Wykorzystanie strategii inkorporacji kapsydu antygenu do opracowania metod szczepień z wektorem 5 serowirusa

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie strategii inkorporacji czapek antygenowych do opracowania pięciu podejść do szczepionki wektorowej serotypu adenowirusa przy użyciu rekombinowanego dwuwalentnego wektora adenowirusowego jako dowodu zasady przy użyciu strategii inkorporacji kapsydu antygenu, wiele etapów klonowania stosuje się do skonstruowania zmodyfikowanego plazmidu, A D pięć R, jeden K-W-S-H-V-R pięć syków. Następnie dwuwartościowy wektor wirusa adenylowego. R jeden K był HVR pięć.

Syk jest ratowany, rozmnażany i oczyszczany. Następnie scharakteryzowano miana wirusa i antygenową ekspozycję wbudowanych antygenów na kapsyd wirusa. Wreszcie, potencjał dwuwartościowego wektora wirusa Aden do obejścia neutralizacji przez surowicę D 5-dodatnią ocenia się przy użyciu strategii inkorporacji antygenu kapsydu.

Do skonstruowania zmodyfikowanego plazmidu stosuje się wiele etapów klonowania, A D pięć R, jeden K-W-A-S-H-V-R pięć syków. Dzisiaj zademonstrujemy strategię inkorporacji antygenu kapsydu. Strategia ta jest korzystna w porównaniu z innymi strategiami, takimi jak metoda ekspresji transgenu, ponieważ nie tylko wyświetla interesujący nas antygen na adenowirusie w niewoli jako białko, ale także umożliwia silną odpowiedź humoralną przeciwko temu antygenowi.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki dotyczące generowania adenowirusa modyfikującego czapeczkę są trudne do nauczenia, ponieważ wiele zmiennych przyczynia się do rozwoju zalecanych wektorów wirusowych, takich jak wybór enzymów restrykcyjnych, soczewka energii interesującej innych Pokazanie procedur. Dzisiaj będą moi dwaj doktorzy, dr Lin Lin Gu i dr Nitra Farrow. Również Alexandre Kren, pracownik naukowy w laboratorium Aby skonstruować plazmid wahadłowy, dodaj sześć jednostek GE i CCC od jednego do sześciu mikrogramów HVR jeden fragment KWA.

Inkubuj reakcję trawienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Rozpuść fragment trawienny w 2% żelu agros za pomocą elektroforezy i użyj zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie z protokołem producenta w celu oczyszczenia fragmentu. Następnie podwiązać 12 nanogramów oczyszczonego fragmentu do miejsc a G i ACC 1 ze 100 nanogramów wcześniej skonstruowanego plazmidu wahadłowego.

HVR pięć syczy sześć pH, pięć s i 10 mikrolitrów objętości reakcji w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie dodać jeden mikrolitr reakcji ligacji do 50 mikrolitrów elektrokompetentnych DH pięciu ogniw alfa, elektro ósemkę przed dodaniem 950 mikrolitrów pożywki SOC. Inkubować przekształcone komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez godzinę przed rozprowadzeniem od 100 do 200 mikrolitrów kultury na płytce LB CANY.

Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj sześciu jednostek Echo R one i PME one, aby trawić sześć mikrogramów oczyszczonego plazmidu wahadłowego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po oczyszczeniu fragmentu zawierającego ramiona rekombinacji homologicznej i podwójnie zmodyfikowany gen eksonu piątego użyj SUA jeden do linearyzacji plazmidu szkieletowego, PAD pięć, delta H pięć do przeprowadzenia rekombinacji homologicznej.

Użyj elektroporacji, aby przekształcić 100 nanogramów każdego z oczyszczonych fragmentów czółenka i plazmidu szkieletowego w 50 mikrolitrów elektrokompetentnych ogniw BJ 5 180 3. Jak pokazano wcześniej w tym filmie, następnego dnia wybierz około 10 kolonii do trzech mililitrów płynu zawierającego mycynę w puszce LB i hoduj przez noc przed badaniem przesiewowym zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie przekształć 100 nanogramów oczyszczonego plazmidu w pięć komórek alfa DH, jak wykazano wcześniej, aby uratować dodatkowy wektor wirusowy.

Zacznij od użycia PAC one do linearyzacji 15 mikrolitrów wektora w objętości 100 mikrolitrów. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny po strawieniu. Aby wyodrębnić zlinearyzowany plazmid pod wyciągiem.

Dodać równą objętość chloroformu fenolowego, alkoholu izoamylowego do wirówki reakcyjnej o stężeniu 10 000 G na jedną minutę i zebrać supernatant przed powtórzeniem ekstrakcji i odwirować do wyekstrahowanej objętości. Dodaj 300 mikrolitrów 100% etanolu i 10 mikrolitrów octanu, wiruj w temperaturze 10 000 G przez 10 minut. Następnie po odrzuceniu supernatantu dodać 700 mikrolitrów 70% etanolu przed ponownym odwirowaniem.

Po ponownym zawieszeniu osadu i ilościowym określeniu DNA, należy przetransfekować trzy mikrogramy zlinearyzowanego plazmidu wraz z komercyjnym odczynnikiem do transfekcji liposomalnej do wcześniej przygotowanej kolby T 25 zawierającej 80% zlewające się komórki HEK 2 93 zgodnie z instrukcjami producenta. Po sześciogodzinnej inkubacji należy zastąpić pożywkę do transfekcji kompletną pożywką przed powrotem kolby do inkubatora. Gdy blaszki miażdżycowe rozwiną pełny efekt cytopatyczny lub CPE pod sterylnym kapturem, zeskrob pozostałe komórki z kolby i odwiruj kulturę w temperaturze 300 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Następnie użyj jednego mililitra pożywki zawierającej 2% FBS, aby ponownie zawiesić osad komórkowy. Następnie rozbij komórki, przeprowadzając cztery rundy rozmrażania przez zamrożenie, a następnie odwiruj lizat w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Zbierz supernatant S zawierający uratowanego wirusa, aby rozmnożyć wektor wirusowy w kulturze na dużą skalę.

Jedna trzecia do całości lizatu wirusa z kolby T 25 do kolby T 75 zawierającej komórki HEK 2 93. Po umożliwieniu pełnego rozwoju CPE i zebraniu supinatu, jak wykazano wcześniej, należy rozpropagować połowę całego wirusa w jednym lub kilku wirusach. Kolby T 1 75 komórek HK 2 93 następnie rozmnażają wirusa wyizolowanego z kolb T 1 75 w kilkunastu lub więcej komórkach.

T 1 75 kolb komórek po przygotowaniu jednego punktu 33 gramy na mililitr i 1,45 grama na mililitr. Roztwory chlorku cezu dodać cztery mililitry, 1,33 grama na mililitr, chlorek cezu do probówki ultrawirówki i dodać cztery mililitry, 1,45 grama na mililitr, chlorek cezu na dno tej samej probówki. Dodaj cztery mililitry supinacji lizatu wirusowego do górnej części tej samej probówki, a następnie odwiruj probówkę w temperaturze 110 000 G i czterech stopniach Celsjusza przez trzy godziny.

Spowoduje to oddzielenie dojrzałego dolnego pasma wirusa od wadliwego wyższego pasma wirusa pod maską. Użyj igły o rozmiarze 33 dołączonej do trzymililitrowej strzykawki, aby zebrać dolną opaskę. Następnie użyj pięciu hipisów, aby doprowadzić roztwór do czterech mililitrów.

Następnie, po przygotowaniu dwóch kolejnych gradientów chlorku cezu, załaduj rozcieńczonego wirusa na wierzch i odwiruj gradienty w temperaturze 110 000 G i czterech stopniach Celsjusza przez noc. Pod maską. Zbierz pasmo wirusa, jak właśnie pokazano.

Następnie użyj igły o rozmiarze 33 i trzymililitrowej strzykawki, aby wstrzyknąć roztwór wirusa do kasety dializowej. Umieściłem kasetę w 700 mililitrach jednego x buforu dializacyjnego przygotowanego zgodnie z protokołem tekstowym, wymieniając bufor cztery razy co trzy godziny. Następnie za pomocą igły i strzykawki.

Zbierz roztwór wirusa z kasety, aby określić fizyczne miano wirusa. Użyć buforu do lizy wirusa, aby rozcieńczyć zarówno wirusa, jak i bufor do dializy stosowany jako kontrola tła w temperaturze od 1 do 10 i od jednego do 20, a następnie inkubować wszystkie probówki w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 10 minut. Włącz biofotometr i ustaw tryb absorbancji na gęstość optyczną 260 nanometrów.

Użyj buforu dializacyjnego rozcieńczonego w proporcjach od 1 do 10, aby zrównoważyć sygnał tła, klikając pusty przycisk. Wpisz 10 plus 90 na ekranie biofotometru. Zastąp probówkę probówką z wirusem rozcieńczoną w proporcjach 1 do 10 i odczytaj sygnał wirusa rozcieńczonego w proporcjach 1 do 10.

Aby zmierzyć rozcieńczenie od 1 do 20, należy użyć buforu dializacyjnego rozcieńczonego do 1 do 20, aby zrównoważyć tło, wpisując 5 plus 95 na ekranie, a następnie wymienić probówkę buforową na probówkę z rozcieńczonym wirusem od 1 do 20 i odczytać sygnał. Pomnóż dwie liczby odczytu wirusa przez 1,1 razy 10 do 12 i oblicz średnie miano z jednostkami VP na mililitr na podstawie dwóch indywidualnych mian z dwóch rozcieńczeń. Oceń wirusa u myszy zgodnie z protokołem tekstowym, aby wykazać, czy uratowany wirus wykazuje antygenowy antygen HIV i znacznik hist na powierzchni kapsydu wirusa.

Główne białko Heon pięć. Eliza została przeprowadzona z ludzkimi dwoma przeciwciałami monoklonalnymi F five i mysim przeciwciałem monoklonalnym z tagiem antysykowym, jak pokazano tutaj, zarówno ludzkie dwa przeciwciała F pięć, jak i mysie przeciwciało antysyczące związane z dwuwartościowym dodają pięć cząsteczek wirusa, podczas gdy nie było wiązania z kontrolą negatywną. Do potwierdzenia danych E iza wykorzystano analizę krwi zachodniej z pięcioma wektorami, ponieważ zarówno ludzkie, dwa przeciwciała F pięć, jak i mysie przeciwciała antysyczące wykryły specyficzne prążki tylko około 117 kilodaltonów.

Do DIVALENT dodać pięć wirusów, co odpowiada wielkości białka Heon pięć. Aby ocenić potencjał skonstruowanego wirusa typu add five w celu obejścia neutralizacji przez dodanie pięciu dodatnich wyników, przeprowadzono test neutralizacji. Wyniki pokazują, że względne jednostki luminescencyjne lub rlu były 12 razy wyższe, gdy kontrolny wektor dodawany był traktowany bez dodawania pięciu dodatnich surowic, niż gdy był traktowany surowicą, co sugeruje, że wirus został zneutralizowany.

W przeciwieństwie do tego, istniała niewielka różnica w zastosowaniu R dla skonstruowanego dwuwartościowego wirusa AD 5 między próbkami poddanymi działaniu substancji i niepoddanymi działaniu substancji, co sugeruje, że skonstruowany wirus uniknął neutralizacji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo lepiej zrozumieć podejście do inkorporacji kapsydu antygenu w celu opracowania szczepionki z pięcioma wektorami. Obecnie stosujemy tę strategię w połączeniu z rzadkimi wektorami serotypów.

Ty też możesz to zrobić.