Uproszczona izolacja i obsługa ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów (NET)

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zademonstrowanie prostego protokołu izolowania neutrofili, pułapek zewnątrzkomórkowych lub sieci z ludzkiej krwi pełnej przy użyciu łatwo dostępnych odczynników. Osiąga się to poprzez wyizolowanie neutrofili z ludzkiej krwi pełnej, a drugim krokiem jest technika wirowania różnicowego. Wyizolowane neutrofile są stymulowane PMA w celu indukowania tworzenia siatki, zwanej również NETosis.

Następnie przygotowuje się płytkę z bezkomórkowym izolatem siatki i dodaje komórki rakowe, aby zademonstrować, jak siatki wpływają na adhezję komórek. Wyniki pokazują, że dodanie monowarstwy siatki poprawia adhezję 5 49 komórek nowotworowych i że adhezja ta zmniejsza się, gdy siatki ulegają degradacji. Korzystanie z DNAS one Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie.

Biorąc pod uwagę nowatorstwo tej techniki, obsługa pułapek komórkowych xor neutrofili jest niezwykle trudna ze względu na to, jak delikatne są te struktury. Na początek należy pobrać 80 mililitrów świeżej ludzkiej krwi pełnej w 14 heparynizowanych zielonych górnych probówkach, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Otwórz każdą probówkę i dodaj do każdej probówki pięć mililitrów PBS bez wapnia i magnezu.

Następnie dodaj 15 mililitrów pożywki do separacji limfocytów lub LSM do każdej z czterech 50-mililitrowych stożkowych probówek w temperaturze pokojowej. Następnie użyj igły o rozmiarze 18 zamontowanym na 60-mililitrowej strzykawce, aby ostrożnie nałożyć rozcieńczoną krew na LSM, tworząc ostry interfejs krwi LSM, odwiruj probówki pod ciśnieniem 800 razy G przez 30 minut w temperaturze 21 stopni Celsjusza bez łamania, aby zatrzymać wirówkę, ostrożnie zassać i wyrzucić dwie górne warstwy cieczy oraz granicę między nimi, pozostawiając tylko dolną czerwoną warstwę. Ta osadka zawiera erytrocyty i neutrofile.

Dodaj 20 mililitrów PBS i 20 mililitrów 6% roztworu dekstranu do każdej probówki. Delikatnie odwróć każdą rurkę i pozostaw ją w temperaturze pokojowej na 30 minut. Czerwone krwinki osadzają się na dnie probówki.

Następnie przenieś supernatanty do świeżych probówek i wyrzuć palety. Odwirować supernatanty w temperaturze 450 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, a następnie wyrzucić supernatant, pozostawiając osad bogaty w neutrofile. Przygotuj roztwór lizujący z 0,5 mililitra buforu do lizy w 4,5 mililitra sterylnej wody.

Dodaj w sumie pięć mililitrów roztworu lizującego do każdej probówki i zbierz wszystkie granulki w jednej kolbie. Umieścić kolbę w ciemności na 10 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć pozostałe czerwone krwinki. Odwirować neutrofile w temperaturze 450 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.

Odrzucić sklarowany osad i przemyć osad pięcioma mililitrami PBS bez wapnia i magnezu. Następnie ponownie odwirować próbkę w temperaturze 450 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant zawierający pozostały roztwór do lizy. Zawiesić osad neutrofili w 30 mililitrach zimnej pożywki RPMI uzupełnionej 3% płodową surowicą bydlęcą i umieścić probówkę na lodzie, aby stymulować tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek lub sieci neutrofili

Dodaj 500 nanomolowców PMA do 30 litrów zawiesiny neutrofili w płaskim naczyniu do hodowli tkankowej o wymiarach 150 milimetrów na 25 milimetrów. Za pomocą 20-milimetrowej siatki inkubuj komórki przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji delikatnie zassać i wyrzucić pożywkę, uważając, aby nie naruszyć warstwy sieci, a neutrofile przylegają do dna naczynia.

Następnie za pomocą pipety umyj dno każdego naczynia 15 mililitrami zimnego PBS bez wapnia i magnezu, cały przylegający materiał należy usunąć z dna. Zebrać zawiesinę do płukania w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, a następnie odwirować w temperaturze 450 razy G przez 10 minut. W temperaturze czterech stopni Celsjusza neutrofile i wszelkie pozostałe komórki będą osadzać się na dnie.

Pozostawiając wolny od komórek supernatant bogaty w netto, następnie zdekantuj supernatant do wielu probówek o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj w temperaturze 8 18 000 razy G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Aby osadzać DNA, należy odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w PBS tak, aby stężenie odpowiadało dwa razy 10 do siódmego neutrofili na 100 mikrolitrów PBS. Ten bezkomórkowy zapas netto może być wykorzystany do kolejnych eksperymentów.

Zmierzyć stężenie DNA w próbce za pomocą spektrofotometrii. Odpowiednie stężenie powinno wynosić od 140 do 180 nanogramów na mikrolitr przy 100 mikrolitrach zapasu netto do każdej studzienki 96-dołkowej płaskiej płytki dennej i inkubować płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, aby pokryć studzienki 12 do 20 godzin później, użyć mikroskopu do sprawdzenia tworzenia się jednolitej monowarstwy bezkomórkowych sieci na dnie studzienek. Po zweryfikowaniu monowarstwy delikatnie odessać cały nieprzylegający materiał z dołków.

Uważając, aby nie zakłócić monowarstwy na dole. Jest to najtrudniejszy aspekt tej procedury. Aby utrzymać odpowiednią monowarstwę siatki, należy obchodzić się z płytą bardzo ostrożnie.

Powoli dodawaj wszystkie odczynniki i komórki z boku studzienek, zasysaj bardzo delikatnie i unikaj dotykania dna studzienki końcówką ssącą. Po usunięciu nieprzylegającego materiału delikatnie dodaj 100 mikrolitrów 1% roztworu blokującego albuminę surowicy bydlęcej do każdej studzienki i pozostaw na godzinę w temperaturze pokojowej. Nie mieszaj ani nie potrząsaj płytką, ponieważ może to zakłócić monowarstwę siatki.

Następnie przygotuj 5 49 komórek rakowych, zbierając je, gdy są w 70 do 80% zlewne. Stosując standardowe techniki, ponownie zawiesić komórki w pożywce w stężeniu dwa razy 10 do czwartego ogniwa na 100 mikrolitrów. Zabarwić komórki, dodając jeden mikrolitr CFS e na mililitr pożywki i pozostawić je w temperaturze pokojowej na 10 minut.

Następnie odwiruj komórki w temperaturze 450 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w początkowej objętości pożywki, aby utrzymać stężenie dwa razy 10 do czwartego komórek rakowych na 100 mikrolitrów pożywki. Weź płytkę pokrytą siatką i delikatnie zassaj roztwór blokujący.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek rakowych do każdej studzienki i pozwól komórkom przylegać do płytki przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, całkowicie zaaspiruj ciecz i dodaj 1000 jednostek DNA, jedną do kilku studzienek na 10 minut, aby zdegradować sieci w innych studzienkach. Dodaj 100 mikrolitrów sterylnej wody do studzienki przez 10 minut jako kontrolę pojazdu. Następnie delikatnie odessaj płyn z każdej studzienki i przemyj 100 mikrolitrami PBS, aby usunąć wszelkie nieprzylegające elementy.

A 5 49 komórek zasysa i odrzuca cały roztwór w studzienkach, pozostawiając tylko sieci i przylegające komórki rakowe na dnie. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 4% roztworu formaldehydu na studzienkę, aby utrwalić komórki, natychmiast przenieś płytkę do mikroskopu fluorescencyjnego, aby odczytać test, a następnie wykreślić i przeanalizować wyniki. Korzystanie z oprogramowania do analizy danych.

Siatki bezkomórkowe zastosowano w statycznych testach adhezyjnych z 5 49 komórkami nowotworowymi. Mikroskopia świetlna wykazała, że komórki rakowe silnie przylegają do monowarstwy siatki. In vitro.

Adhezja ta zmniejszyła się po degradacji monowarstwy siatki przez mikroskopię fluorescencyjną DNA na znakowanych 5 49 komórkach rakowych, które potwierdziły te wyniki. Wiązanie 5 49 komórek z monowarstwą sieci określono ilościowo, zliczając liczbę komórek na pole o dużej mocy. Jak wykazano tutaj, nie zaobserwowano zmian w adhezji komórek rakowych do siatek w kontroli pojazdu.

Nastąpił jednak znaczny spadek adhezji komórek rakowych do siatek w obecności DNA jeden. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak izolować i obchodzić się z siatkami z pełnej ludzkiej krwi. Te bezkomórkowe izolaty siatkowe mogą być następnie wykorzystywane w różnych technikach, w tym w immunofluorescencji, mikroskopii konfokalnej, mikroskopii elektronowej i western blot.