Elektroretinogram Analiza odpowiedzi wzrokowej u larw danio pręgowanego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie kroków niezbędnych do przeprowadzenia analizy elektrograficznej larw rybek danao. Osiąga się to najpierw poprzez wykonanie mikropipet szklanych o odpowiednim kształcie i rozmiarze. Drugim krokiem jest staranne przygotowanie sprzętu kluczowego dla eksperymentu, takiego jak elektrody referencyjne i rejestrujące.

Następnie larwa danio pręgowanego zostaje poddana znieczuleniu i odpowiednio zorientowana względem aparatury stymulującej i rejestrującej. Ostatnim krokiem jest prawidłowe umieszczenie szklanej mikroelektrody na rogówce larwy danio pręgowanego. Ostatecznie larwy danio pręgowanego.

Analiza ERG jest przydatna do badania funkcji widzenia czopków w siatkówce kręgowców posiadających wyłącznie czopki in vivo. Metoda ta jest bardzo pomocna w udzielaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nauk o widzeniu, takie jak identyfikacja szlaków sygnalizacyjnych przyczyniających się do czułości wzrokowej i adaptacji do światła w czopkach. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ właściwe ustawienie mikroelektrody rejestrującej na preparacie jest trudne do opanowania ze względu na niewielki rozmiar oka larwy zebrafish.

Aby rozpocząć tę procedurę, wyciągnij kilka mikro pipet z kapilar borokrzemianowych polerowanych ogniem za pomocą filamentu. Sprawdź każdą mikro pipetę pod mikroskopem z odpowiednią skalą pomiarową, aby upewnić się, że średnica końcówek wynosi od 10 do 15 µm i są one jednolite. W dniu eksperymentu przygotuj roztwór roboczy poprzez rozcieńczenie 10x roztworu Ringera do stężenia 1x.

Przefiltruj roztwór przez filtr do odsolonej wody destylowanej i go wysterylizuj, aby upewnić się, że cząstki stałe nie zablokują końcówki mikropipety. Następnie napowietrzaj roztwór mieszaniną 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez 10 minut. Po tym czasie szczelnie zamknij naczynie, aby utrzymać natlenienie roztworu.

Następnie na stole antywibracyjnym pod źródłem światła umieść ruchomą plastikową platformę z amortyzującą podstawą z wiskoelastycznego polimeru uretanowego. Dalej ustaw kamerę na magnetycznym statywie i skieruj ją na ruchomą plastikową platformę. Następnie umieść mikromanipulator rejestrującej mikroelektrody na drugim magnetycznym statywie.

Upewnij się, że kamera i mikromanipulator nie są zakłócane przez ruch innego sprzętu oraz nie blokują oświetlenia z źródła światła. Następnie podłącz kamerę do monitora wideo i skieruj ją w stronę platformy. Upewnij się, że układ jest prawidłowo uziemiony za pomocą miedzianego przewodu.

Na tym etapie za pomocą czystego ostrza brzytwy należy wyciąć z suchej gąbki PVA niewielki prostokąt, który będzie ściśle pasował do 35 milimetrowej szalki Petriego. W gąbce należy wykonać dodatnie nacięcie, aby pomieścić elektrodę odniesienia. Następnie za pomocą markera odpornego na chemikalia należy zaznaczyć na gąbce małą kropkę w miejscu, w którym zostanie umieszczona larwa.

Następnie namocz gąbkę z PVA w roztworze Ringera aż do nasycenia. Wyjmij ją i szybko osusz dwa lub trzy razy na ręczniku papierowym przed umieszczeniem w czystej szalce Petriego o średnicy 35 milimetrów. Następnie ustaw szalkę Petriego z gąbką na plastikowej platformie w taki sposób, aby znacznik był widoczny dla kamery.

Następnie należy przeprowadzić chlorkowanie elektrod, mocząc je w 6-9% roztworze chlorku sodu. Potem należy je osuszyć na powietrzu na chusteczce Kim wipe przez pięć minut. Umieść pellet srebra i chlorku srebra elektrody odniesienia w gąbce lub pod nią, w zależności od sposobu wykonanego cięcia, a następnie podłącz przewód elektrody odniesienia do systemu rejestrującego.

Następnie do strzykawki o pojemności 5 ml bez gwintu Luer-Lock należy przymocować około 40 cm drenu i napełnić strzykawkę roztworem Ringera. Po tym czasie należy napełnić roztworem Ringera strzykawkę o pojemności 1 ml bez gwintu Luer-Lock. Za pomocą mikrodozownika należy ostrożnie napełnić uchwyt mikroelektrody, zapobiegając powstawaniu pęcherzyków powietrza.

Następnie za pomocą mikro-wypełniaca i strzykawki o pojemności jednego mililitra wypełnionej roztworem Ringera podłącz strzykawkę pięciomililitrową do portu ciśnienia uchwytu mikroelektrody za pomocą rurki. Wypełnij szklaną mikropipetę od strony końcówki, upewniając się, że nie ma w niej pęcherzyków powietrza. Następnie zamocuj szklaną mikropipetę w uchwycie mikroelektrody, uważając, aby drut elektrody pozostał prosty.

Po zabezpieczeniu użyj strzykawki o pojemności 5 ml, aby ostrożnie wprowadzić roztwór Ringera przez mikroelektrodę, aż na jej końcówce pojawi się niewielka ilość roztworu. Następnie ostrożnie umieść mikroelektrodę rejestrującą w mikromanipulatorze i podłącz przewód do systemu rejestrującego, aby sprawdzić poziom szumów systemowych. Umieść elektrodę referencyjną oraz końcówkę mikroelektrody rejestrującej w 35 mm szalce Petriego wypełnionej roztworem Ringera.

Sprawdź poziom zakłóceń elektrycznych układu za pomocą oscyloskopu lub wbudowanej funkcji aparatu ERG. Poziom szumów nie powinien przekraczać plus lub minus 10 µV względem linii bazowej. W ramach tej procedury wytnij kilka kwadratów ręcznika papierowego o boku jednego centymetra, a następnie znieczul od trzech do pięciu larw w 35 mm płytce Petriego, dodając trica do stężenia końcowego 0,02% i odczekując jedną lub dwie minuty.

Następnie ostrożnie przenieś pojedynczą larwę na kwadratowy kawałek ręcznika papierowego pod stereomikroskop sekcyjny przy minimalnym oświetleniu. Sprawdź ułożenie larwy i wybierz osobnika skierowanego grzbietem do góry z przysłoniętym okiem w przypadku sesji nagraniowych trwających powyżej 30 minut. Utrzymuj larwę w stanie wilgotnym, pokrywając ciało 3% metylocelulozą za pomocą cienkiego pędzla z włosia wielbłądziego.

Następnie przenieś kwadrat ręcznika papierowego z larwą na wilgotną gąbkę z PVA. Następnie skieruj ciągły strumień wody nasyconej 100%tlenem na larwy, przepuszczając gaz przez kamień napowietrzający w kolbie z kolbką boczną zawierającej wodę destylowaną. Przy minimalnym oświetleniu ustaw rurkę doprowadzającą nawilżony tlen z bocznej części kolby w pobliżu głowy larwy.

Użyj mikromanipulatora i kamery, aby ustawić końcówkę mikroelektrody w punkcie środkowym pomiędzy przednim a tylnym końcem oka, a następnie delikatnie dociśnij ją do górnej krawędzi rogówki. Pozostaw larwy w ciemności przez 5 do 10 minut w celu adaptacji. Następnie zarejestruj odpowiedzi na błysk testowy przy użyciu źródła światła LED lub stymulatora optycznego.

Rysunek ten przedstawia typowy zapis ERG u larwy ryby zebra w piątym dniu po zapłodnieniu (DPF). Ryby zaadaptowane do ciemności poddano działaniu białego światła LED przez 20 milisekund, przy intensywnościach od 1 do 5 000 kandeli na metr kwadratowy, z początkiem bodźca świetlnego w zerowej sekundzie. Fala a o potencjale ujemnym jest trudna do rozróżnienia, podczas gdy fala b o potencjale dodatnim stanowi dominujący szczyt kształtu fali.

Ten wstawka przedstawia uśrednione amplitudy odpowiedzi fali B, które zostały dopasowane przy użyciu równania Naka-Rushtona. Rycina przedstawia typowy zapis ERG w ciemnoadaptowanej larwie ryby zebra 5 DPF poddanej działaniu PB. Ryby są eksponowane na białe światło LED przez 20 milisekund przy natężeniach od 1 do 5 000 kandel na metr kwadratowy, a dominującym elementem kształtu fali jest izolowany potencjał receptorowy masy czopków. Ta wstawka pokazuje uśrednione amplitudy odpowiedzi larwy ryby zebra poddanej działaniu PB, które zostały dopasowane przy użyciu równania Naka-Rushtona.

Rysunek ten przedstawia typowy zapis ERG u larwy zebrafish traktowanej D-P-F-A-P-B przez pięć dni. Zastosowano paradygmat podwójnego błysku. Ryby zaadaptowane do ciemności poddano kolejnym 20 milisekundowym błyskom białego światła.

Dioda LED błyska z natężeniem 1000 kandel na metr kwadratowy, a ISI pomiędzy błyskami wynosi dwie sekundy. Tutaj zaznaczono moment rozpoczęcia każdego bodźca świetlnego. Rycina ta przedstawia stosunek maksymalnej odpowiedzi potencjału receptorowego masy izolowanych czopków dla drugiego bodźca do odpowiedzi dla bodźca początkowego przy zwiększającym się ISI, co wskazuje na postępujący powrót czułości fotoreceptorów.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że jakość rejestracji zależy od szczelności połączenia elektrody z rogówką oraz od stanu zdrowia larw. Opracowanie tej techniki znacznie zwiększyło możliwości badaczy w dziedzinie nauk o wzroku w zakresie analizy adaptacji i regeneracji czopków w siatkówce kręgowców in vivo.