Name: Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj technikę perforowanego patch-clamp do badania właściwości błonowych neuronów węchowych w nienaruszonym neuroepitelium myszy. Metoda umożliwia analizę odpowiedzi na odoranty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Peterowi Mombaertsowi za hojny dar myszy OR-GFP; Anne Lefranc i ośrodek dla zwierząt CSGA za doskonałą opiekę nad zwierzętami. Finansowanie zostało zapewnione przez CNRS w ramach grantów ATIP i ATIP Plus, przez Conseil Régional de Bourgogne (granty FABER i PARI), przez Université de Bourgogne (program BQR).

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Université de Bourgogne i został zatwierdzony przez komisję etyki Université de Bourgogne.
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Użyj genetycznie zmodyfikowanych myszy OR-IRES-tauGFP dostępnych w Jackson Laboratory. Myszy te zostały opracowane w laboratorium dr Petera Mombaertsa w celu analizy celowania aksonów i rozwoju układu węchowego19. Na przykład linia MOR23-IRES-tauGFP, numer katalogowy 006643, nosi oficjalną nazwę szczepu B6; 129P2-Olfr16tm2Mamo/MamJ; podobnie linia SR1-IRES-tauGFP o numerze magazynowym 6717 nosi oficjalną nazwę B6; 129P2-Olfr124tm1Mama/MamaJ.</li>
	<li>Jeśli chodzi o wiek zwierząt: w celu uzyskania lepszych wyników protokołu należy używać zwierząt w wieku od 2 do 4 tygodni. W tej grupie wiekowej rozwarstwienie jest łatwiejsze (bardziej miękkie kości, mocniejszy nabłonek węchowy), a guzki dendrytyczne są większe w porównaniu ze starszymi zwierzętami.</li>
</ol>
2. Przygotowanie elektrod i roztworów
<ol>
	<li>W przypadku pipet stymulujących: należy zakupić wstępnie naciągnięte pipety stymulacyjne. W przeciwnym razie przygotuj je ręcznie.
	<ol>
		<li>Za pomocą płomienia zegnij sześć szklanych pipet o średnicy 1 mm w odległości około 1 cm od końcówki. Włóż te sześć pipet oraz prostą rurkę termokurczliwą o średnicy 7 cala o średnicy 1,5 cm, wzmocnioną oczkiem.</li>
		<li>Termokurczliwie rurkę, aby beczki były ze sobą połączone. Przymocuj dodatkową rurkę termokurczliwą do drugiego końca beczek. Pociągnij tę stymulującą pipetę za pomocą ściągacza wielobębnowego.</li>
		<li>Dodaj trochę białego płynnego kleju wokół oczka, aby wzmocnić wygięte końcówki. Pozostaw do wyschnięcia O/N.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 1 lub 2 l normalnego roztworu zewnątrzkomórkowego Ringera (w mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1,25, glukoza 15; pH 7,6 i 305 mOsm). Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotować wewnątrzkomórkowy roztwór podstawowy (w mM): KCl 70, KOH 53, kwas metanosulfonowy 30, EGTA 5, HEPES 10, sacharoza 70; pH 7,2 (KOH) i 310 mOsm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Dobre przez kilka tygodni.</li>
	<li>Przygotować wewnątrzkomórkowy roztwór rejestrujący z nystatyną doraźnie (w ostatniej chwili) przed eksperymentem.
	<ol>
		<li>Odważyć 3 mg nystatyny, dodać 50 μl DMSO; wirować przez 20 sekund, a następnie sonikować przez 2-3 minuty, aż do całkowitego rozcieńczenia.</li>
		<li>Dodać 20 μl roztworu DMSO-nystatyny do 5 ml wewnątrzkomórkowego roztworu podstawowego. Wirować 20 sekund, a następnie sonikować 3 minuty. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed bezpośrednim działaniem światła, nystatyna jest wrażliwa na światło. To rozwiązanie może być używane przez kilka godzin. Wymieniaj codziennie.</li>
		<li>Gdy preparat nabłonka węchowego znajdzie się pod mikroskopem, należy pobrać część tego roztworu do strzykawki o pojemności 1 ml z wydłużoną żółtą końcówką w celu napełnienia elektrod; chronić przed bezpośrednim światłem. W RT roztwór nystatyny nie jest stabilny; Roztwór należy wymieniać w strzykawce o pojemności 1 ml co godzinę lub przechowywać w lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pociągnij elektrody rejestrujące za pomocą ściągacza, aby uzyskać długą szyjkę i małą końcówkę (~2 μm) o rezystancji 15-20 MΩ z wewnętrznym roztworem nystatyny.</li>
	<li>Przygotować roztwór nawaniacza o stężeniu 0,5 m w DMSO pod wyciągiem wyciągowym; porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Rozcieńczyć środek zapachowy w roztworze Ringera do uzyskania pożądanego stężenia. Napełnij pipetę stymulującą.</li>
</ol>
3. Przygotowanie nabłonka węchowego
Uwaga: myszy OR-IRES-tauGFP wyrażają tauGFP pod kontrolą promotora OR. U tych myszy wszystkie neurony wyrażające interesujący nas OR są oznaczone GFP. Protokół ten jest dostosowany do sal operacyjnych wyrażonych we wszystkich strefach. Jednak sekcje i zapisy są łatwiejsze w przypadku OR wyrażonych w strefie grzbietowej.
<ol>
	<li>Znieczulenie zwierzęcia należy poprzez wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 150 mg/kg i 10 mg/kg masy ciała). Dekapitację można wykonać ostrymi nożyczkami w przypadku młodych myszy lub odpowiednio konserwowaną gilotyną dla gryzoni w przypadku starszych myszy.
	<ol>
		<li>Za pomocą nożyczek do preparowania pierścieni wykonaj podłużne nacięcie przyśrodkowe przez skórę grzbietową. Usuń skórę, rozsuwając ją. Za pomocą nożyczek przetnij dolne szczęki w stawie szczękowym. Usuń górne przednie zęby za pomocą cięcia koronalnego równoległego do zębów.</li>
		<li>Wykonaj przecięcie koronalne głowy za oczami i zachowaj tylko przednią część głowy. Zanurz go w lodowatym roztworze Ringera do sekcji pod lunetą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparuj pod lunetą: po stronie brzusznej wykonaj podłużne cięcie wzdłuż górnej szczęki/zębów. Przetnij kości grzbietowe wzdłużnie, podążając za grzbietowo-boczną stroną jamy nosowej. Usuń większość kości i podniebienia; przenieść przegrodę i przyczepiony do niej nabłonek w natlenizowanym Ringerze w RT.</li>
	<li>Do końcowej sekcji: Tuż przed rozpoczęciem sesji nagraniowej oderwij nabłonek od leżącej poniżej przegrody za pomocą kleszczy. Odłącz nabłonek za pomocą kleszczy i dwóch nacięć nożycowych 4-5 mm (użyj nożyczek microvannas) w przedniej części przegrody, gdzie zrost jest silniejszy.
	<ol>
		<li>Ostrożnie usuń narząd lemieszowo-nosowy, wycinając go wzdłuż jego grzbietowego połączenia z nabłonkiem przegrody. Przenieś nabłonek do komory rejestracyjnej z warstwą śluzu skierowaną do góry; Trzymaj go płasko w komorze z harfą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainstaluj komorę pod mikroskopem pionowym wyposażonym w optykę fluorescencyjną i czułą kamerę. Wizualizuj przygotowanie na ekranie komputera w dużym powiększeniu dzięki 40-krotnemu obiektywowi zanurzeniowemu w wodzie (apertura numeryczna 0,8) i dodatkowemu powiększeniu 2X lub 4X uzyskanemu przez soczewkę powiększającą. Napełniać w sposób ciągły natlenionym Dzwonkiem przy temperaturze pokojowej (1-2 ml/min).</li>
</ol>
4. Sesja nagraniowa
<ol>
	<li>Poszukiwanie komórki fluorescencyjnej: wzbudzić preparat o długości fali 480 nm dla EGFP, który emituje światło w zakresie 530-550 nm; celować w jedną gałkę dendrytyczną, która jest niezawodnie widoczna we fluorescencji i w jasnym polu.</li>
	<li>Napełnij elektrodę roztworem wewnątrzkomórkowym z nystatyną; usuń pęcherzyki, delikatnie stukając w elektrodę.</li>
	<li>Włóż elektrodę do uchwytu elektrody, zastosuj nadciśnienie w pipecie; Rezystancja powinna wynosić 15-20 MΩ.</li>
	<li>Zbliż elektrodę do ogniwa; gdy rezystancja osiągnie ~40 MΩ, zwolnij nadciśnienie i zastosuj lekkie podciśnienie, aby osiągnąć gigaseal.</li>
	<li>Po osiągnięciu uszczelnienia należy ustawić potencjał membrany na około -75 mV;</li>
	<li>Po otwarciu komórki przystąp do protokołów stymulacji, leczenia farmakologicznego. Aby zmierzyć reakcję na pojedynczą stymulację odorantem, zarejestruj 200-500 ms spontanicznej aktywności, stymuluj przez 500 ms i mierz odpowiedź komórki przez maksymalnie 10 sekund 13. W przypadku zabiegów farmakologicznych należy perfuzjować środki farmakologiczne w pożądanym stężeniu20.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Przeanalizuj prądy wywołane przez stymulację nazapachową w następujący sposób: maksymalna amplituda, czas narastania (czas niezbędny do osiągnięcia 90% maksymalnej amplitudy, w ms), całkowity prąd (obszar pod krzywą w pAs), czas przy 50% (czas między początkiem a przesunięciem odpowiedzi przy 50% maksymalnej amplitudzie, w ms).
	<ol>
		<li>Korzystając ze szczytowych prądów transdukcji (osiągnięta maksymalna amplituda) przy różnych stężeniach, narysuj i dopasuj krzywą odpowiedzi na dawkę, korzystając z równania Hilla: I = Imax/(1 + (K1/2/C)n), gdzie I oznacza prąd szczytowy, Imax maksymalną odpowiedź przy stężeniach nasycenia, K1/2 stężenie, przy którym osiągnięto połowę maksymalnej odpowiedzi, C stężenie nawaniacza i n współczynnik Hilla.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj zapisy potencjału błony w cęgach prądowych pod kątem maksymalnej depolaryzacji, całkowitego generowanego potencjału (obszar pod krzywą w mVsec); rejestruj spontaniczną aktywność skokową w ciągu 30 sekund do 1 minuty; rejestruj pobudliwość poprzez skoki wywołane wtryskiem prądu (5-10 pA).</li>
</ol>

<ol><li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+amplification+by+calcium-dependent+chloride+channels+in+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells.</a> Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).</li>
<li>Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-induced+responses+recorded+from+olfactory+receptor+neurons+using+the+suction+pipette+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique.</a> J Vis Exp. (62), e3862(2012).</li>
<li>Moss, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+biochemical+responses+of+mouse+vomeronasal+receptor+cells+to+urine-derived+compounds%3A+possible+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action.</a> Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).</li>
<li>Kaur, A., Dey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+calcium+imaging+of+dissociated+vomeronasal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons.</a> Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).</li>
<li>Ma, M., Chen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+rat+and+mouse+olfactory+receptor+neurons+from+an+intact+epithelial+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation.</a> J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).</li>
<li>Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li>
<li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li>
<li>Bozza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+class+I+and+class+II+odorant+receptors+to+glomerular+domains+by+two+distinct+types+of+olfactory+sensory+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse.</a> Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).</li>
<li>Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minigenes+impart+odorant+receptor-specific+axon+guidance+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb.</a> Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).</li>
<li>Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+of+mouse+olfactory+sensory+neurons+by+odorant+receptors+and+the+beta2+adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor.</a> Cell. 117 (6), 833-846 (2004).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Grosmaitre, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SR1%2C+a+mouse+odorant+receptor+with+an+unusually+broad+response+profile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile.</a> J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).</li>
<li>Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+responses+of+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptor+MOR23%3A+a+patch+clamp+analysis+in+gene-targeted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).</li>
<li>Lam, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+responsiveness+of+embryonic+mouse+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptors+S1+or+MOR23%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+stimulus+specificity+and+glomerular+position+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system.</a> Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).</li>
<li>Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+detection+of+amines+by+a+trace+amine-associated+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor.</a> J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).</li>
<li>Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+odorant+receptors+and+response+properties+of+olfactory+sensory+neurons+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice.</a> Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).</li>
<li>Cadiou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+odorant+exposure+induces+peripheral+olfactory+plasticity+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level.</a> J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+wiring+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal wiring in the mouse olfactory system.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).</li>
<li>Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+functions+of+mammalian+olfactory+sensory+neurons+as+odor+detectors+and+mechanical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors.</a> Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).</li>
<li>Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+response+properties+of+rat+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Odor response properties of rat olfactory receptor neurons.</a> Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).</li>
<li>Heydel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-binding+proteins+and+xenobiotic+metabolizing+enzymes%3A+implications+in+olfactory+perireceptor+events%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events.</a> Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).</li>
<li>Pelosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perireceptor+events+in+olfaction%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Perireceptor events in olfaction).</a> J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).</li>
<li>Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-phosphoinositides+modulate+cyclic+nucleotide+signaling+in+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons.</a> Neuron. 33, 731-739 (2002).</li>
<li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+%27IP%283%29-odors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors.</a> J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).</li>
<li>Savigner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+spontaneous+and+odorant-evoked+activity+of+rat+olfactory+sensory+neurons+by+two+anorectic+peptides%2C+insulin+and+leptin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin.</a> J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).</li>
<li>Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase-dependent+antagonism+in+mammalian+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons.</a> J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Zdolność tego protokołu do prawidłowego monitorowania właściwości zdrowych OSN zależy w dużej mierze od jakości preparatu. Dlatego etapy sekcji mają kluczowe znaczenie. Po pierwsze, należy zwrócić uwagę na jakość (pH, osmolarność), natlenienie i temperaturę (lodowata, ale nie zamrożona) podłoża preparacyjnego. Po drugie, manipulacja nabłonkiem za pomocą narzędzi preparacyjnych musi być jak najbardziej ograniczona, aby uniknąć uszkodzeń. Wreszcie, bardzo ważne jest, aby uzyskać jak najbardziej płaskie przygotowanie, aby u...

Węchowe neurony czuciowe (OSN) reprezentują pierwszy etap percepcji węchowej. Zlokalizowane w nabłonku węchowym wyściełającym jamę nosową u gryzoni, przekształcają informacje chemiczne substancji zapachowych w potencjały czynnościowe wysyłane przez ich akson do mózgu. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy kodowania węchowego, konieczne jest scharakteryzowanie właściwości transdukcji i błony OSN. Do niedawna większość technik stosowanych do charakterystyki właściwości OSN ssaków przeprowadzano na zdysocjowanych OSN1-4. Proces dysocjacji wykorzystuje różne procesy mechaniczne i chemiczne (tj. enzymy) w celu uwolnienia OSN od ich środowiska. Procesy te indukują małą liczbę dostępnych komórek do nagrań. Ta niska liczba może być jeszcze bardziej krytyczna w przypadku komórek znakowanych GFP. Dysocjacja usuwa również lokalne interakcje międzykomórkowe między OSN a innymi komórkami nabłonka węchowego, co może zwiększyć przeżywalność i modulację właściwości OSN. W celu ominięcia procedury dysocjacji opracowano nienaruszony preparat5.
Każdy OSN wyraża jeden receptor węchowy (OR) wybrany z dużej rodziny wielogenowej6. Istnieje ~ 1,000 OR wyrażonych w głównym nabłonku węchowym myszy. Ze względu na dużą liczbę OR u zwierząt typu dzikiego, szanse na zarejestrowanie OSN wyrażających ten sam OR są bardzo niskie. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, dostępne są myszy ukierunkowane na geny, w których wszystkie OSN wyrażające zidentyfikowany OR są znakowane białkiem fluorescencyjnym7-9. Te oznaczone OSN wykorzystano do przeprowadzenia analizy funkcjonalnej w preparatach zdysocjowanych7,10,11 z wadami wymienionymi wcześniej. Nienaruszony preparat nabłonka5 od genetycznie znakowanych myszy pozwala zatem obejść te problemy. Pozwala na monitorowanie aktywności OSN wyrażających precyzyjnie zdefiniowane OR w środowisku jak najbardziej zbliżonym do in vivo. Poza tym, zapisy OSN typu patch-clamp umożliwiają również precyzyjną analizę właściwości błony, farmakologii szlaku transdukcji, interakcji ligand/OR. Wszystkie te tematy trudno analizować za pomocą nagrań zewnątrzkomórkowych. Użyliśmy tej techniki do monitorowania odpowiedzi OSN wyrażających receptory zapachowe SR1 i MOR2312,13. Wykonalność tej techniki została potwierdzona przez inne grupy na MOR23 z ekspresją OSN14, a także na innych OR z ekspresją neuronów15,16. Monitorowanie zdefiniowanej populacji OSN może prowadzić do analizy ich właściwości w wielu różnych kontekstach, takich jak rozwój14, starzenie się17, plastyczność wywołana odorantem18 oraz rola zmian w sekwencji receptora zapachowego w kodowaniu zapachu15. Protokół ten stanowi zatem potężne narzędzie do monitorowania właściwości funkcjonalnych zdefiniowanych OSN na poziomie membrany.

<table><tbody><tr><td>stół wibracyjny z klatką Faradaya</td> Wymagana seria <td>TMC</td><td>63-500</td><td>: izoluje system rejestrujący od wibracji indukowanych przez otoczenie (ruchy eksperymentatora, wibracje urządzeń takich jak wentylatory do chłodzenia komputerów itp.); może być również zakupiony z klatką Faradaya lub wyposażony w wykonaną na zamówienie klatkę Faradaya; klatka ta jest zalecana w celu uniknięcia zakłóceń elektrycznych z optyki otoczenia</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td> mikroskop <td>pionowy wyposażony w epifluorescencję; stolik stały lub ruchomy w zależności od preferencji użytkownika</td></tr><tr><td>obiektywy</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFL40XW</td><td>wymagane co najmniej 2 obiektywy: 4X lub 10X do zgrubnego podejścia do komórki; oraz 40-krotne zanurzenie na duże odległości Lupa Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3,3 MM</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>U-TVCAC</td><td>BEZWZGLĘDNIE WYMAGANE: umieszczony na ścieżce światła między obiektywem a kamerą; pozwala na powiększenie obrazu na ekranie w celu precyzyjnego dotarcia do pokrętła z kamerą z elektrodą rejestrującą</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td>potrzebna jest dobra kamera, aby zobaczyć neurony we fluorescencji, jak również w jasnym polu; oprogramowanie sterujące jest proste i pozwala na robienie zdjęć i wykonywanie obrazu z kamery na żywo w celu monitorowania zbliżania się elektrody do ogniwa. Ultraczuła kamera nie jest konieczna</td></tr><tr><td>filtruje</td><td>Olympus/Chroma</td><td></td><td>w zależności od białka fluorescencyjnego użytego u myszy; przykład dla GFP: wzbudzenie: BP460-490: emisja: wzmacniacz HQ530/50m</td></tr><tr><td></td><td>HEKA</td><td>EPC10 USB</td><td>monitoruje prądy przepływające przez elektrodę rejestrującą, a także kontroluje zaciąganie się, wysyłając sygnał TTL do spritzera; konfiguracja EPC10 jest kontrolowana przez</td></tr><tr><td>oprogramowanie</td> <td>komputeroweHEKA</td><td>Patchmaster</td><td>steruje wzmacniaczem podczas eksperymentu</td></tr><tr><td>mikromanipulator Mikromanipulator</td> precyzyjny <td>Sutter</td><td>MP225</td><td>, umożliwia precyzyjne ruchy z dokładnością do 1/10 mikrometra; model ten jest bardzo stabilny; należy unikać manipulatorów hydraulicznych, które mogą dryfować</td></tr><tr><td>ściągacz elektrody</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>z żarnikiem FT345-B o szerokim korycie; &nbsp; do przygotowania pipet nagrywających o wielkości około 2&mikro; m średnicy z długą końcówką, aby dotrzeć do komórek; rezystancja powinna wynosić od 15 do 20Mohm z perforowanym szkłem do montażu krosowego</td></tr><tr><td></td><td>Sutter</td><td>BF120-69-10</td><td>w naszych warunkach nagrywania, szkło to jest idealne do nagrywania pipet</td></tr><tr><td>komora nagrywająca</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td>komora jest potrzebna do ustawienia preparatu pod mikroskopem. Aby utrzymać preparat w środku komory, należy użyć siatki/kotwy.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>szkło <td>stymulacyjne</td></tr><tr><td></td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>mocowane w grupach po 7 sztuk, pipety te służą do przygotowania wstępnie naciągniętych pipet stymulujących</td></tr><tr><td>ściągacz wielolufowy</td><td>MDI</td><td>PMP-107-Z</td><td>poprzez połączenie ciągnięcia i przekręcenia, ściągacz ten pozwala nam przygotować elektrody do zaciągania z 7 beczkami</td></tr><tr><td>precyzyjny wtryskiwacz ciśnieniowy&nbsp;</td><td>Toohey Company</td><td>P/N T25-1-900 Pojedynczy kanał&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>ten precyzyjny wtryskiwacz ciśnieniowy steruje ciśnieniem wyrzucanym w ściągaczu wielolufowym; jest sterowany ręcznie lub przez wzmacniacz za pomocą 5V&nbsp; </td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td> TTLs <td>Narishige</td><td>YOU-1</td><td>Manipulator zgrubny wystarczy, aby zbliżyć elektrodę zaciągającą się do</td></tr><tr><td>miejsca nagrywania rurki</td><td>N/A</td><td></td><td>rurki tygonowe, aby doprowadzić ciśnienie z rozdymki do pompowania pipet do pomp do zaciągania</td></tr><tr><td>roztwory/perfuzja/chemikalia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Gardner Denver</td><td>300 Series</td><td>wibracyjna pompa membranowa jest cichsza i wydajniejsza niż inne typy pomp</td></tr><tr><td>system perfuzyjny</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>grawitacyjny system perfuzyjny z rurkami polietylenowymi do wprowadzania i wyprowadzania roztworu zewnętrznego z komory rejestracyjnej</td></tr><tr><td>nystatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td><td>obowiązkowa do perperforowanego zacisku krosowego</td></tr><tr><td>SULFOTLENEK DIMETYLU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>Służy do rozpuszczania nystatyny do roztworu wewnętrznego do łat perforowanych&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>roztwór zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>roztwór wewnątrzkomórkowy/zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>roztwór zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>roztwór zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4 7H2O)</td><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>roztwór zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>roztwór</td></tr> <tr><td>zewnątrzkomórkowyEGTA (Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraoctowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>roztwór wewnętrzny</td></tr><tr><td>Hydroksyd potasu</td><td>Roztwór wewnętrzny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td></tr><tr><td>Methyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387509</td><td>roztwór wewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>Hepes-Na</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td>roztwór wewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>roztwór wewnątrzkomórkowy</td></tr></tbody></table>

perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analiza fizjologicznych reakcji węchowych neuronów czuciowych (OSN) stymulowanych specyficznymi ligandami jest kluczowa dla zrozumienia podstaw zachowań opartych na węchu i ich modulacji. Te właściwości kodowania zależą w dużym stopniu od początkowej interakcji między cząsteczkami zapachu a receptorem węchowym (OR) wyrażonym w OSN. Tożsamość, swoistość i spektrum ligandów wyrażonego OR mają kluczowe znaczenie. Prawdopodobieństwo znalezienia liganda OR wyrażonego w OSN wybranym losowo w obrębie nabłonka jest bardzo niskie. Aby sprostać temu wyzwaniu, protokół ten wykorzystuje genetycznie znakowane myszy wykazujące ekspresję białka fluorescencyjnego GFP pod kontrolą promotora zdefiniowanych OR. OSN znajdują się w ciasnym i zorganizowanym nabłonku wyściełającym jamę nosową, a sąsiednie komórki wpływają na ich dojrzewanie i funkcję. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania nienaruszonego nabłonka węchowego i rejestrowania za pomocą zapisów patch-clamp właściwości OSN wyrażających określone receptory zapachowe. Protokół pozwala scharakteryzować właściwości błony OSN przy zachowaniu wpływu sąsiedniej tkanki. Analiza wyników patch-clamp pozwala na precyzyjne określenie ilościowe interakcji ligand/OR, szlaków transdukcji i farmakologii, właściwości kodujących OSN i ich modulacji na poziomie błony.

Wynik tego protokołu zależy od jakości sekcji. Kroki sekcji muszą być krótkie (mniej niż 10 do 15 min) i precyzyjne (t.j. aby uniknąć uszkodzeń nabłonka). Rysunek 1 ilustruje, jak wygląda idealny preparat przy różnych powiększeniach. Przy niskim powiększeniu w polu jasnym możliwe jest rozróżnienie różnych typów komórek (takich jak gałki OSN, komórki podporowe) (Rysunek 1A). Przy najwyższym stopniu powiększenia, zazwyczaj od 80X do 160X, w polu jasnym, dendrytyczne gałki OSN powi...

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar zmian właściwości błony neuronów sensorycznych węchu w odpowiedzi na bodźce zapachowe. Jest to realizowane poprzez wstępne wypreparowanie nabłonka węchowego i przeniesienie go do komory perfuzyjnej. Drugim krokiem jest zlokalizowanie i wybranie pod mikroskopem interesującegot neuronu sensorycznego węchu (OSN).Następnie w obrębie wybranego guzka dendrytycznego OSN wykonuje się metodę patch clamp i prowadzi analizę podczas stymulacji odorantami. Ostatecznie, zastosowanie metody perforated patch clamp w guzkach dendrytycznych OSN pozwala na charakteryzację właściwości funkcjonalnych OSN na poziomie błony komórkowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie olfaktoryki, takie jak rejestracja aktywności węchowych neuronów sensorycznych wykazujących ekspresję określonych receptorów zapachowych, a także rejestracje metodą patch clamp.Należy podać informacje o właściwościach błonowych tych neuronów. Przygotować pipety stymulujące z jednego milimetra szkła lub zakupić pipety wcześniej dociągnięte metodą płomieniową. Zgiąć sześć pipet w odległości około jednego centymetra od końcówki pod kątem 45 stopni.Następnie ułożyć sześć

perforated-patch-clamp-recording-mouse-olfactory-sensory-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przebijaną rejestrację zaciskania łatkowego neuronów czuciowych węchowych myszy w nienaruszonym neuroepitelium: Analiza funkcjonalna neuronów ekspresujących zidentyfikowany receptor odorantu

Rejestracja elektroolfaktogramu (EOG) jest informacyjną, łatwą do przeprowadzenia i niezawodną metodą oceny funkcji węchowych na poziomie nabłonka węchowego. Niniejszy protokół opisuje konfigurację układu rejestracyjnego, przygotowanie tkanek mysich, gromadzenie danych oraz podstawową analizę danych.

Analiza odpowiedzi neuronów sensorycznych węchu myszy z wykorzystaniem zapisu elektroolfaktogramu w fazie gazowej

Neurony receptorowe węchu (ORNs) przekształcają sygnały zapachowe najpierw w prąd receptorowy, który z kolei wywołuje potencjały czynnościowe przekazywane do neuronów drugiego rzędu w opłatce węchowej. W niniejszej pracy opisujemy technikę pipety ssącej służącą do jednoczesnego rejestrowania indukowanego substancją zapachową prądu receptorowego oraz potencjałów czynnościowych z ORNs myszy.

Rejestracja odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w neuronach receptorowych węchowych z wykorzystaniem techniki pipety ssącej

Ten film demonstruje elektrofizjologiczny zapis węchowych neuronów czuciowych (OSN) u myszy przy użyciu techniki perforowanego patch-clamp. Nabłonek węchowy, zawierający OSN z receptorami zapachowymi znakowanymi fluoroforem, jest izolowany od myszy i umieszczany w komorze rejestracyjnej. Pipeta rejestrująca jest zaciśnięta na dendrytycznym pokrętle OSN, a nystatyna w pipecie perforuje membranę, tworząc połączenie elektryczne z komórką. Na koniec za pomocą kolejnej pipety dostarcza się...

Perforowany zapis węchowych neuronów czuciowych u myszy

Wideo z protokołem opisuje tworzenie klamry do rejestracji elektrofizjologicznej z całych komórek z neuronów czuciowych narządu lemieszowo-nosowego (VNO) u myszy. Koronalny wycinek VNO z fluorescencyjnie znakowanymi neuronami czuciowymi umieszcza się w konfiguracji rejestracyjnej. Znakowany neuron jest łatany pipetą rejestrującą w konfiguracji całej komórki w celu zapisu elektrofizjologicznego w odpowiedzi na bodźce chemiczne.

Ustanowienie klamry krosowej dla całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z neuronów czuciowych lemieszowo-nosowych

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

Skuteczna ręczna metoda odkostniania w celu przygotowania nienaruszonej tkanki nosowej myszy z zachowaną organizacją anatomiczną

Rzęski węchowych neuronów czuciowych zawierają białka kaskady transdukcji sygnału, ale szczegółowa analiza przestrzenna ich rozmieszczenia jest trudna w kriosekcjach. Opisujemy tutaj zoptymalizowane podejście do znakowania całego mocowania i wizualizacji en face białek rzęskowych.

Znakowanie całego mocowania rzęsek w głównym układzie węchowym myszy

Tutaj opisujemy fizjologiczne podejście, które pozwala na identyfikację i dogłębną analizę zdefiniowanej populacji neuronów czuciowych w ostrych wycinkach tkanki koronalnej mysiego narządu lemieszowo-nosowego za pomocą nagrań z całych komórek.

Dogłębna analiza fizjologiczna zdefiniowanych populacji komórek w ostrych wycinkach tkanek mysiego narządu lemieszowo-nosowego

Scharakteryzowanie funkcji receptorów zapachowych jest nieodzowną częścią procesu desierotyzacji. Opisujemy metodę pomiaru aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym za pomocą testu cAMP.

Pomiar aktywacji receptora zapachowego na żywych komórkach za pomocą testu cAMP w czasie rzeczywistym

Węchowe neurony czuciowe wyrażają szeroką gamę cząsteczek sortujących aksony, aby ustanowić prawidłowe obwody neuronowe. Protokół ten opisuje metodę barwienia immunohistochemicznego w celu wizualizacji kombinatorycznych ekspresji cząsteczek sortujących aksony na końcach aksonów węchowych neuronów czuciowych.

Poczwórne barwienie immunologiczne opuszki węchowej w celu wizualizacji węchowych kodów tożsamości molekularnej aksonu czuciowego

Poznaj technikę perforowanego patch-clamp do badania właściwości błonowych neuronów węchowych w nienaruszonym neuroepitelium myszy. Metoda umożliwia analizę odpowiedzi na odoranty.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy (Wideo) | JoVE Journal

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Przeglądaj więcej filmów