Kwantyfikacja ochrony nerwowo-naczyniowej po powtarzającym się kondycjonowaniu wstępnym hipoksyjnym i przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ilościowe określenie neuroprotekcji po powtarzalnym prekondycjonowaniu hipoksją (RHP) poprzez jednoczesny pomiar objętości zawału oraz integralności bariery krew-mózg. Osiąga się to poprzez poddanie myszy dziewięciu stochastycznym ekspozycjom na hipoksję, zróżnicowanym pod względem czasu trwania i intensywności, aby zapewnić ochronę naczyniowo-nerwową przed udarem. Następnie u myszy indukuje się udar, po czym wykonuje się wstrzyknięcie błękitu Evansa.

Błękit Evansa selektywnie wiąże albuminę, co pozwala na ilościowe określenie stopnia przerwania bariery krew-mózg po uśpieniu zwierzęcia po wstrzyknięciu preparatu. Mózg zostaje wyjęty i zabarwiony TTC w celu określenia objętości zawału. Wyniki wykazują działanie neuroprotekcyjne powtarzalnego prekondycjonowania hipoksją u myszy po udarze niedokrwiennym.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak jednorazowe warunkowanie hipoksyjne, jest fakt, że RHP zapewnia neuroprotekcję u myszy przez co najmniej osiem tygodni. Ta podwójna metoda ilościowa pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad udarem, takie jak jednoczesny pomiar objętości zawału oraz stopnia przerwania bariery krew-mózg. Choć metoda ta może dostarczać istotnych informacji na temat udaru niedokrwiennego, RHP można zastosować również w innych stanach zapalnych o podłożu systemowym oraz w chorobach ośrodkowego układu nerwowego. W celu rozpoczęcia należy podzielić myszy na dwie grupy.

Grupa RHP, poddawana ekspozycji na 8% i 11% tlenu, oraz grupa kontrolna, poddawana jednoczesnej ekspozycji na 21% tlenu, usuwają górną pokrywę filtra z każdej klatki, a następnie umieszczają klatki wraz z nienaruszonymi butelkami z jedzeniem i wodą w komorach podłączonych do odpowiednich zbiorników z tlenem. Należy zamknąć i zabezpieczyć pokrywę komory. Otwórz główny zawór gazowy zbiorników i ustaw początkowy przepływ dla każdej komory indukcyjnej na dwa litry na minutę lub LPM.

Po pięciu minutach ekspozycji zmniejszyć szybkość przepływu do 1 LPM na pozostały czas ekspozycji. Po zakończeniu ekspozycji zmniejszyć przepływ do 0 LPM i zamknąć zawór gazowy. W przypadku zbiorników.

Otwórz pokrywy komór i załóż pokrywy z filtrem na każdą klatkę. Umieść klatki w standardowych warunkach utrzymania do następnej ekspozycji na hipoksję. Po każdym użyciu spryskaj każdą komorę indukcyjną środkiem dezynfekującym i odświeżaczem.

Poddawaj myszy RHP oraz myszy kontrolne działaniu czynnika w tej samej porze dnia w ciągu dwóch tygodni trwania protokołu. Następnie wykonaj przejściowe zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej (A-T-M-C-A-O), zgodnie z opisem w tekście. Wstrzyknięcie EB należy przeprowadzić 22 godziny po reperfuzji; barwnik powinien krążyć w krwiobiegu przez dwie godziny przed uśmierceniem zwierząt i barwieniem NTTC.

Przygotować ilość EB niezbędną do iniekcji. Następnie pobrać do strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 cc odpowiednią ilość roztworu w temperaturze pokojowej. Używając igły o rozmiarze 29 G, unieruchomić mysz w ograniczniku z płaskim dnem.

Przytrzymaj ogon tak, aby żyła boczna znajdowała się u góry. Żyły boczne są zlokalizowane po obu stronach linii środkowej ogona. Przytrzymaj końcówkę ogona, aby unieruchomić mysz na czas iniekcji.

Wprowadź igłę do żyły na głębokość około trzech do pięciu milimetrów. Ostrożnie, aby nie przebić żyły, wstrzyknij cały barwnik w ciągu jednej minuty. Jeśli roztwór dostaje się do żyły, opór podczas naciskania tłoka strzykawki powinien być minimalny.

Potwierdź prawidłowe systemowe podanie EB do żyły poprzez natychmiastową zmianę koloru kończyn ogona oraz oczu myszy. Wyjmij igłę z ogona i delikatnie dociśnij miejsce wkłucia czystą gazą, aby zatrzymać krwawienie. Rozpocznij pomiar czasu.

Gdy skóra myszy zmieni kolor na niebieski, należy pozwolić na krążenie EB przez dwie godziny, aby substancja ta mogła przeniknąć przez osłabioną barierę krew-mózg. Perfuzję i barwienie TTC należy przeprowadzić 24 godziny po reperfuzji, czyli 24 godziny po T-M-C-A-O oraz dwie godziny po podaniu EB; zwierzę należy uśmiercić poprzez przedawkowanie izofluranu w małej komorze indukcyjnej. Perfuzję należy rozpocząć niezwłocznie po uśmierceniu, aby zminimalizować autolizę, która rozpoczyna się w wyniku braku tlenu po śmierci.

Szybko unieruchom zwierzę na styropianowej platformie, przypinając przedramiona przez łapy. Wykonaj boczne nacięcie ściany brzusznej od linii środkowej, tuż poniżej klatki piersiowej. Ostrożnie przetnij przeponę, aby odsłonić serce.

Uruchom pompę perfuzyjną z prędkością przepływu 5 ml/min, używając strzykawki 60 cc wypełnionej lodowatym 0,01 M roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) podłączonej do motylkowej igły o rozmiarze 27G. Wprowadź końcówkę igły na głębokość około 0,5 cm do lewej komory serca i przetnij prawy przedsionek. Podczas perfuzji z przedsionka powinna wypływać krew żylna o stopniowo zmniejszającym się stężeniu, aż stanie się ona bezbarwna. Przeprowadź perfuzję transkardiakalną 30 ml 0,01 M PBS przez serce.

Następnie do 20 przezroczystych butelek do scyntylacji należy dodać pięć mililitrów roztworu TTC. Bezpośrednio po perfuzji zwierzęta należy odciąć od tułowia, a mózgi wypreparować za pomocą małych nożyczek i w razie potrzeby szpatułki. Należy sprawdzić, czy półkula przeciwległa do zamkniętej tętnicy środkowej mózgu jest blada, bez widocznego wycieku EB lub obrzęku.

Następnie wlej PBS do akrylowej matrycy do mózgu, przeznaczonej do wykonywania koronalnych przekrojów mózgu myszy o grubości 1,0 mm. Umieść mózg w matrycy stroną grzbietową do góry i natychmiast zalej go PBS. Utrzymuj mózg w stanie wilgotnym.

Usunąć opłaty węchowe, wsuwając stalową ostrze o grubości 0,21 mm do drugiego otworu od strony rostralnej matrycy. Następnie usunąć móżdżek, wsuwając ostrze do czwartego otworu od strony caudalnej matrycy. Wsunąć ostrze do środkowego z pozostałych otworów w matrycy.

Następnie wstaw pozostałe ostrza, dzieląc równomiernie pozostałą tkankę, aby zapewnić jak najbardziej jednorodny rozkład tkanki podczas krojenia. Po wstawieniu wszystkich ostrzy dodaj jedną lub dwie krople PBS na mózg, aby go nawilżyć. Następnie wyjmij ostrza z matrycy pojedynczo, zaczynając od regionu rostralnego.

Zachowaj pierwsze siedem przekrojów do analizy TTC. Po wykonaniu T-M-C-A-O, użyj małej szpachelki, aby ostrożnie przenieść przekroje z ostrza do fiolki wypełnionej TTC. Gdy wszystkie sekcje znajdą się w fiolce, zakręć ją i umieść w ciepłej łaźni wodnej, aż sekcje zabarwią się na różowo.

W razie potrzeby delikatnie obracaj butelkę w kąpieli, aby uniknąć nakładania się przekrojów, co mogłoby doprowadzić do nierównomiernego barwienia. Następnie usunąć TTC i wlać do fiolki 4% roztwór paraformaldehydu, aby pokryć przekroje mózgu. Czynność ta kończy reakcję chemiczną TTC.

Bezzwłocznie ułóż przekroje na czystym szkiełku przedmiotowym o wymiarach 1x3 cale, orientując je od strony rostralnej do ogonowej. Zeskanuj preparat. Używając standardowego skanera, ustaw rozdzielczość na minimum 600 DPI w celu przeprowadzenia analizy obrazu.

Należy upewnić się, że na zeskanowanym obrazie znajduje się nazwa zwierzęcia oraz linijka metryczna. Na koniec należy odwrócić preparat i zeskanować jego tylną stronę, aby upewnić się, że wszystkie dane zostały zebrane. RHP redukuje objętość zawału o 46% w porównaniu z myszami kontrolnymi, ale nie wpływa na obrzęk półkuli mózgu w oparciu o dane z badania TTC u tych samych zwierząt.

RHP zmniejsza przerwanie bariery krew-mózg, definiowane jako wyciek błękitu Ewansa znormalizowany względem przeciwległej półkuli; przedstawiono reprezentatywne barwienia TTC z grupy traktowanej RHP oraz grupy kontrolnej wystawionej na działanie 21% tlenu. Poniżej każdej próbki podano odpowiadające jej objętości zawału oraz wyciek błękitu Ewansa. Strona ipsilateralna to niedokrwienna półkula mózgu, a contralateralna to nieuszkodzona strona mózgu.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wstrzyknięciu błękitu Evansa 22 godziny po fuzji i pozostawieniu go w krwiobiegu przez dwie godziny przed uśmierceniem zwierzęcia po rozwoju zmian. Technika ta otworzyła przed badaczami w dziedzinie przedklinicznych badań nad udarem możliwość eksploracji mechanizmów endogennej ochrony przed udarem u myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne zrozumienie sposobu pomiaru efektu neuroprotekcyjnego RHP poprzez podwójną kwantyfikację integralności bariery krew-mózg oraz objętości ognisk zawałowych.