Metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej

Celem niniejszej procedury jest badanie proliferacji, kolonizacji i migracji komórek raka piersi w modelu systemowym z wykorzystaniem eksplantów ludzkiej tkanki kostnej. Osiąga się to poprzez izolację fragmentów tkanki kostnej gąbczastej z preparatów chirurgicznych głowy kości udowej i ich hodowlę z komórkami raka piersi wykazującymi ekspresję lucyferazy oraz zielonego białka fluorescencyjnego. Obrazowanie bioluminescencyjne jest wykorzystywane do pomiaru proliferacji komórek oraz weryfikacji kolonizacji komórek raka piersi w fragmentach tkanki kostnej.

Wzorce kolonizacji komórek raka piersi są obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Kompartment szpiku może zostać wypłukany z fragmentów w celu analizy za pomocą cytometrii przepływowej, testów luminescencyjnych oraz barwień. Migracja komórek raka piersi w kierunku supernatantów z hodowli tkankowych oraz fragmentów tkanki kostnej jest mierzona w komorach migracyjnych Transwell z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego. Kość jest najczęstszym miejscem przerzutów raka piersi, a niniejszy model otwiera nowe możliwości badania komórek raka piersi w niszy przerzutowej kości.

Wielką zaletą tego modelu jest zapewnienie bezpośredniego dostępu do mikrośrodowiska fragmentów ludzkiej tkanki kostnej, co pozwala na łatwą obserwację i analizę zachowania komórek raka piersi podczas krótkotrwałych eksperymentów z kokulturą. Metoda ta może być wykorzystana do badania kluczowych kwestii dotyczących mechanizmów leżących u podstaw przerzutowania raka piersi do kości, w celu zidentyfikowania strategii terapeutycznych pozwalających na skuteczne zapobieganie i leczenie tego procesu. Choć model ten pozwala na zgłębienie wiedzy o przerzutach raka piersi, może być on również stosowany do badania innych nowotworów z predylekcją do przerzutów do kości, takich jak rak prostaty.

Fragmenty tkanki kostnej muszą zostać pobrane w różnych punktach w każdym badaniu. Proces ten rozpoczyna się od zebrania i przetransportowania próbki kości udowej w soli fizjologicznej oraz przygotowania stanowiska pracy w komorze z laminarnym przepływem powietrza, nosząc rękawice chirurgiczne. Chwyć głowę kości udowej jedną ręką i użyj pilnika chirurgicznego do wydobycia kości beleczkowej.

Fragmenty mają rozmiar od około dwóch do pięciu milimetrów. Pęseta nie będzie odpowiednia do tego kroku. Należy użyć wysokiej jakości kleszczy chirurgicznych.

Do tego eksperymentu należy przygotować zawiesinę komórek raka piersi o stężeniu 100 000 komórek na 50 µL DMEM z dodatkiem 10% FBS. Dodatkowo, wykorzystując odcięte końcówki końcówek do mikropipety, należy przygotować zatyczki z wosku kostnego do mobilizacji fragmentów kości; zatyczki należy przechowywać w szalce Petriego. Następnie, za pomocą pęsety, przenieść zatyczki do płytki sześciodołkowej i, używając sterylnej rękawiczki, docisnąć zatyczki w pozycji godziny 12:00.

Następnie pipetujemy 50 µL zawiesiny komórkowej do centrum każdego dołka. Płytkę umieszczamy w inkubatorze do hodowli tkankowych na 45 minut, aby umożliwić adhezję komórek. Po inkubacji płytki wyjmujemy fragmenty kostne z przytwierdzonymi do nich komórkami. W trzech dołkach umieszczamy fragment tkanki kostnej na wosku do kości i dociskamy każdy z nich za pomocą GER. Trzy dołki bez fragmentów służą jako kontrole.

Następnie powoli dodaj 5 mL DMEM z 10% FBS na ściankę każdego dołka. Należy uważać, aby nie przesunąć wosku kostnego ani fragmentów kości. Następnie inkubuj hodowlę przez 20 do 24 godzin.

Następnego dnia w pierwszej kolejności wykonaj obrazowanie komórek. Do każdej studni dodaj 300 µg/ml Lucyferyny, a następnie niezwłocznie przeprowadź obrazowanie płytki przy użyciu platformy obrazowania Ivis. Eksperyment ten wymaga zawiesiny komórek raka piersi, analogicznie jak w poprzednim przypadku.

Po wyekstrahowaniu fragmentów kości, za pomocą pęsety przenieś każdy fragment do pustego dołka płytki 24-dołkowej, a następnie pipetą nanieś 50 µL zawiesiny komórek bezpośrednio na każdy fragment kości i umieść płytkę w inkubatorze na 45 minut, aby umożliwić adhezję komórek. Po przytwierdzeniu się komórek ostrożnie dodaj do każdego dołka od 1 do 2 mL pożywki, w ilości wystarczającej do całkowitego zanurzenia fragmentu kości. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek na 20 do 24 godzin.

W ramach przygotowania do obrazowania Ivis, obrazowania fluorescencyjnego lub pobierania komórek szpiku do analizy w obrazowaniu Ivis, przenieść fragmenty kości do płytki 24-dołkowej, dodając 1 ml świeżej pożywki do każdego dołka. Do każdego dołka dodać 300 µg/ml Lucifеру i postępować zgodnie z wcześniej opisaną procedurą dla mikroskopii fluorescencyjnej. Do każdego dołka pipetować 5 µL roztworu znakującego fluorescencyjnym bisfosforanem w celu oznakowania beleczek kostnych fragmentu kości, a następnie inkubować płytkę przez kolejne 24 godziny.

Po 24 godzinach za pomocą pęsety przenieść fragmenty na płytki zawierające pożywkę bez czerwieni fenolowej. Następnie obejrzeć płytki pod mikroskopem fluorescencyjnym skonfigurowanym do obrazowania przy 485 nanometrach w celu zlokalizowania kolonii komórek raka piersi wykazujących ekspresję GFP oraz przy 680 nanometrach w celu zidentyfikowania spikul kostnych znakowanych bisfosforanem, a następnie wypłukać przedział szpiku kostnego w celu analizy liczby lub właściwości komórek.

Przenieś fragment na sitko o oczkach 70 µm umieszczone nad probówką typu chronicle o pojemności 50 ml. Następnie, używając strzykawki 10 ml z igłą 25 G, energicznie przepłucz fragment 10 ml buforu PBS. Wirowarkuj zawiesinę z prędkością 300 ×g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby odwirować komórki; odessać i usunąć nadsącz.

Resuspend osad komórek szpiku w PBS lub innych pożądanych roztworach zgodnie z wymogami cytometrii przepływowej lub testów żywotności. Rozpocznij od przygotowania zawiesiny tkanki kostnej. Umieść fragmenty kości w dołkach płytki 12-dołkowej.

Płytka wielodołkowa zawierająca 2,2 ml DMEM z 10% FBS na dołek; należy pozostawić kilka dołków kontrolnych bez fragmentów kości. Inkubować płytkę przez 24 godziny. Następnie odessać i wymienić pożywkę, a następnie kontynuować hodowlę przez kolejne 24 godziny; w 48. godzinie hodowli przenieść 0,9 ml nadsączu do płytki odbiorczej, tymczasowo inkubując płytkę odbiorczą.

Umieść wkłady transwell w pustej płytce 24-dołkowej. Następnie nanieś 100 000 komórek raka piersi w 350 µL na każdy wkład. Inkubuj płytki przez 45 minut, aby umożliwić adhezję komórek. Po 45 minutach za pomocą pęsety przenieś wkłady do płytki odbiorczej.

Podczas umieszczania wkładów w odbiorniku należy je prowadzić pod kątem. Należy je odpowiednio supiniować, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Następnie płytkę z wkładami należy inkubować przez 20 godzin w temperaturze 37 °C do następnego dnia.

Za pomocą pęsety wyjmij wkładki i dodaj do każdej z nich 300 µg/mL Luciferyny. Przeprowadź obrazowanie bioluminescencyjne na płytce odbiorczej, aby wykryć komórki raka piersi, które migrowały przez membrany i przyczepiły się do dna dołków płytki odbiorczej. Najpierw napełnij płytkę odbiorczą pożywką i umieść ją w inkubatorze do hodowli tkankowych.

Aby zasiać komórki na wkładach, należy odwrócić je w pustym pudełku z probówkami typu microfused z pokrywką. Następnie na zewnętrzną dolną powierzchnię każdej membrany wkładu należy nanieść 100 000 komórek w 50 µL.

Przykryć pudełko, pozostawiając pokrywkę lekko uchyloną, i inkubować wkłady przez 45 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych. Następnie za pomocą pęsety odwrócić i przenieść wkłady do dołków płytki odbiorczej, do każdego uchwytu wkładu dodając 0,45 milliliters DMEM z 10%FBS. Następnie do każdego wkładu dodać trzymilimetrowy fragment kości lub kuleczkę szklaną i inkubować na płytce przez 20 godzin.

Następnego dnia za pomocą pęsety przenieść fragmenty i koraliki na płytkę z dołkami zawierającymi 1 ml świeżej pożywki. Do każdego dołka dodać 300 µg/mL Lucyferyny i przystąpić do obrazowania bioluminescencyjnego. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

Komórki raka piersi współhodowano obok unieruchomionych fragmentów kości, aby zmierzyć proliferację komórek piersi. Obrazowanie bioluminescencyjne po 24 godzinach hodowli wykazało zwiększoną proliferację komórek raka piersi w obecności fragmentów kości w trzech górnych dołkach w porównaniu do braku fragmentów kości w trzech dolnych dołkach. Wyniki eksperymentów z wykorzystaniem fragmentów z trzech oddzielnych preparatów chirurgicznych wykazały zwiększoną proliferację w obecności w porównaniu do braku kości.

We wszystkich trzech przypadkach, kolonizacja komórek MCF seven F Luke EGFP osadzonych bezpośrednio pod fragmentami tkanki kostnej została zaobserwowana za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego po 24 godzinach. Zmniejszenie sygnału wiązało się ze spadkiem gęstości wysiewu po 48 godzinach. Fragmenty poddane bezpośredniemu wysiewowi i znakowane odczynnikiem bisfosfonianowym ujawniły kolonizację GFP-dodatnich komórek raka piersi w obrębie przedziałów zmineralizowanych oraz szpiku.

Migracja komórek raka piersi przez porowatą membranę migracyjną w kierunku kultur tkanki kostnej; w trzech górnych studzienkach zaobserwowano intensywną migrację w porównaniu do kontroli. W trzech dolnych studzienkach widoczne jest medium. Odnotowano również migrację do trzech fragmentów kości pochodzących z jednego preparatu THR, podczas gdy nie zaobserwowano migracji na kuleczki.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat sposobu wyodrębniania fragmentów tkanki kostnej człowieka z preparatu głowy kości udowej oraz wprowadzania ich do testów kokultury w celu pomiaru zachowań komórek raka piersi, w tym ich migracji, kolonizacji i proliferacji.