Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Niniejszy materiał wideo demonstruje zastosowanie zautomatyzowanego instrumentu do selekcji rozmiaru fragmentów w żelu w celu uzyskania lepszej jakości odczytów w platformach sekwencjonowania nowej generacji. W pierwszej kolejności pobierane są próbki wody środowiskowej, które następnie przepuszcza się przez szereg filtrów, aby systematycznie odseparować cząstki o rozmiarach charakterystycznych dla eukariotów, bakterii i wirusów. Zatrzymane bakterie są następnie dodatkowo zagęszczane poprzez wirowanie.

Następnie ekstrahuje się bakteryjne DNA. Wyekstrahowane DNA służy do przygotowania bibliotek, w których adaptery i indeksy są włączane do pofragmentowanego DNA. Następnie DNA jest amplifikowane metodą PCR, a próbki są ładowane do stacji roboczej do elektroforezy.

Następnie automatycznie wybierane są fragmenty DNA z określonego zakresu. Analiza śladów z kapilarnej elektroforezy na chipie oraz dodatkowa bioinformatyka wykazują, że metoda ta pozwala na uzyskanie odpowiedniej ilości fragmentów DNA do dalszych analiz, przy minimalnym gromadzeniu się niepożądanych fragmentów poniżej 200 par zasad. Główną zaletą zautomatyzowanej stacji elektroforezy kwadratowej lub kulek paramagnetycznych oraz innych systemów komercyjnych jest możliwość zastosowania ściślejszego, węższego zakresu selekcji, w ramach którego w jednym cyklu można przetworzyć do 96 próbek.

Choć metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o społecznościach mikrobiologicznych w próbkach wody słodkiej, można ją zastosować również do innych systemów, takich jak woda morska, oczyszczalnie ścieków, próbki roślinne, osady glebowe lub maty mikrobiologiczne – w zasadzie do każdej próbki DNA, dla której wymagamy wąskiej selekcji rozmiarów. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zaobserwowaliśmy krótkie fragmenty w sekwencjach z platformy MySEQ. Przetestowaliśmy kilka podejść do selekcji rozmiaru, w tym różne rodzaje kulek para oraz różne proporcje, a także metodę ręcznej selekcji rozmiaru w żelu.

Następnie rozpoczęliśmy współpracę z Coastal Genomics, prywatną korporacją z Kolumbii Brytyjskiej oferującą technologię Ranger. Procedurę zaprezentują dziś Michael Chan, technik badawczy z mojego laboratorium, Miguel Yi, stażysta podoktorski z mojego laboratorium oraz Jared Sloan, inżynier z Coastal Genomics. W tym filmie opiszemy wyłącznie oczyszczanie i analizę materiału odzyskanego na filtrach 0.2 micron, głównie wolno żyjących bakterii, jednak należy pamiętać, że podobne podejścia można zastosować w przypadku innych cząsteczek odzyskanych z filtrów.

Procedurę należy rozpocząć od pobrania 40 litrów próbek słodkiej wody z kilku stanowisk środowiskowych do zdezynfekowanych gąsiorów o pojemności 20 litrów. Próbki należy przefiltrować wstępnie in situ, używając polipropylenowego filtra z siatką o oczkach 105 µm. W tym przypadku próbki pobierane są z obszarów zlewni poddanych wpływom urbanizacji i rolnictwa.

Po pobraniu umieść próbki w chłodziarkach i przetransportuj je z powrotem do laboratorium. Przechowuj próbki w temperaturze 4 °C. Następnego dnia.

Przygotuj system filtracji składający się z gąsiora do zbierania próbek połączonego za pomocą pompy perystaltycznej z kapsułą pobieracza Envirocheck o wielkości porów 1 µm. Połącz kapsułę pobieracza z filtrem dyskowym 0,2 µm, a następnie połącz go z filtrem przepływu stycznego 30 kDa za pomocą drugiej pompy perystaltycznej. Włącz pompy perystaltyczne, aby przepuścić próbki przez serię filtrów; komórki eukariotyczne zostaną wyizolowane podczas przechodzenia przez kapsułę pobieracza.

Frakcja bakteryjna zostanie wyizolowana na dysku filtra membranowego, a cząstki wirusowe na filtrze do filtracji przepływu stycznego. Należy wyjąć filtr lub filtry membranowe o rozmiarze 0,2 µm z systemu filtracji wody. Następnie należy złożyć filtr na pół i umieścić go w probówce o pojemności 50 mL.

Ustawiając probówkę otworem do góry, dodaj do niej 5 mL PBS z tweenem. Jeśli podczas filtracji użyto więcej niż jednego filtra, dla każdego z nich należy zastosować osobną probówkę.

Filtry można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C lub przetworzyć od razu w następujący sposób. Następnie, używając sterylnej pęsety, wyjmij filtr membranowy z probówki o pojemności 50 ml i umieść go na szalce Petriego, korzystając ze sterylnej pęsety i sterylnych nożyczek. Przetnij filtr na kawałki o wymiarach 1 cm na 1 cm pomiędzy próbkami.

Zdezynfekuj instrumenty, mocząc je w 70% izopropanolu, przecierając środek do dekontaminacji powierzchni z DNA, a następnie płucząc je wodą ultrapurego typu 1. Umieść fragmenty filtra z powrotem w tej samej probówce o pojemności 50 ml. Za pomocą sterylnej pęsety dodaj 10 ml PBS z tweenem, aby całkowita objętość buforu wyniosła 15 ml.

Do każdej probówki o pojemności 50 ml należy dodać sześć czystych kulek wolframowych o średnicy 3 mm. Probówkę należy zamknąć folią parafilmową i intensywnie mieszać w wstrząsacu typu vortex przez 20 minut.

Po wymieszaniu w wirówce wierzchowej połączyć wszystkie zawiesiny w jednej czystej probówce o pojemności 50 mililitrów dla każdej próbki. Wirować probówki z prędkością 3 300 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu odlać nadsącz i zawiesić ponownie osad.

W pięciu mililitrach roztworu PBS rozdziel komórki bakteryjne w jedna mililitrowych aliquotach do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mililitra i wiruj w mikrocentryfudze przy 10 000 g przez 10 minut. Po wirowaniu za pomocą pipety usuń cały supernatant, pozostawiając jedynie 200 µL. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub przystąpić do ekstrakcji bakteryjnego DNA przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu do izolacji DNA.

Podczas ekstrakcji bakteryjnego DNA należy użyć PBS lub wody jako ujemnej kontroli ekstrakcji oraz E. coli jako dodatniej kontroli ekstrakcji. Po przeprowadzeniu procedury ekstrakcji DNA, połączyć alikwoty z tej samej próbki w jednej probówce o pojemności 2 mL zawierającej bufor Tris 10 mM. Następnie przeprowadzić wytrącanie przez noc, dodając roztwór składający się z 10% octanu sodu 3 M, dwóch objętości 100% etanolu oraz 5 µL akryloamidu liniowego. Próbki przechowywać w temperaturze -80 °C.

Następnego dnia odwiruj próbki przy 17 000 g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu przemyj osad jednym mililitrem lodowatego 70% etanolu; pozostaw osad do wyschnięcia na powietrzu w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez nie więcej niż pięć minut.

Następnie osad DNA należy zawiesić w 10 mM Tris-HCl. Na koniec oznaczono ilość i jakość DNA, przeprowadzając wysokoczuły fluorescencyjny test ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych, a następnie spektrometrię mikrobioobjętościową. Po określeniu ilości DNA w każdej próbce, do każdej probówki dodano odpowiednią ilość wody, aby uzyskać stężenie około 0,2 ng/µL.

Z wykorzystaniem dostępnego komercyjnie zestawu należy przygotować bibliotekę DNA składającą się z indeksowanych fragmentów z jednego nanograma bakteryjnego DNA. W tym przypadku zastosowano metodę opartą na transpozie, znaną jako mentacja, w celu jednoczesnej fragmentacji DNA i inkorporacji sekwencji adapterów. Następnie przeprowadza się reakcję PCR, aby jednocześnie przeprowadzić amplifikację i indeksowanie próbek ED, co zapewnia nadanie specyficznych kodów kreskowych każdemu fragmentowi oraz sekwencji niezbędnych do tworzenia klastrów, które mogą zostać odczytane przez platformę sekwencjonującą.

Po zakończeniu reakcji PCR pomiń standardowy etap oczyszczania po PCR i dodaj 3,5 µL buforu do nakładania do każdej próbki, tak aby uzyskać całkowitą objętość 28,5 µL. Następnie przenieś próbki do płytki 96-dołkowej. W interfejsie użytkownika oprogramowania Ranger załaduj płytkę 96-dołkową do stacji elektroforetycznej z gotową kasetą z 1,5% agarozą.

Określ zakres selekcji wielkości od 500 do 800 par zasad. Ustaw objętość ekstrakcji na 300 µL. Rozpocznij pracę urządzenia.

Stacja robocza do elektroforezy automatycznie załaduje próbki do kaset aros. Następnie do kaset przyłożone zostanie napięcie, a zamontowany na wysuwie system obrazowania zostanie wykorzystany do zidentyfikowania lokalizacji DNA próbki w kasetach aros w trakcie przebiegu analizy.

Oprogramowanie Ranger rejestruje obrazy i wykorzystując standardy wewnętrzne, szacuje pozycję wyselekcjonowanego pod kątem wielkości celu w każdej próbce. Po zidentyfikowaniu celów, oprogramowanie Ranger zmienia napięcie przyłożone do każdej próbki, aby zsynchronizować dotarcie celów do otworów ekstrakcyjnych kasety.

Na koniec stacja do elektroforezy odsysa cele w buforze TBE z dołków ekstrakcyjnych i dozuje je do nowej płytki 96-dołkowej w celu skoncentrowania surowego materiału wyjściowego, a następnie wytrąca surową objętość eluatu przy użyciu octanu sodu i etanolu z akrylamidem liniowym przez noc w temperaturze -80 °C. Próbki należy ponownie odwirować przy 17 000 ×g przez 30 minut. Po wirowaniu należy odlać nadosady i przystąpić do przemycia osadu DNA za pomocą 1 mL lodowatego, 70% etanolu w wirówce.

Próbki wirować z prędkością 17 000 g przez 30 minut, odrzucić nadsącz, osuszyć je, a następnie zawiesić osad DNA w 10 mM Tris-HCl. Następnie przeprowadzić normalizację próbek przy użyciu kulek do normalizacji bibliotek, które znajdują się w zestawie do przygotowania bibliotek Transpose-On Base. Na koniec przeprowadzić sekwencjonowanie DNA przy użyciu platformy sekwencjonowania nowej generacji, aby uzyskać bardziej informacyjne odczyty w platformach sekwencjonowania nowej generacji poprzez poprawę jakości bibliotek sekwencjonowania.

Próbki wody pobrano z ośmiu różnych miejsc w zlewni, a następnie przygotowano biblioteki DNA indeksowanego z wyizolowanej frakcji bakteryjnej, jak pokazano na tym elektroferogramie. Biblioteki DNA wygenerowane z próbek wody słodkiej po reakcji PCR, ale przed automatyczną selekcją rozmiaru, składały się z fragmentów o długości od 50 par zasad do 3000 par zasad. Po selekcji rozmiaru przy użyciu zautomatyzowanej platformy o wysokiej przepustowości, próbki zawierały wąski zakres fragmentów DNA między 500 a 800 par zasad. Zatem zastosowanie tej zautomatyzowanej platformy do selekcji rozmiaru w żelu pozwoliło na uzyskanie odpowiednich wydajności i zminimalizowało gromadzenie się niepożądanych fragmentów poniżej 200 par zasad.

Sekwencjonowanie DNA tej biblioteki na urządzeniu MiSeq z podłożem aluminiowym pozwoliło uzyskać gęstość klastrów na poziomie 1198 K na milimetr kwadratowy. Odsetek klastrów przechodzących filtry wyniósł 84,2%, przy szacowanej wydajności wynoszącej 9,2 gigabajta. Ponadto 7,4 gigabajta, czyli 82,8% odczytów, uzyskało wynik jakości większy lub równy 30.

Oznacza to, że około 83% zasad zsekwencjonowanych przy użyciu zmodyfikowanego protokołu zastosowanego do próbek wody środowiskowej wykazywało dokładność odczytu zasad na poziomie co najmniej 99,9%. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre zrozumienie tego, jak uzyskać bardziej informacyjne odczyty z bibliotek sekwencyjnych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o frakcji mikrobiologicznej, na której się skupiasz, wyborze metody przygotowania biblioteki, docelowej długości fragmentu oraz platformach sekwencjonowania.