Name: Elektroretinogram Analiza odpowiedzi wzrokowej u larw danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę elektroretinografii u larw Danio rerio do badania funkcji wzrokowej w neurobiologii. Technika mikromanipulacji umożliwia precyzyjne pomiary odpowiedzi siatkówki in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom UNC Zebrafish Aquaculture za utrzymanie danio pręgowanego. Chcielibyśmy również podziękować firmie Diagnosys, LLC za pomoc w konfiguracji aparatury ERG. Dodatkowe podziękowania kierujemy do dr Portii McCoy i laboratorium dr Bena Philpota za pomoc w metodach elektrofizjologicznych. Pragniemy również podziękować Lizzy Griffiths za ilustrację przedstawiającą larwę danio pręgowanego. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health Award F32 EY022279 (dla J.D.C) i R21 EY019758 (dla E.R.W).

Utrzymanie zwierząt i protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Karoliny Północnej w Chapel Hill i spełniają wszystkie wymagania Biura Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych NIH oraz Stowarzyszenia Oceny i Akredytacji Międzynarodowej Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi. 
UWAGA: Aby uzyskać larwy do analizy ERG, wykorzystano opublikowane protokoły standardowej hodowli i utrzymania danio pręgowanego18. Larwy są pozyskiwane w wyniku naturalnej hodowli i trzymane w 14-godzinnym cyklu światła / 10-godzinnym cyklu ciemności. Protokół ten został zoptymalizowany dla larw w 5-7 dniu po zapłodnieniu (dpf), ale idealnie mógłby być wykonywany na starszych rybach z niewielkimi modyfikacjami procedury. W tym przypadku użyj szczepu TL larw danio pręgowanego typu dzikiego w temperaturze 5 dpf.
1. Produkcja mikropipet
<ol>
	<li>Wyciągnij kilka mikropipet za pomocą kapilar z polerowanego ogniowo szkła borokrzemianowego o wymiarach 1,5 x 0,86 mm (średnica zewnętrzna przez średnicę wewnętrzną) z filamentem (temperatura topnienia, 821 °C) i ściągacza do mikropipet P-97 Flaming/Brown wyposażonego w żarnik grzewczy w pudełku. Należy użyć programu do tworzenia mikropipet opisanego w Tabeli 1.</li>
	<li>Sprawdź każdą mikropipetę pod mikroskopem za pomocą odpowiedniej linijki z siatką, aby upewnić się, że końcówki mają średnicę 10-15 μm i gładki otwór końcówki (tj. bez postrzępionych krawędzi).</li>
	<li>Mikropipety należy przechowywać ostrożnie, aby zapobiec uszkodzeniu końcówki i narażeniu na kurz. Opcje przechowywania obejmują szalki Petriego z taśmą laboratoryjną, pudełka wyłożone pianką lub dostępne w handlu pojemniki do przechowywania mikropipet. 
	UWAGA: Inne ściągacze do mikropipet i szklane kapilary mogą być używane, o ile uzyskana jest prawidłowa średnica mikropipety i wysokiej jakości końcówka.</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ciśnienie</td>
			<td>upał</td>
			<td>ciągnąć</td>
			<td>prędkość</td>
			<td>Godzina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500</td> szt.
			<td>560</td> szt.
			<td>-</td>
			<td>Rozdział 30</td>
			<td>200</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>500</td> szt.
			<td>450</td> szt.
			<td>-</td>
			<td>Rozdział 30</td>
			<td>200</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>500</td> szt.
			<td>410</td> szt.
			<td>55</td> Rozdział
			<td>Rozdział 40</td>
			<td>200</td> szt.
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Program do produkcji mikropipet za pomocą flamingowego/brązowego ściągacza do mikropipet P-97 wyposażonego w żarnik grzewczy w pudełku. Mikropipety są wykonane z polerowanych ogniowo kapilar ze szkła borokrzemianowego o wymiarach 1,5 x 1,0mm2 (średnica zewnętrzna na średnicę wewnętrzna) z żarnikiem (temperatura topnienia, 821 °C).
2. Przygotowanie bufora
<ol>
	<li>Użyć przefiltrowanego, natlenionego buforu Ringera19 złotej rybki w kapilarze mikroelektrody i nasycić gąbkę z alkoholu poliwinylowego (PVA), na której umieszcza się larwy do eksperymentów. Alternatywnie użyj pożywki dla zarodków E3 lub Hank's Balanced Salt Solution.</li>
	<li>Przygotować 10x roztwór Ringera dla złotej rybki zgodnie z opisem w Tabeli 2. Dostosuj do pH 7,8 i wysterylizuj za pomocą filtra 0,22 μm i przechowuj 10-krotny bulion w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Stwórz roztwór roboczy w dniu eksperymentu, rozcieńczając 10x roztwór Ringera do 1x dejonizowaną, destylowaną wodą. Filtruj za pomocą systemu filtrów 0,22 μm. Natleniać przez bulgotanie 95% gazem O2/5% CO2 przez 10 minut. Następnie szczelnie zakryj, aby upewnić się, że roztwór pozostaje natleniony.</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zawartość NaCl</td>
			<td>1,25 mln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kcl</td>
			<td>26 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glukoza</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPESY</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Przygotowanie 10x roztworu Ringera dla złotej rybki.
3. Platforma elektroretinogramu
<ol>
	<li>Wykonuj eksperymenty ERG na stole antywibracyjnym wewnątrz klatki Faradaya, aby poprawić stosunek sygnału do szumu. Przymocuj niestandardową stalową platformę do stołu antywibracyjnego za pomocą nakrętek sześciokątnych. Umieść ruchomą plastikową platformę z lepkosprężystym dnem amortyzującym uretan polimer na stole pod źródłem światła.</li>
	<li>Ustaw kamerę za pomocą namagnesowanej podstawy, skierowanej w dół na ruchomą plastikową platformę. Umieść mikromanipulator (który będzie trzymał mikroelektrodę rejestrującą) z drugim namagnesowanym stojakiem po prawej stronie ruchomej plastikowej platformy. Upewnij się, że kamera i mikromanipulator nie będą zakłócane przez ruch innych urządzeń i aby nie blokowały oświetlenia ze źródła światła.</li>
	<li>Podłącz kamerę do monitora wideo i ustaw ją tak, aby view oko larwy, aby ustawić elektrodę we właściwej pozycji.</li>
	<li>Upewnij się, że konfiguracja jest prawidłowo uziemiona drutem miedzianym. Aby sprawdzić szum, umieść elektrodę odniesienia i końcówkę mikroelektrody rejestrującej na szalce Petriego o średnicy 35 mm wypełnionej roztworem Ringera. Sprawdź poziomy zakłóceń elektrycznych w konfiguracji za pomocą oscyloskopu lub wbudowanej funkcji aparatu ERG. Poziom hałasu nie powinien przekraczać ±10 μV od linii podstawowej.</li>
</ol>
4. Przygotowanie gąbki
<ol>
	<li>Wytnij mały prostokąt z suchej gąbki PVA, który będzie dobrze pasował do szalki Petriego o średnicy 35 mm. Grubość gąbki nie powinna być większa niż głębokość naczynia. Do cięcia używaj noża uniwersalnego z czystą żyletką.</li>
	<li>Wykonaj dodatkowe nacięcie w gąbce, aby pomieścić elektrodę odniesienia (albo płytkie nacięcie wzdłużne na dnie gąbki, albo motylek przecięty pionowo przez jeden z mniejszych końców).</li>
	<li>Użyj chemicznie odpornego markera, aby zaznaczyć małą kropkę na gąbce (w miejscu, w którym zostanie umieszczona larwa), którą można wykorzystać do ustawienia kamery.</li>
	<li>Namocz gąbkę PVA w roztworze Ringera, aż się nasiąknie. Usuń i szybko osusz ręcznik papierowy 2-3 razy. Umieść gąbkę na czystej szalce Petriego o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego zawierającą gąbkę na plastikowej platformie w taki sposób, aby znak mógł być uwidoczniony przez kamerę.</li>
</ol>
5. Przygotowanie elektrody
UWAGA: Konfiguracja danio pręgowanego składa się z elektrody referencyjnej stykającej się z nasączoną roztworem gąbką PVA Ringera oraz elektrody rejestrującej stykającej się z rogówką. Elektroda referencyjna składa się z osadu Ag/AgCl. Elektroda rejestrująca jest ciągnioną szklaną mikropipetą wypełnioną roztworem Ringera i trzymaną przez uchwyt mikroelektrody zawierający drut Ag.
<ol>
	<li>Chlorkować elektrody, mocząc je w 6-9% podchlorynie sodu (wybielacz) przez 5 minut (drut mikroelektrody rejestrującej) lub 15 minut (elektroda odniesienia). Suszyć na powietrzu na Kimwipe przez 5 minut.
	<ol>
		<li>W zależności od stylu cięcia wykonanego w kroku 4.2, umieść osad Ag/AgCl elektrody odniesienia w gąbce (w przypadku pionowego cięcia motylkowego) lub pod (w przypadku płytkiego cięcia wzdłuż na dole) gąbce. Podłącz przewód elektrody odniesienia do systemu nagrywania.</li>
		<li>Alternatywnie, jeśli konfiguracja ERG ma ograniczenia przestrzenne lub występują szczególnie silne artefakty fotowoltaiczne z elektrody Ag/AgCl, podłącz elektrodę referencyjną do gąbki za pomocą mostka soli agarowej, aby przesunąć elektrodę poza ścieżkę światła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz ~40 cm rurki o odpowiedniej wielkości do strzykawki o pojemności 5 ml bez Luer lock. Napełnić strzykawkę roztworem Ringera. Uchwyty mikroelektrod posiadające porty ciśnieniowe są zazwyczaj dostarczane z adapterami do rurek o średnicach wewnętrznych 1/16", 3/32", 1/8" lub 5/32".</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem Ringera i za pomocą Micro-fil ostrożnie napełnij uchwyt mikroelektrody. Zapobiegaj tworzeniu się pęcherzyków.</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę o pojemności 5 ml do portu ciśnieniowego uchwytu mikroelektrody za pomocą rurki i użyć jej, aby upewnić się, że uchwyt mikroelektrody jest wypełniony roztworem Ringera. Używając Micro-fil i strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej roztworem Ringera, napełnij szklankę mikropipety od końcówki i upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przymocuj szklaną mikropipetę do uchwytu mikroelektrody, uważając, aby drut elektrody był prosty. Po zabezpieczeniu użyj strzykawki o pojemności 5 ml, aby ostrożnie przecisnąć roztwór Ringera przez mikroelektrodę, aż niewielka ilość roztworu będzie widoczna na końcówce. Sporadyczne wywieranie nacisku na strzykawkę (gdy nie jest stosowany do rogówki) zapobiegnie tworzeniu się pęcherzyków powietrza, a także okluzji spowodowanej gromadzeniem się kurzu lub soli w końcówce mikropipety.
	<ol>
		<li>Jeśli roztwór wypływa w postaci strumienia, wymień szklaną mikropipetę, ponieważ otwór końcówki jest zbyt duży lub jest uszkodzony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie umieść mikroelektrodę rejestrującą w mikromanipulatorze i podłącz przewód do systemu nagrywającego.</li>
</ol>
6. Analiza elektroretinogramu
UWAGA: Ze względu na dominację czopków w siatkówce larwalnej, wysokiej jakości wyniki ERG można uzyskać, gdy przygotowania do rejestracji są wykonywane przy niskich poziomach pośredniego światła białego (<1 luks) lub przy krótkich okresach (<1 min) światła roboczego o większej intensywności (≤250 luksów). Przed nagraniem wymagany jest jeszcze krótki okres adaptacji do ciemności (patrz krok 6.7). Jednak eksperymenty można przeprowadzać w słabym świetle czerwonym lub podczerwonym za pomocą kamery czułej na podczerwień. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w wysterylizowanej filtrem (0,22 μm) wodzie systemowej z UNC Zebrafish AquaCulture Facility, ale można użyć alternatywnych pożywek dla zarodków.
<ol>
	<li>Wytnij kwadraty ręcznika papierowego o wymiarach około 1 cm2.</li>
	<li>W przypadku pomiaru potencjału izolowanego receptora masy czopka, inkubować 3-5 larw w wodzie systemowej z 500 μM (±)-2-amino-4-fosfonomasłowym kwasem (APB) przez 5 min. 
	UWAGA: Chociaż APB jest racemiczną mieszaniną aktywnych (L) i nieaktywnych (R) form AP4, jest tak samo skuteczny jak L-AP4 i jest tańszy.</li>
	<li>Znieczulić 3-5 larw w wodzie systemowej z 0,02% (w/v) Trikainą, aż przestanie reagować, około 1-2 min.</li>
	<li>Użyj pipety Pasteura i pompki do pipet, aby ostrożnie przenieść pojedyncze larwy na kwadraty ręcznika papierowego pod stereoskopem preparacyjnym przy minimalnym oświetleniu (≤250 luksów przez <1 min). Sprawdź pozycję każdej larwy i wybierz kandydata, który jest grzbietową stroną do góry z niezasłoniętym okiem.
	<ol>
		<li>W przypadku dłuższych nagrań (>30 min) utrzymuj larwę wilgotną, glazurując ciało aż do głowy, ale nie włącznie, 3% metylocelulozy za pomocą cienkiej szczotki z wielbłądziej sierści.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś kwadrat ręcznika papierowego z larwą na wilgotną gąbkę PVA.
	<ol>
		<li>W przypadku dłuższych nagrań (>30 min) należy nanieść ciągły strumień nasyconego wodą 100% gazuO2 na larwę, przepuszczając gaz przez kamień napowietrzający w bocznej kolbie zawierającej wodę destylowaną. Umieścić rurkę wychodzącą z bocznego ramienia kolby, która transportuje nawilżony tlen, w pobliżu głowy larwy. 
		UWAGA: Krok 6.4.1 i krok 6.5.1 przedłużą życie ryb16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przy minimalnym oświetleniu za pomocą mikromanipulatora i kamery umieść końcówkę mikroelektrody w punkcie środkowym między nosowym a ogonowym końcem oka i delikatnie dociśnij grzbietową granicę rogówki. 
	UWAGA: Niewłaściwe przemieszczenie końcówki elektrody w odległych obszarach rogówki może spowodować przebiegi ERG o odwróconej polaryzacji.</li>
	<li>Pozwól larwom przystosować się do ciemności przez 5-10 minut.</li>
	<li>Rejestrować testowe reakcje błysku na światło dostarczane przez źródło światła LED lub stymulator optyczny przy użyciu dostępnego sprzętu do stymulacji i nagrywania. Dostosuj parametry protokołu, takie jak intensywność błysku, długość błysku, kolor błysku, intensywność i kolor tła oraz ustawienia filtra, aby dopasować je do eksperymentu.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu należy poddać larwy eutanazji zgodnie z wytycznymi AVMA/IACUC.</li>
</ol>

<ol><li>Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDowling%2C+JE+%22The+retina%3A+an+approachable+part+of+the+brain%22">The retina: an approachable part of the brain</a>. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).</li>
<li>Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inexpensive+device+for+non-invasive+electroretinography+in+small+aquatic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates.</a> J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).</li>
<li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).</li>
<li>Heckenlively, J. R., Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeckenlively%2C+JR+%22Principles+and+Practice+of+Clinical+Electrophysiology+of+Vision%22">Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision</a>. , 2nd edn, The MIT Press. Cambridge, MA. (2006).</li>
<li>Perlman, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerlman%2C+I+%22Webvision%3A+The+Organization+of+the+Retina+and+Visual+System%22">Webvision: The Organization of the Retina and Visual System</a>. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22ProgRetin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
<li>Doerre, G., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+photoreceptor+cell+development+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina.</a> Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+stimulates+a+transducin-independent+increase+of+cytoplasmic+Ca2%2B+and+suppression+of+current+in+cones+from+the+zebrafish+mutant+nof%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof.</a> J Neurosci. 23, 470-480 (2003).</li>
<li>Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cone-specific+kinase+GRK7+in+larval+zebrafish+leads+to+impaired+cone+response+recovery+and+delayed+dark+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation.</a> Neuron. 47, 231-242 (2005).</li>
<li>Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+visual+system+development%3A+more+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye.</a> Genes Dev. 21, 367-378 (2007).</li>
<li>Branchek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+photoreceptors+in+the+zebrafish%2C+brachydaniorerio.+II.+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function.</a> J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).</li>
<li>Schmitt, E. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+retinal+development+in+the+zebrafish%2C+Daniorerio%3A+light+and+electron+microscopic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses.</a> J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+contributions+to+the+electroretinogram+of+the+dark-adapted+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish.</a> Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).</li>
<li>Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+bipolar+cell+input+mechanisms+in+giant+danio%5BTitle%5D)+AND+%22I.+Electroretinographic+analysis.+J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio.</a> I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).</li>
<li>Nelson, R. F., Singla, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+model+for+signal+elements+isolated+from+zebrafish+photopicelectroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram.</a> Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).</li>
<li>Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EML1+%28CNG-modulin%29+controls+light+sensitivity+in+darkness+and+under+continuous+illumination+in+zebrafish+retinal+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors.</a> J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).</li>
<li>Gurevich, L., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+waveforms+of+the+ON+bipolar+neuron+and+the+b-wave+of+the+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram.</a> Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Daniorerio%29%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio)</a>. , 5th edn, University of Oregon Press. Portland, OR. (2007).</li>
<li>Kim, D. Y., Jung, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+contributions+to+the+goldfish+electroretinogram+at+the+photopic+illumination+level%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+PhysiolPharmacol%22%5BJournal%5D)">Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level.</a> Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+retinal+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish retinal mutants.</a> Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).</li>
<li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-potentials+from+colour+units+in+the+retina+of+fish+%28Cyprinidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 536-555 (1966).</li>
<li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-potentials+from+luminosity+units+in+the+retina+of+fish+%28Cyprinidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 587-599 (1966).</li>
<li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects%5BTitle%5D)+AND+%22ProcNatlAcadSci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).</li>
<li>Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroretinogram+%28ERG%29+Measurements+in+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish.</a> CSH protocols. , (2008).</li>
<li>Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganzfeld+ERG+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ganzfeld ERG in zebrafish larvae.</a> Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).</li>
<li>Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lazy+eyes+zebrafish+mutation+affects+M%C3%BCller+glial+cells%2C+compromising+photoreceptor+function+and+causing+partial+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness.</a> J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).</li>
<li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celsr3+is+required+for+normal+development+of+GABA+circuits+in+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+genetics%22%5BJournal%5D)">Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina.</a> PLoS. genetics. 7, e1002239(2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W tym protokole szczegółowo opisano prostą procedurę rejestracji ERG larw danio pręgowanego. Procedura ta pozwala na szybkie i kompleksowe oznaczenie funkcji wzrokowych. W trakcie procedury należy pamiętać o kilku krytycznych krokach. Larwy danio pręgowanego powinny być zdrowe przed eksperymentem, aby zapobiec śmierci podczas potencjalnego leczenia farmakologicznego i zapewnić przedłużone źródło utrzymania podczas zapisów ERG. Ponadto ważne jest, aby larwy wykorzystywane w eksperymentach były ściśle dopasowane do wieku. ...

Elektroretinogram (ERG) to nieinwazyjna metoda elektrofizjologiczna, która była szeroko stosowana w klinice do określania funkcji siatkówki u ludzi. Aktywność elektryczną w odpowiedzi na bodziec świetlny mierzy się poprzez umieszczenie elektrod rejestrujących na zewnętrznej powierzchni rogówki. Charakterystyka paradygmatu bodźca i przebiegu odpowiedzi definiują neurony siatkówki przyczyniające się do odpowiedzi. Metoda ta została dostosowana do stosowania z wieloma modelami zwierzęcymi, w tym myszami i danio pręgowanymi. Typowa odpowiedź ERG kręgowców składa się z czterech głównych elementów: załamka a, która jest ujemnym potencjałem rogówki pochodzącym z aktywności komórek fotoreceptorów; załamek b, potencjał rogówkowo-dodatni pochodzący z komórek dwubiegunowych ON; załamek d, potencjał rogówkowo-dodatni interpretowany jako aktywność komórek dwubiegunowych OFF; oraz załamek c, który występuje kilka sekund po załamku b i odzwierciedla aktywność gleju Müllera i nabłonka barwnikowego siatkówki1-4. Dodatkowymi źródłami do zrozumienia historii i zasad analizy ERG u ludzi i zwierząt modelowych są podręcznik online Webvision z University of Utah oraz teksty takie jak Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision 4,5.
Daniorerio (danio pręgowany) od dawna jest preferowany jako model rozwoju kręgowców, ze względu na jego szybkie dojrzewanie i przezroczystość, co pozwala na nieinwazyjną analizę morfologiczną układów narządów, testy behawioralne oraz zarówno do przodu, jak i do tyłu genetyczne badania przesiewowe (dla przeglądu, zobacz Fadool i Dowling6). Larwy danio pręgowanego są bardzo podatne na manipulacje genetyczne i farmakologiczne, co w połączeniu z ich wysoką płodnością czyni je doskonałym modelem zwierzęcym do wysokoprzepustowych analiz biologicznych. Wyższy stosunek czopków do pręcików u larw danio pręgowanego – około 1:1 w porównaniu z myszami (~3% czopków) – sprawia, że są one szczególnie przydatne do badania funkcji czopków7-9.
W siatkówce kręgowców czopki rozwijają się przed pręcikami10. Co ciekawe, szyszki danio pręgowanego działają już po 4 dpf, co pozwala na selektywną analizę elektrofizjologiczną czopków na tym etapie 6,11,12. Natomiast odpowiedzi ERG w pręcikach pojawiają się między 11 a 21 dpf13. Dlatego larwy danio pręgowanego w stężeniu 4-7 dpf służą funkcjonalnie jako siatkówka w całości stożkowa. Jednak natywna odpowiedź fotobowa ERG larw 4-7 dpf jest zdominowana przez załamek b. Stosowanie środków farmakologicznych, takich jak kwas L-(+)-2-amino-4-fosfono-masłowy (L-AP4), agonista receptora metabotropowego glutaminianu (mGluR6) ulegającego ekspresji przez komórki dwubiegunowe ON, skutecznie blokuje wytwarzanie załamka b i ujawnia izolowany potencjał receptora masy czopka ("fala a")14-17.
Tutaj opisujemy prostą i niezawodną metodę analizy ERG przy użyciu dostępnego na rynku sprzętu ERG przeznaczonego do użytku z myszami, które zostały przystosowane do stosowania z larwami danio pręgowanego. System ten może być stosowany na larwach danio pręgowanego o różnym pochodzeniu genetycznym, a także na tych leczonych środkami farmakologicznymi, aby pomóc naukowcom w identyfikacji szlaków sygnałowych, które przyczyniają się do wrażliwości wzrokowej i adaptacji światła16. Procedury eksperymentalne przedstawione w tym protokole poprowadzą badaczy w korzystaniu z analizy ERG w celu udzielenia odpowiedzi na różne pytania biologiczne dotyczące widzenia i zademonstrują konstrukcję elastycznej konfiguracji ERG.

<table><tbody><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>80/20 Inc</td><td>na zamówienie</td><td>Specjalnie zaprojektowany aluminiowy "Przemysłowy zestaw montażowy" do ramy klatki</td></tr><tr><td>Gąbka PVA</td><td>Amazon</td><td>B000ZOWG1C</td><td>Zapewnia miękką, wilgotną platformę do umieszczania larw danio pręgowanego</td></tr><tr><td>150 ml Sterylne systemy filtracyjne</td><td>Corning</td><td>431154</td><td>Rozwiązania filtrujące zapobiegające blokowaniu mikropipet przez małe przeguby</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys, Sp. z o.o</td>. <td>kontakt</td><td>Modułowy system elektrofizjologiczny zdolny do generowania bodźców wizualnych dla dowolnego stymulatora oraz cyfrowego zapisu i analizy odpowiedzi za pomocą zastrzeżonego oprogramowania, więcej informacji na stronie http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>kontakt</td><td>Stymulator światła z diodami LED RGB i ksenonowymi źródłami światła dla Ganzfeld ERG, więcej informacji na stronie http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>Trzymanie i pozycjonowanie mikroelektrody rejestrującej</td></tr><tr><td>Magnetyczny stojak pierścieniowy</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>Trzymanie i pozycjonowanie kamery i elektrody refrencyjnej</td></tr><tr><td>Przedłużacze ołowiu</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>Zapasowe żeńskie na męskie 1,5 mm do podłączenia elektrod</td></tr><tr><td>Męski Pin na żeński SAFELEAD Adapter</td><td>Grass Technologies</td><td>DF-215/10</td><td>Podłączanie pinów 2 mm do kołków 1,5 wezgłowia</td></tr><tr><td>Rama ekranu okiennego (metalowa) i wielowypust</td><td>Lowes lub Home Depot</td><td>różne</td><td>Do mocowania siatki miedzianej do ramy klatki Faradaya</td></tr><tr><td>Filtry Steriflip 50 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Rozwiązania filtrujące zapobiegające blokowaniu mikropipet przez małe przeguby</td></tr><tr><td>Adapter BNC</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>Podłączanie kamery do BNC</td></tr><tr><td>BNC</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>Podłączanie kamery do adaptera wideo</td></tr><tr><td>Obiektyw kamery</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>Wizualizacja położenia mikroelektrody rejestrującej na rogówce larwy</td></tr><tr><td>Łącznik kamery</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>Wizualizacja położenia mikroelektrody rejestrującej na rogówce larwy</td></tr><tr><td>Luna BNC na VGA + HDMI Konwerter</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>Przejściówka BNC na VGA pozwalająca na projekcję obrazu z kamery na monitorze komputera</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>Agonista mGluR6, blokuje falę b pozwalającą na analizę potencjału izolowanego receptora masy stożka</td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>Szkło borokrzemianowe polerowane ogniowo (temperatura pomiaru = 821&deg; C) o wymiarach filamentu 1,5mm x 0,86 mm (średnica zewnętrzna na średnicę wewnętrzna)&nbsp;</td></tr><tr><td>P97 Flaming/Brown puller</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>Do wyciągania szklanych mikropipet</td></tr><tr><td>Arkusz sorbotanu</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>Syntetyczny lepkosprężysty polimer uretanowy, umieszczony pod pasywnymi mocowaniami izolacyjnymi i platformą ERG w celu amortyzacji wstrząsów i zapobiegania ślizganiu się, może być przycięty na wymiar</td></tr><tr><td>Płytka do krojenia chleba</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>Płyta izolująca drgania do stymulatora ERG i próbki</td></tr> <tr><td>danio pręgowanegoPasywne mocowania izolacyjne</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>Zapewnia izolację drgań na płytce stykowej</td></tr><tr><td>Siatka miedziana</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>Do linii Faraday Cage</td></tr><tr><td>Pompa pipetowa</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>Używana z pipetami Pasteura do ostrożnego przenoszenia larw danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>Używana z pompą do pipet do ostrożnego przenoszenia larw danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>Wizualizacja położenia mikroelektrody rejestrującej na rogówce larwy</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td> <td>Western Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>Znieczulenie klasy farmaceutycznej,</td></tr> <tr><td>Micro-fil</td><td>WPI</td><td>MF28G-5</td><td>Napełnianie uchwytu mikroelektrody i szkła mikroelektrody</td></tr><tr><td>Uchwyt mikroelektrody</td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>Trzyma szklaną mikroelektrodę, łączy się ze sprzętem ERG</td></tr><tr><td>Elektroda referencyjna</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>Ostrożnie oderwij ostatni centymetr obudowy, aby odprowadzić elektrolit i odsłonić spiekaną elektrodę peletową Ag / AgCl</td></tr><tr><td>Elektroda referencyjna (alternatywa)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>Alternatywa dla DRIREF-5SH. Elektroda Ag/AgCl, którą należy okablować/do przewodu połączeniowego</td></tr><tr><td>o niskim poziomie szumów do uchwytu mikroelektrody</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>Podłączanie uchwytu mikroelektrody do nagrywania do adaptera/wezgłowia</td></tr></tbody></table>

elektroretinogram analiza odpowiedzi wzrokowej u larw danio pręgowanego

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

Elektroretinogram (ERG) to nieinwazyjna elektrofizjologiczna metoda określania funkcji siatkówki. Dzięki umieszczeniu elektrody na powierzchni rogówki, aktywność elektryczna generowana w odpowiedzi na światło może być mierzona i wykorzystywana do oceny aktywności komórek siatkówki in vivo. Niniejszy manuskrypt opisuje zastosowanie ERG do pomiaru funkcji wzrokowych u danio pręgowanego. Danio pręgowany od dawna jest wykorzystywany jako model rozwoju kręgowców ze względu na łatwość supresji genów przez oligonukleotydy morfolino i manipulację farmakologiczną. Przy 5-10 dpf w siatkówce larwy funkcjonują tylko czopki. Dlatego danio pręgowany, w przeciwieństwie do innych zwierząt, jest potężnym systemem modelowym do badania funkcji wzrokowych stożków in vivo. Protokół ten wykorzystuje standardowe protokoły znieczulenia, mikromanipulacji i stereomikroskopii, które są powszechne w laboratoriach prowadzących badania nad danio pręgowanym. Przedstawione metody wykorzystują standardowy sprzęt elektrofizjologiczny i kamerę przy słabym oświetleniu, aby pokierować umieszczeniem mikroelektrody rejestrującej na rogówce larwy. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób dostępny na rynku stymulator/rejestrator ERG, pierwotnie zaprojektowany do użytku z myszami, można łatwo dostosować do stosowania u danio pręgowanego. ERG larw danio pręgowanego stanowi doskonałą metodę oznaczania funkcji wzrokowych stożka u zwierząt, które zostały zmodyfikowane przez wstrzyknięcie morfoligonukleotydów, a także nowsze techniki inżynierii genomu, takie jak nukleazy palca cynkowego (ZFN), nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) i zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) / Cas9, z których wszystkie znacznie zwiększyły wydajność i skuteczność celowania w geny u danio pręgowanego. Ponadto wykorzystujemy zdolność środków farmakologicznych do penetracji larw danio pręgowanego, aby ocenić składniki molekularne, które przyczyniają się do fotoreakcji. Protokół ten określa konfigurację, która może być modyfikowana i wykorzystywana przez badaczy mających różne cele eksperymentalne.

Zazwyczaj ERG rejestruje się u larw zebrafish w 5 dpf, ponieważ liczne badania opublikowały zapisy ERG na tym etapie rozwoju9,16,20. Odpowiedzi larwalne mierzono w warunkach adaptacji do ciemności, bez oświetlenia tła, stosując 20 msec bodziec białego światła LED. Wykorzystano dostępny komercyjnie system ERG składający się ze stymulatora światła Ganzfelda oraz kontrolera/rejestratora komputerowego. Stymulator wykorzystuje ściśle kontrolowany, zastrzeżony system modulacji szerokości impulsu (PWM) do ...

Prezentujemy metodę analizy elektroretinograficznej (ERG) larw danio pręgowanego z wykorzystaniem technik mikromanipulacji i elektroretinografii. Jest to prosta i nieskomplikowana metoda oznaczania funkcji wzrokowych larw danio pręgowanego in vivo.

Elektroretinogram Analiza odpowiedzi wzrokowej u larw danio pręgowanego

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie kroków niezbędnych do przeprowadzenia analizy elektrograficznej larw rybek danao. Osiąga się to najpierw poprzez wykonanie mikropipet szklanych o odpowiednim kształcie i rozmiarze. Drugim krokiem jest staranne przygotowanie sprzętu kluczowego dla eksperymentu, takiego jak elektrody referencyjne i rejestrujące.Następnie larwa danio pręgowanego zostaje poddana znieczuleniu i odpowiednio zorientowana względem aparatury stymulującej i rejestrującej. Ostatnim krokiem jest prawidłowe umieszczenie szklanej mikroelektrody na rogówce larwy danio pręgowanego. Ostatecznie larwy danio pręgowanego.Analiza ERG jest przydatna do badania funkcji widzenia czopków w siatkówce kręgowców posiadających wyłącznie czopki in vivo. Metoda ta jest bardzo pomocna w udzielaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nauk o widzeniu, takie jak identyfikacja szlaków sygnalizacyjnych przyczyniających się do czułości wzrokowej i adaptacji do światła w czopkach. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ właściwe ustawienie mikroelektrody rejestrującej na preparacie jest trudne do opanowania ze względu na niewielki rozmiar oka larwy zebrafish.Aby rozpocząć tę procedurę, wyciągnij kilka mikro pipet z kapilar borokrzemianowych polerowanych ogniem za pomocą filamentu. Sprawdź każdą mikro pipetę pod mikroskopem z odpowiednią skalą pomiarową, aby upewnić się, że średnica końcówek wynosi od 10 do 15 µm i są one jednolite. W dniu eksperymentu przygotuj roztwór roboczy poprzez rozcieńczenie 10x roztworu Ringera do stężenia 1x.Przefiltruj roztwór przez filtr do odsolonej wody destylowanej i go wysterylizuj, aby upewnić się, że cząstki stałe nie zablokują końcówki mikropipety. Następnie napowietrzaj roztwór mieszaniną 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez 10 minut. Po tym czasie szczelnie zamknij naczynie, aby utrzymać natlenienie roztworu.Następnie na stole antywibracyjnym pod źródłem światła umieść ruchomą plastikową platformę z amortyzującą podstawą z wiskoelastycznego polimeru uretanowego. Dalej ustaw kamerę na magnetycznym statywie i skieruj ją na ruchomą plastikową platformę. Następnie umieść mikromanipulator rejestrującej mikroelektrody na drugim magnetycznym statywie.Upewnij się, że kamera i mikromanipulator nie są zakłócane przez ruch innego sprzętu oraz nie blokują oświetlenia z źródła światła. Następnie podłącz kamerę do monitora wideo i skieruj ją w stronę platformy. Upewnij się, że układ jest prawidłowo uziemiony za pomocą miedzianego przewodu.Na tym etapie za pomocą czystego ostrza brzytwy należy wyciąć z suchej gąbki PVA niewielki prostokąt, który będzie ściśle pasował do 35 milimetrowej szalki Petriego. W gąbce należy wykonać dodatnie nacięcie, aby pomieścić elektrodę odniesienia. Następnie za pomocą markera odpornego na chemikalia należy zaznaczyć na gąbce małą kropkę w miejscu, w którym zostanie umieszczona larwa.Następnie namocz gąbkę z PVA w roztworze Ringera aż do nasycenia. Wyjmij ją i szybko osusz dwa lub trzy razy na ręczniku papierowym przed umieszczeniem w czystej szalce Petriego o średnicy 35 milimetrów. Następnie ustaw szalkę Petriego z gąbką na plastikowej platformie w taki sposób, aby znacznik był widoczny dla kamery.Następnie należy przeprowadzić chlorkowanie elektrod, mocząc je w 6-9% roztworze chlorku sodu. Potem należy je osuszyć na powietrzu na chusteczce Kim wipe przez pięć minut. Umieść pellet srebra i chlorku srebra elektrody odniesienia w gąbce lub pod nią, w zależności od sposobu wykonanego cięcia, a następnie podłącz przewód elektrody odniesienia do systemu rejestrującego.Następnie do strzykawki o pojemności 5 ml bez gwintu Luer-Lock należy przymocować około 40 cm drenu i napełnić strzykawkę roztworem Ringera. Po tym czasie należy napełnić roztworem Ringera strzykawkę o pojemności 1 ml bez gwintu Luer-Lock. Za pomocą mikrodozownika należy ostrożnie napełnić uchwyt mikroelektrody, zapobiegając powstawaniu pęcherzyków powietrza.Następnie za pomocą mikro-wypełniaca i strzykawki o pojemności jednego mililitra wypełnionej roztworem Ringera podłącz strzykawkę pięciomililitrową do portu ciśnienia uchwytu mikroelektrody za pomocą rurki. Wypełnij szklaną mikropipetę od strony końcówki, upewniając się, że nie ma w niej pęcherzyków powietrza. Następnie zamocuj szklaną mikropipetę w uchwycie mikroelektrody, uważając, aby drut elektrody pozostał prosty.Po zabezpieczeniu użyj strzykawki o pojemności 5 ml, aby ostrożnie wprowadzić roztwór Ringera przez mikroelektrodę, aż na jej końcówce pojawi się niewielka ilość roztworu. Następnie ostrożnie umieść mikroelektrodę rejestrującą w mikromanipulatorze i podłącz przewód do systemu rejestrującego, aby sprawdzić poziom szumów systemowych. Umieść elektrodę referencyjną oraz końcówkę mikroelektrody rejestrującej w 35 mm szalce Petriego wypełnionej roztworem Ringera.Sprawdź poziom zakłóceń elektrycznych układu za pomocą oscyloskopu lub wbudowanej funkcji aparatu ERG. Poziom szumów nie powinien przekraczać plus lub minus 10 µV względem linii bazowej. W ramach tej procedury wytnij kilka kwadratów ręcznika papierowego o boku jednego centymetra, a następnie znieczul od trzech do pięciu larw w 35 mm płytce Petriego, dodając trica do stężenia końcowego 0,02% i odczekując jedną lub dwie minuty.Następnie ostrożnie przenieś pojedynczą larwę na kwadratowy kawałek ręcznika papierowego pod stereomikroskop sekcyjny przy minimalnym oświetleniu. Sprawdź ułożenie larwy i wybierz osobnika skierowanego grzbietem do góry z przysłoniętym okiem w przypadku sesji nagraniowych trwających powyżej 30 minut. Utrzymuj larwę w stanie wilgotnym, pokrywając ciało 3% metylocelulozą za pomocą cienkiego pędzla z włosia wielbłądziego.Następnie przenieś kwadrat ręcznika papierowego z larwą na wilgotną gąbkę z PVA. Następnie skieruj ciągły strumień wody nasyconej 100%tlenem na larwy, przepuszczając gaz przez kamień napowietrzający w kolbie z kolbką boczną zawierającej wodę destylowaną. Przy minimalnym oświetleniu ustaw rurkę doprowadzającą nawilżony tlen z bocznej części kolby w pobliżu głowy larwy.Użyj mikromanipulatora i kamery, aby ustawić końcówkę mikroelektrody w punkcie środkowym pomiędzy przednim a tylnym końcem oka, a następnie delikatnie dociśnij ją do górnej krawędzi rogówki. Pozostaw larwy w ciemności przez 5 do 10 minut w celu adaptacji. Następnie zarejestruj odpowiedzi na błysk testowy przy użyciu źródła światła LED lub stymulatora optycznego.Rysunek ten przedstawia typowy zapis ERG u larwy ryby zebra w piątym dniu po zapłodnieniu (DPF). Ryby zaadaptowane do ciemności poddano działaniu białego światła LED przez 20 milisekund, przy intensywnościach od 1 do 5 000 kandeli na metr kwadratowy, z początkiem bodźca świetlnego w zerowej sekundzie. Fala a o potencjale ujemnym jest trudna do rozróżnienia, podczas gdy fala b o potencjale dodatnim stanowi dominujący szczyt kształtu fali.Ten wstawka przedstawia uśrednione amplitudy odpowiedzi fali B, które zostały dopasowane przy użyciu równania Naka-Rushtona. Rycina przedstawia typowy zapis ERG w ciemnoadaptowanej larwie ryby zebra 5 DPF poddanej działaniu PB. Ryby są eksponowane na białe światło LED przez 20 milisekund przy natężeniach od 1 do 5 000 kandel na metr kwadratowy, a dominującym elementem kształtu fali jest izolowany potencjał receptorowy masy czopków. Ta wstawka pokazuje uśrednione amplitudy odpowiedzi larwy ryby zebra poddanej działaniu PB, które zostały dopasowane przy użyciu równania Naka-Rushtona.Rysunek ten przedstawia typowy zapis ERG u larwy zebrafish traktowanej D-P-F-A-P-B przez pięć dni. Zastosowano paradygmat podwójnego błysku. Ryby zaadaptowane do ciemności poddano kolejnym 20 milisekundowym błyskom białego światła.Dioda LED błyska z natężeniem 1000 kandel na metr kwadratowy, a ISI pomiędzy błyskami wynosi dwie sekundy. Tutaj zaznaczono moment rozpoczęcia każdego bodźca świetlnego. Rycina ta przedstawia stosunek maksymalnej odpowiedzi potencjału receptorowego masy izolowanych czopków dla drugiego bodźca do odpowiedzi dla bodźca początkowego przy zwiększającym się ISI, co wskazuje na postępujący powrót czułości fotoreceptorów.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że jakość rejestracji zależy od szczelności połączenia elektrody z rogówką oraz od stanu zdrowia larw. Opracowanie tej techniki znacznie zwiększyło możliwości badaczy w dziedzinie nauk o wzroku w zakresie analizy adaptacji i regeneracji czopków w siatkówce kręgowców in vivo.

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza elektroretinogramu odpowiedzi wzrokowej larw rybki labiryntowej

Opracowaliśmy metodę odpowiedzi wizualno-motorycznej (Visual-Motor Response), aby ilościowo określić reakcję motoryczną larw zebrafish w odpowiedzi na przyrosty i spadki natężenia światła. Zbadaliśmy również mutanty wzroku zebrafish, w tym mutanty z brakiem odpowiedzi optokinetycznej (nrc), które uznano za całkowicie niewidome podczas testowania za pomocą innego badania wzroku – odruchu optokinetycznego.

Test behawioralny do pomiaru reaktywności rybek zebrafish na zmiany natężenia światła

Reakcja optokinetyczna była szeroko stosowana do oceny funkcji wzrokowych larw danio prążkowanego. Niemniej jednak standardowy protokół dla ryb larwalnych nie jest jeszcze łatwo stosowalny u osobników dorosłych1-5. W niniejszej pracy przedstawiamy sposób pomiaru OKR u dorosłych danio prążkowanych z wykorzystaniem nowego protokołu opracowanego w naszym laboratorium.

Wykorzystanie odpowiedzi optokinetycznej do badania funkcji wzrokowych u rybek danio

VisioTracker to zautomatyzowany system do ilościowej analizy sprawności wzrokowej larw i niewielkich osobników dorosłych ryb, oparty na rejestracji ruchów gałek ocznych. Charakteryzuje się on pełną kontrolą nad właściwościami bodźców wzrokowych oraz analizą w czasie rzeczywistym, co umożliwia prowadzenie wysokoprzepustowych badań w takich dziedzinach jak rozwój i funkcje układu wzrokowego, farmakologia, badania obwodów neuronalnych oraz integracja sensoromotoryczna.

VisioTracker, innowacyjne zautomatyzowane podejście do analizy okulomotorycznej

Ten film opisuje test reakcji fotomotorycznej larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego. Protokół mierzy reakcję behawioralną larw ryb po nagłej zmianie warunków oświetleniowych.

Test odpowiedzi fotomotorycznej: metoda pomiaru reakcji behawioralnej larw danio pręgowanego na nagłą zmianę warunków oświetleniowych

Ten film opisuje test odpowiedzi optokinetycznej u danio pręgowanego. Film mierzy odruchowe ruchy gałek ocznych w oparciu o bodźce wzrokowe poruszające się i określa ostrość wzroku u danio pręgowanego.

Test odpowiedzi optokinetycznej: metoda pomiaru ostrości wzroku u danio pręgowanego

Ten film demonstruje metodę badania wizualnego wykrywania zdobyczy u transgenicznych larw danio pręgowanego za pomocą obrazowania fluorescencyjnego opartego na wskaźniku wapnia z ich neuronami wyrażającymi fluorescencyjne kompleksy wskaźnikowe wapnia.

Analiza aktywności neuronalnej wywołanej przez zdobycz w transgenicznej larwie danio pręgowanego

Danio pręgowany były cennym narzędziem w wielu obszarach badawczych. Tutaj demonstrujemy metodę wywoływania reakcji wzrokowej i obliczania funkcjonalnej ostrości wzroku u dorosłego danio pręgowanego.

Odpowiedź optokinetyczna jako ilościowa miara ostrości wzroku u danio pręgowanego

Wprowadzamy skuteczną metodę wstecznego oznaczania komórek zwojowych siatkówki (RGC) u dorosłych ryb pręgowanych.

Wsteczne znakowanie komórek zwojowych siatkówki u dorosłych danio pręgowanego za pomocą barwników fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki epilepsji u danio pręgowanego, wynikającej z przejściowego zahamowania genu DEPDC5.

Analiza behawioralna i fizjologiczna w modelu padaczki danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół, który upraszcza pomiar odpowiedzi elektroretinogramu wywołanego światłem od larw danio pręgowanego. Nowatorska elektroda w kształcie stożka z końcówką gąbki może pomóc w łatwiejszym do osiągnięcia badaniu rozwoju wzrokowego u larw danio pręgowanego za pomocą elektroretinogramu ERG, zapewniając wiarygodne wyniki i obniżając koszty.

Zapis elektroretinogramu u larw danio pręgowanego przy użyciu nowatorskiej elektrody gąbczastej w kształcie stożka

Artykuł wyjaśnia, jak chirurgicznie usunąć oczy z żywych larw danio pręgowanego, co jest pierwszym krokiem w kierunku zbadania, jak wejście siatkówki wpływa na wzrost i rozwój tektum nerwu wzrokowego. Ponadto artykuł zawiera informacje na temat znieczulenia, fiksacji i preparacji larw, a następnie immunohistochemii i obrazowania konfokalnego.

Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

Poznaj metodę elektroretinografii u larw Danio rerio do badania funkcji wzrokowej w neurobiologii. Technika mikromanipulacji umożliwia precyzyjne pomiary odpowiedzi siatkówki in vivo.

Elektroretinogram Analiza odpowiedzi wzrokowej u larw danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów