Name: Metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Poznaj metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki kostnej do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej kości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były częściowo finansowane z grantów Fundacji Alternatywnych Badań i Rozwoju (107588), Narodowego Instytutu Zdrowia (1U54CA136465-04S1) oraz Kalifornijskiego Programu Badań nad Rakiem Piersi (201B-0141). Dziękujemy doktorom Andrew Wilberowi i R. Scottowi McIvorowi za hojną darowiznę ich transponsonu <pkt2 lubig=""> transponsonu i plazmidów transpozazy pK/hUbiC-SB11. Wyrażamy wdzięczność dr. Johnowi Tamaresisowi za porady dotyczące metod statystycznych, Timothy'emu Brownowi za wykonanie cytometrii przepływowej, Georgette Henrich za porady dotyczące testów migracji oraz Nancy Bellagamba za ułatwienie pobierania próbek THR. </pkt2>

Głowy kości udowych pobrano od pacjentów poddawanych planowej operacji THR na Wydziale Chirurgii Ortopedycznej w Stanford University School of Medicine. Wszystkie tkanki zostały pobrane jako próbki pozbawione elementów pozwalających na identyfikację, zgodnie z przepisami Biura ds. Zgodności Badań Uniwersytetu Stanforda.
1. Wybór linii komórkowej raka piersi
<ol>
	<li>Uzyskać lub przetoczyć pożądaną linię komórkową (linie) komórkową raka piersi za pomocą konstruktu reporterowego lucyferazy-GFP. Następujące eksperymenty przeprowadzono przy użyciu linii komórkowych raka piersi MDA-MB-231 i MCF-7 zaprojektowanych do stabilnej ekspresji lucyferazy świetlików (fLuc) i wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) poprzez transfekcję z transpozonem Sleeping Beauty plazmidem pKT2/LuBiG i plazmidem transpozazy pK/hUbiC-SB1145,46. 
	UWAGA: Transfekowane linie komórkowe są określane jako MDA-MB-231-fLuc-EGFP i MCF-7-fLuc-EGFP.</li>
</ol>
2. Izolowanie fragmentów tkanek od głów kości udowych
<ol>
	<li>Po operacji THR należy zebrać wyrzuconą głowę kości udowej do sterylnego pojemnika wypełnionego solą fizjologiczną. Przenieś próbkę do laboratorium i przetwórz ją w ciągu 1-3 godzin od zabiegu. Uwaga: w przypadku opóźnienia w przetwarzaniu należy umieścić próbkę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj obszar roboczy, umieszczając następujące elementy na macie chłonnej w kapturze do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym: sterylne rękawice, rongeur chirurgiczny, kleszcze, zlewka z 70% izopropanolem do płukania narzędzi oraz naczynia do hodowli tkankowych, jak określono poniżej dla każdego rodzaju eksperymentu.</li>
	<li>Zakładając sterylną rękawicę chirurgiczną do trzymania okrągłej głowy kości udowej w jednej ręce, użyj rongeur w drugiej ręce, aby wydobyć fragmenty kości beleczkowej o pożądanej wielkości (~2-5 mm) z odsłoniętego górnego trzonu kości udowej. Przenieść fragmenty kości do naczynia hodowlanego (np. 6-, 12- lub 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej lub komory migracyjnej), w zależności od rodzaju eksperymentu proliferacji, kolonizacji lub migracji, jak opisano w krokach 3, 4 lub 5. 
	UWAGA: Fragmenty tkanki kostnej powinny być pobierane w sposób opisany powyżej po wykonaniu wstępnych etapów dla każdego konkretnego testu proliferacji, kolonizacji lub migracji. Fragmenty będą miały różną wielkość, jak pokazano na rysunku 2. Fragmenty mogą być ważone przed lub po eksperymentach w celu standaryzacji.</li>
</ol>

3. Współhodowla komórek raka piersi sąsiadujących z fragmentami kości w celu pomiaru proliferacji komórek piersi za pomocą BLI
<ol>
	<li>Przed eksperymentem należy przygotować zawiesinę zawierającą 2 x 105 komórek raka piersi/50 μl oraz przygotować czopy wosku kostnego do unieruchomienia fragmentów kości w hodowli. Pokrój końcówkę mikropipety P200 na 3 części i użyj wąskiego końca największego kawałka w formie "foremki do ciastek", aby pokroić małe (~35 mg) kawałki wosku kostnego. Użyj szerokiego końca najmniejszego kawałka, aby wysunąć korki wosku kostnego do szalki Petriego w celu przechowywania.</li>
	<li>Umieść kawałek wosku kostnego w pozycji godziny 12 każdego dołka i delikatnie dociśnij palcem wskazującym w sterylnej rękawiczce.</li>
	<li>Odpipetować 50 μl zawiesiny komórkowej zawierającej 1 x 105 komórek raka piersi w DMEM-10% FBS + Pen-Strep w środku każdego dołka 6-dołkowej płytki. (Alternatywnie, komórki nasienne w rozproszonym wzorze, jeśli jest to pożądane.) Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 45 minut, aby ułatwić przyczepienie komórek.</li>
	<li>Umieść 1 fragment kości na 1 kawałku wosku kostnego dla każdej studzienki eksperymentalnej i delikatnie dociśnij rongeur, aby go zabezpieczyć. Przeprowadzaj eksperymenty w trzech egzemplarzach, tak aby 3 fragmenty kości z danej próbki THR były umieszczane w trzech górnych studzienkach, podczas gdy trzy dolne dołki zawierały wosk kostny tylko jako kontrole.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 5 ml delikatnie i powoli podaj 5 ml DMEM-10% FBS na bok każdej studzienki, aby uniknąć przemieszczenia komórek piersi lub fragmentów kości. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 20-24 godziny.</li>
	<li>Aby wykonać obrazowanie bioluminescencyjne (BLI), wyjmij płytkę z inkubatora i dodaj substrat lucyferyny (do osiągnięcia stężenia 300 μg/ml) do każdej studzienki. Zobrazuj płytkę natychmiast na platformie obrazowania IVIS przy użyciu następujących parametrów: przysłona 1, małe binning, czas ekspozycji 1 s, poziom D. Zmierz intensywność sygnału w każdej studzience jako średnie promieniowanie (fotony/sekunda/centymetr kwadratowy/steradian).</li>
	<li>Użyj oprogramowania do obrazowania, aby zdefiniować obszary zainteresowania (ROI) w celu ilościowego określenia średniego promieniowania dla wszystkich studni eksperymentalnych i kontrolnych. Eksportuj średnie wartości radiancji do arkusza Excel, aby wykonywać statystyki i generować wykresy.</li>
</ol>
4. Współhodowla komórek raka piersi wysiewanych bezpośrednio na fragmentach kości w celu zbadania kolonizacji i liczby komórek
<ol>
	<li>Za pomocą kleszczy umieść fragmenty kości bezpośrednio w pustych dołkach 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej (1 fragment/dołek).</li>
	<li>Odpipetować kroplę 50 μl zawiesiny komórkowej DMEM-10% FBS zawierającą 1 X 103-6 komórek raka piersi bezpośrednio na każdym fragmencie kości. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 45 minut, aby ułatwić przyczepienie komórek. Delikatnie dodaj 1-2 ml DMEM-10% FBS do boku każdej studzienki, tak aby fragment był całkowicie zanurzony w podłożu. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez 20-24 godziny.</li>
	<li>Po inkubacji za pomocą kleszczy przenieś każdy fragment tkanki kostnej na świeżą 24-dołkową płytkę zawierającą 1 ml DMEM-10% FBS w każdym dołku. Aby wykonać BLI, wykonaj kroki 3.6-3.7 powyżej. Dodatkowo fragmenty można oglądać za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub przepłukiwać w celu uzyskania populacji szpiku do analizy liczby komórek i właściwości raka piersi, jak opisano w kroku 6.</li>
	<li>Aby przygotować nienaruszone fragmenty do oceny jakościowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po BLI, należy pobrać pipetę 5 μl fluorescencyjnego roztworu znakującego bisfosfoniany (przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta) do każdej studzienki w celu oznaczenia zmineralizowanych kolców fragmentów kości. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych przez kolejne 24 godziny.</li>
	<li>Po 24 godzinach hodowli w fluorescencyjnym roztworze znakowania bisfosfonianów, za pomocą kleszczy przenieś fragmenty na płytki do hodowli tkankowej zawierające pożywkę wolną od czerwieni fenolowej i obejrzyj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego skonfigurowanego do obrazowania GFP (485 nm) i znakowania bisfosfonianów (680 nm).</li>
</ol>
5. Pomiar migracji komórek raka piersi do fragmentów tkanki kostnej i supernatantów z hodowanych fragmentów kości
<ol>
	<li>Migracja w kierunku supernatantu do hodowli tkanki kostnej. 
	UWAGA: Wykonaj eksperymenty w trzech egzemplarzach tak, aby 3 fragmenty z danej próbki THR zostały użyte do wytworzenia 3 supernatantów. Dla każdego eksperymentu migracja jest porównywana przez trzy studzienki zawierające supernatanty kostne z trzema studzienkami zawierającymi tylko pożywkę kontrolną.
	<ol>
		<li>Wytwarzaj supernatanty tkanki kostnej, umieszczając fragmenty kości w dołkach 12-dołkowej płytki zawierającej 2,2 ml DMEM-10% FBS na studzienkę. Hodowla w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Wycofaj pożywkę po 24 godzinach i zastąp 2,2 ml świeżego DMEM-10% FBS. Studzienki kontrolne zawierające DMEM-10% FBS należy traktować w ten sam sposób. 
		UWAGA: Pożywka jest zmieniana po 24 godzinach w celu usunięcia czynników wydzielanych w odpowiedzi na uraz tkanki wynikający z operacji. Ponieważ supernatanty tkanki kostnej są generowane w pożywce zawierającej FBS, studzienki zawierające tylko pożywkę zawierającą FBS są uwzględniane w celu kontroli udziału FBS w migracji komórek raka piersi.</li>
		<li>Po 48 godzinach zebrać 0,9 ml każdego supernatantu/pożywki kontrolnej i odpipetować do studzienek płytki odbiorczej. Wkładki zostaną później umieszczone w tych studzienkach. Inkubować płytkę odbiorczą w inkubatorze do hodowli tkankowych podczas wysiewu wkładek. Uwaga: Pozostały supernatant (~1 ml po odparowaniu) można w razie potrzeby pobrać do analizy czynników sekretomu44.</li>
		<li>Aby wysiać wkładki Transwell, umieść je na standardowej, pustej 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Odpipetować 350 μl zawiesiny komórek zawierającej 1 x 105 komórek raka piersi w DMEM-10% FBS na górną, wewnętrzną powierzchnię błony każdej wkładki, jak pokazano na rysunku 1A. Umieścić 24-dołkową płytkę zawierającą wkładki z nasionami w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 45 minut, aby ułatwić przyczepienie.</li>
		<li>Po przymocowaniu ogniw do wkładek należy za pomocą kleszczyków przenieść wkładki na płytkę odbiorczą zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw każdą wkładkę pod kątem podczas umieszczania jej w studzience odbiornika, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków między membraną wkładu a supernatantem studzienki odbiornika. Inkubować płytkę odbiorczą z wkładkami przez 20 godzin w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Sprawdzić, czy na dolnej stronie płytki odbiornika nie ma pęcherzyków powietrza między membraną wkładu a supernatantem studzienki odbiornika. Jeśli widoczne są bąbelki, wyjmij określone wkładki i umieść je ponownie w komorze odbiorczej, aż nie będzie żadnych pęcherzyków.</li>
		<li>Po 20 godzinach za pomocą kleszczy wyjmij wkładki z płytki odbiornika. Korzystając z procedur opisanych w krokach 3.6-3.7, wykonaj BLI, aby zobrazować komórki, które migrowały i przyczepiły się do dna studzienki płytkowej odbiornika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Migracja w kierunku fragmentów tkanki kostnej. 
	UWAGA: Wykonaj eksperymenty w trzech egzemplarzach tak, aby 3 fragmenty z danej próbki THR umieszczać w 3 oddzielnych wkładkach, a 3 szklane koraliki umieszcza się w 3 oddzielnych wkładkach jako kontrole.
	<ol>
		<li>Przygotować płytkę odbiorczą, pipetując 0,9 ml DMEM-10% FBS do każdej studzienki. Umieścić go w inkubatorze do hodowli tkankowych podczas przygotowywania wkładek.</li>
		<li>Aby wysadzić wkładki, odwróć je na powierzchni plastikowego pudełka z rurką do mikrofuge, które ma pokrywkę. Odpipetować kroplę zawiesiny komórkowej o objętości 50 μl DMEM-10% FBS zawierającą 1 x10 5 komórek raka piersi bezpośrednio na zewnętrzną, dolną powierzchnię każdej membrany wkładki (która jest skierowana do góry na odwróconych wkładkach). Przykryj pudełko probówki do mikrofuge z otwartą pokrywką i przenieś je do inkubatora tkanek w temperaturze 37 °C na 45 minut, aby ułatwić przyczepienie komórek.</li>
		<li>Przenieś pudełko probówki do mikrofuge do okapu do hodowli tkankowych i za pomocą kleszczy obróć wkładki z nasionami prawą stroną do góry i przenieś je do dołków płytki odbiorczej. Odpipetować 0,450 ml DMEM-10% FBS do każdego kubka wkładki. Za pomocą kleszczy przenieś jeden fragment tkanki kostnej (~3 mm) do każdej przygotowanej miseczki na wkładkę. Opcjonalnie użyj szklanych kulek jako kontroli ujemnych w dodatkowych studzienkach. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 20 godzin.</li>
		<li>Aby zmierzyć migrację, należy przygotować standardową 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej zawierającą 1 ml DMEM-10% FBS na dołek. Wyjąć płytkę odbiorczą z inkubatora i za pomocą kleszczy przenieść fragmenty kości i koraliki z każdej wkładki do oddzielnych dołków płytki standardowej. Dodaj substrat lucyferyny (aby osiągnąć końcowe stężenie 300 μg/ml) do każdego dołka i wykonaj BLI, stosując procedury opisane w krokach 3.6-3.7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Dodatkowe analizy przed- i poeksperymentalne
<ol>
	<li>Analiza zaczerwienionego szpiku.
	<ol>
		<li>Przenieść fragment kości do sitka o wielkości 70 μm umieszczonego na górze stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o pojemności 25 g energicznie przepłukać fragment 10 ml PBS w celu uzyskania zawiesiny komórek szpiku kostnego w stożkowej probówce. Odwirować zawiesinę komórek przez 3 minuty w temperaturze 300 x g i temperaturze 21 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w PBS lub innym pożądanym roztworze do cytometrii przepływowej. 
		UWAGA: Objętość ponownego zawieszenia będzie się różnić w zależności od wielkości osadu komórkowego po odwirowaniu i aplikacji.</li>
		<li>Do testów żywotności odpowiednie są ~ 75-300 μl objętości PBS, a zawiesiny te można analizować za pomocą dostępnych na rynku testów żywotności opartych na fluorescencji zgodnie z instrukcjami producenta, pipetować do konwencjonalnego hemocytometru i liczyć za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
		<li>W przypadku analizy lub sortowania metodą cytometrii przepływowej w oparciu o wykrycie komórek raka piersi z dodatnim wynikiem GFP, należy ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS zawierającym 2% FBS, 2mM EDTA i 10 mM HEPES, tak aby stężenie wynosiło 1 x 106 komórek/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie H & E i immunohistochemia.
	<ol>
		<li>Aby przetworzyć fragmenty do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) i/lub immunohistochemii, umieść fragmenty w plastikowych kasetach oznaczonych ołówkiem numer 2 i zanurz w pojemniku wypełnionym 10% buforowaną formaliną na 24 godziny.</li>
		<li>Przetwarzaj tkanki pod kątem osadzania, cięcia i barwienia parafiny przy użyciu rutynowych protokołów, które obejmują etap odwapnienia, aby uwzględnić zmineralizowane kolce w każdym fragmencie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Brak informacji do raportowania.

Mehra i in. opisali wcześniej pośmiertne pobieranie i analizę próbek kości od pacjentów z przerzutowym rakiem gruczołu krokowego pobranych w czasie autopsji, ujawniając wysokiej jakości tkanki i zatwierdzając użycie próbek kości ludzkich do badania procesu przerzutowego47. W tym miejscu opisaliśmy protokoły zbierania, przetwarzania i wykorzystywania fragmentów ludzkiej tkanki kostnej uzyskanych z wyrzuconych głów kości udowych po operacji THR w krótkoterminowym systemie kohodowli w celu zbadania migra...

Mikrośrodowisko guza jest powszechnie uznawane za krytyczny czynnik determinujący zachowanie komórek rakowych podczas progresji raka piersi i rozprzestrzeniania się przerzutów1-3. Celem przedstawionej metody jest ułatwienie badania komórek raka piersi w mikrośrodowisku ludzkiej tkanki kostnej, najczęstszego miejsca przerzutów raka piersi4-6. Kość składa się ze zmineralizowanych i szpikowych przedziałów7-9, z których oba zawierają komórki i wydzielane czynniki zaangażowane w progresję przerzutów10,11. Chociaż szeroko stosowane modele mysie in vivo ułatwiają ogólnoustrojowe badania procesu przerzutowego12-15, interakcje komórkowe w szkielecie nie są łatwo dostępne do obserwacji i bezpośrednich zakłóceń. Systemy modelowe do badania i hodowli tkanek kostnych myszy i komórek szpiku myszy zapewniają lepszy dostęp i przyniosły wiele informacji na temat przesłuchów i mechanizmów leżących u podstaw przerzutów komórek raka piersi w szkielecie myszy16-22. Jednak badania sugerują, że mogą istnieć specyficzne dla gatunku wzorce osteotropizmu dla tkanki kostnej23,24. Wzorce te mogą odzwierciedlać nieodłączne specyficzne dla gatunku różnice we właściwościach tkanki kostnej, różnice wynikające ze zmienionych populacji szpiku kostnego u myszy z niedoborem odporności11 i / lub stosunkowo młody wiek myszy wykorzystywanych w eksperymentach, z których wszystkie są prawdopodobnymi determinantami mikrośrodowiska kości.
Podejścia in vitro do badania komórek raka piersi w ludzkich kokulturach kostnych zazwyczaj koncentrowały się na konkretnych typach komórek kostnych, takich jak osteoblasty pochodzące ze szpiku kostnego lub komórki zrębu hodowane jako monowarstwy lub w ramach zaprojektowanych systemów modeli trójwymiarowych25-35. Chociaż dwuwymiarowe modele hodowli komórkowych stanowią podstawę podejść in vitro do badań nad rakiem, od dawna wiadomo, że zachowanie komórek jest zasadniczo zmienione w systemach hodowli jednowarstwowych18,36,37. Doprowadziło to do opracowania zmodyfikowanych mikrośrodowisk, które naśladują złożoność trójwymiarowych żywych tkanek, w tym modeli opartych na matrycach i rusztowaniach złożonych z naturalnych materiałów, takich jak kolagen lub syntetycznych polimerów osadzonych określonymi typami komórek w celu stworzenia mikrośrodowisk podobnych do tkanek36-41. Podejścia inżynieryjne obejmowały również wykorzystanie platform bioreaktorów do kontrolowania i badania środowiska hormonalnego mikrośrodowiska18,19,41-43. Chociaż modele biomimetyczne i bioreaktory dostarczają wielu elementów złożonego mikrośrodowiska tkankowego w kontrolowanych warunkach i zostały z powodzeniem zastosowane do postępu w badaniach nad przerzutami raka piersi do kości18,19,35,42,43, inżynieryjne systemy modelowe na ogół nie obejmują pełnego spektrum typów komórek i składników macierzy zewnątrzkomórkowej obecnych w natywnym środowisku kostnym.
Do niedawna komórki raka piersi nie były badane w natywnym, nienaruszonym, trójwymiarowym mikrośrodowisku ludzkich tkanek kostnych. Niedawno informowaliśmy o opracowaniu modelu kohodowli przy użyciu fragmentów ludzkiej tkanki kostnej wyizolowanych z próbek do operacji całkowitej wymiany stawu biodrowego (THR)44. Próbki te zawierają zarówno zmineralizowane, jak i szpikowe przedziały niezbędne do badania mechanizmów leżących u podstaw mikroprzerzutów w krótkotrwałej hodowli. W poprzednich pracach ustaliliśmy dowód zasady stosowania obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) do monitorowania proliferacji komórek raka piersi wykazujących ekspresję lucyferazy (MDA-MB-231-fLuc) hodowanych wspólnie z fragmentami kości44. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły eksperymentalne do badania proliferacji, kolonizacji i migracji raka piersi w kontekście rodzimego mikrośrodowiska z wykorzystaniem eksplantatów ludzkiej tkanki kostnej.
Najpierw przedstawiamy protokół kohodowli komórek raka piersi sąsiadujących z fragmentami kości w celu zmierzenia proliferacji komórek piersi za pomocą BLI. W tej sekcji zawiesiny komórek piersi są wysiewane jako plamki komórkowe w 6-dołkowych płytkach przylegających do fragmentów kości, które są unieruchamiane przez kawałki wosku kostnego. Studzienki kontrolne zawierają wosk kostny, ale nie zawierają fragmentu kości. Po przyczepieniu się plamek komórkowych dodaje się pożywkę i hoduje się płytkę przez 24 godziny, po czym intensywność sygnału bioluminescencyjnego (związaną z liczbą komórek) mierzy się za pomocą BLI. W kolejnym kroku przedstawiamy metody kohodowli komórek raka piersi wysiewanych bezpośrednio na fragmentach kości w celu zbadania kolonizacji i proliferacji. Tutaj zawiesiny komórek piersi są pipetowane bezpośrednio na fragmenty tkanki kostnej, które są monitorowane w hodowli za pomocą BLI i mikroskopii fluorescencyjnej w czasie w celu śledzenia kolonizacji i liczby komórek. W tej metodzie przedział szpiku może być wypłukany z fragmentów kości w dowolnym momencie w celu analizy skolonizowanych komórek raka piersi za pomocą cytometrii przepływowej lub testów żywotności szpiku.
Ponadto opisujemy dwa różne podejścia do pomiaru migracji komórek raka piersi. W pierwszej metodzie przedstawiono etapy pomiaru migracji w kierunku supernatantów do hodowli tkanki kostnej. W tym protokole komórki raka piersi są wysiewane na wewnętrzne, górne powierzchnie membran wkładek Transwell o wielkości porów 8 μm (jak pokazano na rysunku 1A). Wkładki są następnie umieszczane na płytce odbiorczej z dołkami zawierającymi supernatant tkanki kostnej lub pożywkę kontrolną. W ciągu 20-godzinnego okresu inkubacji niewielka liczba komórek raka piersi migruje przez błony wsuwane do dolnych dołków hodowli tkankowych, gdzie przyczepiają się w celu wykrycia przez BLI. W drugiej metodzie migracji komórki raka piersi są wysiewane na dolne, zewnętrzne powierzchnie membran wkładek Transwell. Fragmenty tkanki kostnej są umieszczane w miseczkach wkładanych, a komórki raka piersi migrują w górę przez błony, aby skolonizować fragmenty kości (jak pokazano na rycinie 1B), które są następnie obrazowane za pomocą BLI.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Uzupełnij wszystkie DMEM o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% Pen/Strep</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>16600-082</td><td>Uzupełnij wszystkie McCoy's&nbsp; 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% Pen/Strep</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicylen Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Blastocydyna (10 mgl/ml)</td><td>InvivoGen&nbsp;</td><td>ant-bl</td><td>Pożywka uzupełniająca stosowana do transfekowanych linii komórkowych.</td></tr><tr><td>Sokół&reg; Wkładki do hodowli komórkowych na płytkę 24-dołkową z przezroczystą membraną PET (8,0 &mu; m wielkość porów)</td><td>Corning Incorporated</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&reg; 24 Well TC-treated Polystyren Cell Culture Insert Companion Plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *dla komórek ssaków*</td><td>Invitrogen Detection Technologies</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite</td><td>DMEM Life Technologies</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>D-lucyferyna świetlik, sól potasowa 5 g (30 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do sterylnych komórek 70 &mu; </td><td>m Fisher Scientific 22363548</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 Klaster kultur komórkowych z powłoką TC</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>12 Klaster kultur komórkowych z powłoką TC</td><td>Corning Incorporated</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24 Klaster kultur komórkowych z powłoką TC</td><td>Corning Incorporated</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>Narzędzia do nauki o naprawach</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Wosk kostny</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>903</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 50 Platforma obrazowania</td><td>Suwmiarka Nauki przyrodnicze/PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software Program&nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td>133026</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL System obrazowania</td><td>Life Technologies</td><td>Wersja 4.2</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680 EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 komórki raka piersi</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 komórki raka piersi</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalna mysia anty-ludzka cytokeratyna przeciwciało</td><td>DAKO Cytomation</td><td>Clone (AE1/AE3)</td><td></td></tr></tbody></table>

metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Kość jest najczęstszym miejscem przerzutów raka piersi. Chociaż powszechnie przyjmuje się, że mikrośrodowisko wpływa na zachowanie komórek rakowych, niewiele wiadomo na temat właściwości i zachowań komórek raka piersi w natywnym mikrośrodowisku ludzkiej tkanki kostnej.Opracowaliśmy metody śledzenia, ilościowego określania i modulowania ludzkich komórek raka piersi w mikrośrodowisku hodowanych fragmentów ludzkiej tkanki kostnej wyizolowanych z wyrzuconych głów kości udowych po operacjach całkowitej wymiany stawu biodrowego. Korzystając z komórek raka piersi zmodyfikowanych pod kątem lucyferazy i zwiększonej ekspresji białka zielonej fluorescencji (EGFP), jesteśmy w stanie odtwarzalnie określić ilościowo wzorce migracji i proliferacji za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI), śledzić interakcje komórkowe we fragmentach kości za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i ocenić komórki piersi po kolonizacji za pomocą cytometrii przepływowej. Do najważniejszych zalet tego modelu należą: 1) natywne, nienaruszone architektonicznie mikrośrodowisko tkankowe, które obejmuje odpowiednie typy komórek ludzkich, oraz 2) bezpośredni dostęp do mikrośrodowiska, który ułatwia szybkie ilościowe i jakościowe monitorowanie i zaburzenia właściwości, zachowań i interakcji komórek piersi i kości. Podstawowym ograniczeniem jest obecnie skończona żywotność fragmentów tkanki, co ogranicza okno badania do krótkoterminowej hodowli. Zastosowania systemu modelowego obejmują badanie podstawowej biologii raka piersi i innych nowotworów złośliwych poszukujących kości w niszy przerzutowej oraz opracowywanie strategii terapeutycznych w celu skutecznego celowania w komórki raka piersi w tkankach kostnych.

Izolacja fragmentów tkanki z głowy kości udowej
Głowy kości udowej pobrano od równej liczby pacjentów płci męskiej i żeńskiej (w wieku 44-90 lat), którzy zostali poddani planowej operacji całkowitej endoprotezoplastyki stawu biodrowego w Departamencie Chirurgii Ortopedycznej w Stanford University School of Medicine. Każda usunięta głowa kości udowej zawiera niewielki fragment górnej części kości udowej, w której znajduje się tkanka kostna beleczkowata składająca się z zmineralizowanych spikul ...

Opisano protokoły do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w systemie modelowym eksplantacji ludzkiej tkanki kostnej.

Metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Celem niniejszej procedury jest badanie proliferacji, kolonizacji i migracji komórek raka piersi w modelu systemowym z wykorzystaniem eksplantów ludzkiej tkanki kostnej. Osiąga się to poprzez izolację fragmentów tkanki kostnej gąbczastej z preparatów chirurgicznych głowy kości udowej i ich hodowlę z komórkami raka piersi wykazującymi ekspresję lucyferazy oraz zielonego białka fluorescencyjnego. Obrazowanie bioluminescencyjne jest wykorzystywane do pomiaru proliferacji komórek oraz weryfikacji kolonizacji komórek raka piersi w fragmentach tkanki kostnej.Wzorce kolonizacji komórek raka piersi są obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Kompartment szpiku może zostać wypłukany z fragmentów w celu analizy za pomocą cytometrii przepływowej, testów luminescencyjnych oraz barwień. Migracja komórek raka piersi w kierunku supernatantów z hodowli tkankowych oraz fragmentów tkanki kostnej jest mierzona w komorach migracyjnych Transwell z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego. Kość jest najczęstszym miejscem przerzutów raka piersi, a niniejszy model otwiera nowe możliwości badania komórek raka piersi w niszy przerzutowej kości.Wielką zaletą tego modelu jest zapewnienie bezpośredniego dostępu do mikrośrodowiska fragmentów ludzkiej tkanki kostnej, co pozwala na łatwą obserwację i analizę zachowania komórek raka piersi podczas krótkotrwałych eksperymentów z kokulturą. Metoda ta może być wykorzystana do badania kluczowych kwestii dotyczących mechanizmów leżących u podstaw przerzutowania raka piersi do kości, w celu zidentyfikowania strategii terapeutycznych pozwalających na skuteczne zapobieganie i leczenie tego procesu. Choć model ten pozwala na zgłębienie wiedzy o przerzutach raka piersi, może być on również stosowany do badania innych nowotworów z predylekcją do przerzutów do kości, takich jak rak prostaty.Fragmenty tkanki kostnej muszą zostać pobrane w różnych punktach w każdym badaniu. Proces ten rozpoczyna się od zebrania i przetransportowania próbki kości udowej w soli fizjologicznej oraz przygotowania stanowiska pracy w komorze z laminarnym przepływem powietrza, nosząc rękawice chirurgiczne. Chwyć głowę kości udowej jedną ręką i użyj pilnika chirurgicznego do wydobycia kości beleczkowej.Fragmenty mają rozmiar od około dwóch do pięciu milimetrów. Pęseta nie będzie odpowiednia do tego kroku. Należy użyć wysokiej jakości kleszczy chirurgicznych.Do tego eksperymentu należy przygotować zawiesinę komórek raka piersi o stężeniu 100 000 komórek na 50 µL DMEM z dodatkiem 10% FBS. Dodatkowo, wykorzystując odcięte końcówki końcówek do mikropipety, należy przygotować zatyczki z wosku kostnego do mobilizacji fragmentów kości; zatyczki należy przechowywać w szalce Petriego. Następnie, za pomocą pęsety, przenieść zatyczki do płytki sześciodołkowej i, używając sterylnej rękawiczki, docisnąć zatyczki w pozycji godziny 12:00.Następnie pipetujemy 50 µL zawiesiny komórkowej do centrum każdego dołka. Płytkę umieszczamy w inkubatorze do hodowli tkankowych na 45 minut, aby umożliwić adhezję komórek. Po inkubacji płytki wyjmujemy fragmenty kostne z przytwierdzonymi do nich komórkami. W trzech dołkach umieszczamy fragment tkanki kostnej na wosku do kości i dociskamy każdy z nich za pomocą GER. Trzy dołki bez fragmentów służą jako kontrole.Następnie powoli dodaj 5 mL DMEM z 10% FBS na ściankę każdego dołka. Należy uważać, aby nie przesunąć wosku kostnego ani fragmentów kości. Następnie inkubuj hodowlę przez 20 do 24 godzin.Następnego dnia w pierwszej kolejności wykonaj obrazowanie komórek. Do każdej studni dodaj 300 µg/ml Lucyferyny, a następnie niezwłocznie przeprowadź obrazowanie płytki przy użyciu platformy obrazowania Ivis. Eksperyment ten wymaga zawiesiny komórek raka piersi, analogicznie jak w poprzednim przypadku.Po wyekstrahowaniu fragmentów kości, za pomocą pęsety przenieś każdy fragment do pustego dołka płytki 24-dołkowej, a następnie pipetą nanieś 50 µL zawiesiny komórek bezpośrednio na każdy fragment kości i umieść płytkę w inkubatorze na 45 minut, aby umożliwić adhezję komórek. Po przytwierdzeniu się komórek ostrożnie dodaj do każdego dołka od 1 do 2 mL pożywki, w ilości wystarczającej do całkowitego zanurzenia fragmentu kości. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek na 20 do 24 godzin.W ramach przygotowania do obrazowania Ivis, obrazowania fluorescencyjnego lub pobierania komórek szpiku do analizy w obrazowaniu Ivis, przenieść fragmenty kości do płytki 24-dołkowej, dodając 1 ml świeżej pożywki do każdego dołka. Do każdego dołka dodać 300 µg/ml Lucifеру i postępować zgodnie z wcześniej opisaną procedurą dla mikroskopii fluorescencyjnej. Do każdego dołka pipetować 5 µL roztworu znakującego fluorescencyjnym bisfosforanem w celu oznakowania beleczek kostnych fragmentu kości, a następnie inkubować płytkę przez kolejne 24 godziny.Po 24 godzinach za pomocą pęsety przenieść fragmenty na płytki zawierające pożywkę bez czerwieni fenolowej. Następnie obejrzeć płytki pod mikroskopem fluorescencyjnym skonfigurowanym do obrazowania przy 485 nanometrach w celu zlokalizowania kolonii komórek raka piersi wykazujących ekspresję GFP oraz przy 680 nanometrach w celu zidentyfikowania spikul kostnych znakowanych bisfosforanem, a następnie wypłukać przedział szpiku kostnego w celu analizy liczby lub właściwości komórek.Przenieś fragment na sitko o oczkach 70 µm umieszczone nad probówką typu chronicle o pojemności 50 ml. Następnie, używając strzykawki 10 ml z igłą 25 G, energicznie przepłucz fragment 10 ml buforu PBS. Wirowarkuj zawiesinę z prędkością 300 ×g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby odwirować komórki; odessać i usunąć nadsącz.Resuspend osad komórek szpiku w PBS lub innych pożądanych roztworach zgodnie z wymogami cytometrii przepływowej lub testów żywotności. Rozpocznij od przygotowania zawiesiny tkanki kostnej. Umieść fragmenty kości w dołkach płytki 12-dołkowej.Płytka wielodołkowa zawierająca 2,2 ml DMEM z 10% FBS na dołek; należy pozostawić kilka dołków kontrolnych bez fragmentów kości. Inkubować płytkę przez 24 godziny. Następnie odessać i wymienić pożywkę, a następnie kontynuować hodowlę przez kolejne 24 godziny; w 48. godzinie hodowli przenieść 0,9 ml nadsączu do płytki odbiorczej, tymczasowo inkubując płytkę odbiorczą.Umieść wkłady transwell w pustej płytce 24-dołkowej. Następnie nanieś 100 000 komórek raka piersi w 350 µL na każdy wkład. Inkubuj płytki przez 45 minut, aby umożliwić adhezję komórek. Po 45 minutach za pomocą pęsety przenieś wkłady do płytki odbiorczej.Podczas umieszczania wkładów w odbiorniku należy je prowadzić pod kątem. Należy je odpowiednio supiniować, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Następnie płytkę z wkładami należy inkubować przez 20 godzin w temperaturze 37 °C do następnego dnia.Za pomocą pęsety wyjmij wkładki i dodaj do każdej z nich 300 µg/mL Luciferyny. Przeprowadź obrazowanie bioluminescencyjne na płytce odbiorczej, aby wykryć komórki raka piersi, które migrowały przez membrany i przyczepiły się do dna dołków płytki odbiorczej. Najpierw napełnij płytkę odbiorczą pożywką i umieść ją w inkubatorze do hodowli tkankowych.Aby zasiać komórki na wkładach, należy odwrócić je w pustym pudełku z probówkami typu microfused z pokrywką. Następnie na zewnętrzną dolną powierzchnię każdej membrany wkładu należy nanieść 100 000 komórek w 50 µL.Przykryć pudełko, pozostawiając pokrywkę lekko uchyloną, i inkubować wkłady przez 45 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych. Następnie za pomocą pęsety odwrócić i przenieść wkłady do dołków płytki odbiorczej, do każdego uchwytu wkładu dodając 0,45 milliliters DMEM z 10%FBS. Następnie do każdego wkładu dodać trzymilimetrowy fragment kości lub kuleczkę szklaną i inkubować na płytce przez 20 godzin.Następnego dnia za pomocą pęsety przenieść fragmenty i koraliki na płytkę z dołkami zawierającymi 1 ml świeżej pożywki. Do każdego dołka dodać 300 µg/mL Lucyferyny i przystąpić do obrazowania bioluminescencyjnego. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.Komórki raka piersi współhodowano obok unieruchomionych fragmentów kości, aby zmierzyć proliferację komórek piersi. Obrazowanie bioluminescencyjne po 24 godzinach hodowli wykazało zwiększoną proliferację komórek raka piersi w obecności fragmentów kości w trzech górnych dołkach w porównaniu do braku fragmentów kości w trzech dolnych dołkach. Wyniki eksperymentów z wykorzystaniem fragmentów z trzech oddzielnych preparatów chirurgicznych wykazały zwiększoną proliferację w obecności w porównaniu do braku kości.We wszystkich trzech przypadkach, kolonizacja komórek MCF seven F Luke EGFP osadzonych bezpośrednio pod fragmentami tkanki kostnej została zaobserwowana za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego po 24 godzinach. Zmniejszenie sygnału wiązało się ze spadkiem gęstości wysiewu po 48 godzinach. Fragmenty poddane bezpośredniemu wysiewowi i znakowane odczynnikiem bisfosfonianowym ujawniły kolonizację GFP-dodatnich komórek raka piersi w obrębie przedziałów zmineralizowanych oraz szpiku.Migracja komórek raka piersi przez porowatą membranę migracyjną w kierunku kultur tkanki kostnej; w trzech górnych studzienkach zaobserwowano intensywną migrację w porównaniu do kontroli. W trzech dolnych studzienkach widoczne jest medium. Odnotowano również migrację do trzech fragmentów kości pochodzących z jednego preparatu THR, podczas gdy nie zaobserwowano migracji na kuleczki.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat sposobu wyodrębniania fragmentów tkanki kostnej człowieka z preparatu głowy kości udowej oraz wprowadzania ich do testów kokultury w celu pomiaru zachowań komórek raka piersi, w tym ich migracji, kolonizacji i proliferacji.

methods-for-culturing-human-femur-tissue-explants-to-study-breast

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Metody hodowania ludzkiego tkanka przeszczepu kości udowej w celu badania kolonizacji przez komórki raka piersi niszy przerzutowej

Opracowaliśmy oparty na kolagenie test in vitro, który stymuluje proliferację i inwazję w próbkach wszystkich podtypów raka piersi. Do wizualizacji i kwantyfikacji ekspansji guza wykorzystano optyczną tomografię projekcyjną, będącą techniką mikroskopii trójwymiarowej. Test ten może być wykorzystywany do ilościowej oceny odpowiedzi na leki w poszczególnych próbkach guzów.

Długoterminowa hodowla próbek raka piersi u ludzi i ich analiza z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej

Ten film opisuje hodowlę komórek raka piersi przylegających do eksplantatów kości udowej w celu zmierzenia proliferacji i kolonizacji komórek rakowych w systemie modelowym ludzkiej tkanki kostnej.

Współkultura komórek BC: hodowla komórek raka piersi z fragmentami kości w celu zbadania proliferacji komórek rakowych

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Pierwotna hodowla komórkowa przy użyciu nienaruszonych organoidów tkankowych dostarcza systemu modelowego, który naśladuje wielokomórkowe mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy model hodowli pierwotnej tkanki nabłonka piersi bez surowicy, który utrwala mieszane linie hodowli komórkowych i wykazuje zróżnicowaną morfologię, bez enzymatycznego rozerwania tkanki. Organoidy piersi zachowują żywotność przez &gt;6 miesięcy.

Nieenzymatyczna, pozbawiona surowicy hodowla tkankowa przedinwazyjnych zmian piersi do spontanicznego wytwarzania mammosfery

Tutaj prezentujemy protokół do ko-hodowli w trzech wymiarach, który jest przydatny do badania interakcji wielokomórkowych i zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej modulacji zachowania komórek rakowych. W tym eksperymentalnym modelu komórki rakowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w ludzkich fibroblastach związanych z rakiem.

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Ten manuskrypt opisuje model ex vivo składający się z narządowych pożywek pochodzących z węzłów chłonnych, kości, płuc i mózgu myszy. Ten system modelowy może być wykorzystany do identyfikacji i badania rozpuszczalnych czynników pochodzących z narządów oraz ich wpływu na tropizm narządów i przerzutowe zachowanie komórek nowotworowych.

Generowanie pożywek narządowych i aplikacje do badania specyficznych dla narządów wpływów na zachowanie przerzutowe raka piersi

Komórki rakowe są umieszczane w żelu kolagenowym, a następnie umieszczane w bezkomórkowym żelu fibrynowym w celu wygenerowania systemu hodowli 3D, w którym można monitorować inwazyjność i powstawanie nowotworów satelitarnych.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

Ten eksperymentalny protokół opisuje izolację BCSC z próbek komórek i tkanek raka piersi, a także testy in vitro i in vivo, które mogą być użyte do oceny fenotypu i funkcji BCSC.

Izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Protokół ten przedstawia metody hodowli, manipulowania i analizowania mysich CAF, w tym testy funkcjonalne in vitro/in vivo , transkryptomikę i analizę obliczeniową. Ponadto opisano w nim platformę internetową opracowaną w celu analizy publicznie dostępnych transkryptomów mikrowypreparowanych składników zrębu i nabłonka z kolekcji ludzkich nowotworów raka piersi.

Fibroblasty związane z rakiem z guzów sutka myszy jako narzędzia do badań molekularnych i obliczeniowych

Poznaj metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki kostnej do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej kości.

Metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej

Przeglądaj więcej filmów