Model spoczynku in vitro wrażliwego na estrogeny raka piersi w szpiku kostnym: narzędzie do badań mechanizmów molekularnych i generowania hipotez

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zastosowanie tego modelu uśpienia in vitro do badania mechanizmów molekularnych i komórkowych oraz sformułowania hipotez do testowania w bardziej złożonych biologicznie modelach in vivo. Cel ten osiąga się poprzez hodowlę komórek raka piersi z dodatnim markerem estrogenowym na płytkach hodowli tkankowej z kodowaną fibryną przy niskiej gęstości, gdzie ich interakcje zachodzą głównie z podłożem, a nie między sobą. W drugim kroku, w niektórych komórkach z dodatnim markerem estrogenowym aktywuje się stan uśpienia, który jest wspierany i utrzymywany przez FGF two oraz fibronektynę, co reprezentuje komórki raka piersi w szpiku kostnym.

Następnie system poddaje się perturbacjom poprzez dodanie przeciwciał, inhibitorów, peptydów lub kwasów nukleinowych, aby zaburzyć różne aspekty fenotypowe i molekularne komórek uśpionych oraz określić ich rolę w utrzymaniu stanu uśpienia. Wyniki pokazują liczbę i wygląd kolonii rosnących oraz uśpionych, które powstały w wyniku potraktowania inkubowanych komórek FGF2 na płytkach pokrytych fibronektyną. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytanie, które szlaki sygnalizacyjne, cząsteczki adhezyjne lub inne specyficzne mechanizmy molekularne są odpowiedzialne za rozwój i utrzymanie uśpienia w estrogenowo zależnych komórkach raka piersi zlokalizowanych w mikrośrodowisku szpiku kostnego.

W celu rozpoczęcia należy odprowadzić pożywkę hodowlaną z płytek, na których siedem linii komórkowych CF osiągnęło około 50% konfluencji, a następnie przemyć je podgrzanym wcześniej PBS. Następnie należy dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny z EDTA rozpuszczonego w pożywce DMEM z wysoką zawartością glukozy, bez dodatku płodowej surowicy bydlęcej. Płytki należy inkubować przez 1 do 4 minut w temperaturze 37°C, aż komórki zaczną się odrywać.

Gdy komórki odkleją się od płytki i zaczną tworzyć zawiesinę pojedynczych komórek, rozbij pozostałe skupiska komórkowe, pipetując zawiesinę kilka razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności dwóch mililitrów. Jeśli po czterech minutach działania trypsyny nadal występują skupiska komórkowe, należy usunąć komórki i przygotować nową hodowlę; komórki, które pozostają przyległe do siebie po czterech minutach, prawdopodobnie wprowadzą błąd podczas liczenia liczby kolonii. Odwiruj komórki poddane działaniu trypsyny i resuspenduj je w pożywce hodowlanej w stężeniu 1 500 komórek na mililitr. Użyj pipety o pojemności pięciu mililitrów, aby wymieszać zawiesinę komórkową, delikatnie pipetując ją w górę i w dół, a następnie policz komórki i sprawdź za pomocą automatycznego licznika komórek, czy zawiesina składa się głównie z pojedynczych komórek.

Można to również przeprowadzić ręcznie, używając komory licznej pod mikroskopem fazowym. Następnie należy pobrać trzy mililitry zawiesiny komórkowej i dozować po jednym mililitrze do dwóch studni płytki 24-dołkowej pokrytej fibronektyną, wykonując to sekwencyjnie. Aby zoptymalizować rozmieszczenie przestrzenne komórek, należy pipetować zawiesinę do środka studni i nie przesuwać płytki, dopóki komórki nie opadną i nie przywrą do powierzchni.

Pozostałą zawiesinę komórkową należy przenieść z powrotem do głównej mieszaniny komórek, a następnie ponownie wymieszać komórki przed pobraniem kolejnych trzech mililitrów. Procedura ta pozwoli zmniejszyć zmienność liczby komórek, ponieważ komórki nieustannie opadają na dno probówki, a praca z pipetą pozwala szybko rozdzielić duże objętości komórek; pozostawienie komórek w zawiesinie w temperaturze pokojowej i przy obecnej stężeniu CO2 mogłoby zmodyfikować ich potencjał kongeniczny. Komórki należy inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Dzień ten uznaje się za dzień minus jeden.

W harmonogramie eksperymentu. W dniu zerowym testu należy wymienić medium na 1 ml świeżego medium lub świeżego medium zawierającego 10 ng/ml czynnika wzrostu fibroblastów 2. Mała liczba komórek w dołku po sześciu dniach nie wpłynie znacząco na skład składników odżywczych ani cytokin, ani na pH pierwotnego medium.

W trzecim dniu dodaj 100 µL roztworu zawierającego 10-krotne docelowe stężenie czynnika zaburzającego, takiego jak inhibitor kinazy PI3K, LY 2 9 4 0 0 2, kontrolę negatywną LY 3 0 3 5 1 1 lub kontrolę pożywkową, do 1 mL pożywki znajdującej się już w studniach i pozwól roztworom zmieszać się drogą dyfuzji. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na kolejne trzy dni. W szóstym dniu rozpuść 0,1% fioletu krystalicznego w roztworze 2% etanolu i 10 mM boranu sodu.

Przy pH 9 odessać pożywkę z dołków, a następnie dodać 1 ml roztworu fioletu krystalicznego do każdego dołka na 20 minut. Przygotować stację płukania, umieszczając wiadro z lodem w zlewie i doprowadzając do niego ciągły strumień wody; myć płytki, zanurzając je w wodzie tak, aby otwory dołków były skierowane w dół pod ostrym kątem w stronę wiadra. Po zanurzeniu przechylić płytkę do poziomu, tak aby otwory dołków były skierowane w dół.

Następnie ponownie przechyl płytkę pod ostrym kątem i wyjmij ją jednym, łagodnym, płynnym ruchem. Powtórz zanurzanie dwa lub trzy razy, aż woda na dnie studzienek przestanie być niebieska. Następnie odwróć płytki do góry dnem i połóż je na ręcznikach na blacie laboratoryjnym do wyschnięcia przez noc.

Po wyschnięciu umieść płytkę pod odwróconym mikroskopem fazokontrastowym i policz liczbę kolonii rosnących oraz uśpionych w każdej studzience. Przy powiększeniu 40x uznaj kolonie liczące powyżej 30 komórek za rosnące, a kolonie liczące 12 lub mniej komórek za uśpione. Poniżej przedstawiono typowy wygląd kolonii rosnącej i uśpionej.

Kolonie rosnące zawierają więcej niż 30 komórek, natomiast kolonie uśpione zawierają 12 lub mniej komórek, które są wielokrotnie większe od komórek rosnących, z dużym stosunkiem objętości cytoplazmy do jądra, przy braku dodatku FGF two do hodowli. Kolonie są reprezentowane głównie przez klony rosnące. Podczas gdy w obecności FGF two ogromna większość klonów pozostaje uśpiona, system ten pozwala również na ocenę wpływu dodatkowych czynników. W niniejszym przypadku w trzecim dniu testu Congenic do studni dodano dwa czynniki zaburzające w wcześniej określonych stężeniach.

Rycina przedstawia preferencyjne hamowanie klonów uśpionych przez inhibitor kinazy PI3K LY 2 9 4 0 2, przy jednoczesnym braku efektu w przypadku kontroli negatywnej LY 3 0 3 511. Eksperymenty te mogą pomóc w zrozumieniu czynników sterujących stanem uśpienia oraz opornością na terapię. W tym przypadku przeżyjące uśpione komórki poddane działaniu inhibitora kinazy PI3K utraciły swój rozległy wygląd, stały się małymi komórkami dendrytycznymi i sprawiały wrażenie uszkodzonych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak ustanowić ten test kongeniczny do hodowli komórek w stanie uśpienia, jak wprowadzać zaburzenia w komórkach poprzez dodawanie specyficznych inhibitorów lub czynników zaburzających po ustanowieniu stanu uśpienia oraz jak ilościowo ocenić efekt działania tych czynników. Test ten może być wykorzystany do oceny wyników ilościowych i jakościowych poprzez liczenie kolonii uśpionych lub pomiar dowolnej liczby zdarzeń ultrastrukturalnych, immunofenotypowych lub molekularnych w komórkach uśpionych i poddanych działaniu czynników zaburzających. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.