Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar zmian właściwości błonowych węchowych neuronów czuciowych w odpowiedzi na stymulanty zapachu. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie nabłonka węchowego i przeniesienie go do perfundowanej komory. Drugim krokiem jest zlokalizowanie i wybranie interesującego OSN pod mikroskopem.

Pokrętło dendrytyczne wybranego OSN jest następnie zaciskane i analizowane podczas stymulacji środkami zapachowymi. Ostatecznie, perforowane mocowanie krosowe pokręteł dendrytycznych OSN charakteryzuje właściwości funkcjonalne OSN na poziomie membrany. Ta metoda może pomóc w rozwiązaniu kluczowych pytań w dziedzinie węchu, takich jak rejestrowanie węchu, neuronów czuciowych, wyrażanie zdefiniowanych receptorów sztuki zapachowej, a także nagrania z zaciskiem łatki.

Podaj informacje o właściwościach błony tych neuronów. Przygotuj pipety stymulujące z jednomilimetrowej szklanki lub kup je wstępnie wyciągnięte za pomocą płomienia. Zegnij sześć pipet około jednego centymetra od końcówki pod kątem 45 stopni.

Następnie ułóż sześć pipet z wygiętą końcówką wokół siódmej pipety prostej, używając oczka jako prowadnicy i zawiń je w rurkę termokurczliwą. Podgrzej folię termokurczliwą na drugim końcu pipet. Nałóż więcej folii termokurczliwej.

To sprawia, że pipeta stymulująca prepo z siedmioma beczkami. Teraz za pomocą wielocylindrowej polarnej dźwigni pociągnij siedmiocylindrową pipetę stymulującą. Po pociągnięciu wzmocnij zespół białym klejem wokół oczka.

Następnie pozostaw klej do wyschnięcia przez noc wymaganych roztworów. Roztwór nystatyny musi być świeży tuż przed użyciem. W razie potrzeby odważ trzy miligramy nystatyny i dodaj je do 50 mikrolitrów DMSO.

Następnie wiruj mieszaninę przez 20 sekund. Następnie poddaj mieszaninę sonikacji przez dwie do trzech minut, aby zapewnić całkowite rozcieńczenie. Teraz dodaj 20 mikrolitrów mieszanki do pięciu mililitrów wewnątrzkomórkowego roztworu podstawowego.

Mieszaj Vortex przez 20 sekund, po czym następuje od dwóch do trzech minut sonikacji. Następnie schłodzić roztwór roboczy na lodzie i chronić go przed światłem. W ten sposób roztwór roboczy jest dobry przez kilka godzin.

Załadować strzykawkę wyposażoną w mikrofilm roztworem roboczym. Będzie dobry przez godzinę użytkowania, dopóki nie zostanie zużyty. Załadowaną strzykawkę należy jednak zakonserwować, trzymając ją na lodzie.

Teraz wyciągnij kilka elektrod nagrywających z długimi szyjkami i otworami o dwóch mikronach. Celem jest uzyskanie rezystancji od 15 do 20 megaomów po załadowaniu roztworem nystatyny. Na koniec napełnij pipetę stymulującą środkiem zapachowym rozcieńczonym w dzwonku. Rozwiązanie.

W przypadku tego protokołu miej myszy dostępne w wieku od dwóch do czterech tygodni. W tej prezentacji myszy wyrażające lub IRES tau GFP są używane przy użyciu lub myszy IS tau GFP. Wszystkie neurony wyrażające lub będące przedmiotem zainteresowania zostaną oznaczone GFP.

Metodę tę można stosować dla wszystkich stref lub wyrażać we wszystkich strefach. Jednak sekcje i zapisy będą łatwiejsze w przypadku sal operacyjnych wyrażonych w strefie grzbietowej. Zacznij od znieczulenia, a następnie odcięcia głowy myszy.

Wynik tego protokołu zależy od jakości sekcji. Te etapy sekcji muszą być jak najkrótsze i precyzyjne. Aby rozpocząć operację, użyj nożyczek preparujących, aby wykonać podłużne cięcie wzdłuż grzbietu.

Rozsuń skórę, aby ją usunąć. Następnie przeciąć wzdłuż dolnej szczęki i wykonać nacięcie koronalne równolegle do zębów. W ten sposób usuń górne siekacze.

Teraz wykonaj nacięcie koronalne wokół głowy, za oczami, odrzuć tylną głowę i przenieś przednią część do lodowatych dzwonków. Teraz pod mikroskopem preparacyjnym wyizoluj przegrodę w ciągu pięciu do 10 minut. Zacznij od podłużnego cięcia wzdłuż strony brzusznej.

Następnie przetnij kości grzbietowe wzdłuż grzbietowej bocznej strony jamy nosowej. Następnie usuń większość kości i podniebienie. Przenieś izolowaną przegrodę i przymocuj nabłonek do pojemnika z natlenionymi dzwonkami w temperaturze pokojowej.

W ciągu pięciu minut dokonaj ostatnich przygotowań przed nagraniem. Roztwór nie może być zbyt ciepły, w przeciwnym razie preparat będzie wyglądał na uszkodzony. Aby uzyskać dostęp do nabłonka nerwowego w celu nagrania.

Najpierw oderwij nabłonek od leżącej poniżej przegrody za pomocą kleszczy. Następnie za pomocą mikro nożyczek Vanna przetnij przedni koniec przegrody, aby uwolnić nabłonek. Teraz ostrożnie usuń narząd nosowy lemieszowy.

Odetnij go w miejscu, w którym jest przymocowany grzbietowo. Wyizolowany nabłonek można teraz przenieść do komory nagraniowej śluzem do góry. Po umieszczeniu na miejscu użyj harfy, aby spłaszczyć tkankę.

Następnie przenieś komorę do pionowego mikroskopu. Wizualizuj nabłonek nerwowy pod obiektywem 40-krotnego zanurzenia w wodzie, jednocześnie stale go przenikając świeżymi dzwonkami w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć poszukiwania interesujących komórek, które w tym przypadku wyrażają EGFP, do skanowania komórek emitujących światło w zakresie od 530 do 550 nanometrów używa się światła o długości 480 nanometrów.

Docelowe gałki dendrytyczne i osn podczas przeglądu przy 80 do 160 x w jasnym polu powinny być wyraźnie odróżnialne od komórek nośnych. Teraz załaduj elektrodę roztworem statyny S. Wystuknij wszelkie tworzące się pęcherzyki i przymocuj elektrodę do uchwytu.

Teraz zastosuj trochę dodatniego ciśnienia. Oczekiwana rezystancja wynosi od 15 do 20 megaomów. Następnie przyłóż elektrodę do ogniwa, utrzymując nadciśnienie.

Gdy rezystancja wzrośnie do około 40 megaomów, zwolnij ciśnienie i zastosuj lekkie podciśnienie. Jeśli wykonana jest uszczelka giga, potencjał membrany powinien być zaciśnięty na poziomie około minus 75 miliwoltów. Teraz, gdy komórka jest otwarta, kontynuuj eksperyment.

Zastosuj stymulację, protokoły i perfuzję z zabiegami farmakologicznymi w razie potrzeby, aby przetestować z pojedynczym środkiem zapachowym. Rejestruj od 200 do 500 milisekund spontanicznej aktywności. Nakładaj środek zapachowy na 500 milisekund, a następnie mierz reakcje przez maksymalnie 10 sekund, korzystając z opisanego protokołu.

MOR 23, neurony wykazujące ekspresję oznaczone EGFP, zostały załatane i stymulowane różnymi stężeniami al. W obecnym trybie cęgowym lyal jest ligandem dla MOR 23. Alternatywnie, ogniwa były symulowane w trybie cęgów napięciowych.

W nagraniach w trybie cęgów napięciowych monitorowano różne charakterystyki. Aby określić ilościowo odpowiedź wykonywaną klasycznie w elektrofizjologii przy użyciu odpowiedzi o maksymalnej amplitudzie, odpowiedź na dawkę wykreślono za pomocą równania wzgórza. Wyniki te dostarczają informacji o właściwościach kodowania każdej nazwy OSN, która obejmuje jej próg wykrywania, czasowy, dynamiczny, zakres dynamiczny i poziom nasycenia.

Po opanowaniu część separacyjną tej techniki można wykonać w ciągu 10 do 15 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać właściwości funkcjonalne węchowych neuronów czuciowych wyrażających zdefiniowane receptory zapachowe u myszy.