Niedrogi, skalowalny test behawioralny do pomiaru wrażliwości i szybkiej tolerancji sedacji etanolem u Drosophila
15 kwietnia 2015
Proste testy do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u Drosophila ułatwiają wykorzystanie tego organizmu modelowego do badania tych ważnych zachowań związanych z etanolem. W tym miejscu opisano stosunkowo prosty, skalowalny test do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u much.
Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ocena wrażliwości muszek owocówek na sedację etanolem. Osiąga się to poprzez umieszczenie muszek w fiolkach i poddanie ich działaniu par etanolu. Drugim krokiem jest określenie liczby muszek w stanie sedacji w każdej fiolce w regularnych odstępach czasu, aż do momentu, gdy wszystkie muszki zostaną uśpione.
Następnie dokonuje się interpolacji punktu czasowego. Gdy 50% much w każdej fiolce zostanie uśpionych, wyniki wskażą indeks czasu wymaganego do uśpienia muszek owocowych za pomocą etanolu; dzisiejszy przebieg tej procedury zaprezentuje Simran Sindu, studentka w moim laboratorium. Aby rozpocząć eksperyment, należy zebrać muchy do świeżych fiolek z pożywką w grupach po 11 osobników tej samej płci, stosując CO2 przez maksymalnie pięć minut, a następnie pozostawić muchy do regeneracji na noc w fiolkach z pożywką w pomieszczeniu o kontrolowanych warunkach środowiskowych.
Przygotuj roztwór etanolu poprzez rozcieńczenie czystego 100% etanolu w wodzie oczyszczonej do końcowego stężenia 85%. Pozostaw roztwór w temperaturze pokojowej przez noc przed przeprowadzeniem testu. Przygotuj czystą, pustą fiolkę do żywności, która będzie służyć jako fiolka testowa. Przygotuj nowy korek z octanu celulozy, zatyczkę silikonową oraz jeden mililitr roztworu etanolu dla każdej fiolki z muchami przeznaczonych do badania. Ustaw temperaturę w pomieszczeniu na 20 do 25 °C oraz wilgotność względną na 55 do 65%. Wyznacz innego pracownika do przypisania unikalnego kodu każdej grupie fiolek i zapisz kod do późniejszego wykorzystania. Umieść zakodowane fiolki z muchami w pomieszczeniu testowym w celu aklimatyzacji przez kilka minut. Następnie opisz puste fiolki testowe zgodnie z kodami na fiolkach z muchami.
Stwórz papierowy dziennik testów, wpisując kody do kolumn w arkuszu kalkulacyjnym, tak aby jedna kolumna odpowiadała jednej fiolce. Korzystając z dziennika testów jako wskazówki, ustaw zakodowane fiolki z pożywką i muchami oraz puste fiolki testowe w dopasowanych układach w pomieszczeniu testowym, a następnie przenosząc muchy z fiolek z pożywką do odpowiadających im i oznakowanych fiolek testowych, jedna po drugiej.
Następnie niezwłocznie włóż korki z octanu celulozy do probówek testowych, tak aby korki z octanu celulozy znajdowały się dwa centymetry poniżej górnej krawędzi probówek. W celu oceny w punkcie czasowym zero chwyć każdą probówkę pojedynczo za pomocą kciuka i palca wskazującego.
Delikatnie uderz trzy razy w stół, aby zbić muchy na dno fiolki. Odczekaj 30 sekund i policz liczbę much unieruchomionych i/lub martwych. Zapisz liczbę unieruchomionych martwych much dla każdej fiolki w danym czasie.
Zero minut w papierowym dzienniku testowym. Uruchomić stoper w czasie zero i natychmiast dodać 1 mL etanolu do octanu celulozy. Mieszać kolistymi ruchami w odstępach pięciosekundowych dla pierwszego zestawu czterech probówek zgodnie z kolejnością.
Zostaną one przetestowane po dodaniu etanolu do wszystkich czterech probówek testowych w zestawie. Włóż silikonowy korek do każdej probówki, aby ją zamknąć po 1, 2, 3, 4 i pięciu minutach. Dodaj jeden mililitr etanolu odpowiednio do drugiego, trzeciego, czwartego, piątego i szóstego zestawu czterech probówek.
Kontynuuj wkładanie silikonowych korków po dodaniu etanolu do każdego zestawu czterech fiolek LS w szóstej minucie. Przetestuj pierwszy zestaw czterech fiolek, chwytając każdą fiolkę kciukiem i palcem wskazującym i delikatnie stukając trzy razy o stół, aby zbić muchy na dno fiolki. Odczekaj 30 sekund, a następnie policz i zapisz całkowitą liczbę much, które zostały uspokojone.
Muchy uznaje się za uspokojone, jeśli: po pierwsze, stoją na dnie fiolki, ale się nie poruszają, lub po drugie, leżą na grzbietach, z trzepoczącymi lub nieruchomymi skrzydłami. Każdą fiolkę z zestawu należy obsłużyć w odstępach pięciosekundowych zgodnie z następującym harmonogramem czasowym: 7, 8, 9, 10 i 11 minuta.
Przetestuj kolejno drugą, trzecią, czwartą, piątą i szóstą serię fiolek w ten sam sposób, w jaki zrobiono to dla pierwszej serii w 12. minucie. Ponownie przetestuj pierwszą serię czterech fiolek, a następnie kontynuuj testowanie drugiej, trzeciej, czwartej, piątej i szóstej serii fiolek odpowiednio w 13, 14, 15, 16 i 17. minucie. Kontynuuj testowanie much, aż wszystkie zostaną uśpione.
Wprowadź całkowitą liczbę much w każdej fiolce podczas testów w wersji papierowej. Odnotuj nieruchome lub martwe muchy wykryte przez czujnik w czasie zero, odejmując je od całkowitej liczby much. Surowe dane z testu sedacji etanolem przekształcono w procent aktywnych much w funkcji czasu.
Wrażliwość na sedację etanolem na podstawie danych pierwotnych ilościowo określono jako czas sedacji 50 lub ST 50. Jest to czas wymagany, aby 50% much uległo sedacji, lub pole pod krzywą, czyli AUC. Test ten wykrywa efekty RNAi przeciwko calnexin 14 D w układzie nerwowym, co osłabiło wrażliwość na etanol w stosunku do kontroli; mutacja scab i rouser zwiększyła wrażliwość na sedację etanolem, a mutacja happy hour osłabiła wrażliwość na sedację etanolem w porównaniu z kontrolami po opanowaniu metody.
W przypadku prawidłowego wykonania technika ta może zostać przeprowadzona w półtorej godziny.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje prosty test służący do pomiaru wrażliwości na etanol oraz szybkiej tolerancji u Drosophila. Metoda ta ułatwia badanie zachowań związanych z działaniem etanolu u tego organizmu modelowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Organizmy modelowe
Wprowadzenie
- Wrażliwość na etanol jest ważną cechą behawioralną u wielu organizmów.
- Drosophila stanowi cenny model do badania efektów działania etanolu.
- Zrozumienie szybkich mechanizmów tolerancji może dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów uzależnienia.
- Proste testy mogą zwiększyć dostępność i powtarzalność eksperymentów.
Cel badania
- Ocena wrażliwości muszek owocówek na sedację etanolem.
- Opracowanie metody pomiaru szybkiej tolerancji na etanol.
- Wkład w zrozumienie zachowań związanych z wpływem etanolu u Drosophila.
Zastosowane metody
- Muchy umieszcza się w fiolkach i poddaje działaniu par etanolu.
- Liczbę uśpionych much odlicza się w regularnych odstępach czasu.
- Interpolowany jest czas potrzebny do uśpienia 50% much.
- Muchy zbiera się w grupach i pozostawia do wybudzenia przed przeprowadzeniem testów.
Główne wyniki
- Test ten skutecznie mierzy wrażliwość muszek owocówek na etanol.
- Wyniki wskazują, że czas wymagany do sedacji różni się między osobnikami.
- Szybką tolerancję można zaobserwować poprzez wielokrotną ekspozycję.
- Metoda ta jest skalowalna i powtarzalna w dalszych badaniach.
Wnioski
- Ten test zapewnia niezawodne podejście do badania wrażliwości na etanol.
- Wyniki mogą być pomocne w przyszłych badaniach nad uzależnieniem i tolerancją.
- Drosophila pozostaje kluczowym modelem w badaniach z zakresu neuronauki behawioralnej.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy test zapewnia skalowalny i niedrogi odczyt behawioralny wrażliwości na etanol oraz szybkiego rozwoju tolerancji u Drosophila, co umożliwia wysokoprzepustowe przesiewy genetyczne w celu zmniejszenia ryzyka walidacji celów w badaniach nad zaburzeniami używania alkoholu. Poprzez kwantyfikację kinetyki odpowiedzi sedatywnej, metoda ta wspiera mechanistyczną weryfikację trafień genetycznych i zwiększa pewność prognostyczną w początkowych etapach procesów odkrywania leków. Prostota i powtarzalność tej metody ułatwiają koordynację działań między zespołami zajmującymi się genetyką, neuronauką i badaniami translacyjnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar sedacji indukowanej etanolem jako funkcjonalnego odczytu manipulacji genetycznej.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki powtarzalnej kwantyfikacji fenotypów sedacyjnych w różnych genotypach.
- Wartość predykcyjna: Pozwala na wyznaczenie wskaźników czasu sedacji 50 (ST50) oraz pola pod krzywą (AUC) w celu priorytetyzacji celów o spójnych efektach behawioralnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Generuje standaryzowane, mierzalne wyniki (procent aktywnych much w czasie), odpowiednie dla procesów przesiewowych.
- Skalowalność: Zaprojektowany pod kątem niskich kosztów i prostego przygotowania, co umożliwia prowadzenie szeroko zakrojonych analiz genetycznych bez konieczności posiadania specjalistycznego sprzętu.
- Reprodukowalność: Niepodatność na sposób obchodzenia się z muchami, ich płeć czy dodatki do pożywki, co zapewnia stabilność danych niezależnie od operatora i laboratorium.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Pomiar szybkiego rozwoju tolerancji, kluczowego wskaźnika fenotypowego dla mechanizmów wczesnego etapu uzależnienia.
- Znaczenie dla choroby: Uchwycenie wrażliwości na etanol modulowanej przez zaburzenia genetyczne (np. RNAi calnexin14D, mutacje scab, rouser, happy hour) z wyraźnymi efektami kierunkowymi.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Umożliwienie wielopoziomowej oceny celów na podstawie wielkości i kierunku zmian w odpowiedzi sedatywnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu po identyfikację związku wiodącego, zapewniając walidację behawioralną, która łączy odkrycia genetyczne z wynikami funkcjonalnymi w neurofarmakologii.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez powiązanie manipulacji genetycznych z mierzalnymi zmianami w kinetyce sedacji etanolem.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, rozdzielonych w czasie danych o sedacji, umożliwiających porównania między różnymi warunkami genetycznymi.
- Analityka: Generuje wartości ST50 oraz AUC jako znormalizowane wskaźniki do porównań między grupami i wyboru trafień (hit selection).
- Badania translacyjne: Łączy wyniki z istotnością przedkliniczną poprzez modelowanie szybkiej tolerancji, będącej behawioralnym prekursorem uzależnienia.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną platformę behawioralną do iteracyjnego przesiewania modulatorów genetycznych i farmakologicznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną, zapewniając bezpośredni, mierzalny wskaźnik behawioralnych zmian wywołanych przez etanol.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki niskiej wrażliwości na zmienne związane z manipulacją i kontrolą środowiskową.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie wyraźnych sygnałów fenotypowych wynikających z zaburzeń genetycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie wielkości i kierunku efektu w zakresie wrażliwości na sedację.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest podstawowa wiedza entomologiczna lub neurobehawioralna w zakresie obsługi much oraz oceny poziomu sedacji.
- Niezbędny jest standardowy sprzęt laboratoryjny: probówki, zatyczki, czasomierze, roztwór etanolu oraz kontrola warunków środowiskowych (20–25°C, 55–65% RH).
- Wymagane są ustandaryzowane kryteria oceny zsedowanych much (unieruchomienie na podłożu lub na grzbiecie) w celu zapewnienia spójności danych.
- Wymagane są etapy aklimatyzacji i kodowania, aby zminimalizować błąd operatora i umożliwić ślepą próbę.
- Metoda ogranicza się do pomiaru reakcji na środki uspokajające; nie obejmuje aktywacji lokomocyjnej ani złożonych zachowań motywacyjnych.
