Name: Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: Poznaj zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych z próbek wody środowiskowej. Ta metoda zwiększa przepustowość i niezawodność analiz DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez Genome BC, Genome Canada i Coastal Genomics. Autorzy dziękują Kirby'emu Croninowi i Michaelowi Chanowi za pomoc w zbieraniu i przetwarzaniu próbek. Chcielibyśmy również podziękować Thei Van Rossum i dr Fionie Brinkman za pomoc w zakresie bioinformatyki.

1. Gromadzenie i filtracja wody
<ol>
	<li>Zbierz próbki słodkiej wody z różnych miejsc (rysunek 1). Przepuszczaj próbki przez szereg filtrów: filtr 1 μm, filtr 0,2 μm i filtr o odciętym przepływie stycznym 30 kDa, aby systematycznie oddzielać cząstki o rozmiarach odpowiednio eukariotycznych, bakteryjnych i wirusowych. 
	Uwaga: W niniejszym raporcie opisano jedynie oczyszczanie i analizę materiału odzyskanego z filtrów 0,2 μm (bakterie wolno żyjące), ale podobne podejścia można zastosować w odniesieniu do innych cząstek odzyskanych z filtrów.</li>
</ol>
2. Koncentracja bakterii, ekstrakcja i oczyszczanie DNA
<ol>
	<li>Wyjmij filtr(y) membranowy(e) 0.2 μm z systemu filtracji wody (schemat ideowy, rysunek 2). Złóż filtr krążkowy 0,2 μm na pół i umieść go w probówce o pojemności 50 ml otwartą stroną do góry. Dodać 5 ml 1x buforowanego roztworu fosforanowego (PBS) i 0,01% Tween, pH 7,4 do probówki. Jeśli podczas procesu używany jest więcej niż jeden filtr, należy użyć innej rurki na filtr. Probówkę (probówki) z filtrem przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia. W przeciwnym razie przejdź do kroku 2.2.</li>
	<li>Wyjmij filtr membranowy 0,2 μm z probówki o pojemności 50 ml za pomocą sterylnych kleszczyków. Umieść filtr(y) na szalce Petriego (pozostaw bufor PBS w probówce).
	<ol>
		<li>Za pomocą sterylnych kleszczyków i sterylnych nożyczek pokrój filtr na małe paski (1 cm x 1 cm). Zdezynfekuj kleszcze i nożyczki, mocząc je w 70% izopropanolu, przecierając środkiem odkażającym powierzchnię DNA i spłukując ultraczystą wodą typu 1 między różnymi próbkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść filtr pokrojony w paski z powrotem w tej samej probówce o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml 1x PBS i 0,01% Tween, pH 7,4 do filtra, tak aby w probówce o pojemności 50 ml znajdowało się łącznie 15 ml buforu.</li>
	<li>Dodaj 6 czystych kulek wolframowych (o średnicy 3 mm) do każdej probówki o pojemności 50 ml, przykryj probówkę Parafilmem i energicznie wiruj przez 20 minut (użyj adaptera wirowego do probówek o pojemności 50 ml). Jeżeli z jednej próbki przetwarzanych jest wiele filtrów, przenieść i zebrać cały homogenat w czystej probówce o pojemności 50 ml. Odwirować probówki o sile 3 300 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad i podwielokrotne komórki bakteryjne (~1 ml podwielokrotności) w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Należy pamiętać, że w każdej próbce będzie 5 probówek do mikrowirówek.</li>
	<li>Wirować probówki do mikrowirówek o masie 10 000 x g przez 10 minut i usunąć większość supernatantu do oznaczenia ~200 μl.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub przystąpić do ekstrakcji bakteryjnego DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do izolacji DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Podczas ekstrakcji DNA bakteryjnego należy użyć PBS lub wody jako negatywnej kontroli ekstrakcji oraz E. coli jako pozytywnej kontroli ekstrakcji.</li>
	<li>Ponieważ ekstrakcja DNA z wielu probówek polega na zebraniu równoległych podwielokrotności z tej samej próbki w jednej probówce o pojemności 2 ml. Następnie przeprowadzić wytrącanie O/N przy użyciu roztworu składającego się z 0,1 objętości 3 M octanu sodu, 2 objętości 100% etanolu i 5 μl liniowego akrylamidu 5 μg/μl. Dobrze wymieszać i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Wirować z maksymalną prędkością (17 000 x g) przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć osad 1 ml lodowatego 70% etanolu, wysuszyć na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego nie dłużej niż 5 minut i ponownie zawiesić osad DNA w 34 μl 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, 
	Uwaga: Liniowy akrylamid pomoże uwidocznić osad DNA po wytrąceniu O/N.</li>
	<li>Oznaczyć ilość i jakość DNA, używając odpowiednio fluorescencyjnego testu ilościowego kwasów nukleinowych o wysokiej czułości i spektrofotometru mikroobjętościowego, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). 
	Uwaga: Jeśli w tym czasie przygotowywanych jest wiele próbek, można zamiast tego użyć ultraczułego fluorescencyjnego testu kwasów nukleinowych do ilościowego oznaczania dsDNA i fluorometru/spektrofotometru na płytce.</li>
</ol>
3. Przygotowanie biblioteki DNA
<ol>
	<li>Normalizować genomowe DNA bakteryjne wyekstrahowane z próbek wody do stężenia ~0,2 ng/μl.</li>
	<li>Enzymatycznie rozdrobnić jeden nanogram bakteryjnego DNA za pomocą metody opartej na transpozonach (tagmentacja). Dodaj sekwencje adaptera i indeksu do rozdrobnionego DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Oznaczone próbki należy poddać 12 cyklom PCR, jak wskazano w instrukcjach producenta, w którym to momencie włącza się wskaźniki sekwencjonowania.</li>
</ol>
4. Automatyczny wybór rozmiaru żelu
<ol>
	<li>Pomiń standardowy etap czyszczenia po PCR opisany w instrukcjach producenta (patrz tabela materiałów). Wybieraj rozmiar próbek po PCR bezpośrednio za pomocą zautomatyzowanej platformy doboru rozmiaru na bazie żelu.
	<ol>
		<li>Do każdej próbki dodać 3,5 μl buforu ładującego.</li>
		<li>Postępując zgodnie z protokołem producenta, załaduj próbki na stację roboczą do elektroforezy, określając docelową wielkość 500-800 pz, w objętości ekstrakcji 300 μl, przy użyciu wstępnie odlanej kasety z 1,5% agarozy.</li>
		<li>Zagęścić surowiec wyjściowy (300 μl) do 25 μl poprzez wytrącanie etanolu. 
		Uwaga: Alternatywnie można użyć stacji roboczej do elektroforezy, aby zautomatyzować zatężanie większej liczby próbek za pomocą płyty filtracyjnej i kolektora próżniowego.
		<ol>
			<li>Wytrącić surową objętość elucji, stosując 0,1 objętości 3 M octanu sodu, 2 objętości 100% etanolu i 5 μl liniowego akryloamidu 5 μg/μl. Dobrze wymieszać, umieścić próbki w temperaturze -80 °C O/N. Próbki odwirować w temperaturze 17 000 x g przez 30 minut.</li>
			<li>Odrzucić supernatanty i przystąpić do przemywania osadu DNA 1 ml lodowatego 70% etanolu.</li>
			<li>Ponownie odwirować próbki przy 17 000 x g przez 30 minut, wyrzucić supernatanty, wysuszyć na powietrzu, a na koniec ponownie zawiesić osad DNA w 25 μl 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Opcjonalnie) Użyj 1 μl biblioteki DNA o wielkości wybranej za pomocą automatycznej platformy wyboru wielkości żelu, aby wykonać pięciokrotne rozcieńczenie przy użyciu roztworu buforowego Tris-EDTA o pH 8,0. Analizuj biblioteki za pomocą przyrządu do elektroforezy kapilarnej na bazie chipa, aby analizować jakość dsDNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
5. Normalizacja i sekwencjonowanie bibliotek
<ol>
	<li>Przejdź do normalizacji próbek za pomocą koralików normalizacyjnych biblioteki (zawartych w zestawie do przygotowywania biblioteki opartej na transpozonach) zgodnie z opisem w przewodniku przygotowawczym producenta.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, zmierz biblioteki dsDNA za pomocą fluorescencyjnego testu ilościowego kwasów nukleinowych o wysokiej czułości, a następnie połącz je w proporcjach równomolowych, aby osiągnąć końcowe stężenie dsDNA 2 nM. Przystąpić do denaturacji bibliotek przy użyciu 10 μl bibliotek zbiorczych i 10 μl 0,2 N NaOH, inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć zdenaturowane biblioteki za pomocą buforu hybrydyzacyjnego (dołączonego do zestawu do przygotowywania na bazie transpozonów) do końcowej objętości 1 ml i stężenia 11,5 pM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj próbki do platformy sekwencjonowania nowej generacji, postępując zgodnie ze standardowymi protokołami sekwencjonowania producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Siuda, W., Chrost, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+susceptibility+of+dissolved+DNA+for+enzyme+degradation+in+lake+water+-+some+methodological+remarks%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks.</a> Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).</li>
<li>Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna">http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna</a> (2010).</li>
<li>Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+detection+using+environmental+DNA+from+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+letters%22%5BJournal%5D)">Species detection using environmental DNA from water samples.</a> Biology letters. 4, 423-425 (2008).</li>
<li>Liles, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery%2C+purification%2C+and+cloning+of+high-molecular-weight+DNA+from+soil+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms.</a> Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).</li>
<li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+high+molecular+weight+DNA+from+microbial+mats%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats.</a> BioTechniques. 49, 631-640 (2010).</li>
<li>Tebbe, C. C., Vahjen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+humic+acids+and+DNA+extracted+directly+from+soil+in+detection+and+transformation+of+recombinant+DNA+from+bacteria+and+a+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast.</a> Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).</li>
<li>Solonenko, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+platform+and+library+preparation+choices+impact+viral+metagenomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes.</a> BMC genomics. 14, 320(2013).</li>
<li>Aird, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+and+minimizing+PCR+amplification+bias+in+Illumina+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries.</a> Genome biology. 12, R18(2011).</li>
<li>Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQuail%2C+MA+%22Current+protocols+in+human+genetics+%2F+editorial+board%2C+Jonathan+L.+Haines+..+%5Bet+al.%5D%22">Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]</a>. 18, 18(2009).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).</li>
<li>Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing%3A+tone+down+the+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).</li>
<li>Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+high-throughput+library+preparation+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7, (2010).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).</li>
<li>Marine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+transposase+protocol+for+rapid+generation+of+shotgun+high-throughput+sequencing+libraries+from+nanogram+quantities+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA.</a> Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).</li>
<li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome research. 22, 939-946 (2012).</li>
<li>Lamble, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+workflows+for+high+throughput+library+preparation+using+the+transposome-based+nextera+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system.</a> Bmc Biotechnology. 13, (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome research. , (2014).</li>
<li>Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+Choices+for+Library+Prep%3A+A+Comparison+of+Library+Preparation+Methods+for+Whole+Genome+Sequencing+of+Cryptococcus+neoformans+Using+Illumina+HiSeq%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq.</a> PloS One. 9, e113501(2014).</li>
</ol>

Jared R. Slobodan i Matthew J. Nesbitt posiadają udziały w Coastal Genomics, prywatnej korporacji z Kolumbii Brytyjskiej oferującej technologię Ranger.

Obecność dimerów adapterowych i grupowanie małych rozmiarów wkładek, które są preferencyjnie sekwencjonowane w obecnych platformach, oznacza spadek użytecznej wydajności i niedostateczne wykorzystanie pojemności sprzętu15. Zastosowanie metod bicia koralików w połączeniu z podejściem opartym na transpozonach do przygotowania bibliotek może skutkować większym ścinaniem DNA w porównaniu z innymi metodami ekstrakcji4,5. Niemniej jednak wszystkie metody ekstrakcji i przygotowania biblioteki potencjalnie ...

Metagenomika polega na sekwencjonowaniu całego materiału genetycznego w próbce w celu scharakteryzowania obecnych społeczności mikroorganizmów. Jest to złożony i kosztowny proces, który obejmuje konwersję wyekstrahowanych kwasów nukleinowych do bibliotek DNA, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji. Wysokiej jakości biblioteki są niezbędne do uzyskania maksymalnych danych wyjściowych i dokładnej analizy metagenomicznej. Próbki środowiskowe, takie jak próbki wody, często stanowią poważne wyzwanie dla generowania wysokiej jakości bibliotek ze względu na małe ilości DNA, które mogą również ulec degradacji1-3 oraz obecność inhibitorów PCR4-6. 
Biblioteki wysokiej jakości idealnie składają się z dłuższych segmentów DNA w wąskim zakresie długości. Aby zmaksymalizować ilość użytecznych danych generowanych w każdym cyklu sekwencjonowania, długość DNA w bibliotece powinna być co najmniej tak długa, jak maksymalna długość odczytu stosowanej metody sekwencjonowania. W przypadku korzystania z technologii sekwencjonowania przez syntezę, takiej jak Illumina MiSeq, rozmiar fragmentów DNA wpływa na wydajność, z jaką klastry są generowane w komórce przepływowej. Na przykład, gdy biblioteka zawiera zarówno krótsze, jak i dłuższe fragmenty DNA, krótsze będą nadreprezentowane w danych sekwencjonowania7,8. Natomiast biblioteka z fragmentami DNA o podobnej wielkości będzie proporcjonalnie reprezentowana w danych sekwencjonowania. Wiele zestawów do przygotowania bibliotek wykorzystuje metody oparte na ligacji do dodawania adapterów do fragmentów DNA, a wybór rozmiaru jest konieczny do usunięcia dimerów adapterów, które nie zawierają insertu9,10. Istnieje wiele metod11,12, aby to osiągnąć, ale jedną techniką, która daje najbardziej spójne wyniki, jest elektroforetyczne rozdzielanie DNA, a następnie odzyskiwanie pożądanych długości DNA13,14. Proces ten można przeprowadzić ręcznie dla niewielkiej liczby próbek, ale w przypadku przetwarzania setek próbek wymagane są zautomatyzowane rozwiązania. Obecnie dostępne platformy do automatycznego wyboru wielkości żelu charakteryzują się niską przepustowością i potrzebne są nowe platformy do przetwarzania dużej liczby próbek do sekwencjonowania. Technologię Ranger można zintegrować z istniejącymi stacjami roboczymi do obsługi cieczy, aby umożliwić wykorzystanie elektroforezy w żelu agarozowym do doboru wielkości i celów analitycznych na skalę, która spełnia dzisiejsze środowisko o wysokiej przepustowości.

<table><tbody><tr><td>Pompa perystaltyczna Masterflex P/S 1400 Series</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1400-1620</td><td></td></tr><tr><td>0,2 i mikro; m Membrana Supor VWR</td><td></td><td>CA28143-969</td><td>Pall Corporation, Ann Harbor, MI</td></tr><tr><td>Koraliki z węglika wolframu 3 mm (200)</td><td>Qiagen</td><td>69997</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy 70%</td> <td>Jedmon Produkty</td><td>825751</td><td>Healthcare Plus</td></tr><tr><td>DNA away</td><td>VWR</td><td>7010</td><td>Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA</td></tr><tr><td>System oczyszczania wody Milli-Q</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZMQS6VF0Y</td><td>Merck Millipore. Ten system został wycofany z produkcji.</td></tr><tr><td>20x PBS pH 7,5</td><td>VWR</td><td>E703-1L</td><td>Amresco, Inc., Solon, OH</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>Fisher chemicals</td></tr><tr><td>Adapter wirowy dla 2 (50&nbsp; ml) rurki</td><td>VWR</td><td>13000-V1-50</td><td>MoBio, Karlowe Wary, CA</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2, 120&nbsp; V (model G560)</td><td>VWR</td><td>SI-0236</td><td>Scientific Industries, Inc.</td></tr><tr><td>Wirówka Beckman</td><td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd</td><td>Model J-6B</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji DNA PowerLyzer Powersoil</td><td>VWR</td><td>12855-100</td><td>MoBio, Karlowe Wary, CA</td></tr><tr><td>Adapter Vortex do probówek 24 (1,5-2 ml)</td><td>VWR</td><td>13000-V1-24</td><td>MoBio, Karlowe Wary, CA</td></tr><tr><td>Wirówka Microfuge 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza Nimbus Select z Ranger Technology</td><td>Hamilton Robotics</td><td>92720-01</td><td>Zawiera stację roboczą do obsługi cieczy i zintegrowany zestaw odczynników Ranger Tech (sprzęt do elektroforezy)</td></tr> <tr><td>Coastal</td><td>Genomics</td><td>CG-10600-150-12-21</td><td>Zawiera bufor załadowczy i kasety</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy (bezwodny)</td> <td>Alkohole komercyjne</td><td>P016EAAN</td><td>Greenfield Etanol</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid liniowy (5&nbsp; mg / ml)</td> <td>Life Technologies</td><td>AM9520</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem Ambion Eppendorf</td><td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Bufor EB (250 ml)</td> <td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spektrofotometr</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometr</td><td>Life Technologies</td><td>Q32857</td><td>Invitrogen. Ten produkt został wycofany z produkcji.</td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA HS</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>Odczynnik DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Chipy DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator Agilent 2011</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania próbek DNA Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw indeksów Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników MiSeq v2 (500 cykli)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>System Miseq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Sekwencjonowanie próbek środowiskowych nowej generacji może być wyzwaniem ze względu na zmienną ilość i jakość DNA w tych próbkach. Do uzyskania optymalnych wyników sekwencjonowania nowej generacji potrzebne są wysokiej jakości biblioteki DNA. Próbki środowiskowe, takie jak woda, mogą mieć niską jakość i ilość DNA, a także zanieczyszczenia, które współwytrącają się z DNA. Procesy mechaniczne i enzymatyczne związane z ekstrakcją i przygotowaniem biblioteki mogą dodatkowo uszkodzić DNA. Wybór wielkości żelu umożliwia oczyszczanie i odzyskiwanie fragmentów DNA o określonej wielkości do zastosowań sekwencjonowania. Niemniej jednak zadanie to jest jednym z najbardziej czasochłonnych etapów w procesie przygotowania biblioteki DNA. Opisany tutaj protokół umożliwia pełną automatyzację ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA. 
W tym badaniu opisujemy wysokoprzepustowe podejście do przygotowania wysokiej jakości bibliotek DNA z próbek słodkowodnych, które mogą być również zastosowane do innych próbek środowiskowych. Zastosowaliśmy podejście pośrednie do koncentracji komórek bakteryjnych z próbek słodkiej wody środowiskowej; DNA wyekstrahowano przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA, a biblioteki DNA przygotowano przy użyciu komercyjnego protokołu opartego na transpozonach. Fragmenty DNA o wielkości od 500 do 800 pz zostały wyselekcjonowane przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej do elektroforezy Ranger Technology. Sekwencjonowanie bibliotek DNA o wybranej wielkości wykazało znaczną poprawę długości odczytu i jakości odczytów sekwencjonowania.

Ocena stężenia i jakości DNA
Stężenia bakteryjnego DNA w próbkach wody z różnych obszarów zlewni wahały się od 0,01 do 0,11 ng/ml (Tabela 1). DNA wyizolowane z frakcji bakteryjnej wykazywało stosunki A260/280 i A260/230 odpowiednio od 1,4 do 1,8 oraz od 0,3 do 1,6. Mimo że niektóre wartości stosunku A260/230 były stosunkowo niskie, nie zaobserwowano wyraźnego hamowania w przygotowanej bibliotece ani w innych późniejszych zastos...

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Niniejszy materiał wideo demonstruje zastosowanie zautomatyzowanego instrumentu do selekcji rozmiaru fragmentów w żelu w celu uzyskania lepszej jakości odczytów w platformach sekwencjonowania nowej generacji. W pierwszej kolejności pobierane są próbki wody środowiskowej, które następnie przepuszcza się przez szereg filtrów, aby systematycznie odseparować cząstki o rozmiarach charakterystycznych dla eukariotów, bakterii i wirusów. Zatrzymane bakterie są następnie dodatkowo zagęszczane poprzez wirowanie.Następnie ekstrahuje się bakteryjne DNA. Wyekstrahowane DNA służy do przygotowania bibliotek, w których adaptery i indeksy są włączane do pofragmentowanego DNA. Następnie DNA jest amplifikowane metodą PCR, a próbki są ładowane do stacji roboczej do elektroforezy.Następnie automatycznie wybierane są fragmenty DNA z określonego zakresu. Analiza śladów z kapilarnej elektroforezy na chipie oraz dodatkowa bioinformatyka wykazują, że metoda ta pozwala na uzyskanie odpowiedniej ilości fragmentów DNA do dalszych analiz, przy minimalnym gromadzeniu się niepożądanych fragmentów poniżej 200 par zasad. Główną zaletą zautomatyzowanej stacji elektroforezy kwadratowej lub kulek paramagnetycznych ora

automated-gel-size-selection-to-improve-quality-next-generation

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Automatyczna selekcja rozmiaru żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych z próbek wody środowiskowej

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing to metoda przygotowania bibliotek sekwencjonowania do analizy metylacji DNA opartej na trawieniu enzymem restrykcyjnym połączonym z konwersją wodorosiarczynu cytozyny. Protokół ten wymaga 50 ng materiału wyjściowego i daje dane o rozdzielczości par zasad w regionach genomowych bogatych w GC.

Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Najczęstsze analizy zawartości jelit makrobezkręgowców są wizualne. Wymagając intensywnej wiedzy na temat różnorodności morfologicznej organizmów drapieżnych, pomijają zdobycz o miękkim ciele, a ze względu na silne rozdrobnienie zdobyczy są prawie niemożliwe dla niektórych organizmów, w tym obunogów. Zapewniamy szczegółowe, nowatorskie podejścia genetyczne do identyfikacji zdobyczy makrobezkręgowców w diecie obunogów.

Protokół laboratoryjny do analizy genetycznej zawartości jelit makrobezkręgowców wodnych przy użyciu starterów rDNA specyficznych dla grupy

Gel-seq umożliwia badaczom jednoczesne przygotowanie bibliotek dla sekwencji DNA i RNA przy znikomych dodatkowych kosztach, zaczynając od 100 - 1000 komórek za pomocą prostego urządzenia hydrożelowego. W artykule przedstawiono szczegółowe podejście do wytwarzania urządzenia, a także protokół biologiczny do generowania sparowanych bibliotek.

Gel-seq: metoda jednoczesnego przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA i RNA przy użyciu matryc hydrożelowych

Indywidualne sekwencjonowanie prowirusowe o pełnej długości (FLIPS) zapewnia efektywną i wysokoprzepustową metodę amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, prawie pełnej długości (nienaruszonych i wadliwych) prowirusów HIV-1 i pozwala na określenie ich potencjalnej zdolności replikacyjnej. Projekt FLIPS pozwala przezwyciężyć ograniczenia poprzednich testów zaprojektowanych do sekwencjonowania utajonego rezerwuaru HIV-1.

Amplifikacja prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Udostępniamy protokół, który może być ogólnie stosowany do wybranych aptamerów, które wiążą się tylko z wirusami zakaźnymi, a nie z wirusami, które stały się niezakaźne za pomocą metody dezynfekcji lub z innymi podobnymi wirusami. Otwiera to możliwość określenia statusu zakaźności w testach przenośnych i szybkich.

Selekcja aptamerów in vitro w celu odróżnienia wirusów zakaźnych od niezakaźnych

Ten protokół zapewnia łatwy do naśladowania przepływ pracy do przeprowadzenia oczyszczania poli(A) RNA, konwersji wodorosiarczynu i przygotowania biblioteki przy użyciu standardowego sprzętu dla interesującej próbki biologicznej.

Wzbogacenie biblioteki mRNA i mRNA wodorosiarczynowego do sekwencjonowania nowej generacji

Poznaj zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych z próbek wody środowiskowej. Ta metoda zwiększa przepustowość i niezawodność analiz DNA.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej (Wideo) | JoVE Journal

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Przeglądaj więcej filmów