Wykorzystanie strategii inkorporacji kapsydu antygenu do opracowania metod szczepień z wektorem 5 serowirusa

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie strategii wbudowy antygenu w kapsyd do opracowania szczepionek wektorowych opartych na adenowirusie serotypu 5, przy użyciu rekombinowanego divalentnego wektora adenowirusowego w ramach dowodu koncepcji. Wykorzystując strategię wbudowy antygenu w kapsyd, zastosowano wiele etapów klonowania w celu skonstruowania zmodyfikowanego plazmidu A D five R one K-W-S-H-V-R five hiss. Następnie przygotowano divalentny wektor adenowirusowy R one K was HVR five.

Wirus Hiss jest ratowany, propagowany i oczyszczany. Następnie charakteryzuje się miana wirusa oraz ekspozycję antygeniczną wbudowanych antygenów na kapsydzie wirusowym. Na koniec, z wykorzystaniem strategii wbudowywania antygenów w kapsyd, ocenia się zdolność divalentnego wektora adenowirusowego do omijania neutralizacji przez surowice dodatnie pod kątem D5.

Do skonstruowania zmodyfikowanego plazmidu, A D five R one K-W-A-S-H-V-R five hiss, wykorzystano wiele etapów klonowania. Dzisiaj zaprezentujemy strategię inkorporacji kapsydu antygenu. Strategia ta jest korzystniejsza w porównaniu z innymi metodami, takimi jak metoda ekspresji transgenu, ponieważ nie tylko eksponuje interesujący nas antygen na kapsydzie adenowirusa w postaci białka, ale także pozwala na uzyskanie silnej odpowiedzi humoralnej przeciwko temu antygenowi.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy dotyczące generowania adenowirusa modyfikującego czapeczkę są trudne do opanowania ze względu na wiele zmiennych wpływających na opracowanie rekomendowanych wektorów wirusowych, takich jak dobór enzymów restrykcyjnych czy długość interesującego fragmentu energii, wśród innych procedur demonstracyjnych. Dzisiaj pomogą mi dwie osoby na stażu podoktorskim, dr Lin Lin Gu oraz dr Nitra Farrow, a także Alexandre Kren, pracownik naukowy w laboratorium. Aby skonstruować plazmid wahadłowy, należy dodać po sześć jednostek GE1 i CCC1 do 6 µg fragmentu HVR1 KWA.

Inkubować reakcję trawienia w temperaturze 37°C przez trzy godziny. Fragmenty trawienia rozdzielić za pomocą elektroforezy w 2% żelu agarozowym, a następnie oczyścić fragment, korzystając z zestawu do izolacji DNA z żelu zgodnie z protokołem producenta. Następnie ligować 12 ng oczyszczonego fragmentu do miejsc A G one i ACC one w 100 ng wcześniej przygotowanego plazmidu wahadłowego.

HVR five hiss six pH five s i 10 µL objętość reakcji w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie dodać 1 µL mieszaniny ligacyjnej do 50 µL elektrokompetentnych komórek DH5α, przeprowadzić elektroporację, a następnie dodać 950 µL pożywki SOC. Inkubować transformowane komórki w temperaturze 37 °C i 200 RPM przez jedną godzinę, a następnie wysiać od 100 do 200 µL hodowli na płytkę LB CANY.

Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Użyć po sześciu jednostkach Echo R1 i PME1 do trawienia 6 µg oczyszczonego plazmidu wahadłowego w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. Po oczyszczeniu fragmentu zawierającego ramiona rekombinacji homologicznej i gen egzonu pięć z podwójną modyfikacją, użyć SUA1 do linearyzacji plazmidu szkieletowego, PAD5, delta H5 w celu przeprowadzenia rekombinacji homologicznej.

Zastosuj elektroporację, aby dokonać kotransformacji 100 ng oczyszczonego fragmentu shuttlowego oraz 100 ng plazmidu szkieletowego do 50 µL elektrokometentnych komórek BJ 5 180 3. Jak pokazano wcześniej w tym filmie, następnego dnia wybierz około 10 kolonii do 3 mL płynnej pożywki LB z kanamycyną i inkubuj przez noc przed przeprowadzeniem przesiewu zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie transformuj 100 ng oczyszczonego plazmidu do komórek DH5α, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, aby odzyskać wektor adeno-asocjowany.

Zacznij od wykorzystania PAC one do linearyzacji 15 µL wektora w objętości 100 µL. Po trawieniu inkubuj przez trzy godziny w temperaturze 37 °C. Następnie wyizoluj zlinearyzowany plazmid pod dygestorium.

Do probówki dodaj równą objętość mieszaniny fenol-chloroform i alkoholu izoamylowego, a następnie wiruj w wirówce przy 10 000 G przez jedną minutę i zbierz nadsącz przed powtórzeniem ekstrakcji i wirowania do uzyskania odpowiedniej objętości ekstraktu. Dodaj 300 µL 100% etanolu oraz 10 µL octanu i wiruj przy 10 000 G przez 10 minut. Po odlaniu nadsączu dodaj 700 µL 70% etanolu i ponownie wiruj.

Po resuspensji osadu i ilościowym oznaczeniu DNA, należy przeprowadzić transfekcję trzech mikrogramów zlinearyzowanego plazmidu wraz z komercyjnym odczynnikiem do transfekcji liposomalnej do wcześniej przygotowanej kolby T 25 z komórkami HEK 2 93 o 80% konfluencji, zgodnie z instrukcjami producenta. Po sześciogodzinnej inkubacji należy zastąpić medium do transfekcji medium kompletnym przed powrotem kolby do inkubatora. Gdy w płytkach rozwinie się pełny efekt cytopatyczny (CPE) w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy zdrapać pozostałe komórki z kolby i odwirować kulturę przy 300 G i czterech stopniach Celsius za pomocą wirówki przez 10 minut.

Następnie użyj 1 mL pożywki zawierającej 2% FBS, aby resuspendować osad komórkowy. Dalej, rozbij komórki, przeprowadzając cztery cykle zamrażania i rozmrażania, a następnie odwiruj lizat w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zbierz nadsącz S zawierający odzyskany wirus w celu namnożenia wektora wirusowego w kulturze wielkoskalowej.

Przenieś jedną trzecią całego lizatu wirusowego z kolby T 25 do kolby T 75 zawierającej komórki HEK 2 93. Po doprowadzeniu do pełnego efektu CPE i zebraniu nadsączu zgodnie z wcześniej przedstawioną procedurą, namnóż połowę całego wirusa w jednej lub kilku kolbach T 1 75 z komórkami HK 2 93, a następnie namnóż wirusa wyizolowanego z kolb T 1 75 w kilkunastu lub więcej kolbach.

T1 75 kolb komórek po przygotowaniu roztworów chlorku cezu o stężeniu 1,33 g/mL oraz 1,45 g/mL. Do probówki do ultrawirówki dodać 4 mL chlorku cezu o stężeniu 1,33 g/mL, a następnie na dno tej samej probówki dodać 4 mL chlorku cezu o stężeniu 1,45 g/mL. Na górę tej samej probówki dodać 4 mL nadsączu lizatu wirusowego, a następnie wirować probówkę przy 110 000 g i 4 °C przez 3 godziny.

Pozwoli to na oddzielenie dojrzałego, dolnego pasma wirusa od wadliwego, górnego pasma wirusa wewnątrz gradientu. Do pobrania dolnego pasma należy użyć igły o rozmiarze 33 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 3 ml. Następnie należy dodać bufor, aby doprowadzić objętość roztworu do 4 ml.

Następnie, po przygotowaniu dwóch kolejnych gradientów chlorku cezu, nałóż na ich powierzchnię rozcieńczony wirus i wiruj gradienty z prędkością 110 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Wewnątrz urządzenia. Zbierz prążek wirusowy w sposób właśnie zaprezentowany.

Następnie użyj igły o rozmiarze 33 G i strzykawki o pojemności 3 ml, aby wprowadzić roztwór wirusa do kasety dializacyjnej. Umieść kasetę w 700 ml jednokrotnego buforu do dializy przygotowanego zgodnie z protokołem tekstowym, wymieniając bufor cztery razy co trzy godziny. Następnie użyj igły i strzykawki.

Zbierz roztwór wirusa z kasety, aby określić fizyczny miano wirusa. Użyj buforu do lizy wirusów, aby rozcieńczyć zarówno wirusa, jak i bufor do dializy stosowany jako kontrola tła w stosunku 1:10 oraz 1:20, a następnie inkubuj wszystkie probówki w temperaturze 56 °C przez 10 minut. Włącz biofotometr i ustaw tryb absorbancji na gęstość optyczną 260 nm.

Aby zrównoważyć sygnał tła, należy użyć buforu do dializy rozcieńczonego 1:10, klikając przycisk blank. Na ekranie biofotometru wpisz 10 plus 90. Zamień probówkę na probówkę z wirusem rozcieńczonym 1:10 i odczytaj sygnał wirusa rozcieńczonego 1:10.

Aby zmierzyć rozcieńczenie 1:20, należy użyć buforu do dializy rozcieńczonego 1:20, aby zrównoważyć tło, wpisując 5+95 na ekranie, a następnie zastąpić probówkę z buforem probówką z wirusem rozcieńczonym 1:20 i odczytać sygnał. Pomnożyć oba odczyty wirusa przez 1,1 × 10¹² i obliczyć średni miano w jednostkach VP/ml na podstawie dwóch indywidualnych mian z dwóch rozcieńczeń. Oceń wirusa u myszy zgodnie z protokołem tekstowym, aby wykazać, czy uratowany wirus wykazuje antygeniczny antygen HIV oraz znacznik His na powierzchni kapsydu wirusowego.

Główne białko Heon pięć. Test ELISA przeprowadzono odpowiednio z użyciem ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 2F5 oraz mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko znacznikowi His, jak pokazano tutaj; zarówno przeciwciało ludzkie 2F5, jak i przeciwciało mysie anty-His związały dwuwartościowe cząstki wirusa A5, podczas gdy w przypadku kontroli negatywnej nie stwierdzono wiązania. W celu potwierdzenia danych z testu ELISA zastosowano analizę Western blot wektora A5, w której zarówno przeciwciało ludzkie 2F5, jak i przeciwciało mysie anty-His wykryły wyłącznie specyficzne prążki o masie około 117 kDa.

Do DIVALENT dodano białko Ad5, które odpowiada wielkości białka Heon Ad5. Aby ocenić potencjał skonstruowanego wirusa Ad5 do omijania neutralizacji przez przeciwciała przeciwko Ad5, przeprowadzono test neutralizacji. Wyniki wskazują, że względne jednostki luminescencji (rlu) były 12 razy wyższe w przypadku kontrolnego wektora Ad5 traktowanego bez surowicy dodatniej Ad5 niż w przypadku traktowania surowicą, co sugeruje, że wirus został zneutralizowany.

Z kolei w przypadku skonstruowanego dwuwartościowego wirusa AD5 zaobserwowano niewielką różnicę w zużyciu R pomiędzy próbkami traktowanymi a nietraktowanymi, co sugeruje, że skonstruowany wirus uniknął neutralizacji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać szerszą wiedzę na temat podejścia opartego na wbudowywaniu kapsydu antygenowego w procesie opracowywania szczepionek z wykorzystaniem wektora AD5. Obecnie stosujemy tę strategię w połączeniu z wektorami rzadkich serotypów.

To również można wykonać.