Wykorzystanie elektroretinogramu do oceny funkcji siatkówki gryzoni i ochronnych skutków warunkowania wstępnego niedokrwiennego kończyn na odległość

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie funkcji wzrokowej u szczurów zdrowych, z uszkodzeniem wywołanym światłem oraz poddanych zdalnemu uprzedzemu niedokrwieniu i uszkodzeniu światłem z wykorzystaniem ERG, w celu wykazania ochronnego działania zdalnego niedokrwienia kończyny na siatkówkę. W pierwszej kolejności szczury poddaje się 12-godzinnej adaptacji do ciemności. W drugim kroku rejestruje się bazowe ERG po adaptacji do ciemności, wykorzystując stymulację światłem LED oraz wzmacniacz cyfrowy.

Następnie poddano szczury stresowi siatkówkowemu poprzez ekspozycję na jasne, ciągłe światło. Ostatnim krokiem jest porównanie zapisów ERG szczurów z uszkodzeniem świetlnym oraz tych poddanych prekondycjonowaniu poprzez niedokrwienie kończyny, a następnie pomiar odpowiedzi fotoreceptorów widocznych w fali A oraz odpowiedzi wewnętrznej warstwy siatkówki widocznych w fali B. Ostatecznie ERG po adaptacji do ciemności służy do oceny skotopowej funkcji wzrokowej.

W ten sposób metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat neuroprotekcji opartej na zdalnej ischemii. Może ona zostać zastosowana również w badaniach farmakologicznych nad innymi rodzajami uszkodzeń i chorób siatkówki, a także w przesiewowych badaniach zwierząt z wadami wzroku. Aby rozpocząć tę procedurę, poddaj szczura 12-godzinnej adaptacji do ciemności, a następnie znieczul go poprzez wstrzyknięcie koktajlu ketaminy i ksylazyny.

Po utracie przytomności przez zwierzę należy sprawdzić głębokość anestezji, lekko uszczypując stopę, aby upewnić się, że reakcja odruchowa nie występuje. Następnie na rogówkę należy nanieść kroplę atropiny oraz kroplę proksymetanu. Odciąć czarną nić o długości 10 centymetrów.

Następnie wykonaj pętlę z nici i nasuń ją na równik gałki ocznej, ściśle wiążąc, aby lekko wysunąć gałkę oczną do przodu i zapobiec przykryciu rogówki przez powiekę. Następnie do rogówek zakropliny krople do oczu Carmer. Umieść szczura na chłonnej ściółce na podgrzewanej platformie, tak aby głowa znajdowała się w otworze ganzfeldu.

Następnie wprowadź wewnętrzną sondę temperatury do odbytnicy, aby upewnić się, że temperatura ciała jest utrzymywana na poziomie 37 °C, a następnie przymocuj sondę temperatury, przyklejając jej przewód do ogona szczura. Następnie wprowadź podskórnie elektrodę referencyjną do kończyny tylnej. Umieść stabilnie elektrodę ujemną w jamie ustnej, aby zapobiec jej wysunięciu z pyska.

Przymocuj przewód łączący do stabilnej powierzchni. Następnie umieść elektrodę dodatnią nad środkiem rogówki i za pomocą mikromanipulatora upewnij się, że elektroda delikatnie dotyka rogówki. Po rozmieszczeniu elektrod przykryj cały zestaw, w tym ganzfeld i zwierzę, nieprzezroczystym materiałem w celu zachowania adaptacji do ciemności.

W oprogramowaniu do akwizycji ustaw częstotliwość próbkowania na 2 kHz, czas próbkowania wstępnego (pre-collection) na 5 ms oraz czas zbierania danych w przedziale od 100 do 1000 ms. Następnie ustaw filtry pasmowe na zakres od 1 do 1000 Hz i upewnij się, że próbkowanie jest wyzwalane na okres 100 ms po błysku.

Teraz sprawdź linię bazową rejestracji. Powinna być ona wolna od zewnętrznych zakłóceń, lecz wykazywać szumy wzmacniacza oraz oscylacje oddechowe. Następnie przeprowadź błysk testowy.

Jest to typowa postać fali ERG w odpowiedzi na błysk testowy. Po zakończeniu procedury należy pozwolić zwierzęciu na ponowną adaptację do ciemności przez 10 minut. Następnie należy ponownie sprawdzić linię bazową w celu uzyskania stabilnego sygnału.

Następnie rozpocznij rejestrację. Po zakończeniu sesji rejestracyjnej sprawdź stabilność temperatury ciała zwierzęcia. Usuń elektrody, a następnie ponownie nałóż polimer carmer na rogówki. Po tym czasie pozwól zwierzęciu dojść do siebie na podgrzewanej podkładce, aż odzyska pełną sprawność ruchową i aktywność, przed powrotem do klatki.

Na tej ilustracji przedstawiono pomiar fali a oraz fali b w zapisie ERG po adaptacji do ciemności. Pokazany tutaj ślad zarejestrowano z rogówki oka zaadaptowanego do ciemności w odpowiedzi na jasny błysk światła podany w czasie oznaczonym jako T zero. Amplitudę fali a mierzy się od linii bazowej do pierwszego minimum.

Amplitudę fali B mierzy się od dołka fali A do następnego dodatniego piku. Latencję mierzy się od artefaktu stymulacji do punktu zainteresowania na zapisie, takiego jak dołek fali A. Surowy sygnał ERG z dominującą odpowiedzią wzrasta wraz ze zwiększeniem bodźca świetlnego.

Fala staje się widoczna przy wartości około 0,4 log scotopic candela seconds per meter squared, a paradygmat podwójnego błysku (twin flash paradigm) jest wykorzystywany do rozdzielenia mieszanego sygnału ERG na odpowiedzi czopkowe i pręcikowe. Po opanowaniu tej techniki, procedura ta może zostać wykonana w ciągu 30 minut.