Niedrogi, skalowalny test behawioralny do pomiaru wrażliwości i szybkiej tolerancji sedacji etanolem u Drosophila
15 kwietnia 2015
Proste testy do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u Drosophila ułatwiają wykorzystanie tego organizmu modelowego do badania tych ważnych zachowań związanych z etanolem. W tym miejscu opisano stosunkowo prosty, skalowalny test do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u much.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena wrażliwości na sedację etanolem u muszek owocowych. Osiąga się to poprzez umieszczenie much w fiolkach i wystawienie ich na działanie oparów etanolu. Drugim krokiem jest określenie liczby much, które są uspokajane w każdej fiolce w powtarzających się punktach czasowych, aż wszystkie muchy zostaną uspokojone.
Następnie punkt czasowy jest interpolowany. Kiedy 50% muszek zostanie uspokojonych dla każdej fiolki, wyniki pokazują wskaźnik czasu potrzebnego do uspokojenia muszek owocowych etanolem, demonstrując tę procedurę dzisiaj, będzie Simran Sindu, student w moim laboratorium. Aby rozpocząć eksperyment, zbierz muchy w fiolkach ze świeżą żywnością w grupach po 11 osób tej samej płci przez maksymalnie pięć minut CO2, pozwól muchom zregenerować się przez noc w fiolkach z jedzeniem w kontrolowanej przestrzeni środowiskowej.
Przygotuj roztwór etanolu, rozcieńczając czysty 100% etanol w oczyszczonej wodzie do końcowego stężenia 85%Poczekaj, aby roztwór powrócił do temperatury pokojowej przez noc przed testem, przygotuj czystą, pustą fiolkę z żywnością, która posłuży jako fiolka do testów. Nowa zatyczka z octanu celulozy, silikonowy korek i jeden mililitr roztworu etanolu na każdą fiolkę much, która ma być testowana, dostosuj temperaturę w pomieszczeniu do 20 do 25 stopni Celsjusza, a wilgotność względną do 55 do 65%Wyznacz innego pracownika, który przypisze unikalny kod do każdej grupy fiolek i zapisze kod, aby później umieścić zakodowane fiolki z muchami w pomieszczeniu testowym, aby zaaklimatyzować się na kilka minut. Następnie oznacz puste fiolki testowe, aby pasowały do kodów na fiolkach muchowych.
Skonstruuj dziennik testowania w wersji papierowej, wprowadzając kody w kolumnach z jedną kolumną na fiolkę w arkuszu kalkulacyjnym. Korzystanie z dziennika testów jako przewodnika. Ułóż zakodowane fiolki z żywnością z muchami i puste fiolki testowe w pasujące tablice w pomieszczeniu testowym, przenieś muchy z fiolek z jedzeniem do dopasowanych i oznakowanych fiolek testowych, pojedynczo.
Następnie natychmiast włóż zatyczki z octanu celulozy do fiolek testowych, aż zatyczki z octanu celulozy znajdą się dwa centymetry poniżej górnej części fiolki. Dla oceny czasu zerowego. Chwycić każdą fiolkę pojedynczo kciukiem i palcem wskazującym.
Delikatnie postukaj w stół trzy razy, aby strącić muchy na dno fiolki. Odczekaj 30 sekund i policz liczbę much, które są nieruchome i/lub martwe. Zapisz liczbę nieruchomych martwych much dla każdej fiolki w tym samym czasie.
Zero minut w dzienniku testowania wersji papierowej. Uruchom minutnik o godzinie zero i natychmiast dodaj jeden mililitr etanolu do octanu celulozy. Wprowadza ruchy okrężne w odstępach pięciosekundowych dla pierwszego zestawu czterech fiolek w kolejności.
Zostaną one przetestowane, gdy etanol zostanie dodany do wszystkich czterech fiolek testowych w zestawie. Włożyć silikonową zatyczkę do każdej fiolki, aby zamknąć ją po 1, 2, 3, 4 i pięciu minutach. Dodaj jeden mililitr etanolu do drugiego, trzeciego, czwartego, piątego i szóstego zestawu czterech fiolek odpowiednio.
Kontynuować wkładanie silikonowych korków po dodaniu etanolu do każdego zestawu czterech fiolek LS po sześciu minutach. Zbadać pierwszy zestaw czterech fiolek, chwytając każdą fiolkę kciukiem i palcem wskazującym, a następnie delikatnie stukając trzy razy w stół, aby strącić muchy na dno fiolki. Odczekaj 30 sekund, a następnie policz i zapisz całkowitą liczbę much, które są uspokojone.
Score leci jako uspokojony, jeśli jeden, jeden, stoi na podłodze fiolki, ale nie chodzi, lub dwa leżą na plecach z trzepotaniem skrzydłami lub bez. Z każdą fiolką w zestawie należy obchodzić się w odstępach pięciosekundowych, korzystając z tego harmonogramu w czasie. 7, 8, 9, 10 i 11 minut.
Przetestować odpowiednio drugi, trzeci, czwarty, piąty i szósty zestaw fiolek, tak jak dla pierwszego zestawu po 12 minutach. Ponownie przetestować pierwszy zestaw czterech fiolek i kontynuować testowanie drugiego, trzeciego, czwartego, piątego i szóstego zestawu fiolek odpowiednio po 13, 14, 15, 16 i 17 minutach. Kontynuuj testowanie much, aż wszystkie zostaną uspokojone.
Wprowadzić całkowitą liczbę much w każdej fiolce w testach w wersji papierowej. Czujnik logarytmiczny nieruchomych lub martwych much w czasie zero od całkowitej liczby much. Surowe dane z testu sedacji etanolem przeliczono na procent aktywnych much w funkcji czasu.
Wrażliwość na sedację etanolem na podstawie danych pierwotnych określono ilościowo jako czas sedacji 50 lub ST 50. Czas wymagany, aby 50% much uległo uspokojeniu lub znalazło się pod krzywą lub UC. Test wykrywa wpływ RNAi na kalneksynę 14 D w układzie nerwowym, co stępiło wrażliwość etanolu w stosunku do kontroli, mutację parcha i budzika, zwiększoną wrażliwość na sedację etanolem i mutację happy hour. czułość na sedację etanolem w porównaniu z kontrolami Po opanowaniu.
Tę technikę można wykonać w półtorej godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje prosty test służący do pomiaru wrażliwości na etanol oraz szybkiej tolerancji u Drosophila. Metoda ta ułatwia badanie zachowań związanych z działaniem etanolu u tego organizmu modelowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Organizmy modelowe
Wprowadzenie
- Wrażliwość na etanol jest ważną cechą behawioralną u wielu organizmów.
- Drosophila stanowi cenny model do badania efektów działania etanolu.
- Zrozumienie szybkich mechanizmów tolerancji może dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów uzależnienia.
- Proste testy mogą zwiększyć dostępność i powtarzalność eksperymentów.
Cel badania
- Ocena wrażliwości muszek owocówek na sedację etanolem.
- Opracowanie metody pomiaru szybkiej tolerancji na etanol.
- Wkład w zrozumienie zachowań związanych z wpływem etanolu u Drosophila.
Zastosowane metody
- Muchy umieszcza się w fiolkach i poddaje działaniu par etanolu.
- Liczbę uśpionych much odlicza się w regularnych odstępach czasu.
- Interpolowany jest czas potrzebny do uśpienia 50% much.
- Muchy zbiera się w grupach i pozostawia do wybudzenia przed przeprowadzeniem testów.
Główne wyniki
- Test ten skutecznie mierzy wrażliwość muszek owocówek na etanol.
- Wyniki wskazują, że czas wymagany do sedacji różni się między osobnikami.
- Szybką tolerancję można zaobserwować poprzez wielokrotną ekspozycję.
- Metoda ta jest skalowalna i powtarzalna w dalszych badaniach.
Wnioski
- Ten test zapewnia niezawodne podejście do badania wrażliwości na etanol.
- Wyniki mogą być pomocne w przyszłych badaniach nad uzależnieniem i tolerancją.
- Drosophila pozostaje kluczowym modelem w badaniach z zakresu neuronauki behawioralnej.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy test zapewnia skalowalny i niedrogi odczyt behawioralny wrażliwości na etanol oraz szybkiego rozwoju tolerancji u Drosophila, co umożliwia wysokoprzepustowe przesiewy genetyczne w celu zmniejszenia ryzyka walidacji celów w badaniach nad zaburzeniami używania alkoholu. Poprzez kwantyfikację kinetyki odpowiedzi sedatywnej, metoda ta wspiera mechanistyczną weryfikację trafień genetycznych i zwiększa pewność prognostyczną w początkowych etapach procesów odkrywania leków. Prostota i powtarzalność tej metody ułatwiają koordynację działań między zespołami zajmującymi się genetyką, neuronauką i badaniami translacyjnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar sedacji indukowanej etanolem jako funkcjonalnego odczytu manipulacji genetycznej.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki powtarzalnej kwantyfikacji fenotypów sedacyjnych w różnych genotypach.
- Wartość predykcyjna: Pozwala na wyznaczenie wskaźników czasu sedacji 50 (ST50) oraz pola pod krzywą (AUC) w celu priorytetyzacji celów o spójnych efektach behawioralnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Generuje standaryzowane, mierzalne wyniki (procent aktywnych much w czasie), odpowiednie dla procesów przesiewowych.
- Skalowalność: Zaprojektowany pod kątem niskich kosztów i prostego przygotowania, co umożliwia prowadzenie szeroko zakrojonych analiz genetycznych bez konieczności posiadania specjalistycznego sprzętu.
- Reprodukowalność: Niepodatność na sposób obchodzenia się z muchami, ich płeć czy dodatki do pożywki, co zapewnia stabilność danych niezależnie od operatora i laboratorium.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Pomiar szybkiego rozwoju tolerancji, kluczowego wskaźnika fenotypowego dla mechanizmów wczesnego etapu uzależnienia.
- Znaczenie dla choroby: Uchwycenie wrażliwości na etanol modulowanej przez zaburzenia genetyczne (np. RNAi calnexin14D, mutacje scab, rouser, happy hour) z wyraźnymi efektami kierunkowymi.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Umożliwienie wielopoziomowej oceny celów na podstawie wielkości i kierunku zmian w odpowiedzi sedatywnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu po identyfikację związku wiodącego, zapewniając walidację behawioralną, która łączy odkrycia genetyczne z wynikami funkcjonalnymi w neurofarmakologii.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez powiązanie manipulacji genetycznych z mierzalnymi zmianami w kinetyce sedacji etanolem.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, rozdzielonych w czasie danych o sedacji, umożliwiających porównania między różnymi warunkami genetycznymi.
- Analityka: Generuje wartości ST50 oraz AUC jako znormalizowane wskaźniki do porównań między grupami i wyboru trafień (hit selection).
- Badania translacyjne: Łączy wyniki z istotnością przedkliniczną poprzez modelowanie szybkiej tolerancji, będącej behawioralnym prekursorem uzależnienia.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną platformę behawioralną do iteracyjnego przesiewania modulatorów genetycznych i farmakologicznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną, zapewniając bezpośredni, mierzalny wskaźnik behawioralnych zmian wywołanych przez etanol.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki niskiej wrażliwości na zmienne związane z manipulacją i kontrolą środowiskową.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie wyraźnych sygnałów fenotypowych wynikających z zaburzeń genetycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie wielkości i kierunku efektu w zakresie wrażliwości na sedację.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest podstawowa wiedza entomologiczna lub neurobehawioralna w zakresie obsługi much oraz oceny poziomu sedacji.
- Niezbędny jest standardowy sprzęt laboratoryjny: probówki, zatyczki, czasomierze, roztwór etanolu oraz kontrola warunków środowiskowych (20–25°C, 55–65% RH).
- Wymagane są ustandaryzowane kryteria oceny zsedowanych much (unieruchomienie na podłożu lub na grzbiecie) w celu zapewnienia spójności danych.
- Wymagane są etapy aklimatyzacji i kodowania, aby zminimalizować błąd operatora i umożliwić ślepą próbę.
- Metoda ogranicza się do pomiaru reakcji na środki uspokajające; nie obejmuje aktywacji lokomocyjnej ani złożonych zachowań motywacyjnych.
