Name: Badanie wpływu alkoholu etylowego na prędkość poruszania się Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Poznaj metodę badania wpływu etanolu na zachowanie Caenorhabditis elegans poprzez pomiar prędkości poruszania się. Technika ta pozwala kwantyfikować wrażliwość i rozwój tolerancji u różnych genotypów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez granty National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse: R01AA016837 (JCB) i P20AA017828 (AGD i JCB).

1. Kroki wykonywane w dniu przed badaniem
<ol>
	<li>Wybierz robaki w stadium L4 na świeże płytki z podłoża do hodowli nicieni (NGM) obsiane darnią OP50 E. coli i hodują je w temperaturze 20 ˚C przez całą noc. Każda warunkowa próba wymaga 10 robaków; wybierz więcej robaków, aby zapobiec utracie robaków przez całą noc.
	<ol>
		<li>Tylko zwierzęta badane w pierwszy dzień dorosłości; wiele mutantów rośnie wolniej niż dzikiego typu. Skoryguj czas wybierania dla szczepów, które mają opóźnienia rozwojowe, tak aby wszystkie testowane zwierzęta były dorosłe w pierwszy dzień.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kroki wykonywane w dniu badania
<ol>
	<li>Przygotowanie do badania:
	<ol>
		<li>Przeprowadź badania na standardowych, nieobsianych płytkach NGM o wymiarach 60 x 15 mm. Wysusz wszystkie płytki, które mają być użyte w badaniu w temperaturze 37 ˚C przez 2 godziny, z pokrywkami zdejmowanymi. Na każde pojedyncze eksperymentalne testowanie użyj czterech wysuszonych płytek NGM; będą to płytki do badania o stężeniu 0 mM i 400 mM etanolu oraz towarzyszące im płytki aklimatyzacyjne. 
		UWAGA: Użycie płytek NGM jest tutaj ważne; różnice w składzie płytek, w szczególności ich osmolarność, mogą znacznie wpływać na reakcję dawkową na etanol w zachowaniu, co jest spowodowane przynajmniej częściowo zmianami w ilości etanolu akumulowanego przez zwierzęta20. Agar NGM ma 160 mOsm.</li>
		<li>Po wysuszeniu waży każdą z nieobsianych płytek NGM, które mają być użyte w badaniu i odnotuj wagę. Określ objętość podłoża na płytkach na podstawie wagi pustej płytki. Aby przybliżyć konwersję wagi agaru na objętość, zakłada się, że podłoże waży tak samo jak równoważna objętość wody. 
		UWAGA: Nasze najbardziej spójne wyniki uzyskano dla podłoża NGM, które zostało wystarczająco odwodnione, aby oryginalny objętość 10 ml miał objętość po wysuszeniu między 8,3–8,9 ml. Alternatywą dla czasu wysuszania 2 godzin jest wysuszenie, aż płytki osiągną ten zakres objętości, aby uwzględnić różnice w inkubatorach.</li>
		<li>Wtop 4 pierścienie miedziane (średnica wewnętrzna 1,6 cm) w powierzchnię każdej z płytek, aby służyły jako wybiegi dla różnych genotypów lub grup leczenia robaków. Chwytaj każdy pierścień kleszczami i podgrzewaj w płomieniu (dobrze sprawdza się mocny płomień z palnika Bunsena) przez około 3 s. Natychmiast umieść pierścień na płytce, nadal trzymając go kleszczami, aby zapobiec jego ‘skakaniu’.
		<ol>
			<li>Upewnij się, że pierścień spoczywa płasko na powierzchni agaru, delikatnie przyciskając go kleszczami w kilku punktach na pierścieniu. Podczas umieszczania pierścienia uważaj, aby pozostawić miejsce na dodatkowe trzy pierścienie.</li>
			<li>Wtop trzy dodatkowe pierścienie miedziane w powierzchnię płytki, uważając, aby umieścić je jak najbliżej siebie, aby wszystkie cztery były w polu widzenia kamery. 
			UWAGA: Utworzenie dobrego uszczelnienia z agarem jest niezbędne, aby utrzymać robaki w pierścieniach podczas badania. Pierścienie, które skaczą po płytce, prawdopodobnie nie utworzyą prawidłowego uszczelnienia z agarem i mogą uszkodzić agar, co pozwala robakom na kopanie i interferencję z wizualizacja robaków.</li>
			<li>Dla każdej płytki do badania przygotuj towarzyszącą “aklimatyzację”, która powinna być wysuszona i nieobsiana i nie będzie otrzymywać etanolu. Umieść cztery pierścienie miedziane na tych płytkach.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oznacz dno płytek obok każdego pierścienia szczepem robaków, który ma być użyty w pierścieniu, uważając, aby nie pisać w polu widzenia samego pierścienia. Dopasuj etykiety na płytce do badania do towarzyszącej jej płytki aklimatyzacyjnej.</li>
		<li>Oblicz ilość 100% etanolu do dodania do każdej płytki do badania, aby ostateczne stężenie wynosiło 0 mM lub 400 mM etanolu (waga do objętości). Dla każdego eksperymentu (n = 1) będą jedna płytka 0 mM i jedna płytka 400 mM etanolu; płytki aklimatyzacyjne nie otrzymują etanolu. Dodaj etanol, pipetując go na powierzchnię płytki. Użyj folii laboratoryjnej, aby uszczelnić płytkę i pozwól jej równoważeniu na blacie przez 2 godziny.</li>
		<li>Kiedy minęło 1,5 godziny, rozpocznij krok aklimatyzacji badania, krok 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź badanie ruchliwości: Płytki do badania
	<ol>
		<li>Starannie przenieś 10 robaków z każdej grupy eksperymentalnej do środka pierścienia miedzianego na płytce aklimatyzacyjnej. Usuń widoczny pokarm na agarze w tym momencie, delikatnie zdrapywając go za pomocą szczypiec do robaków. Zmieniaj kolejność, w jakiej grupy eksperymentalne są umieszczane na płytkach w poszczególnych eksperymentach, aby te same szczepy nie były umieszcz

<ol><li>Prescott, C. A., Kendler, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+contributions+to+alcohol+abuse+and+dependence+in+a+population-based+sample+of+male+twins%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins.</a> Am. J. Psychiatry. 156, 34-40 (1999).</li>
<li>Schuckit, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+the+risk+for+alcoholism%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Addict.+Article+Review%22%5BJournal%5D)">Genetics of the risk for alcoholism.</a> Am. J. Addict. Article Review. 9, 103-112 (2000).</li>
<li>Heath, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+differences+in+alcohol+sensitivity+and+the+inheritance+of+alcoholism+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol.+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk.</a> Psychol. Med. 29, 1069-1081 (1999).</li>
<li>Rodriguez, L. A., Wilson, J. R., Nagoshi, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+psychomotor+sensitivity+to+alcohol+predict+subsequent+alcohol+use%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Does psychomotor sensitivity to alcohol predict subsequent alcohol use.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 17, 155-161 (1993).</li>
<li>Schuckit, M. A., Smith, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+8-year+follow-up+of+450+sons+of+alcoholic+and+control+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Gen.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects.</a> Arch. Gen. Psychiatry. 53, 202-210 (1996).</li>
<li>Kalu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritability+of+level+of+response+and+association+with+recent+drinking+history+in+nonalcohol-dependent+drinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Heritability of level of response and association with recent drinking history in nonalcohol-dependent drinkers.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 522-529 (2012).</li>
<li>Davis, S. J., Scott, L. L., Hu, K., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+single+residue+in+the+BK+potassium+channel+required+for+activation+by+alcohol+and+intoxication+in%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conserved single residue in the BK potassium channel required for activation by alcohol and intoxication in.</a> C. elegans. J. Neurosci. 34, 9562-9573 (2014).</li>
<li>Raabe, R. C., Mathies, L. D., Davies, A. G., Bettinger, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Omega-3+Fatty+Acid+Eicosapentaenoic+Acid+Is+Required+for+Normal+Alcohol+Response+Behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Omega-3 Fatty Acid Eicosapentaenoic Acid Is Required for Normal Alcohol Response Behaviors in C. elegans.</a> PLoS ONE. 9, e105999(2014).</li>
<li>Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+disinhibition+of+behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans.</a> PLoS ONE. 9, e92965(2014).</li>
<li>Bhandari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+intracellular+channels+modulate+acute+ethanol+behaviors+Drosophila%2CCaenorhabditis+elegans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors Drosophila,Caenorhabditis elegans and mice.</a> Genes Brain Behav. 11, 387-397 (2012).</li>
<li>Davies, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+of+the+BK+potassium+channel+in+behavioral+responses+to+ethanol+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A central role of the BK potassium channel in behavioral responses to ethanol in C. elegans.</a> Cell. 115, 655-666 (2003).</li>
<li>Davies, A. G., Bettinger, J. C., Thiele, T. R., Judy, M. E., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+the+npr-1+gene+modifies+ethanol+responses+of+wild+strains+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Natural variation in the npr-1 gene modifies ethanol responses of wild strains of C. elegans.</a> Neuron. 42, 731-743 (2004).</li>
<li>Kapfhamer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+RAB-3%2FA+in+Caenorhabditis+elegans+and+the+mouse+affects+behavioral+response+to+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Loss of RAB-3/A in Caenorhabditis elegans and the mouse affects behavioral response to ethanol.</a> Genes Brain Behav. 7, 669-676 (2008).</li>
<li>Speca, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+role+of+unc-79+in+ethanol+responses+in+lightweight+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Conserved role of unc-79 in ethanol responses in lightweight mutant mice.</a> PLoS Genet. 6, e1001057(2010).</li>
<li>Thiele, T. E., Badia-Elder, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+neuropeptide+Y+in+alcohol+intake+control%3A+evidence+from+human+and+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">A role for neuropeptide Y in alcohol intake control: evidence from human and animal research.</a> Physiol. Behav. 79, 95-101 (2003).</li>
<li>Treistman, S. N., Martin, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BK+Channels%3A+mediators+and+models+for+alcohol+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">BK Channels: mediators and models for alcohol tolerance.</a> Trends Neurosci. 32, 629-637 (2009).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+GWASs+and+human+protein+interaction+networks+identifies+a+gene+subnetwork+underlying+alcohol+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence.</a> Am. J. Hum. Genet. 93, 1027-1034 (2013).</li>
<li>Kendler, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomewide+association+analysis+of+symptoms+of+alcohol+dependence+in+the+molecular+genetics+of+schizophrenia+%28MGS2%29+control+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Genomewide association analysis of symptoms of alcohol dependence in the molecular genetics of schizophrenia (MGS2) control sample.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 35, 963-975 (2011).</li>
<li>Schuckit, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+linkage+analysis+for+the+level+of+response+to+alcohol%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Autosomal linkage analysis for the level of response to alcohol.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 29, 1976-1982 (2005).</li>
<li>Alaimo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+metabolism+and+osmolarity+modify+behavioral+responses+to+ethanol+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Ethanol metabolism and osmolarity modify behavioral responses to ethanol in C. elegans.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 1840-1850 (2012).</li>
<li>Morgan, P. G., Sedensky, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+sensitivity+to+ethanol+in+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting sensitivity to ethanol in the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 19, 1423-1429 (1995).</li>
<li>Mitchell, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration-dependent+effects+of+ethanol+on+Caenorhabditis+elegans+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">The concentration-dependent effects of ethanol on Caenorhabditis elegans behaviour.</a> Pharmacogenomics J. 7, 411-417 (2007).</li>
<li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+selects+distinct+crawling+and+swimming+gaits+via+dopamine+and+serotonin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans selects distinct crawling and swimming gaits via dopamine and serotonin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 17504-17509 (2011).</li>
<li>Bettinger, J. C., Leung, K., Bolling, M. H., Goldsmith, A. D., Davies, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+environment+modulates+the+development+of+acute+tolerance+to+ethanol+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Lipid environment modulates the development of acute tolerance to ethanol in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7, e35129(2012).</li>
<li>Davies, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+genes+influence+toluene-+and+ethanol-induced+locomotor+impairment+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Alcohol+Depend%22%5BJournal%5D)">Different genes influence toluene- and ethanol-induced locomotor impairment in C. elegans.</a> Drug Alcohol Depend. 122, 47-54 (2012).</li>
<li>Newlin, D., Thomson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+challenge+with+sons+of+alcoholics%3A+a+critical+review+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Alcohol challenge with sons of alcoholics: a critical review and analysis.</a> Psychol. Bull. 108, 383-402 (1990).</li>
<li>Ponomarev, I., Crabbe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+assess+initial+sensitivity+and+acute+functional+tolerance+to+hypnotic+effects+of+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">A novel method to assess initial sensitivity and acute functional tolerance to hypnotic effects of ethanol.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 257-263 (2002).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHusson%2C+SJ+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Research Community. (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnięcia.

Prosta neurobiologia i dostępne narzędzia genetyczne C. elegans sprawiają, że dżdżownica jest doskonałym modelem do badania molekularnych podstaw działania alkoholu na zachowanie. Opisujemy tutaj metodę, która została wykorzystana do zidentyfikowania kilku molekularnych i środowiskowych mediatorów ostrej reakcji behawioralnej na alkohol8,10,20,24,25. Ta metoda umożliwia różnicowanie i jednoczesne badanie dwóch różnych fenotypow zachowania reakcji na alkohol, początkowej wrażliwości i rozwoju ostrej to...

Zaburczenia związane z używaniem alkoholu (AUD) są powszechne i powodują poważne problemy zdrowotne, społeczne i ekonomiczne. U ludzi podatność na rozwój AUD jest znacznie wpłynięta zarówno przez genetykę, jak i środowisko1,2. Silnym fizjologicznym predyktorerem skłonności do nadużywania jest początkowy poziom reakcji (LR) na alkohol (etanolu), który jest wykazywany przez naiwnych pijaków3-5. Ten fenotyp LR jest wpłynięty przez komponenty genetyczne i niegenetyczne6. Określenie mechanizmów molekularnych, które wpływają na LR do etanolu, jest ważnym celem badań nad zachowaniami reakcji na etanol.
Niemiec, Caenorhabditis elegans, jest coraz częściej stosowany jako model do badania wpływu etanolu na zachowanie7-9. Istnieje silne molekularne zachowanie w mechanizmie funkcji układu nerwowego między robakami a ssakami, a kilka genów, które wykazano, że wpływają na LR do etanolu u robaków, wykazano, że wpływają na LR do etanolu u ssaków10-16, i zostały zaangażowane w skłonności do nadużywania u ludzi17-19.
Etanol odurza robaki, co znajduje odzwierciedlenie w zmniejszeniu ich prędkości poruszania się. Kilka różnych laboratoriów opracowało testy behawioralne, które różnią się pod wieloma względami, na przykład w badanym zachowaniu ruchowym (pełzanie versus pływanie11,12,14,20,21) lub w składzie roztworów, w których przeprowadza się testy (medium do hodowli nematodów versus sól Dent’a20,22). Co ciekawe, te różnorodne testy dały nieco różne profile dawki-reakcji dla efektów etanolu. Wyniki te wskazały na istotne różnice w podstawowych zachowaniach pełzania i pływania9,23, a także na rolę zmiennej środowiskowej osmolarności w reakcjach na etanol20, i podkreśliły znaczenie opisu szczegółów eksperymentu dla różnych testów.
Prezentowany jest test do pomiaru ostrego wpływu etanolu na zachowanie pełzania. Test ten był szeroko stosowany do badania genetycznych i środowiskowych wpływów na LR do etanolu8,10,20,24,25. Fenotyp LR u ssaków jest złożony z co najmniej dwóch komponentów, początkowej wrażliwości na etanol i ostrej tolerancji funkcjonalnej na etanol26,27. U robaków fenotyp LR został wykazany jako oddzielny na te dwa komponenty za pomocą tego testu behawioralnego. Wpływ manipulacji genetycznych i środowiskowych na oba fenotypy można badać za pomocą tego pojedynczego testu. Co ważne, te dwa fenotypy są genetycznie oddzielne.

<table><tbody><tr><td>C. elegans strains</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri plates, triple vented</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628161</td><td>Other plate brands will suffice.</td></tr><tr><td>NGM agar</td><td>Various</td><td></td><td>NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Various</td><td></td><td>np. Fisher Scientific #10300</td></tr><tr><td>37 &deg;C Incubator</td><td>Various</td><td></td><td>For drying agar</td></tr><tr><td>Digital balance</td><td>Various</td><td></td><td>For determining plate weights and agar volume</td></tr><tr><td>Copper rings</td><td>Plumbmaster</td><td>STK#35583 (48 cap thread gasket)</td><td>1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings</td></tr><tr><td>100% ethanol</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>QImaging</td><td>RET-4000R-F-M-12</td><td>This camera has a large field of view.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Discontinued model, M60 is current equivalent.</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Schott</td><td>A08923</td><td>3&rdquo;x3&rdquo;&nbsp; backlight for even illumination across the field of view</td></tr><tr><td>Imaging and tracking software</td><td>Media Cybernetics</td><td>ImagePro-Plus v6.0-6.3</td><td>Newer versions of the software have tracking functions.</td></tr></tbody></table>

badanie wpływu alkoholu etylowego na prędkość poruszania się caenorhabditis elegans

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Zaburzenia związane z używaniem alkoholu są istotnym problemem zdrowia publicznego, dla którego istnieje niewiele skutecznych strategii leczenia. Jedną z trudności, która opóźniła opracowanie bardziej skutecznych terapii, jest względny brak rozumienia molekularnych podstaw wpływu etanolu na zachowanie. Glebacz, Caenorhabditis elegans (C. elegans), zapewnia przydatny model do generowania i testowania hipotez dotyczących molekularnych efektów etanolu. W tym miejscu opisujemy test, który został opracowany i wykorzystany do badania ról poszczególnych genów i czynników środowiskowych w reakcjach behawioralnych na etanol, w których ruch jest wyjściowym zachowaniem. Etanol w sposób zależny od dawki powoduje ostrą depresję pełzania na powierzchni agaru. Efekty są dynamiczne; zwierzęta narażone na wysokie stężenie wykazują początkowo silną depresję pełzania, nazywaną tu początkową wrażliwością, a następnie częściowo odzyskują prędkość lokomocji mimo ciągłej obecności leku. Ta indukowana etanolem plastyczność behawioralna jest tu nazywana rozwojem ostrej tolerancji funkcjonalnej. Test ten został wykorzystany do wykazania, że te dwa fenotypy są odrębne i genetycznie oddzielne. Prosty test lokomocji opisany tutaj nadaje się do badania wpływu zarówno manipulacji genetycznych, jak i środowiskowych na te ostre reakcje behawioralne na etanol w C. elegans.

Przedstawione dane (Rysunek 1) z kilku różnych genotypów i ich sparowanych kontroli są przedstawione8,24; dane zostały specjalnie wybrane, aby podkreślić różnice w badanych zwierzętach. Stopień wpływu po 10 min ekspozycji jest uważany za początkową wrażliwość szczepu, która jest pokazana na lewej osi w Rysunku 1B-G. Szczepy mutantów o względnej prędkości większej niż kontrola po 10 min uważane są za odporne na etanol (Rysunek 1F, G), podczas gdy szczepy mutant...

C. elegans jest przydatnym modelem do badania wpływu alkoholu etylowego na zachowanie. Prezentujemy test behawioralny, który ilościowo określa wpływ alkoholu etylowego na szybkość poruszania się pełzających dżdżownic; zarówno początkową wrażliwość, jak i rozwój ostrej tolerancji funkcjonalnej na alkohol etylowy można zmierzyć za pomocą tego testu.

Badanie wpływu alkoholu etylowego na prędkość poruszania się Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Ogólnym celem tej procedury jest sprecyzowanie wpływu alkoholu na narządy CL o różnych genotypach w sposób spójny. Osiąga się to poprzez stworzenie płytki agarowej zawierającej alkohol z miedzianym pierścieniami osadzone na powierzchni, aby zgromadzić zwierzęta. Następnie różne genotypy są oddzielnie zgromadzane i narażone na alkohol. Podczas narażenia zbierane są dane wideo w ustalonych punktach czasowych.Ostatnim etapem jest pomiar prędkości każdego genotypu przy użyciu oprogramowania do rozpoznawania obiektów. Ostatecznie porównanie prędkości we wczesnych i późnych punktach czasowych jest wykorzystywane do odkrycia nienormalnej wrażliwości lub rozwoju tolerancji na alkohol. Określone genotypy.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, które porównują genotypy na różnych płytkach, jest to, że zmniejsza się zmienność środowiskowa. Ogólnie, osoby nieznające tej metody będą mieć trudności z wybieraniem robaków za pomocą gołej szczypców. W dzień przed zabiegiem. Wybierz L czteroetapowe robaki do świeżych płytek NGM Usadź z darnią kultury OP 50 E coli, płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc, zabieg wymaga standardowych 60 na 15 milimetrów.Płytki NGM wysuszają wszystkie płytki do użycia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny z otwartymi pokrywkami. Każdy eksperyment wymaga czterech płytek. Ważne jest użycie płytek NGM.Różnice w składzie płytek. W szczególności ich osmolarność może znacząco wpływać na wrażliwość na etanol w zachowaniu. Jest to spowodowane przynajmniej częściowo zmianami w ilości etanolu akumulowanego przez zwierzęta. Po wysuszeniu, waży każdą z nieosadzanych płytek NGM.Użyj tej wagi, aby określić objętość medium na każdej płytce, zakładając, że medium waży tyle, ile woda. Następnie zaplanuj stopienie czterech miedzianych pierścieni o średnicy wewnętrznej 1,6 centymetra w każdej płytce, aby można je było jednocześnie zobaczyć przez kamerę. Używając szczypiec.Przejdź przez każdy pierścień przez ogień przez około trzy sekundy i natychmiast umieść pierścień na płytce bez upuszczania go. Następnie delikatnie przyciśnij pierścień w kilku miejscach, aby zamocować go wzdłuż obwodu. Oznakuj płytki odmianą, która będzie w każdym pierścieniu.Teraz oblicz ilość 100% etanolu potrzebnego, aby uzyskać 400 milimolarną stężoną masę na objętość na płytce. Następnie załaduj połowę płytek etanolem, kropkiąc etanol z pipety. Pozwól wszystkim przygotowanym płytkom zrównoważyć się przez dwie godziny przed rozpoczęciem eksperymentu.Aby rozpocząć, weź dwie minuty lub mniej, aby przenieść 10 robaków z każdej grupy eksperymentalnej do środka miedzianego pierścienia na płytce aklimatyzacyjnej. To jest płytka bez etanolu. Unikaj przenoszenia pokarmu z robakami, ponieważ zmniejszy to ich ruch.Również, unikaj uszkodzenia powierzchni agaru, ponieważ robaki się zagrzebają. Zapisz czas załadowania na płytkę i upewnij się, że przenoszenie robaków na każdą płytkę jest rozłożone o ponad dwie minuty, aby każda płytka mogła być filmowana indywidualnie w odpowiednich odstępach czasowych. Pozostaw każdą płytkę aklimatyzacyjną do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Następnie przenieś robaki na płytkę testową, stosując kolejność używaną do umieszczania robaków na płytce aklimatyzacyjnej, używając płasko zakończonego robaka o cienkim brzegu. Wybierz bez bakterii. Zbieraj robaki na szczypce płasko.Używając ruchu szufladkowego, a następnie uszczelniaj płytki folią laboratoryjną, aby zminimalizować utratę etanolu na parowanie. Prędkość, z jaką zwierzęta są przenoszone w tym kroku, jest bardzo ważna, ponieważ przeniesienie na zwierzęta będzie narażone na etanol dłużej, więc dobrym pomysłem jest obracanie, które szczepy są umieszczane na płytce. Najpierw przez replikaty eksperymentalne.Wymagany jest mikroskop z wysokiej rozdzielczości kamerą wideo do nakręcenia robaków. Teraz, równomierne oświetlenie, takie jak z trzech cali kwadratowego tyłowego oświetlenia, jest niezbędne do analizy. Następnie, aby zachować kontrast obrazu, przygotuj oprogramowanie do analizy obrazu, aby uchwycić 120.Klatka 12 bitowa skala szarości time-lapse filmów w jednej klatce na sekundę. Aby zmniejszyć rozmiar pliku wyjściowego, zachowując wystarczającą rozdzielczość obrazu, użyj trybu zgięcia dwa na dwa. Teraz nagrywaj dwu minutowe filmy z każdej płytki.10 minut po ostatnich robakach zostały umieszczone na tej płytce. Następnie wykonaj drugie dwu minutowe nagranie. 30 minut po umieszczeniu robaków na płytce dla tego demonstracyjnego obrazu.Stosowane jest oprogramowanie Pro plus, ale szeroka gama innego oprogramowania może być dostosowana do tej techniki. Analizuj filmy jako dwuminutowe segmenty. Najpierw zastosuj filtr do obrazów, który spłaszcza tło i poprawia kontrast obiektów robaków.W menu wybierz proces. Następnie filtry, a następnie ulepszenie, a następnie spłaszcz. Ustaw parametr

an-assay-for-measuring-effects-ethanol-on-locomotion-speed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano prosty test służący do pomiaru działania sedatywnego etanolu na muszki Drosophila, oparty na utracie odruchu prostowania.

Prosty sposób pomiaru wrażliwości much na etanol

Badacze mogą uruchomić ruch na żądanie u C. elegans, stosując pole elektryczne, które robaki wyczuwają i na które reagują. Ten film przedstawia zachowanie elektrotaktyczne i pokazuje przykładowy protokół, który jest wykonywany w urządzeniu mikroprzepływowym.

Test elektrotaksji: metoda obserwacji lokomocji u C. elegans

Ten film opisuje użycie oprogramowania do nagrywania ruchu robaków na arenie. Przykładowy protokół mierzy wpływ ekspozycji na etanol na poruszanie się robaków.

C. elegans (C. elegans) Śledzenie ruchu: metoda oceny lokomocji u robaków

Ten film demonstruje zastosowanie testu lokomocji promieniowej do oceny dysfunkcji motorycznej u C. elegans wykazujących ekspresję ludzkiego białka TDP-43 typu dzikiego lub z mutacją ALS. Robaki o różnym poziomie ekspresji TDP-43 typu dzikiego lub zmutowanego mogą pełzać, a ich ruch jest mierzony odległością promieniową przebytą od centralnego punktu na płytce testowej. Test rozróżnia łagodne, umiarkowane i ciężkie upośledzenie motoryczne na podstawie odległości przebytej przez różne szczepy C.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach C. elegans za pomocą testu lokomocji radialnej

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Test EIW (egg-in-worm) jest użyteczną metodą do ilościowego określenia zachowania podczas składania jaj. Zmiany w składaniu jaj mogą być reakcją behawioralną organizmu modelowego Caenorhabditis elegans na potencjalnie szkodliwe substancje środowiskowe, takie jak te wytwarzane przez bakterie chorobotwórcze.

Pomiar wpływu bakterii na zachowanie C. elegans za pomocą testu retencji jaj

Proste testy do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u Drosophila ułatwiają wykorzystanie tego organizmu modelowego do badania tych ważnych zachowań związanych z etanolem. W tym miejscu opisano stosunkowo prosty, skalowalny test do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u much.

Niedrogi, skalowalny test behawioralny do pomiaru wrażliwości i szybkiej tolerancji sedacji etanolem u Drosophila

Obecne metody pomiaru wrażliwości na alkohol u Drosophila są przeznaczone do testowania grup much. Przedstawiamy prosty, tani, wysokoprzepustowy test do oceny wrażliwości na sedację alkoholową u dużej liczby pojedynczych much. Metoda nie wymaga specjalistycznych narzędzi i może być wykonywana w dowolnym laboratorium przy użyciu powszechnie stosowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa metoda pomiaru czasu sedacji alkoholowej u poszczególnych osobników Drosophila melanogaster

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Obecny protokół opisuje test określający odpowiedź na lewamizol, farmakologicznego agonistę jednej klasy receptorów acetylocholiny Caenorhabditis elegans. W tym płynnym teście pływania z lewamizolem naukowcy wizualnie obserwują i określają ilościowo zależny od czasu paraliż zwierząt hodowanych na 24-dołkowych płytkach.

Pomiar wrażliwości Caenorhabditis elegans na lewamizol, agonistę receptora acetylocholiny

Poznaj metodę badania wpływu etanolu na zachowanie Caenorhabditis elegans poprzez pomiar prędkości poruszania się. Technika ta pozwala kwantyfikować wrażliwość i rozwój tolerancji u różnych genotypów.

Badanie wpływu alkoholu etylowego na prędkość poruszania się Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów