Name: Uproszczona izolacja i obsługa ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów (NET) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę izolacji pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów (NET) z ludzkiej krwi. Technika ta umożliwia badanie wpływu NET na adhezję komórek nowotworowych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Paulowi Kubesowi za jego wskazówki i mentoring, które były kluczowe w tworzeniu tej pracy.

UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi wytycznymi etycznymi instytucji.
1. Rysunek krwi
<ol>
	<li>Poprzez żyłę przełokciową zbierz 14 probówek krwi od zdrowego ochotnika do zielonych górnych (heparynizowanych) probówek i odwróć każdą probówkę przed osiądnięciem na lodzie. Zbierz krew w ciągu 10-15 minut od eksperymentu, aby zapewnić optymalną wydajność neutrofili</li>.
</ol>
2. Izolacja neutrofili z krwi pełnej
<ol>
	<li>Przemyć każdą zieloną górną probówkę krwi 5 ml PBS bez Ca i Mg w celu rozcieńczenia krwi. Do każdej z 4 stożkowych probówek o pojemności 50 ml dodaj 15 ml pożywki do separacji limfocytów (LSM) w temperaturze pokojowej. Używając igły 18 G zamontowanej na strzykawce o pojemności 60 ml, ostrożnie nałóż rozcieńczoną krew na LSM, tworząc ostrą granicę LSM-krew. 
	UWAGA: W miarę możliwości unikaj mieszania warstw.</li>
	<li>Wirować przy 800 x g przez 30 min w temperaturze 21 °C bez przerwy. 
	UWAGA: Nagłe pęknięcia mogą powodować mieszanie się różnych warstw.</li>
	<li>Obserwuj osad erytrocytów i neutrofili na dnie. Odessaj i odrzuć górne 2 warstwy (osocze i LSM), upewniając się, że pozbyłeś się interfejsu między tymi warstwami, który zawiera limfocyty i komórki jednojądrzaste, pozostawiając tylko dolną czerwoną warstwę.</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 20 ml soli fizjologicznej z buforu fosforanowego (PBS) i 20 ml 6% roztworu dekstranu. Delikatnie odwrócić każdą probówkę, aby wymieszać ją z warstwą erytrocytów i neutrofili i pozostawić w temperaturze pokojowej przez 30 minut. 
	UWAGA: Umożliwi to czerwonym krwinkom (RBC) osadzanie się na dnie.</li>
	<li>Po 30 minutach przenieść supernatant bogaty w neutrofile do świeżych probówek i wyrzucić granulki RBC. Odwirować supernatanty w temperaturze 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Osad będzie zawierał głównie neutrofile i niewiele erytrocytów.</li>
	<li>Przygotować roztwór lizujący, dodając 0,5 ml buforu do lizy do 4,5 ml sterylnej wody. Pozostałe erytrocyty należy poddać lizie przygotowanym 5 ml roztworu lizy, przenosząc wszystkie zawieszone osady do jednej probówki. Pozostawić do lizy w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut.</li>
	<li>Odwirować przy 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i przemyć osad 5 ml PBS bez Ca i Mg i ponownie odwirować przy 450 x g w temperaturze 4 °C, aby usunąć resztki roztworu lizy. Osad otrzymany w tym momencie zawiera neutrofile. Zawiesić granulkę w 30 ml zimnego 3% RPMI i umieścić na lodzie. 
	UWAGA: 3% RPMI wytwarza się przez uzupełnienie pożywki RPMI 3% płodową surowicą bydlęcą (FBS)</li>
	<li>Sprawdź czystość próbki za pomocą barwienia błękitem metylenowym. >95% komórek powinno być granulocytami z jądrami wielopłatowymi. Użyj barwienia błękitem trypanowym, aby sprawdzić >95% żywotność komórek i policzyć ostateczną wydajność neutrofili. Rozcieńczyć neutrofile w lodowatym 3% RPMI, aby uzyskać końcowe stężenie 5 x 106 neutrofili/ml.</li>
</ol>
3. Generowanie sieci NETs
<ol>
	<li>Stymulować neutrofile za pomocą 500 nM PMA (na 30 ml roztworu neutrofili) i inkubować na płaskim naczyniu do hodowli tkankowej o wymiarach 150 x 25 mm z siatką 20 mm przez 4 godziny w temperaturze 37 °C 5% CO2 . Umożliwi to NETosis.</li>
	<li>Po 4 godzinach stymulacji delikatnie odessać i wyrzucić pożywkę, pozostawiając warstwę NET i neutrofili przylegającą na dnie. Nie naruszaj tej warstwy.</li>
	<li>Używając łącznie 15 ml zimnego PBS bez Ca i Mg na naczynie, umyj dno każdego naczynia, pipetując 15 ml PBS na dno naczynia w celu usunięcia całego przylegającego materiału z dna</li>.
	<li>Zebrać roztwór otrzymany z mycia każdego naczynia (krok 3.3) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i odwirować przez 10 minut przy 450 x g w temperaturze 4 °C. Neutrofile i wszelkie pozostałe komórki osadzają się na dnie, pozostawiając bezkomórkowy supernatant bogaty w NET.</li>
	<li>Podzielić supernatant na 1,5 ml probówki do mikrowirówek i wirować przez 10 minut w temperaturze 18 000 x g w temperaturze 4 °C. Pozwoli to na granulowanie całego DNA. 
	UWAGA: Wirowanie w większych probówkach jest łatwiejsze i mniej czasochłonne, jeśli tak wysokie prędkości są osiągalne w zwykłej wirówce, w przeciwnym razie konieczne będzie podzielenie supernatantów na mniejsze probówki, aby można było użyć mikrowirówki o dużej prędkości.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wszystkie otrzymane razem granulki w lodowatym PBS do stężenia odpowiadającego 2 x10,7 neutrofili na 100 μl PBS. W ten sposób uzyskamy bezkomórkowy materiał NET, który można wykorzystać do kolejnych eksperymentów.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie DNA w próbce otrzymanej za pomocą spektrofotometrii lub alternatywnego narzędzia do oznaczania ilościowego DNA. Odpowiednie stężenie w próbce powinno mieścić się w przedziale 140 - 180 ng/μl.</li>
</ol>
4. Test adhezji statycznej komórek rakowych NET.
<ol>
	<li>Dodać 100 μl wcześniej otrzymanego materiału NET na studzienkę do 96-dołkowej płaskiej płytki dennej i pozostawić do pokrycia studzienek O/N w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Między 12 a 20 godziną później sprawdź, czy na dnie studzienek pod mikroskopem tworzy się jednolita monowarstwa bezkomórkowych sieci NET (ryc. 1). W tym momencie delikatnie zassaj cały nieprzylegający materiał z dołków, uważając, aby nie naruszyć monowarstwy NET na dole.</li>
	<li>Dodać 100 μl 1% roztworu blokującego albuminę surowicy bydlęcej (BSA) do każdej studzienki i pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odłączyć komórki rakowe A549 od kolby T-75 za pomocą 2 ml 0,25% roztworu trypsyny. Po odłączeniu dodać 10 ml pożywki A549 do trypsynizowanych komórek i odwirować w temperaturze 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce, aby uzyskać stężenie 2 x104 komórek rakowych na 100 μl pożywki. 
	UWAGA: Komórki A549 hodowano oddzielnie. Krótko mówiąc, komórki hodowano i utrzymywano w pożywkach DMEM F12 zawierających 10% FBS i 1% penicyliny Streptomycyny i inkubowano w temperaturze 37 °C 5% CO2 . Po osiągnięciu 70 - 80% konfluencji komórek, zostały one odłączone za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i ponownie zawieszone w tym samym pożywce, które opisano powyżej.</li>
	<li>Wybarwić komórki rakowe za pomocą CFSE, dodając 1 μl CFSE na ml pożywki i pozostawić do barwienia w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po barwieniu odwirować w temperaturze 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, a następnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w początkowej objętości pożywki, aby uzyskać stężenie 2 x104 komórek nowotworowych na 100 μl pożywki.</li>
	<li>Po 1 godzinie blokowania NETs delikatnie odessać roztwór blokujący i dodać 2 x104 komórki rakowe w pożywce, co odpowiada 100 μl, na basenie nad monowarstwą NET i pozostawić do przylegania przez 90 minut w temperaturze 37 °C 5% CO2 . Delikatnie odessać komórki i dodać 100 μl PBS do każdej studzienki, aby umyć wszelkie nieprzylegające komórki.</li>
	<li>W niektórych studzienkach dodaj 1000U DNAse1 na studzienkę przez 10 minut przed myciem, aby zdegradować NET. Będzie to służyć jako kontrola negatywna. W innych studzienkach dodaj 100 μl sterylnej wody na studzienkę przez 10 minut, która posłuży jako kontrola pojazdu (VC). 
	UWAGA: Zwykle wykonuje się 3 powtórzenia na warunek w celu zwiększenia wielkości próby.</li>
	<li>Odessać i wyrzucić cały roztwór ze studzienek, pozostawiając na dnie tylko NET i przylegające komórki rakowe. Dodać 100 μl 4% roztworu formaldehydu na studzienkę, aby przymocować przylegające komórki rakowe do NETS i odczytać test pod mikroskopem fluorescencyjnym (ryc. 1). Wykreśl i przeanalizuj wyniki (Rysunek 3).</li>
</ol>

<ol><li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li>
<li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+extracellular+traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+RodA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6 (4), e1000873(2010).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETs%3A+a+new+strategy+for+using+old+weapons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">NETs: a new strategy for using old weapons.</a> Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).</li>
<li>McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+neutrophil+extracellular+traps+capture+bacteria+from+the+bloodstream+during+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).</li>
<li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Khandpur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETs+are+a+source+of+citrullinated+autoantigens+and+stimulate+inflammatory+responses+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis.</a> Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140(2013).</li>
<li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li>
<li>Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+NETs+in+reproduction%3A+from+infertility+to+preeclampsia+and+the+possibility+of+fetal+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss.</a> Front Immunol. 3, 362(2012).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> J Clin Invest. , (2013).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in cancer progression.</a> Cell Mol Life Sci. , (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li>
<li>Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+laboratory+procedures+for+isolating+human+peripheral+blood+derived+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Med+J+Malaysia%22%5BJournal%5D)">Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils.</a> Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lymphocytes%2C+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages.</a> Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).</li>
<li>Calado, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+hormones%2C+acting+on+the+TERT+gene%2C+increase+telomerase+activity+in+human+primary+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells.</a> Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).</li>
<li>Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+bv8+in+human+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of bv8 in human blood cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).</li>
<li>Wu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+leukocyte+labeling+with+intravenous+ferumoxides%2Fprotamine+sulfate+complex+and+in+vitro+characterization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).</li>
<li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death%3A+a+predominant+role+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366(2012).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Protokół izolacji zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili pokazany w tym filmie łączy różne techniki stosowane w literaturze do izolacji neutrofili i tworzenia NET. Upraszcza dość złożony i zmienny proces oraz oferuje bardzo niezawodny i powtarzalny sposób izolowania oczyszczonych, bezkomórkowych sieci NET przy mniejszej liczbie kroków niż inne protokoły. Ponadto stosowane są łatwo dostępne odczynniki, co upraszcza protokoły i znacznie obniża ich koszt. Zastosowanie NET do statycznego testu adhezyjnego służy wykazaniu elas...

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili to nowo odkryte elementy pochodzące z neutrofili, składające się z nici zewnątrzkomórkowego DNA ozdobionego setkami białek i histonów. Są one wydzielane przez neutrofile w kontekście infekcji i stanu zapalnego w następstwie określonych bodźców i początkowo uznano, że są częścią mechanizmów obronnych neutrofili przed infekcjami. Po raz pierwszy wykazano, że sprzyjają one łapaniu różnych mikrobiologicznych najeźdźców, w tym bakterii, wirusów i grzybów 1-3. Uwięzienie drobnoustroju doprowadziłoby następnie do jego zniszczenia zarówno bezpośrednio przez białka związane z NET 3,4, jak i pośrednio poprzez lokalną rekrutację komórek fagocytarnych 5,6. Rola sieci NET nie wydaje się jednak ograniczać do obrony hosta. Ostatnio wykazano, że odgrywają one ważną rolę w chorobach autoimmunologicznych 7,8, zakrzepicy 9, zaburzeniach związanych z ciążą 10, a nawet progresji raka 11,12. W związku z tym wydaje się, że NET odgrywają ważną rolę w wielu różnych procesach fizjologicznych. Biorąc jednak pod uwagę nowatorski charakter takich badań, wiele pozostaje do wyjaśnienia w odniesieniu do mechanizmów, za pomocą których NET wywierają swoje skutki. W niniejszym artykule przedstawiamy uproszczoną metodę izolacji NET przy braku neutrofili.
W poniższym filmie pokazujemy uproszczoną i łatwą technikę izolowania NET z ludzkiej krwi pełnej. Bezkomórkowe NET mogą być następnie wykorzystywane w wielu eksperymentach in vitro, w tym w barwieniu, imuunofluorescencji, blotach, a także w wielu testach, takich jak adhezja, proliferacja i migracja. Istnieją inne protokoły 13, 19, jednak są one zwykle długie, złożone, drogie i często mają niską wydajność 13. Ten uproszczony protokół wykorzystuje podstawowe odczynniki i zmniejsza liczbę kroków wymaganych do wyizolowania neutrofili, minimalizując w ten sposób długość procedury przy jednoczesnej maksymalizacji wydajności.
Poniższa metoda łączy różne techniki izolacji neutrofili wcześniej opisane w literaturze, aby uzyskać prosty protokół dający bardzo czystą próbkę żywych neutrofili. Jak sugeruje literatura, krew żylna jest pobierana w probówkach EDTA i zużywana w ciągu 10 minut, aby uniknąć aktywacji neutrofili 14. Używamy wirowania w gradiencie gęstości pożywki separacyjnej limfocytów (LSM) do izolowania granulocytów i czerwonych krwinek z heparynizowanej krwi pełnej, metody zaadaptowanej z techniki wirowania gęstości Ficoll początkowo opisanej przez Boyuma i wsp. 15. LSM jest modyfikacją preparatu Bojum, która zastępuje metrizoinian sodu ditrizoinianem sodu i jest z powodzeniem stosowana w wielu badaniach do izolacji neutrofili 16-18.
Po odwirowaniu o zróżnicowanej gęstości, monocyty i limfocyty są odrzucane; czerwone krwinki są następnie sedymentowane za pomocą 6% roztworu Dekstranu 14, a pozostałe RBC są poddawane lizie w celu uzyskania populacji czystych neutrofili, która jest weryfikowana za pomocą barwienia błękitem trypanowym i błękitem metylenowym.
Do wywołania NETozy użyto wielu czynników, w tym lipopolisacharydu (LPS), octanu mirystynianu forbolu (PMA) i interleukiny (IL-8) 3,5,6. W poniższym protokole izolowane neutrofile są stymulowane 500 nM PMA przez 4 godziny, co wykazano, że jest odpowiednim stężeniem, aby umożliwić spójne i niezawodne tworzenie NET bez promowania apoptozy 19,20.
Po izolacji, pokazujemy, jak można wykorzystać bezkomórkowe sieci NET uzyskane z tego protokołu w teście adhezyjnym. DNAse1 służy do trawienia i degradacji NET, jak opisano wcześniej, a zatem służy jako kontrola 2,3,11. Inne opcje obejmują zastosowanie inhibitora elastazy neutrofilowej (NEi) w celu zahamowania tworzenia NET, co jest akceptowalną alternatywą, gdy celem jest zahamowanie powstawania NET, a nie spowodowanie ich degradacji 11. Chociaż NEi pełni wiele różnych funkcji, wcześniej wykazano, że depozycja NET może być hamowana przez NEi poprzez blokowanie dekondensacji chromatyny, degranulacji jądrowej i śmierci neutrofili 12

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), modyfikowana, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu</td><td>Żubr</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do separacji limfocytów (LSM)</td><td>Żubr</td><td>305-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek dekstranu (proszek)</td><td>Spectrum</td><td>DE130</td><td>6% roztwór dekstranu wytwarzany jest przez uzupełnienie PBS z Ca i Mg 6% Dekstranem w proszku</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Pożywka z L-glutaminą</td><td>Żubr</td><td>350-000-CL</td><td>3% roztwór RPMI jest wytwarzany przez uzupełnienie RPMI 3% płodową surowicą bydlęcą</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse Lysing bufor lizujący</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octanu (PMA) Phorbol 12-mirystynian 13-octan (PMA)</td><td>Sigma-Alrdrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>DNAse1</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>F12 DMEM</td><td>Żubr</td><td>319-075-CL</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Żubr</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Integralne naczynie do hodowli tkankowych z siatką 20 mm (150 x 25 mm)</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr></tbody></table>

uproszczona izolacja i obsługa ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów (net)

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NET) zostały niedawno zidentyfikowane jako część arsenału przeciwbakteryjnego neutrofilów. Oprócz ich roli w zwalczaniu infekcji, ostatnie badania wykazały, że mogą być zaangażowane w wiele innych procesów chorobowych, w tym w progresję raka. Izolowanie oczyszczonych sieci NET jest kluczowym elementem umożliwiającym badanie tych funkcji.
W tym filmie demonstrujemy uproszczoną metodę bezkomórkowej izolacji NET z ludzkiej krwi pełnej przy użyciu łatwo dostępnych odczynników. Wyizolowane NET mogą być następnie wykorzystywane do barwienia immunofluorescencyjnego, blottingu lub różnych testów funkcjonalnych. Umożliwia to ocenę ich właściwości biologicznych przy braku potencjalnego zakłócającego wpływu samych neutrofili.
Technika separacji gradientu gęstości jest stosowana do izolowania neutrofili od zdrowych dawców krwi pełnej. Wyizolowane neutrofile są następnie stymulowane przez 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) w celu wywołania NETozy. Aktywowane neutrofile są następnie odrzucane i uzyskuje się bezkomórkowy zapas NET.
Następnie pokazujemy, jak izolowane NET mogą być używane w teście adhezyjnym z ludzkimi komórkami raka płuc A549. Zapas NET służy do powlekania studzienek 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej O/N, a po zapewnieniu odpowiedniego uformowania monowarstwy NET na dnie studzienek, dodaje się komórki A549 oznaczone CFSE. Przylegające komórki są oznaczane ilościowo za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego TE300 firmy Nikon. W niektórych studzienkach 1000U DNAse1 dodaje się 10 minut przed zliczeniem w celu degradacji NET

Pomyślne przeprowadzenie testu statycznej adhezji z udziałem NET wymaga odpowiedniego pokrycia dołków monowarstwą NET przed dodaniem komórek nowotworowych (Rycina 1). Wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane z ostrożnością, aby nie przerwać tej warstwy. Po utworzeniu odpowiedniej warstwy NET oczekuje się zaobserwowania znaczącej adhezji komórek nowotworowych do NET, co przedstawiono na Rycynie 2A oraz 2C. Efekt ten jest niwelowany przez dodanie DNAse1, która degraduj...

W poniższym protokole opisujemy bardzo prosty sposób izolowania neutrofilowych pułapek zewnątrzkomórkowych (NET) z ludzkiej krwi pełnej za pomocą łatwo dostępnych odczynników. Następnie pokazujemy, w jaki sposób wyizolowane NET można wykorzystać w teście adhezji in vitro z komórkami nowotworowymi.

Uproszczona izolacja i obsługa ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów (NET)

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zaprezentowanie prostego protokołu izolacji zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NETs) z pełnej krwi ludzkiej przy użyciu łatwo dostępnych odczynników. Cel ten osiąga się poprzez wstępną izolację neutrofili z pełnej krwi ludzkiej, wykorzystując w drugim kroku technikę centryfugacji różnicowej. Izolowane neutrofile są stymulowane PMA w celu indukowania powstawania pułapek, procesu zwanego NETozą.Następnie przygotowuje się płytkę z bezkomórkowym izolatem sieci i dodaje komórki nowotworowe, aby zademonstrować, w jaki sposób sieci wpływają na adhezję komórek. Wyniki pokazują, że dodanie monowarstwy sieci poprawia adhezję komórek nowotworowych 5 49 i że adhezja ta ulega zmniejszeniu po degradacji sieci. Wykorzystując DNAs one, kluczowa jest wizualna demonstracja tej metody.Ze względu na nowatorstwo tej techniki, manipulacja sieciami z neutrofili (neutrophil extracellular traps) jest niezwykle trudna ze względu na kruchość tych struktur. W pierwszej kolejności należy pozyskać 80 ml świeżej ludzkiej krwi pełnej w 14 probówkach z heparyną (z zielonymi nakrętkami), zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Otwórz każdą probówkę i dodaj do niej 5 ml PBS bez wapnia i magnezu.Następnie do każdej z czterech stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów dodać 15 mililitrów medium do separacji limfocytów (LSM) w temperaturze pokojowej. Następnie, używając igły o rozmiarze 18 G zamontowanej na strzykawce 60 mililitrów, ostrożnie nanieść rozcieńczoną krew na warstwę LSM, tworząc wyraźną granicę między LSM a krwią. Odwirować probówki przy 800 ×g przez 30 minut w temperaturze 21 °C bez hamowania. Po zatrzymaniu wirówki ostrożnie odessać i usunąć dwie górne warstwy cieczy oraz granicę między nimi, pozostawiając jedynie dolną czerwoną warstwę. Osad ten zawiera erytrocyty i neutrofile.Do każdej probówki dodaj 20 mililitrów PBS oraz 20 mililitrów 6% roztworu dekstranu. Delikatnie odwróć każdą probówkę i pozostaw je w temperaturze pokojowej na 30 minut. Erytrocy opadną na dno probówki.Następnie przenieś nadsączniki do nowych probówek i odrzuć osady. Odwiruj nadsączniki przy 450 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut, a następnie odlej nadsącznik, pozostawiając osad bogaty w neutrofile. Przygotuj roztwór lizujący, mieszając 0,5 ml buforu do lizy z 4,5 ml sterylnej wody.Do każdej probówki dodaj łącznie 5 mL roztworu lizującego, a następnie połącz wszystkie osady w jednej kolbie. Pozostaw kolbę w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zlizować pozostałe erytrocyty. Neutrofile odwiruj przy 450 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.Odlej supernatant i przemyj pellet pięcioma mililitrami PBS bez wapnia i magnezu. Następnie ponownie odwirowuj próbkę przy 450 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usuń supernatant zawierający pozostały roztwór lizujący. Resuspenduj pellet neutrofili w 30 mililitrach zimnego medium RPMI uzupełnionego o 3% płodowej surowicy bydlęcej i umieść probówkę na lodzie, aby stymulować tworzenie pozakomórkowych pułapek neutrofilowych lub NETs.Dodaj 500 nM PMA do 30 L zawiesiny neutrofili w płaskiej płytce hodowlanej do tkanek o wymiarach 150 mm na 25 mm. Z wykorzystaniem siatki 20 mm inkubuj komórki przez cztery godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Po inkubacji ostrożnie odessaj i usuń medium, dbając o to, aby nie naruszyć warstwy sieci i neutrofili przylegających do dna płytki.Następnie za pomocą pipety wypłucz dno każdej płytki 15 mililitrami zimnego PBS bez wapnia i magnezu, tak aby cały przylegający materiał został usunięty z dna. Zbierz zawiesinę z płukania do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów, a następnie odwiruj przy 450 ×g przez 10 minut. W temperaturze czterech stopni Celsjusza neutrofile i pozostałe komórki utworzą osad na dnie.Po uzyskaniu nadsączu bogatego w sieci wolne od komórek, należy przelać nadsącz do wielu probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 18 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Aby osadzić DNA, należy odlać nadsącz i resuspendować osad w PBS w taki sposób, aby stężenie odpowiadało 2 × 10⁷ neutrofili na 100 µL PBS. Ten zapas sieci wolnych od komórek może być wykorzystany w kolejnych eksperymentach.Zmierz stężenie DNA w próbce za pomocą spektrofotometrii. Odpowiednie stężenie powinno mieścić się w zakresie od 140 do 180 nanogramów na mikrolitr; nanieś 100 mikrolitrów zapasu sieci do każdej studni płytki 96-dołkowej z płaskim dnem i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, aby pokryć dno studni. Po 12 do 20 godzinach użyj mikroskopu, aby zweryfikować utworzenie jednorodnej monowarstwy sieci pozbawionych komórek na dnie studni. Po potwierdzeniu obecności monowarstwy delikatnie odessij cały nieprzylegający materiał ze studni.Należy uważać, aby nie uszkodzić monowarstwy na dnie. Jest to najtrudniejszy etap tej procedury. Aby zachować odpowiednią nienaruszoną monowarstwę, płytkę należy obchodzić się bardzo ostrożnie.Powoli dodaj wszystkie odczynniki i komórki przy ściankach studzienek, bardzo ostrożnie odessij ciecz, unikając dotknięcia końcówką pipety ssącej dna studzienki. Po delikatnym usunięciu materiału nieprzylegającego dodaj do każdej studzienki 100 µL 1% roztworu blokującego albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i pozostaw na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Nie wstrząsaj ani nie potrząsaj płytką, ponieważ może to naruszyć monowarstwę sieci.Następnie należy przygotować komórki nowotworowe 5 49, zbierając je, gdy osiągną 70 do 80% konfluencji. Stosując standardowe techniki, należy resuspender komórki w medium do stężenia 2 × 10⁴ komórek na 100 µL. Komórki barwi się poprzez dodanie 1 µL CFS e na 1 mL medium, pozostawiając je w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Następnie odwiruj komórki przy 450 ×g w temperaturze 4°C przez pięć minut. Odlej nadsącz i resuspenduj komórki w początkowej objętości medium, aby utrzymać stężenie 2 × 10⁴ komórek nowotworowych na 100 µL medium. Weź płytkę powleczoną Net i delikatnie odessaj roztwór blokujący.Następnie dodaj 100 µL zawiesiny komórek nowotworowych do każdej studni i pozostaw komórki na 90 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aby przywarły do płytki. Całkowicie odessij ciecz i do niektórych studni dodaj 1000 jednostek DNazy I na 10 minut w celu degradacji sieci NETs. Do pozostałych studni dodaj 100 µL sterylnej wody na studnię na 10 minut jako kontrolę nośnika. Następnie delikatnie odessij ciecz z każdej studni i przemyj 100 µL PBS, aby usunąć wszystkie nieprzylegające komórki.Odessać i usunąć cały roztwór z 49 studni, pozostawiając jedynie siatki oraz przylegające komórki nowotworowe na dnie. Następnie dodać 100 µL 4% roztworu formaldehydu do każdej studni w celu utrwalenia komórek, niezwłocznie przenieść płytkę pod mikroskop fluorescencyjny w celu odczytu testu, a następnie nanieść i przeanalizować wyniki za pomocą oprogramowania do analizy danych.Siatki wolne od komórek wykorzystano w testach adhezji statycznej z komórkami raka 5 49. Mikroskopia świetlna wykazała, że komórki nowotworowe silnie przylegają do monowarstwy siatki. In vitro.Adhezja ta uległa zmniejszeniu po degradacji monowarstwy sieci przez DNA, a fluorescencyjna mikroskopia znakowanych komórek nowotworowych A549 potwierdziła te wyniki. Wiązanie komórek A549 z monowarstwą sieci określono ilościowo, licząc liczbę komórek w polu widzenia dużego powiększenia. Jak pokazano tutaj, w kontroli nośnikowej nie odnotowano zmian w adhezji komórek nowotworowych do sieci.Odnotowano jednak istotny spadek adhezji komórek nowotworowych do sieci w obecności DNazy I. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak izolować i przetwarzać sieci z pełnej krwi ludzkiej. Te izolaty sieci pozbawione komórek mogą być następnie wykorzystane w różnych technikach, w tym w immunofluorescencji, mikroskopii konfokalnej, mikroskopii elektronowej oraz w technice western blotting.

simplified-human-neutrophil-extracellular-traps-nets-isolation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Uproszczona izolacja i obsługa zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych człowieka (NETs)

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować

Ten film demonstruje technikę in vitro do generowania i izolowania neutrofili w pułapkach zewnątrzkomórkowych (NET). Neutrofile są izolowane z krwi obwodowej i stymulowane octanem mirystynianu forbolu (PMA) w celu wytworzenia NET. Podczas inkubacji neutrofile przechodzą proces śmierci komórki (NETosis) w celu uwolnienia NET zawierających zdekondensowaną chromatynę zmieszaną z ziarnistymi białkami cytoplazmatycznymi.

Technika in vitro do generowania ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Tutaj prezentujemy metodę, w której ludzkie neutrofile o niskiej gęstości (LDN), odzyskane z pooperacyjnego płynu z płukania otrzewnej, wytwarzają ogromne pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET) i skutecznie zatrzymują wolne komórki nowotworowe, które następnie rosną.

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili generowane przez neutrofile o niskiej gęstości uzyskane z płynu do płukania otrzewnej pośredniczą we wzroście i przyczepianiu komórek nowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół do generowania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i obsługi NETQUANT, w pełni automatycznej opcji oprogramowania do ilościowego oznaczania NET w obrazach immunofluorescencyjnych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT

Ten protokół opisuje wysoce czuły i wysokoprzepustowy test pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) do półautomatycznego oznaczania ilościowego tworzenia ex vivo NET za pomocą immunofluorescencji trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być wykorzystany do oceny powstawania i degradacji NET po różnych bodźcach i może być wykorzystany do badania potencjalnych terapii ukierunkowanych na NET.

Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili to trójwymiarowe struktury generowane przez stymulowane granulocyty neutrofilowe. W ostatnich latach stało się jasne, że sieci NET są zaangażowane w wiele różnych chorób. Wykrywanie NET w tkance może mieć znaczenie diagnostyczne, dlatego wymagane są standardowe protokoły znakowania składników NET.

Znakowanie immunofluorescencyjne ludzkich i mysich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w tkance zatopionej w parafinie

Prezentowany tutaj jest protokół do indukcji i analizy in vitro zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Kwantyfikacja DNA, katelicydyny (LL37) i aktywności enzymów dostarczyła danych, które pokazują zmienność składu i morfologii NET indukowanych przez bodźce mikrobiologiczne i chemiczne w podobnie kontrolowanych warunkach.

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

To badanie przedstawia dwie techniki izolowania licznych pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) ze szpiku kostnego szczura. Jedna metoda łączy komercyjny zestaw do izolacji neutrofili z wirowaniem w gradionym przepływie gęstości, podczas gdy druga wykorzystuje tylko wirowanie w gradiencie gęstości. Oba podejścia dają funkcjonalne NET przewyższające te z neutrofili krwi obwodowej.

Unikalne podejście do izolowania neutrofili szpiku kostnego szczurów o porównywalnej pojemności

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Poznaj uproszczoną metodę izolacji pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów (NET) z ludzkiej krwi. Technika ta umożliwia badanie wpływu NET na adhezję komórek nowotworowych in vitro.

Uproszczona izolacja i obsługa ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów (NET)

Przeglądaj więcej filmów