Metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej

Opisano protokoły do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w systemie modelowym eksplantacji ludzkiej tkanki kostnej.

Celem tej procedury jest zbadanie proliferacji, kolonizacji i migracji komórek raka piersi w systemie modelowym ludzkiej tkanki kostnej. Osiąga się to poprzez wyizolowanie fragmentów tkanki kostnej beleczkowej z próbek chirurgicznych głowy kości udowej i wyhodowanie ich z komórkami raka piersi eksprymującymi lucyferazy i zielonym białkiem fluorescencyjnym. Obrazowanie bioluminescencyjne służy do pomiaru proliferacji komórek i weryfikacji kolonizacji komórek raka piersi we fragmentach tkanki kostnej.

Wzorce kolonizacji komórek raka piersi są obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przedział szpiku kostnego można wypłukać z fragmentów do analizy za pomocą cytometrii przepływowej za pomocą testów luminescencji i barwienia. Migracja komórek raka piersi w kierunku hodowli tkankowej, supernatantów i fragmentów tkanki kostnej jest mierzona w komorach migracyjnych Transwell z obrazowaniem bioluminescencyjnym kość jest najczęstszym miejscem przerzutów raka piersi, a ostatecznie model ten zapewnia nowe okno do badania komórek raka piersi w niszy przerzutów do kości.

Dużą zaletą tego modelu jest to, że zapewnia on bezpośredni dostęp do mikrośrodowiska fragmentów tkanki kostnej człowieka, co pozwala nam w łatwy sposób obserwować i analizować zachowanie komórek raka piersi podczas krótkoterminowych eksperymentów z kokulturą. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania kluczowych pytań dotyczących mechanizmów leżących u podstaw raka piersi, przerzutów do kości w celu zidentyfikowania strategii terapeutycznych w celu skutecznego zapobiegania i leczenia tego nowotworu. Chociaż model ten może dostarczyć informacji na temat przerzutów raka piersi, może być również wykorzystany do badania innych nowotworów złośliwych poszukujących kości, takich jak rak prostaty.

Fragmenty tkanki kostnej muszą być pobierane w różnych punktach każdego testu. Rozpoczyna się to od pobrania i przetransportowania próbki kości udowej w soli fizjologicznej i przygotowania stanowiska pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego w rękawicy chirurgicznej. Chwyć głowę kości udowej jedną ręką i użyj surowca chirurgicznego, aby usunąć kość beleczkową.

Fragmenty mają rozmiar od dwóch do pięciu milimetrów. Kleszcze nie będą działać na tym etapie. Potrzebujesz dobrej jakości surowca chirurgicznego.

Do tego eksperymentu przygotuj zawiesinę komórek raka piersi ze 100 000 komórek na 50 mikrolitrów DMEM plus 10% FBS. Ponadto należy przygotować zatyczki z wosku kostnego do mobilizacji fragmentów kości za pomocą odciętych końcówek końcówki mikropipety, a zatyczki przechowywać na szalce Petriego. Następnie za pomocą kleszczy przenieś zatyczki do płytki sześciodołkowej i za pomocą sterylnej rękawicy dociśnij zatyczki do pozycji godziny 12.

Następnie odpipetować 50 mikrolitrów zawiesiny komórek do środka każdej z nich. Dobrze umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 45 minut, aby pobudzić przyczepienie komórek, podczas gdy płytka inkubuje, ekstrahując fragmenty kości z komórkami przyczepionymi do płytki. Umieść fragment tkanki kostnej na wosku kostnym w trzech studzienkach i dociśnij każdy z nich za pomocą trzech studzienek bez fragmentów GER.

Następnie powoli dodaj pięć mililitrów DMEM plus 10% FBS do ściany każdej studzienki. Wosk kostny i fragmenty kości nie mogą być przemieszczane. Następnie inkubuj kulturę przez 20 do 24 godzin.

Następnego dnia najpierw zobrazuj komórki. Dodaj 300 mikrogramów na mililitr Lucyfera do każdej studzienki, a następnie natychmiast zobrazuj płytkę za pomocą platformy obrazowania Ivis. Ten eksperyment wymaga zawieszenia komórek raka piersi, podobnie jak poprzedni.

Po ekstrakcji fragmentów kości za pomocą kleszczy przenieś każdy fragment do pustego dołka na 24-dołkowej płytce, a następnie pipetuj 50 mikrolitrów zawiesiny komórek bezpośrednio na każdy fragment kości i przenieś płytkę do inkubatora na 45 minut, aby przyspieszyć przyczepienie komórek. Gdy komórki się zwiążą, delikatnie dodaj od jednego do dwóch mililitrów pożywki do każdej z nich, wystarczająco dobrze, aby zanurzyć fragment kości. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 20 do 24 godzin.

Przygotowując się do obrazowania Ivis, obrazowania fluorescencyjnego lub pobierania komórek szpiku do analizy do obrazowania Ivis, należy przenieść fragmenty kości na 24-dołkową płytkę z jednym mililitrem świeżej pożywki na dołek. Dodaj 300 mikrogramów na mililitr Lucyfera do każdej studzienki i postępuj zgodnie z wcześniejszym opisem dla mikroskopii fluorescencyjnej. Odpipetować pięć mikrolitrów fluorescencyjnego roztworu do znakowania bisfosforanu do każdej studzienki, aby oznaczyć kostne kolce fragmentu kości i inkubować płytkę przez kolejne 24 godziny.

24 godziny później za pomocą kleszczy przenieś fragmenty na płytki zawierające wolne podłoże z czerwienią fenolową. Następnie obejrzyj płytki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego skonfigurowanego do obrazowania w 485 nanometrach w celu zlokalizowania kolonizacji komórek raka piersi z ekspresją GFP i 680 nanometrów. Identyfikacja spikul kostnych znakowanych bisfosforanem w celu przepłukania przedziału szpiku kostnego w celu analizy liczby komórek lub właściwości.

Przenieś fragment do sitka o średnicy 70 mikronów na 50-mililitrowej tubce kronikowej. Następnie użyj 10-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 25, aby energicznie przepłukać fragment za pomocą 10 mililitrów wirówki PBS. Zawiesina w stężeniu 300 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek, odessania i odrzucenia supinatu reus.

Zgiąć osad komórek szpiku w PBS lub innych pożądanych roztworach zgodnie z cytometrią przepływową lub testami żywotności. Zacznij od wygenerowania siatki tkanki kostnej. Umieść fragmenty kości w studzienkach 12.

Płytka studzienna zawierająca 2,2 mililitra DMEM 10% FBS na studzienkę i pozostawić kilka studzienek kontrolnych bez fragmentów kości. Hoduj na płytce przez 24 godziny. Następnie odessać i zastąpić pożywkę i kontynuować hodowlę przez kolejne 24 godziny, 48 godzin do hodowli, przenieść 0,9 mililitra supinatu na płytkę odbiorczą, jednocześnie tymczasowo inkubując płytkę odbiorczą.

Umieść wkładki transwell w pustej płytce 24-dołkowej. Następnie iPet 100 000 komórek raka piersi w 350 mikrolitrach na każdej wkładce. Następnie hoduj płytki przez 45 minut, aby promować przyczepianie się komórek Po 45 minutach użyj kleszczy, aby przenieść wkładki na płytkę odbiorczą.

Pamiętaj, aby ustawić wkładki pod kątem podczas umieszczania ich w odbiorniku. Dobrze supinuj, aby nie tworzyły się pęcherzyki. Następnie inkubować płytkę z wkładkami przez 20 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia.

Użyj kleszczyków, aby usunąć wkładki i dodaj 300 mikrogramów na mililitr Lucyfera do każdego. Dobrze wykonaj obrazowanie bioluminescencyjne na płytce odbiornika, aby wykryć komórki raka piersi, które migrowały przez błony i przyczepiły się do dna dołka płytki odbiornika. Najpierw załaduj płytkę odbiorczą pożywką i umieść ją w inkubatorze do hodowli tkankowych.

Do wysiewu wkładek. Odwróć je w pustym pudełku z mikro bezpiecznikiem z pokrywką. Następnie dodaj 100 000 komórek w 50 mikrolitrach do zewnętrznej dolnej powierzchni każdej wkładki membranowej.

Przykryj pudełko, pozostawiając pokrywkę pękniętą, a następnie inkubuj wkładki przez 45 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych. Następnie użyj kleszczyków, aby odwrócić i przenieść wkładki, dołki płytki odbiorczej do każdego kubka wkładki o pojemności 0,45 mililitra DMEM z 10% FBS. Następnie dodaj trzymilimetrowy fragment kości lub szklany koralik do każdej wkładki i przycinaj na płytce przez 20 godzin.

Następnego dnia za pomocą kleszczy przenieś fragmenty i koraliki na płytkę z dołkami zawierającymi mililitr świeżej pożywki. Dodaj 300 mikrogramów na mililitr Lucyfera na studzienkę i kontynuuj obrazowanie bioluminescencyjne. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

Komórki raka piersi hodowano wspólnie w sąsiedztwie unieruchomionych fragmentów kości w celu zmierzenia proliferacji komórek piersi. Obrazowanie bioluminescencyjne po 24 godzinach hodowli wykazało zwiększoną proliferację komórek raka piersi w obecności fragmentów kości w trzech górnych dołkach w porównaniu z brakiem fragmentów kości w trzech dolnych dołkach. Wyniki eksperymentów z wykorzystaniem fragmentów z trzech oddzielnych próbek chirurgicznych wykazały zwiększoną proliferację w obecności w porównaniu z brakiem kości.

We wszystkich trzech przypadkach po 24 godzinach zaobserwowano kolonizację siedmiu komórek MCF F Luke EGFP znajdujących się bezpośrednio pod fragmentami tkanki kostnej za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Zmniejszony sygnał wiązał się ze spadkiem gęstości wysiewu po 48 godzinach. Bezpośrednio wysiane fragmenty znakowane odczynnikiem bisfosfonianowym wykazały kolonizację komórek raka piersi GFP dodatnich w przedziałach zmineralizowanych i szpikowych.

Migracja komórek raka piersi przez porowatą błonę migracyjną w kierunku hodowli tkanki kostnej, supernatantów obserwowanych w trzech górnych studzienkach była silna w porównaniu z migracją do kontroli. Podłoże widoczne w trzech dolnych studzienkach. Zaobserwowano również migrację do trzech fragmentów kości z danego okazu THR, natomiast nie zaobserwowano migracji na koraliki.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyodrębnić fragmenty ludzkiej tkanki kostnej z próbki głowy kości udowej i zainicjować je w testach kohodowlanych w celu zmierzenia zachowań komórek raka piersi, w tym migracji, kolonizacji i proliferacji.