Zastosowanie techniki iniekcji stereotaktycznej do badania wpływu genetycznego na zachowania zwierząt

Ogólnym celem tej procedury jest ocena, w jaki sposób modulowanie ekspresji genu w obszarze docelowym wpływa na zachowanie zwierząt. Osiąga się to poprzez stworzenie najpierw lentiwirusa w celu modulacji ekspresji docelowego genu. Drugim krokiem jest zastosowanie wstrzyknięcia stereotaktycznego w celu wstrzyknięcia lentiwirusa do określonego obszaru mózgu gryzonia ER.

Następnie zachowania, takie jak lęk i depresja, można mierzyć ilościowo przy użyciu ustalonych paradygmatów behawioralnych. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie badania histologicznego w celu potwierdzenia prawidłowego miejsca wstrzyknięcia. Ostatecznie, wstrzyknięcie stereotaktyczne w połączeniu z oceną behawioralną może pokazać, w jaki sposób określony gen w obszarze docelowym może wpływać na zachowanie myszy.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że naukowcy mogą zmienić ekspresję pojedynczego genu na małym obszarze docelowym, a następnie ocenić zmiany w zachowaniu myszy. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść znieczuloną mysz w aparacie stereotaktycznym, zatrzaśnij przednie zęby na przednim zacisku i zabezpiecz szczękę. Następnie włóż wkładki douszne do kanałów słuchowych, aby w pełni ustabilizować głowę.

Następnie umieść poduszkę grzewczą pod myszką, aby regulować temperaturę jej ciała. Przez cały czas trwania zabiegu należy umieszczać sztuczne łzy na oczach gryzonia, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie dokładnie oczyść obszar operacyjny, najpierw wcierając 10% jodu powidonu bawełnianym wacikiem okrężnymi ruchami.

Następnie w ten sam sposób wetrzyj 70% alkohol etylowy w miejsce operacji. Powtórz tę procedurę czyszczenia jeszcze dwa razy. Po przygotowaniu myszy otwórz sterylną torbę na sprzęt.

Zmień rękawice przed dotknięciem instrumentów. Następnie wyjmij sterylną szmatkę i połóż narzędzia na ściereczce. Teraz delikatnie chwyć skórę myszy kleszczami do końcówek krwi i wykonaj nacięcie za pomocą skalpela.

Rozpocznij nacięcie około 1,5 centymetra nad uszami i rozciągnij do około 0,5 centymetra poniżej uszu, aby odsłonić bgma. Po uwidocznieniu bgma użyj sterylnej bawełnianej końcówki, aby delikatnie usunąć krew pokrywającą powierzchnię czaszki. Następnie użyj dwóch bawełnianych końcówek, aby popchnąć skórę w kierunku boków głowy.

Następnie w dygestorii napełnić strzykawkę wirusem, który ma zostać wstrzyknięty. Upewnij się, że w środku nie są uwięzione żadne bąbelki. Następnie umieść strzykawkę w aparacie stereotaktycznym, upewniając się, że jest w pełni zabezpieczona.

Następnie powoli opuść strzykawkę, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią czaszki. Następnie przesunąć końcówkę sterylnej igły strzykawki do punktu przecięcia B bgma i linii międzywiejskiej. Ustaw ten punkt na zero.

Następnie ustaw współrzędne obszaru zainteresowania. Przesunąć igłę strzykawki do miejsca docelowego, które ma być wiercone. Następnie umieść wiertło tuż nad miejscem docelowym pod kątem 45 stopni do czaszki i rozpocznij wiercenie.

Uważaj, aby nie wwiercać się w mózg, aby zapobiec uszkodzeniu kory mózgowej. Następnie usuń krew z otworu sterylną bawełnianą końcówką. Opuścić strzykawkę tak, aby końcówka przylegała bezpośrednio do powierzchni mózgu.

Ustaw współrzędną DV na zero, a następnie opuść strzykawkę na żądaną głębokość. Teraz rozpocznij wstrzykiwanie z szybkością 0,2 mikrolitra na minutę. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać około dwóch minut, aby upewnić się, że wszelkie pozostałości wirusa zostały wchłonięte.

Następnie powoli podnieś strzykawkę. Za pomocą bawełnianej końcówki usunąć płyn z miejsca wstrzyknięcia. Następnie zszyj skórę i usuń zwierzę z systemu stereotaktycznego.

Trzymaj mysz na poduszce grzewczej, aż się obudzi i w razie potrzeby podaj dodatkowy środek przeciwbólowy. W tej procedurze uzyskaj plastikową kwadratową arenę. Oczyść arenę 70% alkoholem etylowym przed eksperymentem.

Następnie umieść arenę na podłodze i upewnij się, że oświetlenie jest ustawione tak, aby zminimalizować cienie i odblaski. Następnie dostosuj ustawienia wykrywania tak, aby mysz była widoczna na ekranie. Następnie włącz kamerę, aby nagrać zadanie behawioralne i umieść mysz w kierunku środka przodu areny, tak aby mysz była skierowana w stronę ściany.

Ustaw minutnik na pięć minut i odejdź od areny lub opuść pomieszczenie. Po pięciu minutach przenieś mysz z powrotem do klatki. Użyj 70% alkoholu etylowego, aby dokładnie oczyścić pole przed przystąpieniem do następnego zwierzęcia.

Teraz napełnij dwulitrowe przezroczyste wiadro wodą o temperaturze 22 stopni. Umieść wiadro na podłodze i upewnij się, że oświetlenie jest ustawione tak, aby zminimalizować cienie i odblaski. Jeśli korzystasz z oprogramowania śledzącego, ustaw kamerę bezpośrednio nad łyżką.

Dostosuj ustawienia oprogramowania tak, aby mysz była dobrze widoczna na ekranie. Następnie włącz kamerę, aby nagrać zadanie behawioralne. Delikatnie umieść mysz na środku wiadra z wodą, tak aby jej przednie łapy.

Najpierw dotknij wody i nie pozwól, aby jego głowa się zanurzyła. Następnie ustaw minutnik na sześć minut przed odejściem od obszaru zachowania. Po sześciu minutach wyjmij mysz z wiadra, zetrzyj nadmiar wody przed umieszczeniem jej z powrotem w klatce.

Oto reprezentatywny wycinek mózgu, który ilustruje udane wstrzyknięcie wirusa do zakrętu zębatego. Rysunek ten pokazuje ilość czasu, jaką myszy kontrolne i eksperymentalne spędziły w centrum nowego otwartego pola. Myszy eksperymentalne spędzały znacznie mniej czasu w centrum areny, co wskazuje na fenotyp lęku, a rysunek ten pokazuje czas, w którym myszy kontrolne i eksperymentalne są unieruchomione w teście wymuszonego pływania.

Myszy eksperymentalne nie różniły się znacząco od myszy kontrolnych pod względem czasu spędzonego w bezruchu. Po obejrzeniu tego filmu widzowie powinni mieć dobre pojęcie o tym, jak używać zastrzyków stereotaktycznych do oceny zachowań gryzoni.