Name: Produkcja, charakterystyka i potencjalne zastosowania 3D modelu błony śluzowej przełyku dla człowieka opartego na inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Odkryj metodę inżynierii tkankowej do tworzenia trójwymiarowego modelu nabłonka przełyku człowieka. Technika wykorzystuje pierwotne komórki ludzkie i dekompozycyjny szkielet wieprzowy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Panom Rogerowi Ackroydowi, Panu Andrew Wymanowi i Panu Chrisowi Stoddardowi, Konsultantom Chirurgów w Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, za ich pomoc w pozyskiwaniu próbek tkanki przełyku i wsparcie naszej pracy. Dziękujemy Ashrafulowi Haque za pomoc we włączeniu linii komórek nowotworowych do modelu. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe dla tego badania poprzez granty z Bardhan Research and Education Trust (BRET) i Yorkshire Cancer Research (YCR).

Ludzkie komórki przełyku pozyskuje się od pacjentów poddawanych operacji żołądka lub przełyku. Uzyskuje się świadomą zgodę na wykorzystanie tkanki do celów badawczych oraz anonimowe wykorzystanie tkanki zgodnie z odpowiednimi zatwierdzeniami etycznymi (SSREC 165/03, licencja banku tkanek przeznaczonych do badań klinicznych na ludziach 12179).
1. Izolacja ludzkich komórek nabłonka przełyku
<ol>
	<li>Pracując w kapturze do hodowli tkankowych z przepływem laminarnym i stosując sterylną technikę, przygotuj pożywkę do hodowli nabłonkowych, mieszając zmodyfikowaną pożywkę Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco i F12 Ham's w stosunku 3:1 (v:v). Dodać 10% (v/v) FCS, 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 0,4 μg/ml hydrokortyzonu, 1,8 x 10-4 M adenina, 5 μg/ml insuliny, 5 μg/ml transferyny, 2 x 10-7 M trójjodotyroniny, 1 x 10-10 M toksyny, 2 x 10-3 M glutamina, 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,625 μg/ml amfoterycyny B.</li>
	<li>Stosując standardowe sterylne techniki, umieść 11 ml DMEM, 10% FCS, 2 x 10-3 M L-glutaminy, 100 IU / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny i 0,625 μg / ml amfoterycyny B do kolby do hodowli tkankowej T75. Dodać 1 x 106 śmiertelnie napromieniowanych mysich fibroblastów 3T312 w 1 ml tej samej pożywki i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2, wilgotnej atmosferze. W ten sposób powstanie warstwa zasilająca dla późniejszej hodowli komórek nabłonkowych.</li>
	<li>Za pomocą skalpela i zgodnie z zaleceniami histopatologa należy wypreparować około 2cm2 próbkę tkanki z wolnego od choroby obszaru tła błony śluzowej przełyku uzyskanego od pacjentów poddawanych operacji żołądka lub przełyku. Transport do laboratorium w pojemniku o pojemności 50 ml ze sterylnym podłożem transportowym (PBS 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,625 μg/ml amfoterycyny B) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W tym momencie należy przechowywać tkankę w podłożu transportowym do 12 godzin (przez noc) w temperaturze 4 °C, dla wygody; jednak nie należy stosować dłuższych okresów przechowywania, ponieważ powodują one zmniejszenie żywotności komórek.</li>
	<li>Pracując w kapturze do hodowli tkanek z przepływem laminarnym i stosując sterylną technikę, wysterylizuj ostrze skalpela, mocząc je w 70% etanolu przez 5 minut. Spłucz w sterylnym PBS.</li>
	<li>Umieść tkankę na sterylnej szalce Petriego i skalpelem pokrój ją w paski o długości 0,5 cm. Dodać 5 ml 0,1% (m/v) trypsyny z PBS do szalki Petriego, przykryć szalkę pokrywką i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 5 ml FCS do tkanki na szalce Petriego, aby zahamować działanie trypsyny. Trzymając pasek tkanki sterylnymi kleszkami, delikatnie zeskrob powierzchnię nabłonka ostrzem skalpela przez 1-2 minuty na pasek, aby usunąć komórki nabłonka do otaczającego podłoża. Usuń zeskrobaną chusteczkę i odłóż na bok. Powtórz ten proces dla wszystkich pasków tkanki.</li>
	<li>Zebrać pożywkę zawierającą oderwane komórki nabłonka do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować (5 min, 200 x g). Odlać supernatant i ponownie zawiesić osad w 12 ml podłoża nabłonkowego (opisanego w kroku 1.1).</li>
	<li>Odlać i wyrzucić pożywkę z warstwy komórek zasilających w kolbie T75 przygotowanej w kroku 1.2. Za pomocą sterylnej pipety dodać zawiesinę zawierającą świeżo wyizolowane komórki nabłonka do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% nawilżonej atmosferzeCO2.</li>
	<li>Po 24 godzinach odlać i wyrzucić pożywkę hodowlaną, która będzie również zawierać resztki komórek, i zastąpić 12 ml świeżej pożywki nabłonkowej. Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 . Kolonie zaczną pojawiać się w ciągu najbliższych 24 do 48 godzin i można je obejrzeć, umieszczając kolbę hodowlaną pod standardowym mikroskopem świetlnym. Odlej zużytą pożywkę hodowlaną i zastąp równą objętością świeżej pożywki co 2 do 3 dni.</li>
	<li>Gdy kolba osiągnie 80% zbieżności, przeprowadź przez komórki13. Podziel komórki w stosunku 1:5, aby zwiększyć liczbę komórek do użycia w modelu. Postępuj zgodnie z krokiem 1.2, aby ustalić warstwy zasilające napromieniowanych komórek 3T3 w każdej kolbie, która będzie otrzymywać komórki nabłonkowe na 24 godziny przed pasażowaniem komórek. 
	Uwaga: Używaj komórek nabłonkowych w modelu przełyku opisanym poniżej tylko między przejściami 1 i 4.</li>
</ol>
2. Izolacja ludzkich fibroblastów przełyku
<ol>
	<li>Pracując w komorze z przepływem laminarnym i stosując technikę sterylną, należy odłożyć tkankę odłożoną na bok w kroku 1.7. Umieść na sterylnej szalce Petriego i drobno posiekaj sterylnym ostrzem skalpela. Dodać 10 ml 0,5% (m/v) roztworu kolagenazy A i przykryć pokrywką szalkę Petriego i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5%CO2.</li>
	<li>Przenieść trawienie do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować (10 min, 200 x g), ostrożnie odlać i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml pożywki hodowlanej fibroblastów (DMEM 10% FCS, 2 x 10-3 M L-glutamina, 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,625 μg/ml amfoterycyny B).</li>
	<li>Umieścić zawiesinę w kolbie T75 i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% nawilżonej atmosferze o stężeniu 5% CO2 . Po 24 godzinach odlej pożywkę, która będzie zawierać zanieczyszczenia i zastąp 12 ml świeżej pożywki fibroblastowej. Wymieniaj pożywkę hodowlaną co 2 do 3 dni i pasażuj komórki, gdy osiągną 80% konfluencji13, dzieląc komórki w stosunku 1:5, aby zwiększyć liczbę komórek. 
	Uwaga: Użyj komórek fibroblastów w modelu opisanym poniżej tylko między przejściami 4 i 10.</li>
</ol>
3. Przygotowanie rusztowania przełyku bez komórek
<ol>
	<li>Uzyskaj nienaruszony przełyk świń w rzeźni ze świeżo ubitych świń rasy Landrace, które są wykorzystywane do produkcji żywności. Pojedynczy przełyk zapewni wystarczającą ilość rusztowań dla około 30 oddzielnych konstrukcji. 
	Uwaga: Ze względu na wymagany obszerny i czasochłonny protokół sterylizacji, zwykle warto uzyskać i przetworzyć minimum 10 przełyków jednocześnie.</li>
	<li>Świeżo wycięty przełyk należy natychmiast umieścić w sterylnym garnku o pojemności 180 ml zawierającym około 150 ml 10% roztworu jodu powidonu na 5 minut, aby zmniejszyć zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Przenieść przełyk do drugiego garnka zawierającego około 100 ml sterylnego PBS zawierającego 200 j.m./ml penicyliny, 200 μg/ml streptomycyny i 1,25 μg/ml amfoterycyny B.
	<ol>
		<li>Załóż pokrywkę na pojemnik i przetransportuj przełyk z powrotem do laboratorium w temperaturze pokojowej. W każdym pojemniku można przewozić dwa lub trzy przełyki, w zależności od ich wielkości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po przybyciu do laboratorium należy obchodzić się z tkanką w okapie z przepływem laminarnym przy użyciu techniki aseptycznej, aby zminimalizować zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Wysterylizuj pęsety, nożyczki i ostrza skalpela, mocząc przez 5 minut w 70% etanolu i spłukując w sterylnym PBS.</li>
	<li>Dotykaj przełyku za pomocą sterylnej pęsety. Za pomocą nożyczek rozetnij przełyk wzdłużnie. Opłucz tkankę, umieszczając przełyk w sterylnym pojemniku o pojemności 180 ml zawierającym około 100 ml sterylnego PBS i delikatnie potrząsając, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.</li>
	<li>Wyczyść deskę do preparowania korka, spryskując obficie 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.</li>
	<li>Wyjmij przełyk z PBS i za pomocą sterylnych igieł przypnij przełyk do deski, powierzchnią błony śluzowej do góry. Chwyć powierzchnię błony śluzowej na jednym końcu przełyku sterylną pęsetą i oderwij od deski. Spowoduje to oddzielenie błony śluzowej od leżącej pod nią błony podśluzowej.
	<ol>
		<li>Następnie użyj sterylnego ostrza skalpela, aby wyciąć przełyk wzdłużnie wzdłuż blaszki właściwej, usuwając szpilki w miarę postępu sekcji, aby umożliwić usunięcie błony śluzowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zachowaj wypreparowaną błonę śluzową i odrzuć leżącą pod nią błonę podśluzową.</li>
	<li>Odetnij i odrzuć najbardziej proksymalne i dystalne 2 cm błony śluzowej, ponieważ w tych obszarach występuje większa liczba gruczołów podśluzówkowych i grubsza blaszka właściwa7.</li>
	<li>Za pomocą skalpela pokrój pozostałą tkankę na 5 cm2. Umieść całą pociętą tkankę w sterylnym garnku o pojemności 180 ml zawierającym około 150 ml sterylnego PBS i delikatnie mieszaj, aby spłukać tkankę. W przypadku przetwarzania więcej niż pięciu przełyków jednocześnie może być konieczne użycie wielu doniczek do tego i trzech kolejnych kroków.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pęsety przenieś pociętą tkankę do garnka o pojemności 180 ml zawierającego 150 ml sterylnego 1 M NaCl, 200 j.m./ml penicyliny, 200 μg/ml streptomycyny i 1,25 μg/ml amfoterycyny B. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieść tkankę w świeżym pojemniku o pojemności 180 ml zawierającym 150 ml sterylnego PBS. Nabłonek zacznie widocznie oddzielać się od leżącej pod nim tkanki. Delikatnie oderwij odklejający się nabłonek od przełyku świni za pomocą sterylnych kleszczy i wyrzuć.
	<ol>
		<li>Umieść pozostałą tkankę w świeżym garnku o pojemności 180 ml i dodaj 150 ml sterylnego PBS. Mieszaj delikatnie przez 5 minut do umycia. Odlej PBS i powtórz kolejne dwa razy ze świeżym PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść całą tkankę w szklanej butelce o pojemności 500 ml zawierającej 400 ml sterylnego 80% (v/v) roztworu glicerolu na 24 godziny w temperaturze pokojowej. Przenieść do 400 ml sterylnego 90% (v/v) roztworu glicerolu na kolejne 24 godziny.</li>
	<li>Przechowywać w 400 ml sterylnego roztworu 100% glicerolu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 4 miesiące w celu odwodnienia i wysterylizowania tkanki przy zachowaniu integralności błony podstawnej.</li>
</ol>
4. Produkcja pożywki hodowlanej
<ol>
	<li>Przygotować chelatowaną surowicę cieląt nowonarodzonych do użycia w pożywce hodowlanej.
	<ol>
		<li>Wlej 100 g Chelex 100 do szklanej butelki o pojemności 1 l i dodaj wodę dejonizowaną. Dokładna objętość nie jest krytyczna, ale należy dodać wystarczającą ilość wody, aby pokryć proszek Chelex. Dodać mieszadło magnetyczne i sterylizować w autoklawie (121 °C przez 15 min).</li>
		<li>Pozwól butelce ostygnąć, a Chelex osiądzie. W komorze z przepływem laminarnym odlewać nadmiar wody, dodać 500 ml surowicy dla nowonarodzonych cieląt (NCS) i pozostawić na noc do wymieszania w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przestań mieszać i pozwól Chelexowi się uspokoić, może to potrwać do 30 minut. W komorze z przepływem laminarnym zdekantować chelatowaną surowicę za pomocą sterylnej pipety, uważając, aby nie naruszyć Chelexu, i przechowywać w 10 ml porcji w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj trzy różne podłoża w komorze z przepływem laminarnym, zaczynając od preparatów proproliferacyjnych, a kończąc na preparatach proróżnicujących.
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę złożoną I składającą się z DMEM i szynki F12 w stosunku 3:1 (v:v), 4 x 10-3 M L-glutaminy, 0,5 μg/ml hydrokortyzonu, 1 x 10-4 M O-fosforyloetanoloaminy, 2 x 10-12 M trójjodotyroniny, 1,8 x 10-4 M adeniny, 1,88 x 10-3 M CaCl2, 4 x 10-12 M progesteronu, 10 μg/ml insuliny, 10 μg/ml transferyny, 10 ng/ml selenu, 1 x 10-3 M etanoloaminy i 0,1% (v/v) chelatowany NCS.</li>
		<li>Przygotować Pożywkę Kompozytową II jako Pożywkę Złożoną I, z wyjątkiem zastąpienia chelatowanej surowicy 0,1% (v/v) niechelatowanym NCS.</li>
		<li>Preparat Composite Medium III należy przygotować jako pożywkę kompozytową II, z wyjątkiem pominięcia progesteronu i zwiększenia surowicy do 2% (v/v) niechelatowanego NCS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Produkcja modelu ludzkiej błony śluzowej przełyku
<ol>
	<li>Wszystkie prace należy wykonywać w okapie z przepływem laminarnym, stosując technikę aseptyczną, aby utrzymać sterylne środowisko. Wysterylizuj wszystkie narzędzia, mocząc je w 70% etanolu przez 5 minut, a następnie spłucz w sterylnym PBS.</li>
	<li>Dzień przed zapotrzebowaniem należy nawodnić bezkomórkowe rusztowanie przełyku świń. Do przygotowania każdej konstrukcji wymagany jest jeden kawałek rusztowania.
	<ol>
		<li>Aby nawodnić tkankę, umieść wystarczającą ilość rusztowania wieprzowego w garnku zawierającym 100 ml sterylnego PBS, mieszaj i moczyć przez 10 minut. Zdekantuj PBS i zastąp świeżym PBS. Powtórz proces mycia pięć razy, aby upewnić się, że wszystkie ślady glicerolu zostaną usunięte.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdzić sterylność rusztowania poprzez inkubację uwodnionej tkanki przez noc w 100 ml DMEM w temperaturze 37 °C. Jeżeli pod koniec okresu inkubacji nie nastąpi zmiana koloru lub zmętnienia pożywki, zakłada się, że rusztowanie jest sterylne. Po potwierdzeniu bezpłodności umieść rusztowanie bezkomórkowe o średnicy 5 cm2 w 6-dołkowej płytce, stroną podśluzówkową do góry.</li>
	<li>Umieść sterylny pierścień ze stali nierdzewnej klasy medycznej (średnica wewnętrzna 10 mm, średnica zewnętrzna 20 mm) na środku każdego rusztowania i delikatnie dociśnij za pomocą sterylnych kleszczyków, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie z tkanką.</li>
	<li>Zbierz fibroblasty za pomocą trypsyny-EDTA13, aby wytworzyć zawiesinę komórkową. Policz komórki za pomocą hemocytometru14. Odwirować zawiesinę komórek (10 min, 200 x g). Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki z fibroblastami, aby uzyskać końcową liczbę komórek 2,5 x 106 komórek na ml.</li>
	<li>Dodać 0,2 ml pożywki z fibroblastami, zawierającej 5 x 105 ludzkich fibroblastów przełyku, do każdego pierścienia. Zalać obszar wokół zewnętrznej strony pierścienia około 2 ml pożywki z fibroblastów. Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w wilgotnej atmosferze.</li>
	<li>Po 24 godzinach usuń pierścienie i pożywkę z fibroblastów i dodaj co najmniej 5 ml świeżej pożywki fibroblastowej do każdej studzienki, upewniając się, że rusztowanie jest całkowicie zanurzone w podłożu. Hodowla przez 1 tydzień, w temperaturze 37 °C w 5% CO2 , nawilżona atmosfera wymieniając pożywkę co 2 do 3 dni.</li>
	<li>Po 1 tygodniu wyjmij 6 płytek dołkowych zawierających rusztowania do laminarnego okapu zalewowego, usuń podłoże i odwróć każde rusztowanie za pomocą sterylnych kleszczy, umieszczając powierzchnię błony śluzowej u góry. Ten punkt czasowy jest określany jako Dzień 0.</li>
	<li>Umieść stalowe pierścienie na powierzchni błony śluzowej w środku tkanki, jak w kroku 5.4.</li>
	<li>Przygotować kolby T75 komórek nabłonka do trypsynizacji13. Po przemyciu PBS, a przed dodaniem roztworu trypsyny-EDTA, do każdej kolby dodać 2 ml sterylnego 0,02% (m/v) roztworu EDTA. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Delikatnie postukać w kolbę, aby selektywnie oderwać warstwę zasilającą i3T3, pozostawiając przyczepione komórki nabłonka. 
	Uwaga: Generalnie nie jest praktyczne ani konieczne dopasowywanie komórek nabłonka do fibroblastów już włączonych do modelu w poprzednim tygodniu.</li>
	<li>Odlej roztwór EDTA zawierający warstwę zasilającą i dodaj roztwór trypsyny-EDTA, aby zebrać komórki nabłonkowe13. Policz komórki za pomocą hemocytometru14. Odwirować zawiesinę komórek (10 min, 200 x g). Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki kompozytowej 1, aby uzyskać końcową liczbę komórek 5 x 106 komórek na ml.</li>
	<li>Dodać 0,2 ml pożywki Composite Medium I, zawierającej 1 x 106 komórek nabłonkowych, do pierścienia. Zalać obszar wokół zewnętrznej strony pierścienia około 2 ml pożywki kompozytowej I i umieścić konstrukty w inkubatorze w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze o stężeniu 5%CO2.</li>
	<li>Po 24 godzinach (dzień 1) usunąć pierścienie i podłoże i dodać co najmniej 5 ml świeżego podłoża kompozytowego I, upewniając się, że rusztowania są całkowicie zanurzone i powrócić do inkubatora. Po kolejnych 24 godzinach (dzień 2) usuń pożywkę i zastąp ją co najmniej 5 ml pożywki kompozytowej II, ponownie upewniając się, że rusztowania są całkowicie zanurzone i wróć do inkubatora.</li>
	<li>W dniu 4 umieść sterylne siatki siatkowe ze stali nierdzewnej klasy medycznej (2 cm szerokości x 2 cm długości x 0,5 cm wysokości) w świeżych 6-dołkowych płytkach, po jednej na konstrukcję. Użyj sterylnej pęsety, aby przenieść konstrukcje na wierzch stalowych siatek, powierzchnią błony śluzowej do góry.
	<ol>
		<li>Dodać wystarczającą ilość podłoża kompozytowego III, aby ciecz dotarła do spodu kompozytu, ale powierzchnia była wystawiona na działanie powietrza, co zapewnia utrzymanie próbki na granicy faz powietrze-ciecz. Dokładna wymagana objętość medium będzie się różnić w zależności od grubości rusztowania, objętości studni i dokładnej wysokości siatki ze stali nierdzewnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymuj kompozyty na granicy faz powietrze-ciecz przez okres od 10 do 20 dni (dzień 14 do dnia 24), w zależności od wymagań eksperymentu. Podłoże kompozytowe III należy wymieniać na świeże co 2 do 3 dni (poniedziałki, środy, piątki to reżim przyjazny dla użytkownika). 
	Uwaga: Po 5 dniach na granicy faz powietrze-ciecz (dzień 9) konstrukty mają wystarczająco dojrzały nabłonek przełyku, który można wykorzystać w eksperymentach dotyczących wpływu czynników środowiskowych na nabłonek przełyku.</li>
	<li>Pod koniec eksperymentu utrwal konstrukty do analizy histologicznej i barwienia immunohistochemicznego7 lub wyekstrahuj białko15 lub RNA11,16 z nabłonka do dalszej analizy. W razie potrzeby należy zachować kondycjonowaną pożywkę hodowlaną do analizy zewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnałowych17.</li>
</ol>

<ol><li>Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).</li>
<li>Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+on+the+effect+of+bile%2C+and+bile+and+hydrochloric+acid+mixture+on+the+esophageal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Rom.+J.+Morphol.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa.</a> Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).</li>
<li>Andl, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation%2C+migration%2C+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li>
<li>Underwood, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+primary+oesophageal+squamous+epithelial+cells+with+HET-1A+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture.</a> Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).</li>
<li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
<li>Okawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+interplay+between+EGFR+overexpression%2C+hTERT+activation%2C+and+p53+mutation+in+esophageal+epithelial+cells+with+activation+of+stromal+fibroblasts+induces+tumor+development%2C+invasion%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation.</a> Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).</li>
<li>Green, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+characterization+of+an+organotypic+tissue-engineered+human+esophageal+mucosal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model.</a> Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+induces+immortalization+of+human+esophageal+keratinocytes+without+p16INK4a+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation.</a> Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).</li>
<li>Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+buccal+mucosa+for+substitution+urethroplasty%5BTitle%5D)+AND+%22BJU.+Int%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty.</a> BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).</li>
<li>Ralston, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+contract+human+dermal+extracellular+matrix+and+reduce+soluble+fibronectin+production+by+fibroblasts+in+a+skin+composite+model%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model.</a> Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).</li>
<li>Green, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatile+exposure+to+simulated+reflux+leads+to+changes+in+gene+expression+in+a+3D+model+of+oesophageal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa.</a> Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).</li>
<li>Wang, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+culture+of+epithelial+cells+from+primary+breast+carcinomas+using+irradiated+3T3+cells+as+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Res.+Pract%22%5BJournal%5D)">Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer.</a> Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsinizing+and+subculturing+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Trypsinizing and subculturing mammalian cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e755(2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2014).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Am.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).</li>
<li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometric+bead+array%3A+a+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+abnormal+expression+of+retinoic+acid+receptor-beta%2C+p+53+and+Ki67+protein+in+normal%2C+premalignant+and+malignant+esophageal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues.</a> World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).</li>
<li>Moll, R., Divo, M., Langbein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+keratins%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The human keratins: biology and pathology.</a> Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).</li>
<li>Rice, R. H., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+in+human+epidermal+cells+of+a+soluble+protein+precursor+of+the+cross-linked+envelope%3A+activation+of+the+cross-linking+by+calcium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions.</a> Cell. 18 (3), 681-694 (1979).</li>
<li>Eves, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+invasion+in+reconstructed+human+skin+is+influenced+by+skin+cells+-+investigation+of+the+role+of+proteolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy manuskrypt opisuje produkcję i charakterystykę biologicznie istotnego modelu błony śluzowej ludzkiego przełyku, nadającego się do wykorzystania jako platforma eksperymentalna do badania wpływu narażenia na stresory środowiskowe na nabłonek przełyku.
Najważniejszymi etapami pomyślnego wytworzenia modelu ludzkiej błony śluzowej przełyku są: zapewnienie, że większość komórek nabłonka pozostaje proliferacyjna i nie zaczęła się różnicować jeszcze przed umieszczeniem ich na rusztowaniu; ut...

Błona śluzowa przełyku składa się z warstwowego, płaskonabłonkowego nabłonka ponad warstwą tkanki łącznej, blaszką właściwą, i jest jednym z pierwszych miejsc, w których stwierdzono spożycie stresorów środowiskowych. Narażenie na toksyny dietetyczne jest związane z rozwojem raka płaskonabłonkowego przełyku, podczas gdy refluks dwunastniczo-przełykowy jest krytycznym czynnikiem w patogenezie metaplazji Barretta, co wiąże się ze zwiększonym ryzykiem progresji do gruczolakoraka przełyku. Rak przełyku jest ósmym najczęstszym nowotworem złośliwym u mężczyzn w Wielkiej Brytanii, a gruczolakorak przełyku gwałtownie rośnie w świecie zachodnim1. Co więcej, nastąpiła niewielka poprawa w rokowaniu choroby, z ogólnym wskaźnikiem 5-letniego przeżycia wynoszącym około 15%. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na platformy eksperymentalne w celu zbadania wpływu ekspozycji na stresory środowiskowe na ten nabłonek przełyku i ich potencjalny udział w rozwoju metaplazji lub nowotworu.
Chociaż unieśmiertelnione lub nowotworowe linie komórkowe pozwalają badaczom badać reakcję komórek nabłonkowych na te stresory in vitro, pozostają one proliferacyjne i nie różnicują się w dojrzałe komórki nabłonkowe znajdujące się na najwyższych warstwach błony śluzowej przełyku. Co więcej, linie komórkowe, które już przeszły nowotworzenie mogą dostarczać tylko ograniczonych informacji na temat początkowych reakcji normalnych komórek w nabłonku na czynniki środowiskowe; I to jest etap, w którym potencjał interwencji terapeutycznej może być największy. Wreszcie, konwencjonalne systemy hodowli komórkowych nie są w stanie uchwycić potencjalnie ważnych interakcji między komórkami nabłonkowymi i mezenchymalnymi oraz między tymi komórkami a otaczającą macierzą, które zachodzą w tkankach in vivo.
Modele zwierzęce dostarczają bardziej realistycznego mikrośrodowiska do badania reakcji nabłonka przełyku i mogą zawierać sztuczną indukcję choroby refluksowej przełyku2. Jednak manipulowanie stresorami środowiskowymi w tych modelach może być trudniejsze i mogą one nie w pełni reprezentować reakcję w ludzkim przełyku.
Inne eksperymentalne modele ludzkiego przełyku zostały opracowane, które wykorzystują komórki pierwotne, unieśmiertelnione komórki lub linie komórek nowotworowych na kolagenie lub połączonym kolagenie/Matrigelu, rusztowaniu zawierającym fibroblasty3,4. Generowanie tych rusztowań jest mniej pracochłonne niż bezkomórkowe rusztowanie przełyku opisane w tym manuskrypcie, a te modele organotypowe stanowią użyteczne narzędzie, szczególnie w badaniu inwazji guza5,6, gdzie można łatwo zaobserwować infiltrację komórek nowotworowych do żelu kolagenowego. Jednak te żele kolagenowe mają nienatywne właściwości mechaniczne i brakuje im pewnych cech oryginalnej tkanki, w tym specyficznej błony podstawnej i odpowiedniej topografii powierzchni. Może to wpływać na zachowanie komórek, powodując na przykład gorszą przyczepność między nabłonkiem a rusztowaniem podczas stosowania rusztowania z żelu kolagenowego7. W związku z tym opracowano bezkomórkowe rusztowanie przełyku świń, którego zaletą jest to, że jest bardziej realistycznym biologicznie rusztowaniem, a tym samym bardziej odpowiednim do wykorzystania jako platforma doświadczalna. Wykazano również, że lepiej jest włączyć komórki pierwotne do konstruktów przełyku niż unieśmiertelnione linie komórkowe nabłonka przełyku, takie jak Het-1A, ponieważ komórki te tworzą wielowarstwowy nabłonek, ale nie rozwarstwiają się ani nie różnicują4,7,8.
W związku z tym, ten protokół został zaadaptowany z metody już używanej w laboratorium MacNeila do tworzenia tkankowo modyfikowanej błony śluzowej skóry i jamy ustnej9,10 i zawiera pozbawione komórek rusztowanie przełyku świń połączone z pierwotnymi ludzkimi komórkami nabłonka przełyku i fibroblastami. Protokół ten wytwarza dojrzały, warstwowy nabłonek, podobny do nabłonka normalnego ludzkiego przełyku, jak wykazano za pomocą barwienia CK4, CK14, Ki67 i inwolukryny. Powstały w ten sposób model stanowi platformę eksperymentalną do badania reakcji na stresory środowiskowe i został skutecznie wykorzystany do zbadania zmian w ekspresji genów w nabłonku przełyku w odpowiedzi na składniki refluksowe11.

<table><tbody><tr><td>Trypsyna</td><td>BD Biosciences</td><td>215240</td><td>Przygotować 0,1% w/v roztwór w PBS i wysterylizować filtrem. Ciepło w 37&nbsp; &deg; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Labtech</td><td>LM-D1112</td><td>Ciepły w 37&nbsp; &deg; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Labtech</td><td>LM-H1236</td><td>Warm in 37&nbsp; &deg; C Kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Surowica dla cieląt płodowych</td><td>Labtech</td><td>FB-1090</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>R+D Systems</td><td>236-EG-200</td><td>Przygotuj 200 &mikro; g/ml roztwór podstawowy w 10 mM kwasie octowym, 1% FCS</td></tr><tr><td>Hydorkortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396</td><td>Przygotować roztwór podstawowy w PBS i wysterylizować filtr przed użyciem</td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2786</td><td>Przygotować roztwór podstawowy w PBS i wysterylizować filtr przed użyciem</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2767</td><td>Przygotować 10 mg/ml roztwór w 0,01&nbsp; M HCl, rozcieńczyć w stosunku 1:10 w wodzie destylowanej i przefiltrować sterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2036</td><td>Przygotować roztwór podstawowy w wodzie destylowanej i filtrować sterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>Trijodotyronina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2752</td><td>Przygotować roztwór podstawowy w wodzie destylowanej i przefiltrować sterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>Toksyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>Przygotować roztwór podstawowy w wodzie</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td>Nazwa handlowa Fungizone</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Oxoid</td><td>BR0014</td><td>Rozpuścić 1 tabletkę w 100&nbsp; ml wody i autoklawu do sterylizacji</td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td></td></tr><tr><td>roztwór jodu powidonu</td><td>Ecolab</td><td>10830E</td><td>Nazwa handlowa Videne</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla noworodków</td><td>Gibco</td><td>26010074</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>Przygotować roztwór podstawowy w DMEM i przefiltrować sterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td>Przygotować roztwór podstawowy w DMEM i filtrować sterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>Przygotować roztwór podstawowy w DMEM i filtrować sterylizować przed użyciem</td></tr> <tr><td>użycieO-fosforyloetanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0503</td><td>Przygotować roztwór podstawowy w DMEM i przefiltrować, sterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>ITS (insulina, transferyna, selen)</td><td>Lonza</td><td>17-838Z</td><td>Używany do przygotowania pożywek kompozytowych</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td>Ciepły w 37&nbsp; &deg; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Roztwór EDTA 0,02%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008</td><td>Ciepły w 37&nbsp; &deg; C Kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Kolba hodowlana T75</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Fisher</td><td>11819650</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka uniwersalna</td><td>SLS</td><td>SLS7504</td><td></td></tr><tr><td>180 ml</td><td>VWR</td><td>216-2603</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>SLS</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>pierścienie ze stali nierdzewnej</td><td>Wyprodukowano we własnym zakresie - stal nierdzewna klasy medycznej, średnica wewnętrzna 10 mm, średnica zewnętrzna 20 mm</td>siatki stalowe Produkowane we własnym zakresie - arkusze mają otwory o średnicy 0,3 cm, wygięte do produkcji siatki 2&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> cm (szer.) x 2 cm (gł.) x 0,5 cm (wys.)</td></tr> <tr><td>KI67</td><td>Novocastra</td><td>KI67-MM1-L-CE</td><td>Klon MM1. Użyj w 1:100.</td></tr><tr><td>CK4</td><td>Abcam</td><td>ab9004</td><td>Klon 6B10. Użyj o 1:200.</td></tr><tr><td>CK14</td><td>Novocastra</td><td>LL002-L-CE</td><td>Klon LL002. Użyj o 1:200.</td></tr><tr><td>Involucrin</td><td>Novocastra</td><td>INV</td><td>Clone SY5. Użyj w 1:100.</td></tr><tr><td>OE21</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>96062201</td><td></td></tr><tr><td>OE33</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>96070808</td><td></td></tr><tr><td>Het-1A</td><td>ATCC-LGC</td><td>CRL-2692</td><td></td></tr><tr><td>Mysie fibroblasty 3T3</td><td>ATCC-LGC</td><td>CRL-1658</td><td>wcześniej zatrzymane przez napromieniowanie (60 Gy)</td></tr></tbody></table>

produkcja, charakterystyka i potencjalne zastosowania 3d modelu błony śluzowej przełyku dla człowieka opartego na inżynierii tkankowej

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Częstość występowania zarówno gruczolakoraka przełyku, jak i jego prekursora, metaplazji Barretta, gwałtownie rośnie w świecie zachodnim. Ponadto gruczolakorak przełyku ma na ogół złe rokowanie, z niewielką poprawą wskaźników przeżycia w ostatnich latach. Są to trudne warunki do zbadania i brakuje odpowiednich platform eksperymentalnych do badania zaburzeń błony śluzowej przełyku.
W laboratorium MacNeila opracowano model ludzkiej błony śluzowej przełyku, który, w przeciwieństwie do konwencjonalnych systemów hodowli komórkowych 2D, podsumowuje interakcje komórka-komórka i komórka-matryca obecne in vivo i wytwarza dojrzały, warstwowy nabłonek podobny do tego z normalnego ludzkiego przełyku. Krótko mówiąc, model wykorzystuje nieprzekształcone normalne pierwotne ludzkie fibroblasty przełyku i komórki nabłonkowe wyhodowane w bezkomórkowym rusztowaniu przełyku pochodzącym od świń. Charakterystyka immunohistochemiczna tego modelu za pomocą CK4, CK14, Ki67 i barwienia inwolukryny wykazuje odpowiednią rekapitulację histologii prawidłowej ludzkiej błony śluzowej przełyku.
Ten model dostarcza solidny, biologicznie istotny eksperymentalny model błony śluzowej ludzkiego przełyku. Można nim łatwo manipulować w celu zbadania szeregu pytań badawczych, w tym skuteczności środków farmakologicznych i wpływu ekspozycji na czynniki środowiskowe, takie jak alkohol, toksyny, wysoka temperatura lub składniki refluksu żołądkowo-przełykowego. Model ułatwia również wydłużenie okresów hodowli, które nie są osiągalne w przypadku konwencjonalnej hodowli komórkowej 2D, umożliwiając m.in. badanie wpływu powtarzającej się ekspozycji dojrzałego nabłonka na czynnik będący przedmiotem zainteresowania przez okres do 20 dni. Co więcej, różne linie komórkowe, takie jak te pochodzące z guzów przełyku lub metaplazji Barretta, mogą zostać włączone do modelu w celu zbadania procesów, takich jak inwazja guza i reakcja na lek w bardziej istotnym biologicznie środowisku.

Niniejszy manuskrypt opisuje proces niezbędny do skutecznego hodowania trójwymiarowych modeli ludzkiego nabłonka przełyku, przedstawiony schematycznie na Rysunku 1. Aby potwierdzić przydatność modelu jako platformy eksperymentalnej, przeprowadzono badania histologiczne i immunohistochemiczne, porównując hodowane tkanki z prawidłową ludzką błoną śluzową płaskonabłonkową przełyku.
Ocena histologiczna nabłonka wytworzonego metodą opisaną wykazuje dojrzały, wielowarstwowy, wielorz...

Ten manuskrypt opisuje produkcję, charakterystykę i potencjalne zastosowania konstruktu przełyku 3D wykonanego z normalnego pierwotnego ludzkiego fibroblastu przełyku i płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych umieszczonych w pozbawionym komórek rusztowaniu wieprzowym. Wyniki wskazują na tworzenie się dojrzałego nabłonka warstwowego podobnego do normalnego ludzkiego przełyku.

Produkcja, charakterystyka i potencjalne zastosowania 3D modelu błony śluzowej przełyku dla człowieka opartego na inżynierii tkankowej

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie trójwymiarowego inżynieryjnego modelu tkankowego nabłonka przełyku człowieka do wykorzystania jako platforma eksperymentalna. Osiąga się to poprzez wstępną izolację prawidłowych ludzkich fibroblastów przełyku oraz komórek nabłonkowych z próbek tkanki przełyku człowieka. W drugim kroku fibroblasty wysiewa się na pozbawione nabłonka, acellularne, porowate rusztowanie przełyku i inkubuje przez siedem dni.Następnie rusztowanie zostaje odwrócone, a do hodowli dodaje się wyizolowane ludzkie komórki nabłonka przełyku na cztery dni. W ostatnim kroku model przenosi się na granicę powietrze-ciecz na kolejne pięć dni hodowli, aby umożliwić rozwój dojrzałego nabłonka wielowarstwowego. Ostatecznie, w celu charakterystyki kluczowych markerów proliferacji i różnicowania ekspresywnych w komórkach nabłonkowych modelu, stosuje się immunohistochemię.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalną hodowlą komórek 2D jest to, że umożliwia ona zachowanie oddziaływań między komórkami a komórkami oraz między komórkami a macierzą, które występują in vivo. Stosując tę metodę, możemy wytworzyć dojrzały wielowarstwowy nabłonek płaski, podobny do naturalnego nabłonka przełyku. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności z trzech powodów.Po pierwsze, wyzwaniem może być zapewnienie, aby większość komórek nabłonkowych nie uległa różnicowaniu przed ich umieszczeniem w rusztowaniu. Po drugie, należy zadbać o zapewnienie odpowiedniego styku powietrze-ciecz w okresie dojrzewania nabłonka. Po trzecie, wyzwaniem może być utrzymanie jego stabilności przez cały okres hodowli.Aby wyizolować ludzkie komórki nabłonka przełyku, umieść pobraną tkankę błony śluzowej nabłonka wielowarstwowego przełyku w sterylnej szalce Petriego i za pomocą skalpela wysterylizowanego etanolem potnij tkankę na paski o szerokości 0,5 cm. Następnie inkubuj tkankę w 0,1% trypsyny w temperaturze 37 °C, przerywając trawienie po godzinie poprzez dodanie 5 mL FCS. Następnie, trzymając paski pęsetą, delikatnie zeskrob powierzchnię nabłonka ostrzem skalpela przez jedną do dwóch minut na pasek, aby uwolnić komórki nabłonka do otaczającego medium; gdy wszystkie paski zostaną zeskrobione, przenieś medium zawierające oddzielone komórki nabłonka do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL.Po odwirowaniu komórek usunąć sennę i resuspender osad w 12 mililitrach pożywki nabłonkowej. Następnie usunąć pożywkę z hodowli komórek karmiciele i za pomocą sterylnej pipety wysiać komórki nabłonkowe na komórki karmiciele w celu wyizolowania ludzkich fibroblastów przełyku. Przenieść zeskrobane paski tkanki do sterylnej szalki Petriego, a na koniec posiekać tkankę skalpelem.Traw kawałki w 10 ml 0,5% roztworu kolagenazy w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w atmosferze nawilżonej przez noc. Następnego dnia przenieś trawiony materiał do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwiruj komórki. Resuspenduj osad w 10 ml pożywki do hodowli fibroblastów.Kultura w kolbie T 75 w inkubatorze do hodowli komórek. Aby przygotować odkomórkowane rusztowania z przełyku świni, należy najpierw za pomocą nożyczek i pęsety rozciąć przełyk świni wzdłużnie. Następnie przełyk należy myć przez 10 minut w 180 mililitrowym sterylnym naczyniu zawierającym 100 ml sterylnego PBS, delikatnie wstrząsając w celu usunięcia zanieczyszczeń podczas płukania tkanki.Spryskaj korkową deskę do sekcji 70% etanolem, a następnie połóż wysuszony przeływ na desce stroną śluzówkową do góry. Następnie, używając sterylnej pęsety, chwyć powierzchnię śluzówki na jednym z końców przeływu i odciągnij tkankę od deski, aby oddzielić śluzówkę od leżącej pod nią błony podśluzowej. Następnie, używając sterylnego ostrza skalpela, wykonaj nacięcie przeływu wzdłuż błony właściwej, usuwając kolejne piny w miarę postępów sekcji, aby umożliwić odniesienie śluzówki.Usunąć znajdującą się pod spodem błonę podśluzową, a następnie za pomocą skalpela pociąć pozostałą błonę śluzową na kwadratowe kawałki o boku pięciu centymetrów. Przemyć kawałki w 150 mililitrach sterylnego PBS przy delikatnym mieszaniu, zgodnie z zaprezentowaną procedurą. Po pięciu minutach przenieść tkankę do naczynia o pojemności 180 mililitrów zawierającego 150 mililitrów jednomolarnego roztworu chlorku sodu.Uzupełniono antybiotykami w temperaturze 37°C. Po 72 godzinach tkankę przenosi się do 150 ml sterylnego PBS, kiedy to nabłonek zacznie wyraźnie oddzielać się od tkanki podścielistej. Za pomocą sterylnej pęsety i ostrza skalpela należy usunąć oddzielający się nabłonek, a pozostałą tkankę umieścić w nowym naczyniu z 150 ml sterylnego PBS i przemyć trzykrotnie przez pięć minut przy łagodnym wytrząsaniu; następnie tkankę należy przechowywać w glicerolu przez co najmniej cztery miesiące.Aby w pełni wysterylizować rusztowanie, należy rozpocząć przygotowanie modelu błony śluzowej przełyku poprzez rehydratację fragmentów świńskiego rusztowania, które były sterylizowane w glicerolu przez co najmniej cztery miesiące. Proces ten przeprowadza się w 100 mililitrach sterylnego PBS podczas pięciu 10-minutowych cykli mieszania, wymieniając nasycony roztwór na świeży PBS przy każdym płukaniu.Po piątym teście mieszania sprawdź sterylność rusztowania poprzez inkubację przez noc w 100 ml DMEM w temperaturze 37 °C. Następnego ranka przenieś rusztowania do poszczególnych studzienek płytki 6-dołkowej, stroną podśluzówkową do góry. Następnie umieść sterylny pierścień ze stali nierdzewnej klasy medycznej na środku każdego rusztowania i za pomocą sterylnej pęsety delikatnie naciśnij pierścienie pięciokrotnie, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie z tkanką.Umieść pięć ludzkich fibroblastów przełyku w 0,2 mililitrach pożywki do fibroblastów w centrum każdego pierścienia. Następnie zalej obszar wokół zewnętrznej strony pierścienia co najmniej dwoma kolejnymi mililitrami pożywki do fibroblastów i inkubuj rusztowania w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 24 godzinach wyjmij pierścienie i wymień pożywkę w każdej studzience na co najmniej pięć mililitrów świeżej pożywki do fibroblastów.Pożywkę, dbając o to, aby rusztowania były całkowicie zanurzone. Po tygodniu odlać pożywkę i za pomocą pęsety odwrócić rusztowania powierzchnią śluzową do góry. Ponownie umieścić pierścienie na rusztowaniach, a następnie do centrum każdego pierścienia dodać 0,2 mililitrów pożywki kompozytowej zawierającej komórki nabłonkowe.Wypełnij obszar na zewnątrz pierścienia około dwoma mililitrami kompozytowego medium one i przenieś konstrukty z powrotem do inkubatora. Po 24 godzinach usuń pierścienie i zastąp medium w każdej studni co najmniej pięcioma mililitrami świeżego kompozytowego medium one, upewniając się, że rusztowania są całkowicie zanurzone. Po kolejnych 24 godzinach zastąp medium co najmniej pięcioma mililitrami kompozytowego medium two.Czwartego dnia umieść sterylne siatki z medycznej stali nierdzewnej w dołkach nowej płytki 6-dołkowej, a następnie przenieś konstrukty na siatki stroną śluzówkową do góry. Na koniec dodaj wystarczającą ilość pożywki kompozytowej trzy, aby dotarła do dolnej części kompozytu, pozostawiając powierzchnię wystawioną na działanie powietrza, co zapewni utrzymanie próbki na granicy faz powietrze-ciecz. Najtrudniejszym elementem procedury jest ustanowienie granicy faz powietrze-ciecz.Jeśli nie jest jasne, czy siatka styka się z cieczą na końcówce pipety, warto zauważyć, że łatwiej jest dostrzec, gdy końcówka jest zanurzona. Alternatywnie można spróbować delikatnie kołysać płytką, ponieważ ciecz jest łatwiej widoczna w ruchu, a następnie sprawdzić, czy na siatce znajduje się ciecz i czy nie zakrywa ona próbki. Ocena logiczna nabłonka wskazuje na dojrzały, wielowarstwowy nabłonek płaski wielorzędowy, podobny, lecz cieńszy od obserwowanego w normalnym ludzkim przełyku, przy czym komórki stają się stopniowo bardziej płaskie i ostatecznie bezyjądrowe w miarę migracji w stronę powierzchni.Charakterystyka immunohistochemiczna kluczowych markerów proliferacji i różnicowania wykazuje, że mikroanatomia nabłonka w modelu jest podobna do mikroanatomii prawidłowego ludzkiego nabłonka przełyku. Na przykład, porównywalna ekspresja cytokeratyny 14 jest obserwowana zarówno w rodzimym przełyku, jak i w nabłonku modelowym, przy czym barwienie ogranicza się do komórek warstwy podstawnej. Model ten został z powodzeniem zmodyfikowany w celu wprowadzenia komórek nowotworowych poprzez zastąpienie pierwotnych komórek nabłonka komórkami raka, co świadczy o elastyczności tego modelu.Na przykład komórki raka płaskonabłonkowego wytwarzają nabłonek widoczny w konstrukcie jako wyraźny żółty obszar z dużymi szczelinami w obrębie nabłonka, co prawdopodobnie odzwierciedla obecność dysfunkcyjnych cząsteczek cellia; włączenie komórek gruczołowego raka przełyku do modelu skutkuje znaczną degradacją rusztowania, widoczną gołym okiem jako jego pocienienie. Po dwóch tygodniach wzrostu na granicy faz powietrze-ciecz, co zostało potwierdzone w analizie barwienia H i E jako wyraźny spadek grubości rusztowania w obszarze pod komórkami. Po zastosowaniu tej procedury, do tej samej tkanki można zastosować inne metody badania ekspresji genów, takie jak northern lub western blotting, aby odpowiedzieć na pytania, np. w jaki sposób nabłonek reaguje na stresy środowiskowe? Stanowi to zatem niezwykle cenny zasób do bardziej szczegółowego badania kolejnych zagadnień po opracowaniu modelu.Technika ta utorowała drogę badaczom zainteresowanym metaplazją Barretta do badania wpływu ekspozycji na konkretne składniki refluksu na ekspresję genów w prawidłowym ludzkim przełyku.

production-characterization-potential-uses-3d-tissue-engineered-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Produkcja, Charakteryzacja i Potencjalne Zastosowania 3D Tkankowego Modelu Błony Śluzowej Przełyku Człowieka

W tym filmie pokazujemy przygotowanie bezkomórkowego rusztowania przełyku świni, z zachowaną jego biochemiczną architekturą i składem, do zastosowań w inżynierii tkankowej.

Bezkomórkowe przygotowanie rusztowania przełyku świni: technika generowania rusztowania bezkomórkowego z przełyku świni

Ten film opisuje technikę hodowli in vitro do generowania ludzkich organotypowych konstruktów przełyku poprzez kokulturę pierwotnych ludzkich fibroblastów przełyku i płaskonabłonkowych komórek nabłonka w zdecelularowanym rusztowaniu świni. Te modele hodowli 3D naśladują funkcję i fizjologię swoich odpowiedników tkankowych in vivo.

Model hodowli tratwy 3D przełyku: technika hodowli in vitro do generowania modelu błony śluzowej przełyku

Opisano metody tworzenia ludzkich tkanek nowotworowych 3D jako systemów testowych. Technologie te opierają się na bezkomórkowym biologicznym rusztowaniu unaczynionym (BioVaSc), pierwotnych komórkach ludzkich i linii komórek nowotworowych, które mogą być hodowane zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych w bioreaktorze przepływowym.

Inżynieria tkankowa ludzkiego systemu badań 3D nowotworów in vitro

Komórki rosnące w środowisku trójwymiarowym (3D) reprezentują wyraźną poprawę w stosunku do hodowli komórek w środowiskach 2D (np. kolby lub szalki). W tym artykule opisano rozwój wielokomórkowego 3-wymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelita ludzkiego hodowanej w warunkach mikrograwitacji zapewnianej przez bioreaktory o obrotowych ściankach i naczyniach (RWV).

Opracowanie wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelit człowieka hodowanej w warunkach mikrograwitacji

Ekspansja ludzkich pediatrycznych komórek nabłonka przełyku za pomocą warunkowego przeprogramowania dostarcza badaczom specyficznej dla pacjenta populacji komórek, które mogą być wykorzystane do inżynierii konstrukcji przełyku do autologicznej implantacji w celu leczenia wad lub urazów i służyć jako rezerwuar dla terapeutycznych testów przesiewowych.

Warunkowe przeprogramowanie pediatrycznych ludzkich komórek nabłonka przełyku do wykorzystania w inżynierii tkankowej i badaniach chorób

Rekonstrukcja przełyku jest wymagającą procedurą, a opracowanie inżynierii tkankowej przełyku, która umożliwia regenerację błony śluzowej i mięśni przełyku i która może być wszczepiona jako sztuczny przeszczep, jest konieczna. Tutaj przedstawiamy nasz protokół generowania sztucznego przełyku, w tym produkcję rusztowań, hodowlę bioreaktorów i różne techniki chirurgiczne.

Przeszczep inżynierii tkankowej do obwodowej rekonstrukcji przełyku u szczurów

Ten protokół opisuje kluczowe kroki do wygenerowania i scharakteryzowania mysich organoidów 3D ustno-przełykowych, które reprezentują normalne, przednowotworowe i płaskonabłonkowe zmiany rakowokomórkowe wywołane przez chemiczną kancerogenezę.

Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D

Współhodowle organoidów i fibroblastów dostarczają modelu do badania niszy komórek macierzystych in vivo. W tym miejscu opisano protokół dla kokultur organoidów i fibroblastów przełyku. Dodatkowo obrazowanie całego mocowania służy do wizualizacji interakcji fibroblast-organoid.

Charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

To badanie wprowadza nowatorską sub-mikrożelową kąpiel zawiesinową κ-karagenową, wykazującą niezwykłe właściwości odwracalnego przejścia między zakleszczeniem a odblokowaniem. Atrybuty te przyczyniają się do budowy biomimetycznych tkanek i narządów w osadzonym biodruku 3D. Udane drukowanie tkanek przypominających serce/przełyk o wysokiej rozdzielczości i wzroście komórek świadczy o wysokiej jakości biodruku i zastosowaniach inżynierii tkankowej.

Osadzony biodruk struktur tkankopodobnych przy użyciu submikrożelowej pożywki κ-karagenowej

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Odkryj metodę inżynierii tkankowej do tworzenia trójwymiarowego modelu nabłonka przełyku człowieka. Technika wykorzystuje pierwotne komórki ludzkie i dekompozycyjny szkielet wieprzowy.

Produkcja, charakterystyka i potencjalne zastosowania 3D modelu błony śluzowej przełyku dla człowieka opartego na inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal

Produkcja, charakterystyka i potencjalne zastosowania 3D modelu błony śluzowej przełyku dla człowieka opartego na inżynierii tkankowej

Przeglądaj więcej filmów