służą do wykazania uszkodzenia warstwy nabłonka oskrzeli wywołanego LMP i apoptozy komórek nabłonka.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak izolacja mikrocząstek z ludzkiej krwi obwodowej, jest to, że jesteśmy w stanie przeprowadzić generowanie na dużą skalę mikrocząstek pochodzących z linii komórkowej in vitro. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą walczyć, ponieważ krytyczne etapy hodowli oskrzela nie są łatwe do przygotowania. Na początek kultura.

Komórki CEMT w czterech kolbach T 1 75 z których każda zawiera 150 mililitrów świeżej, pożywki i inkubują w temperaturze 37 stopni Celsjusza do gęstości 2 milionów komórek na mililitr. Zebrać komórki z każdej kolby przez odwirowanie w temperaturze 200 razy G przez pięć minut, a następnie ponownie zgiąć 300 razy 10 do sześciu komórek do nowych kolb T 1 75 zawierających 150 mililitrów świeżej pożywki. Aby utrzymać gęstość 2 milionów komórek na mililitr, dodaj 37,5 mikrolitra aktyny mycyny D do pożywki o końcowym stężeniu 0,5 mikrograma na mililitr i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Przenieś całą pożywkę hodowlaną do stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów i wiruj komórki w temperaturze 750 razy G przez pięć minut. Następnie przenieś supernatant do 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj w temperaturze 1500 razy G przez 15 minut, aby usunąć duże fragmenty komórek. Następnie przenieś supernatant do butelki o pojemności 250 mililitrów i odwiruj ultra w temperaturze 12 000 razy G przez 50 minut.

Następnie wyrzuć supernatant i zbierz granulki. Użyj 40 mililitrów sterylnego PBS do przemycia granulek wzbogaconych w LMP w 50-mililitrowej probówce i odwiruj przy 12 000 razy G przez 50 minut. Powtórz ten krok dwukrotnie.

Zebrać supernatant z ostatniego płukania do użycia jako kontrola pojazdu z jednym mililitrem PBS. Zawiesić granulki i przenieść do 1,5 mililitrowej sterylnej mikroprobówki i przechowywać izolowane LMP w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza. Aby scharakteryzować mikrocząstki za pomocą analizy faksowej, należy rozpocząć od przygotowania dwóch próbek buforu neksynowego, jednej z chlorkiem wapnia, a drugiej bez wapnia.

W probówce faksowej rozcieńczyć jeden mikrolitr LMP w 44 mikrolitrach buforu neksynowego z chlorkiem wapnia. Przygotować kolejną probówkę, używając buforu nexin bez chlorku wapnia. Następnie dodaj pięć mikrolitrów X i V sci five do każdej probówki i dobrze wymieszaj, inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Po inkubacji należy użyć 400 mikrolitrów płynu do płukania pochwy faksowej. Aby zatrzymać reakcje, dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny kulek liczących o siedmiu mikronach jako wzorzec wewnętrzny w każdej probówce. Aby uzyskać liczbę bezwzględną, ustalono bramki o względnej wielkości, FSCH i względnej ziarnistości SSCH oraz wykres punktowy na cytometrze przepływowym.

Używanie skalibrowanych pod względem wielkości koralików fluorescencyjnych o wielkości jednego mikrometra dla bramki pierwszej i zliczania koralików o wielkości siedmiu mikrometrów. W przypadku bramki drugiej przeanalizować próbkę LMP na wykresie F-S-C-H-S-S-C-H przy użyciu ustalonych bramek i czterokanałowego FL dla wykresu kropkowego aneksyny, uzyskując sygnał do momentu osiągnięcia 10 000 kulek zliczających w drugim chodzie, określić dodatnie w ex NV zdarzenia LMP w buforze neksyny zawierającym chlorek wapnia i odjąć zdarzenia LMP w buforze neksyny bez chlorku wapnia. Oblicz bezwzględną liczbę LMP na podstawie poniższego równania.

Używa skalpela dumont super cienkiej pęsety i nożyczek chirurgicznych do aseptycznego preparowania tkanki płucnej. Ostrożnie usuń miąższ i naczynia krwionośne. Następnie należy rozciąć oskrzela zanurzone w pożywce do płukania tkanek i oddzielić oskrzela o średnicy od jednego do 2,5 milimetra od obwodowych tkanek płuc.

Użyj skalpela, aby pokroić tkanki oskrzeli na szeregi oskrzeli o grubości około pięciu milimetrów, wykonując ruch nabierania sterylnymi, zakrzywionymi kleszczami do mikropreparacji. Podnieś fragmenty oskrzeli i umieść je na porysowanych miejscach wcześniej przygotowanych potraw. Zgodnie z protokołem tekstowym usuń pożywkę do mycia tkanek i inkubuj fragmenty w temperaturze pokojowej przez około pięć minut, aby mogły przylgnąć do naczyń.

Dodaj 10 mililitrów kompletnego podłoża leczniczego do każdej pożywki i umieść je w modułowej komorze inkubatora z kontrolowaną atmosferą z mieszaniną gazów o wysokiej zawartości tlenu, przepłucz komorę, a następnie umieść ją w laboratoryjnym inkubatorze orbitalnym i potrząśnij nią w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny przy 10 cyklach na minutę, aby umożliwić okresowy przepływ pożywki po fragmentach. Po inkubacji obserwować eksplan tkanek pod mikroskopem kontrastu fazowego i odwróconego światła. Wybierz explan oskrzelowy z pełnym delikatnym ruchem włosów i żywym nabłonkiem oskrzeli do późniejszego leczenia LMP.

Aby leczyć LMP, policz właśnie wybrany explan oskrzelowy i zaznacz każdy dołek na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Dla każdego explanu przenieś 0,5 mililitra kompletnej pożywki wzrostowej do sterylnej probówki Einor. Następnie dodać 25 mikrolitrów l i p zapasu na plan leczenia lub dodać 25 mikrolitrów pojazdu kontrolnego.

W celu kontroli eksplantaty dobrze wymieszaj, delikatnie stukając w rurkę. Przenieś zmieszane podłoże do każdej studzienki z oznaczoną 12-dołkową płytką do hodowli tkankowej za pomocą zakrzywionych mikrokleszczy preparacyjnych. Przenieś każde wybrane oskrzela x explan do każdej studzienki płytki do hodowli tkankowej.

Kontynuować inkubację w modułowej komorze inkubatora w kontrolowanej atmosferze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając po 24 godzinach. Za pomocą PBS umyć EXPLAN trzykrotnie i przystąpić do barwienia utrwalającego h i e oraz testu tunelowego. Zgodnie z protokołem tekstowym, jak pokazano tutaj, LMP scharakteryzowano barwieniem nexin V za pomocą analizy faksowej i bramkowano za pomocą kulek o długości jednego mikrometra, gdzie 97% mps było w nexin V sci-fi dodatnie.

Zazwyczaj około 2,5 miligrama LMP uzyskiwano zgodnie z tym protokołem. Eksplan tkanki oskrzelowej od czarnych myszy C 57 sześć poddano leczeniu podłożem i LMP. Na tym rysunku analiza histopatologiczna odcinków oskrzeli ujawnia wpływ LMP na integralność strukturalną nabłonka oskrzeli.

Pod kontrolą. Okazało się, że nabłonek oskrzeli był w dużej mierze nieuszkodzony. Jednak w eksplantatach traktowanych LMP powierzchowna warstwa komórek nabłonka została uszkodzona lub utracona, a także nastąpił znaczny spadek wysokości i gęstości komórek nabłonka, jak widać tutaj.

Barwienie tunelowo-dodatnie, marker apoptozy, było bardziej wyraźne w nabłonku oskrzeli leczonym LMP w porównaniu z tkanką kontrolną. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o pracy w sterylnych warunkach podczas wytwarzania mikrocząstek i wykonywania hodowli tkankowej.