Name: Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Poznaj półautomatyczny test inwazji sferoidów guza w biomatrycy 3D. Metoda pozwala monitorować zachowanie komórek rakowych w warunkach fizjologicznych przez 72–96 godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) oraz Oracle Cancer Trust. SE jest wspierany przez The Institute of Cancer Research i Cancer Research UK (numer grantu C309/A8274). Potwierdzamy finansowanie NHS dla Centrum Badań Biomedycznych NIHR.

1. Generowanie sferoid guza o powtarzalnej wielkości
<ol>
	<li>Przemyć monowarstwy komórek nowotworowych solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS; 5 ml dla kolby o średnicy 25 cm2 lub 8 - 10 ml dla kolby o średnicy 75cm2), dodać enzym dysocjujący komórki (1 ml dla kolby o średnicy 25 cm lub 2 ml dla kolby o średnicy 75cm2) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 - 5 minut.</li>
	<li>Sprawdzić oderwanie komórek pod mikroskopem i zneutralizować enzym dysocjujący komórki za pomocą kompletnej pożywki wzrostowej (5 ml dla kolby o średnicy 25 cm2 lub 8 ml dla kolby o średnicy 75 cm2).</li>
	<li>Zawiesina komórek wirówki przy 500 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant, postukać w probówkę i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej za pomocą pipety P1000. Powinno to dać zawiesinę pojedynczej komórki bez skupisk komórek.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńcz zawiesinę komórek, aby uzyskać 0,5 - 2 x 104 komórek/ml (optymalna gęstość komórek musi być określona dla każdej linii komórkowej w celu uzyskania sferoid guza o średnicy 300 - 500 μm 4 dni po wysiewie komórek12,13).</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika i za pomocą pipety wielokanałowej dozować 200 μl/studzienkę do 96-dołkowych płytek o okrągłym dnie12 z bardzo niskim mocowaniem (ULA).</li>
	<li>Przenieść płytki do inkubatora (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności). Cztery dni później wizualnie potwierdź tworzenie sferoidów guza i przystąp do testu inwazji 3D.</li>
</ol>
2. 3D Test inwazji sferoidów nowotworowych
<ol>
	<li>Rozmrozić BMM na lodzie.</li>
	<li>Zestaw sterylnych końcówek filtrujących do pipet i sterylnych probówek P10, P200 i P1000 (o objętości 1,5 ml lub większej, w zależności od wymaganej całkowitej objętości) należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Umieścić na lodzie 96-dołkowe płytki ULA zawierające 4-dniowe sferoidy.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie usunąć 100 μl/studzienkę podłoża wzrostowego z płytek sferoidalnych. W przypadku tego kroku należy ustawić końcówki pod kątem w kierunku wewnętrznej ściany studzienek z dnem w kształcie litery U, unikając kontaktu z dnem studni i położeniem sferoid; zminimalizować zakłócenia sferoidów.</li>
	<li>Za pomocą lodowatych końcówek przenieś BMM do lodowatych rur. W przypadku inwazji wywołanej cytokinami lub w badaniach oceny leków, dodaj odczynniki (o stężeniu 2x końcowym) do BMM za pomocą lodowatych końcówek. Na przykład użyj naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), aby stymulować inwazję komórek raka płaskonabłonkowego CALS iCAL R. Dobrze wymieszaj, delikatnie obracając, unikając tworzenia się pęcherzyków.</li>
	<li>Delikatnie dozuj 100 μl BMM do studzienki w kształcie litery U, kierując końcówkę w stronę wewnętrznej ścianki studzienki. Ten krok jest najbardziej krytyczny, ponieważ, aby zapewnić optymalną analizę obrazu, sferoidy muszą pozostać w środku studzienki12.</li>
	<li>Powtórz krok 2.6 dla wszystkich wymaganych studzienek, pozwalając na 5-6 powtórzeń/warunek. W razie potrzeby zmień końcówkę na świeżo schłodzoną. 
	UWAGA: Jeśli masz większe doświadczenie, dozuj BMM za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej igły usuń pęcherzyki, jeśli są obecne.
	<ol>
		<li>Za pomocą mikroskopu sprawdź wzrokowo, czy sferoidy znajdują się w centralnym położeniu. W przeciwnym razie należy odwirować płytkę o masie 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Zapewni to, że sferoidy będą umieszczone centralnie w każdej studni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i pozostawić BMM do zestalenia się.</li>
	<li>1 godzinę później, za pomocą pipety wielokanałowej, delikatnie dodaj 100 μl/studzienkę kompletnego podłoża wzrostowego. W przypadku badań inwazji wywołanej cytokinami lub oceny leku, należy uwzględnić cytokiny lub inhibitory w pożywce (1x stężenie końcowe). Alternatywnie, jeśli odczynniki nie zostały dodane do BMM w kroku 2.5, dodaj je do pożywki w tym momencie (3x pożądane stężenie końcowe).</li>
</ol>
3. Automatyczne pozyskiwanie obrazów
<ol>
	<li>Skanuj płytki na cytometrze (specyfikacje znajdują się w Tabeli sprzętu i materiałów) w odstępach czasu, zaczynając od czasu zerowego (t0 = dzień przygotowania testu inwazji, bezpośrednio po kroku 2.10 do 72 godzin lub 96 godzin dla wolniej atakujących linii komórek nowotworowych.</li>
	<li>Wybierz aplikację "Confluence".</li>
	<li>Sprawdź, czy sferoida jest ostra i, jeśli to konieczne, wyreguluj ręcznie i napraw "Przesunięcie ostrości".</li>
	<li>W sekcji "Ustawienia próbkowania" wybierz, aby zeskanować jedno centralne pole widzenia (FOV). Po dodaniu BMM sferoidy guza powinny pozostać w pozycji centralnej, dlatego nie ma potrzeby skanowania całej studni.</li>
	<li>W oprogramowaniu zdefiniuj studnie, które mają zostać zeskanowane, zaznaczając je na mapie płyty. Kliknij "Rozpocznij skanowanie". 
	UWAGA: Skan jest zapisywany automatycznie i można go później przejrzeć w trybie offline.</li>
</ol>
4. Automatyczna analiza obrazu
<ol>
	<li>Wybierz aplikację "Confluence".</li>
	<li>W zakładce "Analiza" dostosuj ustawienia aplikacji (np. "precyzja": niska, normalna, wysoka; "próg intensywności": 1 - 15), aby uzyskać precyzyjną segmentację wokół sferoidy, w tym procesy komórkowe i inwadopodia rozciągające się do BMM (patrz rysunek 1). Dostosuj ustawienia dla każdej linii komórek nowotworowych i/lub w różnych punktach czasowych. Aplikacja "Confluence" mierzy % powierzchni studzienki pokrytej przez atakujące komórki, w wybranym polu widzenia.</li>
	<li>Sprawdź, czy ustawienia analizy są odpowiednie (tj. segmentacja jest dokładna) dla innych sferoid na płycie, klikając kilka różnych dołków. Jeśli segmentacja nie wyznacza dokładnie sferoidy, dostosuj ustawienia aplikacji dalej.</li>
	<li>Kliknij "Rozpocznij analizę".</li>
	<li>W zakładce "Wyniki" sprawdź wiele dołków, aby zweryfikować jakość analizy. Eksportuj "Dane na poziomie studni" do programu arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Powtórz analizę dla wszystkich punktów czasowych. Oblicz średnią % konfluencji dla zduplikowanych odwiertów i inwazji wykresu (% konfluencji) w funkcji czasu na wykresie słupkowym, korzystając z wybranych wykresów naukowych i oprogramowania statystycznego.</li>
</ol>
5. Ręczne pozyskiwanie obrazów
<ol>
	<li>Rejestruj obraz dla każdej sferoidy guza w odstępach od t = 0 do 72 - 96 godzin, w zależności od prędkości inwazji danej linii komórkowej, za pomocą mikroskopu odwróconego (w przypadku płytki 96-dołkowej zajmuje to około 20 - 30 minut). Użyj obiektywu 10X. Użyj obiektywu 4X, gdy zaatakowany obszar jest zbyt duży, aby można go było całkowicie uchwycić w polu widzenia 10X.</li>
	<li>Zapisz każdy uzyskany obraz z osobna.</li>
	<li>W celu kalibracji zrób zdjęcia siatki stolika (1 mm) przy użyciu obiektywów 10X i 4X (i zapisz obrazy).</li>
</ol>
6. Ręczna analiza obrazu
<ol>
	<li>Otwórz obrazy siatki stołu montażowego w wybranym oprogramowaniu do analizy obrazu.</li>
	<li>Wprowadź pomiary siatki, jednostki (μm), używane obiektywy (10X lub 4X) i przeprowadź kalibrację. Ten krok jest wymagany tylko raz. W celu późniejszej analizy obrazu wystarczy ponownie załadować wymagane ustawienia kalibracji.</li>
	<li>Otwórz obrazy testu inwazji i wybierz ustawienia kalibracji w zależności od obiektywu mikroskopu (10X lub 4X) użytego do uzyskania obrazów.
	<ol>
		<li>Alternatywnie można zaimportować obrazy uzyskane za pomocą cytometru obrazowego (krok 3) i przeanalizować je ręcznie, zgodnie z opisem dla obrazów uzyskanych przy użyciu mikroskopu odwróconego (patrz wyniki pokazane na rysunku 3 i rysunku 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz obszar pokryty sferoidami.
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu używanym tutaj do reprezentatywnych wyników (specyfikacje znajdują się w tabeli wyposażenia i materiałów) przejdź do "Pomiaru" i wybierz "Liczba/rozmiar". Wybierz "Plik", a następnie "Załaduj ustawienia" i wybierz wstępnie określone ustawienia testu. Następnie wybierz opcję "Policz". Sferoida powinna być następnie dokładnie podzielona na segmenty.</li>
		<li>Możesz też przejść do "Edytuj", a następnie "Rysuj/Scalaj obiekty", aby otworzyć okno "Magiczna różdżka/Śledź". Użyj kursora różdżki, aby kliknąć obraz sferoidalny i uzyskać segmentację. Wybierz "Śledź" (w oknie "Magiczna różdżka"), aby ręcznie obrysować sferoidę za pomocą myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksport pomiarów o różnych parametrach (powierzchnia, średnica, obwód itp.) do arkusza kalkulacyjnego. Zapisz w arkuszu kalkulacyjnym odpowiednie informacje o obrazie (np. numer studni, względny punkt czasowy).</li>
	<li>Wykreśl średnią powierzchnię replikowanych sferoid (inwazji) w funkcji czasu, korzystając z wykresów naukowych i oprogramowania statystycznego. Alternatywnie, oblicz zmianę obszaru sferoidalnego w każdym punkcie czasowym względem obszaru przy t = 0. Następnie wykreśl inwazję (% t0) w funkcji czasu jako wykres liniowy.</li>
</ol>

<ol><li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+therapeutics%22%5BJournal%5D)">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology & therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li>
<li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+vs.+Three-Dimensional+In+Vitro+Tumor+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays.</a> Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).</li>
<li>Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia+formation+in+oral+squamous+cell+carcinoma%3A+the+role+of+epidermal+growth+factor+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling.</a> Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+invadopodia+formation+for+lung+carcinoma+invasion+with+a+microfluidic+3D+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device.</a> PLoS One. 8 (2), e56448(2013).</li>
<li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+invasion+and+the+microenvironment%3A+plasticity+and+reciprocity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li>
<li>Brekhman, V., Neufeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+asymmetric+3D+in-vitro+assay+for+the+study+of+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion.</a> BMC Cancer. 9, 415(2009).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
<li>Deisboeck, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+self-organization+in+tumour+systems%3A+complex+growth+dynamics+in+a+novel+brain+tumour+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model.</a> Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).</li>
<li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth%2C+invasion+and+drug+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), e10431(2010).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
<li>Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods and Protocols. , 253-266 (2013).</li>
<li>Box, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+serum+protein+signature+associated+with+resistance+to+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).</li>
<li>Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+growth+factors+on+invasion+and+proliferation+of+endocrine+resistant+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), e41847(2012).</li>
<li>Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin-C+is+expressed+by+human+glioma+in+vivo+and+shows+a+strong+association+with+tumor+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+research%22%5BJournal%5D)">Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels.</a> Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li>
<li>Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+glioblastoma+cells+acquire+stemness+and+increased+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation.</a> Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).</li>
</ol>

Opłaty za otwarty dostęp zostały wsparte przez Nexcelom Bioscience, LLC.

Dwa opisane tutaj modele nowotworów (glejak wielopostaciowy i SCCHN) zostały specjalnie wybrane, aby zilustrować nasz test 3D, ponieważ są to klinicznie istotne nowotwory miejscowo inwazyjne z niezaspokojoną potrzebą skutecznych terapii12. Po leczeniu farmakologicznym ocenę zmian biomarkerów farmakodynamicznych (PD) in vitro można łatwo przeprowadzić za pomocą western blot lub testów immunologicznych lizatów po zastosowaniu specyficznych dostępnych na rynku odczynników, aby umożliwić regenerację komórek z BMM i/lub analizę immunofluorescencyjną inwazyjnych sferoid guza przez barwienie całego wierzchowca.
Ten test inwazji jest przydatną techniką do szybkiej i powtarzalnej oceny inwazji komórek nowotworowych na półstałe podłoże i dlatego jest szczególnie odpowiedni do przyszłych badań przesiewowych leków in vitro . Komórki rakowe atakują macierz w sposób 3D, gdy rozprzestrzeniają się z "mikroguza", reprezentowanego przez sferoidę guza, i rozszerzają się do środowiska przypominającego macierz zewnątrzkomórkową. Prawdziwa trójwymiarowość testu jest widoczna w morfologii komórki, która różni się od płaskiej, przylegającej morfologii, jaką komórki przyjmują, poruszając się po stałym podłożu. Stopień inwazji można łatwo określić ilościowo za pomocą cytometru obrazowego, umożliwiającego automatyczny odczyt, lub za pomocą standardowego mikroskopu w połączeniu z oprogramowaniem do obrazowania. Ponadto metoda ta nadaje się do obrazowania fluorescencyjnego13 (na przykład z liniami komórkowymi wykazującymi ekspresję białek fluorescencyjnych lub wstępnie znakowanymi barwnikami fluorescencyjnymi).
Metoda jest prosta do wykonania, a jedynym krytycznym krokiem jest dodanie BMM, gdy istnieje ryzyko zakłócenia centralnego położenia sferoidy w studzience w kształcie litery U. Może to skutkować nieoptymalną analizą obrazu, ze sferoidami w różnych płaszczyznach ogniskowych. Dlatego bardzo ważne jest, aby ostrożnie i powoli dodawać BMM do każdej studzienki. Po dodaniu BMM zaleca się sprawdzenie płytki pod mikroskopem, a jeśli lokalizacja jest uważana za niedopuszczalną, można temu zaradzić poprzez delikatne odwirowanie. Z doświadczenia rzadko jest to konieczne. Chociaż metoda ta jest solidna i bardzo powtarzalna, zmienność międzydoświadczalna może wystąpić w przypadku różnych partii BMM. Aby tego uniknąć, zaleca się zakup wystarczającej ilości BMM z jednej partii, aby ukończyć serię badań.
Ograniczeniem metody (jak w przypadku każdego takiego testu) jest trudność w rozróżnieniu między inwazją a proliferacją, której komórki nowotworowe prawdopodobnie podlegają w czasie testu. Chociaż można wziąć pod uwagę czas podwajania komórek lub wprowadzić inhibitory cyklu komórkowego, takie jak cytochalazyna D, nie jest łatwo kontrolować lub wyraźnie rozróżnić te dwa różne aspekty progresji guza, szczególnie w przypadku szybko rosnących komórek nowotworowych i tych, które mają bardziej "ekspansywny", a nie naciekający, wzorzec inwazji. Z tego powodu sugeruje się, aby przeprowadzić równoległy test wzrostu 3D w celu oceny specyficznych skutków wszelkich środków hamujących lub stymulujących. Jeżeli przeprowadzone zostaną dokładne badania odpowiedzi na dawkę, możliwe będzie wybranie stężeń, które minimalizują wpływ na proliferację. Na przykład wykazaliśmy, że inhibitor HSP90 17-AAG hamuje inwazję sferoidalną guza U-87 MG 3D już po 24 godzinach i w stężeniach poniżej stężenia, hamując wzrost 3D o 50% (GI50)12.
Z drugiej strony, znaczenie tego testu w porównaniu z innymi standardowymi testami inwazji (np. Testy oparte na filtrze lub inwazja pojedynczych komórek na matryce 3D1) polega na tym, że komórki nowotworowe intrują do otaczającej macierzy ze sferoidy, która przypomina "mikroguz" lub "mikroprzerzuty", a zatem uwzględnia ważne aspekty patofizjologii masy guza. Przedstawiona przez nas metoda dostarcza informacji na temat zbiorowego zachowania komórek nowotworowych, gdy początkowo opuszczają sferoidy, a także indywidualnie, gdy pojedyncze komórki docierają do bardziej odległych obszarów BMM. Ponadto komórki w sferoidach guza mogą doświadczać niedotlenienia i niedoboru składników odżywczych, co poprzez zmiany w ekspresji genów może sprzyjać migracji i inwazji; takie cechy są nieobecne w testach 2D. Co więcej, wszystko to jest dostępne w formacie o wysokiej przepustowości dzięki zastosowaniu specjalnych 96-dołkowych płytek i najnowszej technologii obrazowania, co pozwala na łatwe wykorzystanie bardziej złożonego testu 3D do walidacji celów i odkrywania leków.
Metoda, którą prezentujemy, może pomieścić dalsze zastosowania w celu rozwiązania dodatkowych aspektów inwazji komórek nowotworowych. W szczególności można przewidzieć dodatkową złożoność poprzez dodanie komórek gospodarza, takich jak fibroblasty i/lub komórki śródbłonka, do samej sferoidy lub otaczającej ją macierzy. Można to również modyfikować, nie tylko pod względem sztywności (poprzez zastosowanie różnych stężeń BMM), ale także pod względem składu (poprzez dodanie innych składników zależnych od konkretnej tkanki/narządu przyjętego modelu nowotworu: np. tenascyny w przypadku raka mózgu16 i kolagenu w przypadku raka piersi17).
Podobny układ (generowanie sferoid i obrazowanie) można również dostosować do oceny inwazji tkanek w 3D, gdzie sferoidy guza są współhodowane z ciałami embrionalnymi przypominającymi złożoną tkankę12 lub z innymi organoidami specyficznymi dla komórek (np. astrocytami w przypadku glejaka18 lub kulturami krypt w przypadku nowotworów przewodu pokarmowego), ale konieczne są dalsze prace, aby umożliwić automatyczną analizę obrazu.

Klasyczny rozwój leków przeciwnowotworowych jest głównie skoncentrowany na wykorzystaniu testów in vitro opartych na komórkach do wykrywania czynników cytotoksycznych, które hamują proliferację komórek nowotworowych i/lub promują programowaną śmierć komórki (apoptozę). Ostatnio wysiłki przeniosły się na terapie celowane wraz z opracowaniem inhibitorów molekularnych przyczyn leżących u podstaw proliferacji komórek nowotworowych. Pomimo spektakularnych wyników, takie środki często wiążą się z szybkim rozwojem lekooporności. Biorąc pod uwagę, że to właśnie potencjał inwazyjny i przerzutowy komórek nowotworowych jest odpowiedzialny za większość zgonów z powodu raka, a nawrót choroby często ma bardziej agresywny fenotyp, logiczne jest również rozważenie komplementarnych modeli eksperymentalnych in vitro 1,2 w celu zidentyfikowania nowych czynników, które będą hamować te dodatkowe kluczowe "cechy charakterystyczne" raka.
Podczas progresji nowotworu, komórki nowotworowe nabywają zdolność do atakowania otaczającej tkanki i/lub rozprzestrzeniania się na odległe narządy (przerzuty). Komórki nowotworowe przenikają przez błonę podstawną poprzez tworzenie inwadopodiów3,4. Struktury te są wzbogacone o filamenty aktynowe, specyficzne białka adhezyjne i proteinazy i są wspólnie odpowiedzialne za ruchliwość komórek nowotworowych i degradację macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)5. Inwadopodia rozciągają się do ECM i uważa się, że są ważne dla inwazji komórek nowotworowych, a także wynaczynienia do kanałów naczyniowych, ułatwiając rozsiewanie krwiopochodne (lub limfatyczne) i przerzuty.
Obecne standardowe metody oceny inwazji komórek nowotworowych in vitro obejmują następujące. Testy w komorze Transwella lub w komorze Boydena2,6, w których zawiesiny pojedynczych komórek są wysiewane na wierzchu filtra pokrytego grubą warstwą białek pochodzących z ECM. Komórki następnie atakują i przemieszczają się do dolnej komory w odpowiedzi na chemoatraktant. Powszechnie stosowanymi białkami ECM są kolagen typu I lub macierz przypominająca błonę podstawną (BMM, np. Matrigel, pochodząca z guza EHS7), która naśladuje naturalny skład błon podstawnych.
Jako alternatywa dla testów typu komora Boydena opartych na filtrze8, komórki mogą być wysiewane na wierzchu żelu ECM (do którego mogą być dodawane fibroblasty), gdzie tworzą monowarstwę, a następnie indywidualnie lub zbiorowo intrują w żelu. Inwazję można zmierzyć pod względem liczby atakujących komórek i/lub odległości przebytej od powierzchni żelu9. Komórki nowotworowe mogą być również całkowicie osadzone w macierzy, albo jako zawiesina pojedynczej komórki, albo jako sferoidy - zwykle umieszczone między dwiema warstwami żelu ECM - umożliwiając komórkom inwazję z masy guza do otaczającej macierzy2,6,10,11.
Opisany tutaj trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza zapewnia szybki, zautomatyzowany system inwazji przy użyciu wysoce powtarzalnej, ustandaryzowanej metody12 w formacie płytki 96-dołkowej z jedną sferoidą na studzienkę. BMM jest dodawany bezpośrednio do każdej studzienki, aby zapewnić półstałą matrycę, do której komórki nowotworowe atakują z ciała sferoidalnego. Stopień inwazji komórek nowotworowych jest monitorowany w odstępach czasu przez okres 72 - 96 godzin. Metoda ta zapewnia następujące zalety w porównaniu z obecnymi testami inwazji in vitro, o których mowa powyżej: komórki nowotworowe są zorganizowane w strukturę 3D naśladującą mikroregion guza lub mikroprzerzuty; sferoidy guza są wysoce powtarzalne pod względem wielkości; Test inwazji przeprowadza się in situ na tej samej płytce, na której rozwija się sferoid guza, bez konieczności przenoszenia ich na płytki wtórne; Metoda, w połączeniu z najnowszymi technologiami automatycznej analizy obrazu, umożliwia zarówno wysokotreściowe, jak i wysokoprzepustowe analizy inwazji komórek nowotworowych.
Analiza obrazu jest wykonywana za pomocą cytometru obrazowego, który skanuje 96-dołkową płytkę w ciągu 10 minut. Korzystając z aplikacji konfluencji, zakres i szybkość inwazji osiągniętej zarówno przez pojedyncze komórki, jak i przez klastry komórek rozprzestrzeniające się ze sferoid guza i wnikające do macierzy, można zmierzyć w sposób dynamiczny. W celu uzyskania mniejszej przepustowości przedstawiono alternatywną metodę analizy obrazu, opartą na wykorzystaniu mikroskopu odwróconego i standardowego oprogramowania do obrazowania.

<table><tbody><tr><td>Matryca błony podstawnej Corning Matrigel</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>354234</td><td>Przechowywać w 4 &amp;deg;C, aby zapobiec krzepnięciu; dozować za pomocą schłodzonych końcówek do pipet</td></tr><tr><td>Ekstrakt z błony podstawnej Cultrex, PathClear</td><td><a href="http://www.trevigen.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Trevigen</a></td><td>3432-005-01</td><td>Przechowywać w 4 &amp;deg;C, aby zapobiec krzepnięciu; dozować za pomocą schłodzonych końcówek do pipet</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa o ultra niskim przytwierdzaniu</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td><a href="http://www.miltenyibiotec.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Miltenyi Biotec</a></td><td>130-093-825</td><td>Do 100 &amp;mu;g EGF dodać 100 &amp;mu;l 1% BSA (w/v) w wodzie. Do 25 &amp;mu;l tak przygotowanego roztworu dodać 4,975 &amp;mu;l pożywki RHB-A, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 5 &amp;mu;g/ml. Podzielić na aliquoty i przechowywać w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pożywka RHB-A</td><td><a href="http://www.stemcellsinc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Stem Cells Inc.</a></td><td>SCS-SF-NB-01</td><td>Do rozcieńczania EGF</td></tr><tr><td>DMEM</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>31966-021</td><td>Przed użyciem ogrzać w kąpieli wodnej o temperaturze 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td><a href="http://www.biosera.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Biosera</a></td><td>1001/500</td><td>Przed użyciem podgrzać do 56 &amp;deg;C w celu inaktywacji dopełniacza</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>12605</td><td>Roztwór do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>Cytometr Celigo</td><td><a href="http://www.nexcelom.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Nexcelom Bioscience</a></td><td>n/a</td><td>Specjalistyczny sprzęt do przechwytywania i analizy obrazów. Alternatywą jest ręczne przechwytywanie obrazów za pomocą mikroskopii i niezależnego oprogramowania do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony IX70</td><td><a href="http://www.olympus.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Olympus</a></td><td>n/a</td><td>Używany z kamerą do ręcznego przechwytywania obrazów</td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera Retiga Exi Fast 1394</td><td><a href="http://www.qimaging.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Qimaging</a></td><td>n/a</td><td>Przymocowana do mikroskopu do ręcznego przechwytywania obrazów</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>Oprogramowanie służące do sterowania kamerą i mikroskopem podczas ręcznego przechwytywania obrazów</td></tr><tr><td>Image-Pro Analyzer 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>Samodzielne oprogramowanie do analizy obrazu do ręcznego pomiaru wielkości sferoidów</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td><a href="http://www.microsoft.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td>n/a</td><td>Oprogramowanie do tworzenia wykresów naukowych i analizy statystycznej</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td><a href="http://www.graphpad.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad</a></td><td>n/a</td><td>Oprogramowanie do tworzenia wykresów naukowych i analizy statystycznej</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowy (3d) test inwazji sferoidów guza

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest ogólnie uważana za kluczową cechę nowotworów złośliwych (w przeciwieństwie do łagodnych). W szczególności w przypadku niektórych nowotworów (np. guzów mózgu, takich jak glejak wielopostaciowy i rak płaskonabłonkowy głowy i szyi – SCCHN) jest przyczyną ciężkiej chorobowości i może zagrażać życiu nawet przy braku odległych przerzutów. Ponadto nowotwory, u których nastąpił nawrót choroby po leczeniu, niestety często mają bardziej agresywny fenotyp. W związku z tym istnieje możliwość ukierunkowania procesu inwazji w celu zapewnienia nowatorskich terapii, które mogłyby być komplementarne ze standardowymi środkami antyproliferacyjnymi. Do tej pory strategia ta była utrudniona ze względu na brak solidnych, powtarzalnych testów odpowiednich do szczegółowej analizy inwazji i badań przesiewowych leków. Tutaj udostępniamy prostą metodę mikropłytek (opartą na jednolitych, samoorganizujących się sferoidach nowotworowych 3D), która ma ogromny potencjał dla takich badań. Ilustrujemy platformę testową wykorzystującą ludzką linię komórkową glejaka, a także model SCCHN, w którym rozwój oporności na inhibitory receptora docelowego naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) wiąże się ze zwiększonym potencjałem inwazyjnym macierzy. Oferujemy również dwie alternatywne metody półautomatycznej kwantyfikacji: jedną z wykorzystaniem cytometru obrazującego i drugą, która wymaga po prostu standardowej mikroskopii i przechwytywania obrazu z cyfrową analizą obrazu.

Inwazję sferoid nowotworowych 3D ocenia się za pomocą prostej, powtarzalnej i zautomatyzowanej metody przedstawionej schematycznie na Rysunku 1: sferoidy nowotworowe o powtarzalnej wielkości uzyskuje się poprzez wysiewanie komórek do płytek 96-dołkowych o okrągłym dnie typu ULA. 4 dni po inicjacji sferoidy zostają zatopione w BMM. Zapewnia to półstałą strukturę, w którą wnikają komórki nowotworowe, rozprzestrzeniając się poza sferoid. Sferoidy znajdują się centralnie u podstawy każdego dołka, a inwazję do BMM można łatwo monitorować w odstępach czasu od t = 0 do 72 - 96 hr za pomocą cytometru obrazowego. Pozwala to na w pełni zautomatyzowaną analizę obrazu.
Przykłady różnych typów inwazji komórek nowotworowych przedstawiono na Rysunkach 2 - 4. Wysoce złośliwa ludzka linia komórkowa glioblastoma multiforme (GBM) U-87 MG tworzy zwartą, sferyczną strukturę 3D i służy tutaj jako przykład guzów mózgu, w których lokalna inwazja jest kluczową cechą zagrażającą życiu. Po osadzeniu w BMM, komórki ze sferoidów U-87 MG rozprzestrzeniają się w typowy wzór inwazji przypominający „wybuch gwiazdy”12. Komórki nowotworowe rozszerzają się promieniście w macierzy, w której zachowują trójwymiarowy kształt. Proces ten śledzono przez okres 72 hr, co pokazano na Rysunku 2 dla sferoidów U-87 MG, gdzie wyraźnie widoczny jest zakres inwazji komórek nowotworowych, wraz ze szczegółami procesów komórkowych i invadopodiów wnikających w BMM. W pełni zautomatyzowana analiza obrazu z wykorzystaniem cytometru obrazowego umożliwia precyzyjną kwantyfikację inwazji komórek nowotworowych w czasie. Kwantyfikacja na Rysunku 2 została uzyskana zgodnie z ilustracją na Rysunku 1, gdzie zautomatyzowana analiza generuje segmentację wokół wypustek komórkowych wnikających do BMM z korpusu sferoidu U-87 MG. Należy zauważyć, że w przypadku tej linii komórkowej korpus sferoidu nowotworowego jest wykluczony z pomiaru obszaru inwazji.
Inny wzorzec inwazji zaobserwowano w liniach komórkowych ludzkiego raka płaskonakletkowego głowy i szyi. Linie CALS i CALR są izogeniczne, jednak CALS jest wrażliwa na inhibitory tyrozynowej kinazy EGFR, natomiast CALR jest na nie oporna14. Wobec braku EGF żadna z linii komórkowych nie wykazała inwazji do BMM (Rysunek 3), jednak wraz ze wzrostem stężenia EGF (do 2,5 ng/ml) sferoidy zaczęły „pączkować”. Przy wyższych stężeniach EGF (40 i 80 ng/ml) stopień inwazji uległ zmniejszeniu. Jest to zgodne z wcześniej opisaną, klasyczną dzwonowatą odpowiedzią dawka-odpowiedź na EGF w kontekście inwazji15. Przy stężeniu 20 ng/ml EGF, z głównego ciała sferoidów CALR wydzielały się wypustki przypominające palce, podczas gdy komórki CALS wykazywały mniejszą zdolność do inwazji po 72 h (Rysunek 3). Ta różnica w inwazji była widoczna 48 h po umieszczeniu sferoidów w BMM (zawierającym 20 ng/ml EGF w celu maksymalnego rozróżnienia linii komórkowych), a najwyższą była po 72 h (Rysunek 4). Obrazy te pozyskano szybko za pomocą cytometru obrazowego, podobnie jak w przypadku U-87 MG. Jednak w tym przypadku, aby zaprezentować alternatywną metodę, stopień inwazji określono ilościowo ręcznie, korzystając z samodzielnego oprogramowania do analizy obrazu, i przedstawiono go graficznie (Rysunki 3 i 4). Wyniki te ilustrują różnice fenotypowe między komórkami wrażliwymi a opornymi na lek, co mogłoby zostać wykorzystane do przesiewania związków, które specyficznie zniesą oporny na leki, inwazyjny fenotyp.
<img alt="Proces hodowli sferoidów nowotworowych, płytka 96-dołkowa i analiza za pomocą cytometru Celigo, schemat doświadczenia." src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczny przegląd testu inwazji 3D sferoidów nowotworowych. Przepływ pracy przedstawia etapy metody, w tym reprezentatywne obrazy sferoidów glejaka U-87 MG bezpośrednio po osadzeniu w BMM (panel górny; t = 0) oraz po inwazji do BMM (panel dolny; t = 72 hr), z segmentacją mierzącą obszar zajęty przez komórki naciekające oraz bez niej. Pasek skali = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Inwazja komórek w czasie; obrazy mikroskopowe, wzrost w czasie 0-72 h; wykres słupkowy procenta inwazji." src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przebieg czasowy inwazji sferoidów glejaka U-87 MG do BMM. Inwazja 3D sferoidów U-87 MG do BMM była monitorowana i ilościowo określana do 72 h przy użyciu cytometru obrazowego. (A) Przedstawiono reprezentatywne obrazy, a (B) ilościowe oznaczenie inwazji komórek nowotworowych. Pasek = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Test inwazji organoidów; obrazy mikroskopowe, stężenie EGF, wykres procentu inwazji w funkcji EGF." src="/files/ftp_upload/52686/52686fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Inwazja sferoidów nowotworowych CALR (opornych) i CALS (wrażliwych). (A) Przedstawiono reprezentatywne obrazy oraz (B) manualną kwantyfikację zależnej od dawki EGF inwazji sferoidów nowotworowych CALR i CALS. Pasek = 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Test inwazji komórek, CALS vs. CALR, obrazy mikroskopowe z okresu 0-72h, wraz z analizą wykresu % inwazji." src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4. Komórki ze sferoidówCALR (opornych) wykazują większą inwazyjność niż sferoidy nowotworowe CALS (wrażliwe) po umieszczeniu w BMM. Po stymulacji EGF sferoidy nowotworowe CALR wykazują bardziej nasiloną inwazję niż CALS. (A) Przedstawiono reprezentatywne obrazy oraz (B) manualną kwantyfikację inwazji. Pasek = 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie in vitro, półautomatycznego, trójwymiarowego testu inwazji komórek nowotworowych w mikropłytce. Jest to realizowane poprzez najpierw powtarzalne generowanie sferoidów nowotworowych o określonej wielkości w zawiesinie w płytkach 96-dołkowych o zaokrąglonym dnie i ultraniskiej adhezji, z jednym sferoidem w każdym dołku. Drugim krokiem jest usunięcie części pożywki i dodanie do każdego dołka macierzy przypominającej błonę podstawną (BMM), aby zapewnić półstałą macierz, w którą komórki nowotworowe naciekają z ciała sferoidu.Następnie inwazję steroidów nowotworowych monitoruje się w odstępach czasu przez okres od 72 do 96 godzin, podczas którego akwizycja obrazów jest wykonywana automatycznie na cytometrze lub ręcznie za pomocą mikroskopu. Ostatnim krokiem jest analiza inwazji komórek nowotworowych przy użyciu automatycznego cytometru lub oprogramowania do analizy obrazu. W ostateczności test inwazji steroidów nowotworowych 3D jest wykorzystywany do modelowania inwazji raka in vitro w formacie, który jest bardziej istotny fizjologicznie i odpowiedni do walidacji celów oraz badań przesiewowych leków.Uważamy, że technika ta uzupełnia proste dwuwymiarowe testy proliferacji komórek, zazwyczaj stosowane do walidacji celów i przesiewania leków w badaniach nad rakiem, ponieważ pozwala ona również badać inwazję, która jest kluczowym aspektem progresji nowotworu, w fizjologicznie istotnym formacie trójwymiarowym. Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie podczas optymalizacji 3D tumor phe, czyli wzrostu na mikropłytce. Pomyślałem, że warto wykorzystać ten sam układ, aby przyjrzeć się również inwazji; rozwiązanie okazało się proste – wystarczyło usunąć część medium z każdego dołka i zastąpić je macierzą przypominającą błonę podstawną.Wizualna demonstracja tej metody jest niezbędna, ponieważ utrzymanie steroidów w centralnej części każdej studzienki po przeniesieniu BMM może być na początku trudne. Może to prowadzić do nieoptymalnej analizy obrazu z powodu znajdowania się steroidów w różnych płaszczyznach ogniskowania. Wraz z doświadczeniem.Dzieje się to rzadko, ale w razie potrzeby proces ten można ułatwić poprzez delikatne wirowanie płytki. Aby rozpocząć przygotowanie wszystkich BMM na lodzie przez noc, należy przygotować zestaw sterylnych końcówek z filtrem do pipet P 10 E 200 i P 1000 oraz sterylne probówki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Należy również umieścić na lodzie płytki 96-dołkowe o ultraniskim przywieraniu zawierające czterodniowe steroidy.Używając pipety wielokanałowej, ostrożnie usuń po 100 µL pożywki wzrostowej z każdej studzienki płytek typu sparrow. Na tym etapie skieruj końcówkę w stronę wewnętrznej ścianki dna w kształcie litery U. Unikaj kontaktu z dnem studzienki oraz miejscem, w którym znajduje się sferoid.Aby zminimalizować zaburzenia poziomu steroidów, należy przenieść BMM do schłodzonych w lodzie probówek, używając końcówek schłodzonych w lodzie. W przypadku badań nad inwazją indukowaną cytokinami lub badań nad oceną leków, należy dodać odczynniki do BMM, używając końcówek schłodzonych w lodzie. Na przykład, można zastosować czynnik wzrostu naskórka lub EGF w celu stymulacji inwazji komórek raka płaskonabłonkowego Cal S i cal r.Następnie ostrożnie nanieś 100 µL BMM do dołka ubo. Skieruj końcówkę pipety w stronę wewnętrznej ścianki dołka. Ten etap jest najbardziej krytyczny.W przypadku analizy obrazu optycznego sterydy muszą pozostać w centrum dołka. Powtórz ten krok dla wszystkich wymaganych dołków, wykonując od pięciu do sześciu powtórzeń dla każdego stanu. W razie potrzeby wymień końcówkę na nową i schłodzoną, używając sterylnej igły.Usunąć pęcherzyki powietrza, jeśli są obecne. Użyć mikroskopu, aby wizualnie sprawdzić, czy steroidy znajdują się w centralnej pozycji; jeśli nie, wirować płytkę z prędkością 300 ×g przez trzy minuty w temperaturze 4 °C. Zapewni to centralne rozmieszczenie steroidów w każdej studni.Następnie przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i odczekaj godzinę, aż BMM stężeje. Za pomocą pipety wielokanałowej ostrożnie dodaj 100 µL na dołek pełnej pożywki wzrostowej, pożywki indukującej inwazję cytokinami lub roztworów do badań oceny działania leków.Do pożywki przeznaczonej do zautomatyzowanego pozyskiwania obrazów należy dodać cytokiny lub inhibitory. Płytki należy skanować w cytometrze w określonych odstępach czasu. Począwszy od czasu zero, należy wybrać aplikację do analizy konfluencji.Następnie sprawdź, czy obraz w mikroskopie stereoskopowym jest ostry. W razie potrzeby ręcznie ustaw ostrość i zdefiniuj przesunięcie ostrości (focus offset) w ustawieniach próbkowania.Skaner wybiera jedno centralne pole widzenia. Po dodaniu BMM steroidy nowotworowe powinny pozostać w pozycji centralnej. W związku z tym nie ma potrzeby skanowania całego dołka w oprogramowaniu.Zdefiniuj studzienki do skanowania, zaznaczając je na mapie płytki. Następnie kliknij przycisk start scan. W przypadku zautomatyzowanej analizy obrazu wybierz aplikację confluence.W karcie analizy dostosuj ustawienia aplikacji, aby uzyskać precyzyjną segmentację wokół steroidu, obejmującą wypustki komórkowe oraz stopki (podia) komórek naciekających wnikające do BMM. Dostosuj ustawienia dla każdej linii komórkowej nowotworu i/lub dla różnych punktów czasowych. Sprawdź, czy ustawienia analizy są odpowiednie dla innych steroidów na płytce, klikając w kilka różnych dołków.Jeśli segmentacja nie obrysowuje dokładnie steroidu, należy dalej dostosować ustawienia aplikacji. Kliknij przycisk start analysis w zakładce results. Sprawdź wiele studzienek, aby zweryfikować jakość analizy przed wyeksportowaniem danych na poziomie studzienek do programu arkuszy kalkulacyjnych.Powtórz analizę dla wszystkich punktów czasowych, a następnie oblicz średni procent konfluencji dla studni powtórzonych oraz stopień inwazji w czasie i przedstaw wyniki na wykresie słupkowym. Korzystając z wybranego oprogramowania do statystyki i tworzenia wykresów naukowych, użyj mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw 10x, aby rejestrować obraz każdego sferoidu nowotworowego w określonych odstępach czasu. Rozpocznij od T równego zero, aż do T wynoszącego od 72 do 96 godzin.W zależności od szybkości naciekania analizowanej wyściółki komórkowej, należy użyć obiektywu Forex w przypadku, gdy obszar nacieku jest zbyt duży, aby został w całości ujęty w polu widzenia 10x. Każde pozyskane pojedyncze zdjęcie należy zapisać do ręcznej analizy obrazu. Przenieś obrazy z etapu graficznego do analizy obrazowania.Do kalibracji należy użyć oprogramowania przeznaczonego do analizy zdjęć mikrometru przedmiotu. Należy wykorzystać obiektywy 10 x oraz 4 x. Wprowadź pomiary graficzne, jednostki oraz użyte obiektywy, a następnie przeprowadź kalibrację.Ten krok jest wymagany tylko raz przed kolejną analizą obrazów. Wystarczy ponownie załadować wymagane ustawienia kalibracji. Następnie należy otworzyć obrazy z testu inwazji i wybrać ustawienia kalibracji w zależności od obiektywu mikroskopu użytego do wykonania zdjęć.Zmierz obszar zajęty przez steroidy za pomocą zastosowanego tutaj oprogramowania. Przejdź do sekcji pomiarów (measure) i wybierz opcję zliczania wielkości (count size). Następnie wybierz opcję ładowania ustawień (load settings) i zaznacz wcześniej zdefiniowane ustawienia analizy (predetermined assay settings).Następnie wybierz opcję count. Steroid powinien zostać wówczas precyzyjnie wysegmentowany. Wyeksportuj pomiary poszczególnych parametrów do arkusza kalkulacyjnego i zapisz w nim odpowiednie informacje dotyczące obrazu.Na koniec, przy użyciu naukowego oprogramowania do tworzenia wykresów i analizy statystycznej, nanieś na wykres średnią powierzchnię powtórzeń steroidów lub inwazji w funkcji czasu. Przedstawiono tutaj przykład inwazji komórek nowotworowych zaobserwowany w linii komórkowej glejaka U 87 MG, który może służyć do zilustrowania inwazji guza mózgu. Po osadzeniu w BMM komórki rozprzestrzeniają się w typowym dla inwazji wzorze gwiaździstym, a proces ten jest monitorowany przez okres 72 godzin.W pełni zautomatyzowana analiza obrazu. Zastosowanie cytometru obrazowego pozwala na segmentację wypustek komórkowych i umożliwia precyzyjne ilościowe określenie inwazji komórek nowotworowych. Należy pamiętać, że w przypadku tej linii komórkowej ciało steroidowe jest wykluczone z pomiaru obszaru inwazji.W pełni zautomatyzowana analiza obrazów jest łatwa do przeprowadzenia i umożliwia ilościowe określenie inwazji komórek nowotworowych w czasie. Różny wzorzec inwazji komórkowej wykazują izogeniczne linie komórek raka płaskonabłonkowego głowy i szyi człowieka. Linia komórek rakowych Cal S jest wrażliwa na inhibitory kinazy tyrozynowej EGFR, natomiast CAL R jest na nie oporna.Wobec braku EGF żadna z linii komórkowych nie naciekła BMM; w obecności EGF zaobserwowano wypustki przypominające palce, wydzielone z głównego ciała steroidów Cal ars. Chociaż komórki Cal s wykazały mniejszą inwazyjność po 72 godzinach, obrazy w tym przypadku zostały pozyskane szybko za pomocą cytometru obrazowego, a aby zilustrować alternatywną metodę, stopień inwazji ilościowano ręcznie przy użyciu samodzielnego oprogramowania do analizy obrazu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że każda linia komórkowa wymaga optymalizacji pod kątem zdolności do tworzenia steroidów, gęstości zasiewu komórek, składu macierzy oraz ustawień obrazowania i analizy. Po przeprowadzeniu tej procedury tę samą metodę można dostosować do oceny inwazji tkanki 3D, wykorzystując na przykład guzy w kokulturze z ciałami zarodkowymi w celu odwzorowania złożonej tkanki lub inne organoidy, takie jak astrocyty dla glejaka, hodowle krypt dla nowotworów przewodu pokarmowego lub wątrobę dla raka hepatokomórkowego i przerzutów raka jelita grubego.

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test inwazji sferycznego guza trójwymiarowym (3D)

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Ten film demonstruje metodę tworzenia trójwymiarowej kohodowli sferoidów guza i limfocytów T. Przygotowuje się odlew agarozowy z mikrostudzienkami zawierającymi sferoidy guza, a następnie dodaje się limfocyty T. Po inkubacji układ ten pozwala na badanie interakcji limfocytów T ze sferoidami guza w kontrolowanym trójwymiarowym środowisku.

Trójwymiarowy model kohodowli naciekających limfocytów T w sferoidach nowotworowych

Źródło: Guyon, J., et al. Model sferoidalny 3D glejaka. J. Vis. Exp. (2020)Film demonstruje generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych. Sferoidy są tworzone z ludzkich komórek nowotworowych mózgu i osadzone w macierzy kolagenowej. Komórki nowotworowe na obrzeżach sferoidy przyjmują fenotyp inwazyjny, wydzielając proteazy w celu degradacji kolagenu i posuwając się do inwazji na otaczającą macierz.

Generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Procesy rządzące inwazją raka pęcherza moczowego stanowią okazję do rozwoju biomarkerów i terapii. Poniżej przedstawiamy model inwazji raka pęcherza moczowego, który obejmuje hodowlę 3D sferoid guza, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną. Technika ta jest przydatna do definiowania cech procesu inwazyjnego oraz do badań przesiewowych środków terapeutycznych.

System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

Mikrośrodowisko guza jest istotną częścią wzrostu i inwazji raka. Aby naśladować postęp raka, potrzebna jest biologicznie istotna ludzka matryca. Protokół ten wprowadza ulepszenie trójwymiarowego testu inwazji sferoidalnej in vitro poprzez zastosowanie ludzkiej matrycy opartej na mięśniaku gładkokomórkowym. Protokół wprowadza również komputerową analizę inwazji komórek.

W pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji urządzenia do obrazowania sferoidowego. Urządzenie to umożliwia dynamiczne lub podłużne obrazowanie fluorescencyjne sferoid komórek nowotworowych. Protokół oferuje również prostą procedurę przetwarzania obrazu do analizy inwazji komórek rakowych.

Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D

Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).

Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D

Poznaj półautomatyczny test inwazji sferoidów guza w biomatrycy 3D. Metoda pozwala monitorować zachowanie komórek rakowych w warunkach fizjologicznych przez 72–96 godzin.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Przeglądaj więcej filmów