Produkcja, charakterystyka i potencjalne zastosowania 3D modelu błony śluzowej przełyku dla człowieka opartego na inżynierii tkankowej

Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie trójwymiarowego modelu tkankowego ludzkiego nabłonka przełyku do wykorzystania jako platforma eksperymentalna. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie normalnych ludzkich fibroblastów przełyku i komórek nabłonkowych z próbek ludzkiej tkanki przełyku. W drugim etapie fibroblasty są wysiewane na nabłonkowym bezkomórkowym, znakowym porę, rusztowaniu przełyku i hodowane przez siedem dni.

Następnie rusztowanie jest odwracane, a izolowane ludzkie komórki nabłonka przełyku dodaje się do hodowli na cztery dni. W ostatnim etapie model jest przenoszony do granicy faz powietrze-ciecz na kolejne pięć dni hodowli, co pozwala na rozwój dojrzałego nabłonka warstwowego. Ostatecznie immunohistochemia jest wykorzystywana do scharakteryzowania kluczowych markerów proliferacji i różnicowania wyrażanych przez modelowe komórki nabłonkowe.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalną hodowlą komórkową 2D jest to, że pozwala komórkom na interakcje komórkowe, komórkowe i macierzowe, które miałyby in vivo. Za pomocą tej techniki możemy wytworzyć dojrzały warstwowy nabłonek płaskonabłonkowy podobny do normalnego przełyku. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z trzech powodów.

Po pierwsze, wyzwaniem może być zapewnienie, że większość komórek nabłonka nie różnicuje się przed włączeniem do rusztowania. Po drugie, należy zadbać o to, aby w okresie dojrzewania nabłonka zapewniony był prawidłowy interfejs powietrza i cieczy. I po trzecie, utrzymanie tego stanu przez cały okres kultury może być wyzwaniem.

Aby wyizolować ludzkie komórki nabłonka przełyku, umieść pobraną tkankę błony śluzowej przełyku na sterylnej szalce Petriego i użyj skalpela wysterylizowanego etanolem, aby pociąć tkankę na 0,5-centymetrowe paski. Następnie inkubuj tkankę w 0,1% tryynie pokrytej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, zatrzymując trawienie po godzinie pięcioma mililitrami FCS. Następnie, trzymając paski kleszczami, delikatnie zeskrob powierzchnię nabłonka ostrzem skalpela przez jedną do dwóch minut na pasek, aby usunąć komórki nabłonka do otaczającego podłoża, gdy wszystkie paski zostaną zeskrobane, przenieś pożywkę zawierającą oderwane komórki nabłonka do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Po odwirowaniu komórek wyrzuć senes i ponownie zawieś osad w 12 mililitrach podłoża nabłonkowego. Następnie wyrzuć pożywkę z hodowli komórek pętowych i użyj sterylnej pipety, aby pokryć komórki nabłonka na komórkach zasilających, aby wyizolować ludzkie fibroblasty przełyku. Przenieś zeskrobane paski tkanki na sterylną szalkę Petriego, a na koniec zmiel tkankę skalpelem.

Strawij kawałki w 10 mililitrach 0,5% kolagenazy, roztworu pokrytego temperaturą 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, w wilgotnej atmosferze przez noc. Następnego dnia przenieś trawienie do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i odwiruj komórki. Resus zawieszający podniebienie w 10 mililitrach kultury fibroblastów Średnie.

Hodowla w kolbie T 75 w inkubatorze do hodowli komórkowych. Aby przygotować bezkomórkowe rusztowania przełyku świni, zacznij od użycia nożyczek i pęsety, aby rozciąć przełyk świni wzdłużnie. Następnie umyj przełyk w sterylnym garnku o pojemności 180 mililitrów zawierającym 100 mililitrów sterylnego PBS przez 10 minut, delikatnie potrząsając, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z dnia codziennego podczas płukania tkanki.

Spryskaj korkową deskę do preparacji 70% etanolem, gdy korek wyschnie w przełyku, na deskę śluzówką do góry. Teraz użyj sterylnej pęsety, aby chwycić powierzchnię błony śluzowej na jednym końcu przełyku i odciągnij tkankę od deski, aby oddzielić błonę śluzową od leżącej pod nią błony podśluzowej. Następnie za pomocą sterylnego ostrza skalpela rozetnij przełyk wzdłuż lanar właściwy, usuwając szpilki w miarę postępu sekcji, aby umożliwić uniesienie błony śluzowej.

Odrzuć leżącą pod spodem błonę śluzową i użyj skalpela, aby pokroić pozostałą błonę śluzową na pięć centymetrowych kwadratowych kawałków. Umyj kawałki w 150 mililitrach sterylnego PBS z delikatnym mieszaniem, jak pokazano. Po pięciu minutach przenieś tkankę do 180-mililitrowego garnka zawierającego 150 mililitrów jednomolowego roztworu chlorku sodu.

Uzupełniony antybiotykami w temperaturze 37 stopni. Po 72 godzinach przenieś tkankę do 150 mililitrów sterylnego PBS, w którym to momencie nabłonek zacznie widocznie oddzielać się od tkanki leżącej pod spodem. Użyj sterylnych kleszczy i ostrza skalpela, aby usunąć odklejający się nabłonek i umieść pozostałą tkankę w świeżym garnku zawierającym 150 mililitrów sterylnego PBS z trzema pięciominutowymi płukaniami z delikatnym mieszaniem, tkanka musi być teraz przechowywana w glicerolu przez co najmniej cztery miesiące.

Aby w pełni wysterylizować rusztowanie, należy rozpocząć przygotowanie modelu błony śluzowej przełyku od ponownego nawodnienia części rusztowania wieprzowego, które były sterylizowane glicerolem przez co najmniej cztery miesiące. W 100 mililitrach sterylnego PBS na pięć, 10 minut mieszania. Zastąpienie supinatu świeżym PBS przy każdym praniu.

Po piątym teście mieszania sterylność rusztowania z całonocną inkubacją w 100 mililitrach DMEM w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka przenieś rusztowania do pojedynczych studzienek z sześciodołkową płytką podśluzówkową do góry. Następnie umieść sterylny pierścień ze stali nierdzewnej klasy medycznej na środku każdego rusztowania i użyj sterylnych kleszczy, aby delikatnie docisnąć pierścienie, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie z tkanką pięć razy.

Wyśrodkuj pięć ludzkich fibroblastów przełyku w 0,2 mililitra pożywki z fibroblastami w środku każdego pierścienia. Następnie zalej obszar wokół zewnętrznej strony pierścienia co najmniej dwoma dodatkowymi mililitrami pożywki dla fibroblastów i inkubuj rusztowania w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 24 godzinach usuń pierścienie i zastąp pożywkę w każdej studzience co najmniej pięcioma mililitrami świeżych fibroblastów.

Średni, dbając o to, aby rusztowania były całkowicie zanurzone. Po tygodniu wyrzuć pożywkę i użyj kleszczy, aby odwrócić powierzchnię błony śluzowej rusztowania do góry. Umieść pierścienie z powrotem na rusztowaniach, a następnie dodaj jeden środek czasowy sześciu komórek nabłonka w 0,2 mililitra pożywki złożonej, po jednym do środka każdego pierścienia.

Zatkaj obszar na zewnątrz pierścienia około dwoma mililitrami pożywki kompozytowej i włóż konstrukty z powrotem do inkubatora. Po 24 godzinach usuń pierścienie i zastąp podłoże w każdej studzience co najmniej pięcioma mililitrami świeżego podłoża kompozytowego, jeden, upewniając się, że rusztowania są całkowicie zanurzone. Po kolejnych 24 godzinach zastąp pożywkę co najmniej pięcioma mililitrami pożywki złożonej. Dwa.

Czwartego dnia umieść sterylne siatki siatkowe ze stali nierdzewnej klasy medycznej w dołkach nowej sześciodołkowej płytki i przenieś konstrukty na siatkę śluzówką do góry. Na koniec dodaj tyle podłoża kompozytowego, aby dotarło do spodu kompozytu, pozostawiając powierzchnię wystawioną na działanie powietrza, upewniając się, że próbka jest utrzymywana na granicy faz powietrze-ciecz. Najtrudniejszą częścią procedury jest skonfigurowanie interfejsu powietrze-ciecz.

Jeśli nie jest jasne, czy kratka ma kontakt z cieczą ze sterylną końcówką rury, ponieważ łatwiej jest sprawdzić, czy rura jest zanurzona. Alternatywnie możesz spróbować delikatnie kołysać płytką, ponieważ łatwiej jest zobaczyć płyn, gdy się porusza, i sprawdzić, czy na siatce znajduje się płyn, który nie zakrywa próbki. Ta logiczna ocena nabłonka przedstawia dojrzały, wielowarstwowy, warstwowy nabłonek płaskonabłonkowy, podobny, ale cieńszy do tego obserwowanego w normalnym ludzkim przełyku, z komórkami, które stają się coraz bardziej płaskie i ostatecznie jądrowe, gdy migrują w kierunku powierzchni.

Charakterystyka immunohistochemiczna kluczowych markerów proliferacji i różnicowania pokazuje, że mikroanatomia nabłonka modelowego jest podobna do normalnej ludzkiej nabłonka przełyku. Na przykład porównywalną ekspresję cytokeratyny 14 obserwuje się zarówno w natywnym przełyku, jak i w nabłonku modelowym z barwieniem ograniczonym do komórek w warstwie podstawnej. Model ten został z powodzeniem zmodyfikowany w celu włączenia komórek nowotworowych poprzez zastąpienie pierwotnych komórek nabłonka komórkami rakowymi, co świadczy o elastyczności modelu.

Na przykład komórki raka płaskonabłonkowego wytwarzają nabłonek widoczny na konstrukcie jako zdefiniowany żółty obszar z dużymi szczelinami w nabłonku, prawdopodobnie odzwierciedlający obecność dysfunkcyjnych cząsteczek cellii, w tym komórek gruczolakoraka przełyku w modelu, co powoduje dużą degradację rusztowania widoczną dla oka jako ścieńczenie rusztowania. Po dwóch tygodniach wzrostu na granicy faz powietrze-ciecz i potwierdzone w analizie h i e jako oczywiste zmniejszenie grubości rusztowania w obszarze poniżej komórek Po tej procedurze inne metody ekspresji genów, takie jak northern lub western blotting, można zastosować do tej samej tkanki, aby odpowiedzieć na pytania takie jak: Jak nabłonek reaguje na stresy środowiskowe? Jest to więc naprawdę cenne źródło do głębszego przyjrzenia się większej liczbie pytań po jego opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zainteresowanym metaplazją Barretta do zbadania wpływu ekspozycji na określone składniki refluksu na ekspresję genów w normalnym ludzkim przełyku.