Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza
1 maja 2015
Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.
Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie in vitro, półautomatycznego, trójwymiarowego testu mikropłytki inwazji komórek nowotworowych. Osiąga się to poprzez najpierw generowanie sterydów nowotworowych o powtarzalnej wielkości w zawiesinie w ultraniskim nawiązaniu wokół dna 96, płytki dołkowe jednocześnie steryd w każdym dołku. Drugim krokiem jest usunięcie części pożywki i dodanie błony podstawnej, takiej jak matryca lub BMM, bezpośrednio do każdej studzienki, aby zapewnić półstałą matrycę, do której komórki nowotworowe atakują z ciała steroidowego.
Następnie inwazja steroidów nowotworowych jest monitorowana w odstępach czasu przez okres od 72 do 96 godzin, podczas których akwizycja obrazu odbywa się automatycznie na cytometrze lub ręcznie pod mikroskopem. Ostatnim krokiem jest analiza inwazji komórek nowotworowych za pomocą automatycznego cytometru lub oprogramowania do obrazowania. Ostatecznie test inwazji steroidów w 3D guza służy do modelowania inwazji raka in vitro w formacie, który jest bardziej odpowiedni fizjologicznie i podatny na walidację celową i badania przesiewowe leków.
Uważamy, że ta technika jest komplementarna w stosunku do prostych dwuwymiarowych testów proliferacji komórek, zwykle stosowanych do walidacji celów i badań przesiewowych leków w badaniach nad rakiem, ponieważ umożliwia nam również badanie inwazji, która jest kluczowym aspektem progresji raka w fizjologicznie istotnym trójwymiarowym formacie. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, kiedy zoptymalizowałem phe guza w 3D, czyli wzrost na mikropłytce. Pomyślałem, że dobrze byłoby użyć tej samej konfiguracji i spojrzenia również na inwazję, a wynik był łatwy do usunięcia części pożywki z każdej studzienki i zastąpienia jej matrycą podobną do membrany podstawnej.
Wizualna demonstracja tej metody jest niezbędna, ponieważ utrzymanie sterydów w centralnej pozycji każdej studni po tradycji BMM może być trudne na początku. Może to spowodować nieoptymalną analizę obrazu ze względu na to, że sterydy znajdują się w różnych płaszczyznach ogniskowych. Z doświadczeniem.
Zdarza się to rzadko, ale w razie potrzeby proces ten można ułatwić poprzez delikatne odwirowanie płytki. Aby rozpocząć wszystkie BMM na ICE przez noc, zachowaj zestaw sterylnych końcówek filtrujących do pipet P 10 E 200 i P 1000, a sterylne probówki mają minus 20 stopni Celsjusza. Umieść również ultra low attachment 96 dołków zawierających czterodniowe sterydy na lodzie.
Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie usuń 100 mikrolitrów pożywki wzrostowej na studzienkę z płytek wróbla. W przypadku tego kroku pochyl końcówkę w kierunku wewnętrznej ścianki dna U. Cóż, unikając kontaktu z dnem studni i lokalizacją sphe
.W celu zminimalizowania zakłóceń sterydów za pomocą lodowatych końcówek, przenieś BMM do lodowatych rurek. W przypadku inwazji indukowanej cytokinami lub do badań oceniających leki, dodaj odczynniki do BMM za pomocą lodowatych końcówek. Na przykład użyj naskórkowego czynnika wzrostu lub EGF, aby stymulować inwazję komórek Cal S i raka płaskonabłonkowego.
Następnie delikatnie dozuj 100 mikrolitrów BMM do ubo. Dobrze skieruj końcówkę w kierunku wewnętrznej ściany studni. Ten krok jest najbardziej krytyczny.
Jeśli chodzi o optyczną analizę obrazu, sterydy muszą pozostać w centrum, dobrze. Powtórz ten krok dla wszystkich wymaganych studzienek, pozwalając na pięć do sześciu powtórzeń na warunek. W razie potrzeby zmień końcówkę na świeżo schłodzoną za pomocą sterylnej igły.
Usuń bąbelki, jeśli są obecne. Użyj mikroskopu, aby wizualnie sprawdzić, czy sterydy są w pozycji centralnej, jeśli nie są odwirować płytkę w 300 razy G przez trzy minuty czterech stopni Celsjusza. Zapewni to, że sterydy są centralnie zlokalizowane w każdej studni.
Następnie przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól BMM zastygnąć godzinę później. Użyj pipety wielokanałowej, aby delikatnie dodać 100 mikrolitrów na studzienkę pełnego wzrostu. Badania inwazji indukowanej pożywką lub cytokinami lub oceny leków.
Uwzględnij cytokiny lub inhibitory w pożywce w celu automatycznego pozyskiwania obrazu. Skanuj płytki na cytometrze w odstępach czasu. Zaczynając od czasu zero, wybierz aplikację Confluence.
Następnie sprawdź, czy steryd jest w centrum uwagi. W razie potrzeby wyreguluj ostrość ręcznie i napraw przesunięcie ostrości. W obszarze Ustawienia próbkowania.
Selektor skanuje jedno centralne pole widzenia. Po dodaniu BMM steroidy nowotworowe powinny pozostać w pozycji centralnej. Dzięki temu nie ma potrzeby skanowania całej studni w oprogramowaniu.
Zdefiniuj studnie, które mają być skanowane, podświetlając je na mapie płyty. Następnie kliknij Rozpocznij skanowanie. Aby uzyskać automatyczną analizę obrazu, wybierz aplikację confluence.
Na karcie analizy dostosuj ustawienia aplikacji, aby uzyskać precyzyjną segmentację wokół sterydu, w tym procesy komórkowe i invader podia rozciągające się do BMM. Dostosuj ustawienia dla każdej linii komórek nowotworowych i/lub w różnych punktach czasowych. Sprawdź, czy ustawienia analizy są odpowiednie dla innych sterydów w płytce, klikając na kilka różnych dołków.
Jeśli segmentacja nie zarysuje dokładnie steryd, dostosuj ustawienia aplikacji dalej. Kliknij rozpocznij analizę w zakładce wyników. Sprawdź wiele dołków, aby zweryfikować jakość analizy przed wyeksportowaniem danych na poziomie odwiertu do programu arkusza kalkulacyjnego.
Powtórz analizę dla wszystkich punktów czasowych, a następnie oblicz średnią procentową konfluencję dla studni replikowanych i plus inwazję w czasie na wykresie słupkowym. Korzystając z wybranego oprogramowania do tworzenia wykresów naukowych i statystyk do ręcznej akwizycji obrazu, użyj odwróconego mikroskopu wyposażonego w obiektyw 10x, aby zarejestrować obraz dla każdego steroidu nowotworowego w odstępach czasu. Zaczynając od T równa się zero, po T równa się od 72 do 96 godzin.
W zależności od prędkości inwazji na daną wyściółkę komórki, użyj celu Forex, gdy zaatakowany obszar jest zbyt duży, aby można go było całkowicie uchwycić w polu widzenia 10x. Zapisz każdy pojedynczy obraz do ręcznej analizy obrazu. Otwórz obrazy grafów stołu montażowego do analizy obrazowania.
Oprogramowaniem z wyboru do kalibracji są obrazy wykresu scenicznego. Korzystanie zarówno z obiektywów 10x, jak i 4x. Wprowadź pomiary graficzne, jednostki i używane obiektywy, a następnie wykonaj kalibrację.
Ten krok jest wymagany tylko raz w celu późniejszej analizy obrazu. Wystarczy ponownie załadować wymagane ustawienia kalibracji. Następnie otwórz obrazy testu inwazji i wybierz ustawienia kalibracji w zależności od obiektywu mikroskopu użytego do uzyskania obrazów.
Zmierz obszar objęty sterydami w oprogramowaniu używanym tutaj. Przejdź do opcji Measure (Miara) i wybierz rozmiar licznika. Wybierz while, a następnie załaduj ustawienia i wybierz wstępnie określone ustawienia testu.
Następnie wybierz pozycję liczba. Steryd powinien być następnie dokładnie segmentowany. Eksportowanie pomiarów to różne parametry do arkusza kalkulacyjnego i zapisywanie odpowiednich informacji o obrazie w arkuszu kalkulacyjnym.
Na koniec, wykreślić średni obszar replikacji sterydów lub inwazji w czasie za pomocą wykresów naukowych i oprogramowania statystycznego. Pokazany tutaj jako przykład inwazji komórek rakowych obserwowanej w linii komórkowej glejaka U 87 MG, który można wykorzystać do zilustrowania inwazji guza mózgu. Po osadzeniu w komórkach BMM rozprzestrzeniających się z typowym wzorcem inwazji gwiazdotwórczej, proces ten jest obserwowany przez okres 72 godzin.
W pełni zautomatyzowana analiza obrazu. Za pomocą obrazowego cytometru tworzy segmentację wokół wypukłości komórek i umożliwia precyzyjne określenie ilościowe inwazji komórek nowotworowych. Należy pamiętać, że w przypadku tej linii komórkowej ciało steroidowe jest wyłączone z pomiaru zaatakowanego obszaru.
W pełni zautomatyzowana analiza obrazu jest łatwa do przeprowadzenia i zapewnia ilościowe określenie inwazji komórek nowotworowych w czasie. Inny wzór inwazji komórek wykazuje się w przypadku ludzkich łunabłonków, głowy i szyi izogenicznych. Linie komórek rakowych, na które Cal S jest wrażliwy, a CAL R jest oporny na inhibitory kinazy tyrozynowej EG FFR.
W przypadku braku EGF żadna linia komórkowa nie zaatakowała BMM w obecności wypukłości przypominających palce EGF, wytłoczonych z głównego ciała sterydów Cal ars. Podczas gdy komórki Cal były mniej inwazyjne po 72 godzinach, obrazy w tym przypadku zostały uzyskane szybko za pomocą cytometru obrazowego, a jako przykład alternatywnej metody, stopień inwazji określono ilościowo ręcznie za pomocą samodzielnego oprogramowania do analizy obrazu. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać, że każda linia komórkowa musi być zoptymalizowana pod kątem jej zdolności do tworzenia sterydów, gęstość wysiewu komórek, skład matrycy oraz ustawienia obrazu i analizy Postępując zgodnie z tą procedurą. Ta sama metoda, którą można również zaadaptować do oceny inwazji tkanek 3D przy użyciu, na przykład, guzów w kokulturze z ciałami zarodków, aby przypominały złożoną tkankę lub inne organoidy, takie jak astrocyty w przypadku glejaka lub kultury krypt w przypadku raka przewodu pokarmowego lub wątroby w przypadku raka wątrobowokomórkowego i przerzutów raka jelita grubego.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia półautomatyczny test na mikropłytkach, zaprojektowany do badania inwazji komórek nowotworowych w trójwymiarową biomatrycę. Metoda ta pozwala na monitorowanie zachowania komórek rakowych w środowisku bardziej odpowiadającym warunkom fizjologicznym niż w przypadku tradycyjnych testów 2D.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Onkologia
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Inwazja na zdrowe tkanki jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych.
- Obecne metody często opierają się na testach 2D, które mogą nie odzwierciedlać dokładnie warunków in vivo.
- Modele 3D zapewniają bardziej realistyczne środowisko do badania zachowania nowotworu.
- Celem niniejszego badania jest pogłębienie zrozumienia progresji raka poprzez ulepszone techniki analityczne.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnego testu in vitro do badania inwazji komórek nowotworowych.
- Wykorzystanie trójwymiarowej biomatrycy naśladującej środowisko pozakomórkowe.
- Ułatwienie przesiewania leków i walidacji celów terapeutycznych w badaniach nad rakiem.
Zastosowane metody
- Tworzenie sferoidów nowotworowych na płytkach o ultraniskim przywieraniu.
- Zastosowanie macierzy przypominającej błonę podstawną w badaniach nad inwazją.
- Monitorowanie inwazji za pomocą automatycznego obrazowania lub mikroskopii manualnej.
- Analiza danych dotyczących inwazji przy użyciu specjalistycznego oprogramowania.
Główne wyniki
- Test ten skutecznie modeluje inwazję komórek nowotworowych w kontekście 3D.
- Analiza obrazów umożliwia ilościowe określenie stopnia inwazji w czasie.
- Metoda wykazuje powtarzalność i niezawodność dla różnych modeli nowotworów.
- Zapewnia ona wgląd w dynamikę progresji raka.
Wnioski
- Ten test inwazji 3D jest cennym narzędziem w badaniach nad rakiem.
- Uzupełnia on tradycyjne testy 2D poprzez uwzględnienie dynamiki inwazji.
- Metoda ta może pomóc w opracowywaniu terapii celowanych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten test inwazji sferoid tumorowych 3D wypełnia istotną lukę w procesie poszukiwania leków przeciwnowotworowych, umożliwiając fizjologicznie odpowiednie modelowanie inwazji tkankowej — kluczowego fenotypu złośliwego, który często zostaje pominięty w badaniach proliferacji 2D. Metoda ta wspiera walidację celów terapeutycznych oraz identyfikację związków wiodących poprzez kwantyfikację dynamiki inwazji w powtarzalnych formatach o wysokiej zawartości danych (high-content), które nadają się do przesiewania. Zwiększa ona pewność prognostyczną w ramach przedklinicznej analizy ryzyka, łącząc mechanizmy molekularne z funkcjonalnymi efektami inwazyjnymi w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez pomiar potencjału inwazyjności macierzy jako funkcjonalnego wskaźnika złośliwości nowotworu.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie wyjaśnienia szlaków sygnałowych poprzez modulację sygnalizacji EGFR oraz inwazji indukowanej cytokinami w modelach izogenicznych.
- Wpływ na portfolio: Zwiększenie pewności co do wyboru celu terapeutycznego poprzez rozróżnienie fenotypów proliferacyjnych od inwazyjnych w liniach nowotworowych opornych i wrażliwych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennych zależnych (procent konfluencji, obszar inwazji) do profilowania kinetycznego i analizy zależności dawka-odpowiedź.
- Wartość operacyjna: Oferuje półautomatyczne przepływy pracy kompatybilne z cytometrami obrazowymi lub standardową mikroskopią z analizą obrazu, co zapewnia skalowalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wiarygodną ocenę związków poprzez standaryzację odczytów inwazji w ramach powtórzeń i punktów czasowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modelowanie systemów istotnych w przebiegu choroby z wykorzystaniem linii glioblastoma oraz raka głowy i szyi pochodzących od pacjentów, o znanych mechanizmach oporności.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez stosowanie spójnych protokołów hodowli 3D i kwantyfikacji.
- Wpływ na portfolio: Wsparcie decyzji o dalszym rozwoju w oparciu o analizę ryzyka poprzez identyfikację związków, które hamują inwazję bez wpływu na proliferację.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po ewaluację przedkliniczną, w szczególności w programach onkologicznych skoncentrowanych na przerzutach i mechanizmach oporności.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez, umożliwiając modulację inwazji za pomocą inhibitorów EGFR, cytokin lub czynników cytotoksycznych w kontekście 3D.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do analizy dzięki powtarzalnemu tworzeniu sferoidów oraz nakładaniu matrycy, generując standaryzowane wskaźniki inwazji w czasie od 72 do 96 godzin.
- Analityka: Generuje ilościowe wyniki (stopień konfluencji, powierzchnia, wskaźniki wypustek), które umożliwiają porównania między różnymi warunkami i punktami czasowymi przy użyciu naukowego oprogramowania do tworzenia wykresów.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie inwazji w ludzkich liniach nowotworowych o znaczeniu klinicznym dla progresji glejaków oraz SCCHN.
- Zastosowania instytucjonalne: Służy jako wielokrotnego użytku platforma, którą można dostosować do wielu typów nowotworów, składów matrycy i metod odczytu (zautomatyzowanych lub manualnych).
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia wiarygodność prognostyczną poprzez obrazowanie inwazji, kluczowej cechy złośliwości nowotworu, co uzupełnia testy badające wyłącznie proliferację.
- Wartość operacyjna: Gwarantuje standaryzację i powtarzalność dzięki określonej wielkości sferoidów, aplikacji macierzy oraz protokołom obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go poprzez wczesną identyfikację związków przeciwinwazyjnych, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach ze względu na potencjał przerzutowy.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez oddzielenie efektów cytostatycznych od przeciwinwazyjnych podczas optymalizacji wiodących związków.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie trójwymiarowych hodowli komórkowych, technik sterylnych oraz optymalizacji procesu tworzenia sferoidów dla poszczególnych linii komórkowych.
- Zależność od płytek o ultraniskiej adhezji, matrycy naśladującej błonę podstawną oraz systemów obrazowania (cytometru lub mikroskopu z oprogramowaniem analitycznym).
- Konieczność standaryzacji gęstości zasiewu, objętości matrycy i harmonogramu punktów czasowych pomiędzy zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji do różnych typów nowotworów, w tym modeli kokultur z komponentami stromy lub organoidami.
- Ograniczenie wynikające z potrzeby precyzyjnego centrowania sferoidów, aby uniknąć rozbieżności płaszczyzny ogniskowania w analizie obrazu, co można niwelować poprzez krótkie wirowanie w razie potrzeby.
