Name: Deprywacja tlenowo-glukozowa i reoksygenacja jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro do badania dysfunkcji bariery krew-mózg (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro przy użyciu deprywacji tlenowo-glukozowej i reoksygenacji komórek śródbłonka bariery krew-mózg. Ta metoda pozwala badać mechanizmy dysfunkcji BBB.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Scott and White Hospital Research Grants Program za wsparcie finansowe oraz Texas A&M Health Science Center College of Medicine Integrated Imaging Laboratory za korzystanie z konfokalnego mikroskopu laserowego. Dziękujemy Panu Glenowi Cryerowi za pomoc w redagowaniu manuskryptu.

1. Wysiewanie komórek śródbłonka
<ol>
	<li>Pozyskaj pierwotne kultury RBMEC od dorosłych szczurów Sprague Dawley (lub uzyskaj je komercyjnie).</li>
	<li>Hoduj RBMEC na 100 cm pokrytych fibronektyną (50 μg/ml) szalkach Petriego, używając pożywki do wzrostu komórek śródbłonka mózgu szczura. Zmieniaj podłoże co dwa dni, aż do osiągnięcia zbiegu.</li>
	<li>Po osiągnięciu 80-90% zbiegu delikatnie umyj komórki w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), mieszając. Komórki są następnie odłączane, wystawiając je na działanie 1 ml ciepłego 0,25% roztworu kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), w równowadze do 37 °C.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut, aż komórki zostaną oderwane i rozproszone. 
	UWAGA: Dotknij naczynia hodowlanego, aby odłączyć komórki. Zobacz komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić całkowite oderwanie komórek od powierzchni naczynia.</li>
	<li>Dodać 5 ml kompletnej pożywki na szalkę Petriego w celu zneutralizowania trypsyny. Odpipetować pożywkę zawierającą oderwane komórki i zebrać ją do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. .</li>
	<li>Odwirować pożywkę zawierającą komórki śródbłonka przy sile 220 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i zakonserwować komórki zawierające osad. Zawieś osad w 3-5 ml świeżej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka mózgu szczura, delikatnie mieszając ją w górę iw dół za pomocą pipety Komórki zostaną następnie policzone za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórek do fibronektyny (50 μg / ml) wstępnie powlekanego 8-dołkowego sterylnego systemu szkiełek komorowych, 0,7 cm2 / dołek o gęstości wysiewu w zakresie 10 000-15 000 komórek na dołek. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia konfluencji 
	UWAGA: W celu wykonania western blot lub innych eksperymentów komórki można hodować w 10-centymetrowych szalkach do hodowli komórkowych lub specjalnych szalkach, zgodnie z wymaganiami eksperymentu.</li>
</ol>
2. Model deprywacji tlenu i glukozy – reoksygenacja in vitro 
UWAGA: Poniższy protokół został zaadaptowany z Zulueta et al. 1997; Zhu H i wsp. 20128,9.
<ol>
	<li>Użyj systemu hodowli komórek hipoksji, aby zbadać wpływ OGD-R na RBMEC w (patrz rycina 1). Skonfiguruj i skalibruj system hodowli komórek hipoksji przed rozpoczęciem eksperymentu, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wyjąć szkiełka z komorą zlewającą się (krok 1.8) z inkubatora w temperaturze 37 °C. Zastąp całe podłoże w szkiełku komory odtlenionym, niezawierającym glukozy, zmodyfikowanym podłożem Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco i umieść w komorze do hipoksji z 95%, N2 i 5% CO2 przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, aby przedstawić stan OGD.</li>
	<li>Przenieść komórki z powrotem do inkubatora z 95%O2, 5% CO2 w temperaturze 37 °C i zaopatrzyć w świeżą pożywkę z komórek śródbłonka mózgu szczura i inkubować przez kolejną 1 godzinę w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Ten krok reprezentuje sytuację ponownego natleniania.</li>
	<li>Szkiełka z komory należy stosować do lokalizacji immunofluorescencji i znakowania falloidyny rodaminy (patrz punkt 3).</li>
</ol>
3. Immunofluorescencyjna lokalizacja znakowania ZO-1 i f-aktyny za pomocą faroidyny rodaminy 
<ol>
	<li>Szkiełka komory zawierające monowarstwy RBMEC należy wystawić na działanie 100 μl opti-MEM/zredukowanej pożywki surowicy/studzienki przez 1 godzinę. Przemyć szkiełka komory 3 razy w 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,0-7,2).</li>
	<li>Utrwalić komórki za pomocą 100 μl 4% paraformaldehydu w PBS (pH 7,0-7,2) przez 15 minut i umyć szkiełka komory jeszcze 3 razy w PBS (pH 7,0-7,2).</li>
	<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 100 μl 0,5% Triton X-100 w PBS (pH 7,0-7,2) przez kolejne 15 minut. Blok ze 100 μl 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez godzinę. Po tym kroku albo wybarwić/oznaczyć komórki dla ZO-1, albo f-aktyny.
	<ol>
		<li>W celu barwienia immunofluorescencyjnego inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-króliczym przeciwko ZO-1 w stosunku 1:150, przygotowanym w 2% BSA-PBS dla O/N w temperaturze 4 °C. Umyć komórki 3 razy w PBS (pH 7,0-7,2). Inkubować ze 100 μl drugorzędowego przeciwciała przeciw królikowi znakowanemu izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W przypadku znakowania faroidyny rodaminy, po zablokowaniu, należy wystawić komórki na działanie 100 μl falloidyny rodaminy w rozcieńczeniu 1:50, przygotowanej w 2% BSA-PBS, przez 20 min.</li>
		<li>Umyj komórki z barwienia immunofluorescencyjnego i znakowania falloidyną rodaminy w PBS (pH 7,0-7,2). Zamontuj komory za pomocą mediów montażowych zawierających odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizuj komórki za pomocą soczewki zanurzeniowej 60 X, a komórki są skanowane w jednej płaszczyźnie optycznej pod mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycium+barbarum+polysaccharides+reduce+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injuries+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats.</a> Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).</li>
<li>Kaur, C., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+in+hypoxic-ischemic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions.</a> Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).</li>
<li>Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%2C+reperfusion+injury%2C+and+hemorrhagic+transformation+in+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke.</a> Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+the+investigation+of+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental models for the investigation of brain ischemia.</a> Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).</li>
<li>Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+modulates+the+barrier+and+coagulant+function+of+cultured+bovineendothelium.+Increased+monolayer+permeability+and+induction+of+procoagulant+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties.</a> J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).</li>
<li>Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+generation+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cellsexposed+to+anoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation.</a> Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baicalin+reduces+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+during+hypoxia+in+vitro+by+increasing+the+expression+of+tight+junction+proteins+in+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells.</a> J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).</li>
<li>Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+mechanisms+generate+oxygen+free+radicals+in+neurons+and+contribute+to+cell+death+during+anoxia+and+reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation.</a> J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).</li>
<li>Gundimeda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+polyphenols+precondition+against+cell+death+induced+by+oxygen-glucose+deprivation+via+stimulation+of+laminin+receptor%2C+generation+of+reactive+oxygen+species%2C+and+activation+of+protein+kinase+Cepsilon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon.</a> J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).</li>
<li>Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+in+cerebral+ischemia+for+developing+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics.</a> Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).</li>
<li>Alluri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species-Caspase-3+Relationship+in+Mediating+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cell+Hyperpermeability+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation.</a> Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).</li>
<li>Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+and+ROCK+signaling+in+VEGF-induced+microvascular+endothelial+hyperpermeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability.</a> Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin.</a> J Vis Exp. (57), (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

OGD-R jako model in vitro uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego został dobrze przyjęty do badania neuronów10,11. Istnieją również badania wykazujące wpływ OGD na komórki śródbłonka mózgu oraz zmiany w przepuszczalności i integralności TJ9. Jednak nasze badanie pokazuje wpływ OGD, a także reoksygenacji, która jest bliższą reprezentacją niedokrwiennego uszkodzenia reperfuzyjnego w warunkach in vivo , które występują po udarze niedokrwiennym.
Wiadomo, że...

Uraz niedokrwienno-reperfuzyjny (IR) jest częstą przyczyną różnych wyniszczających powikłań i zgonów związanych z udarem, zawałem mięśnia sercowego, urazem, chorobą naczyń obwodowych i urazowym uszkodzeniem mózgu1,2. Uszkodzenie IR w naczyniach mózgowych jest wczesnym wtórnym uszkodzeniem prowadzącym do stanu zapalnego i obrzęku3. Jednym z poważnych powikłań, do których dochodzi w wyniku stresu oksydacyjnego i metabolicznego po zapaleniu, jest utrata równowagi homeostatycznej prowadząca do powstawania wolnych rodników, zmian w barierze krew-mózg (BBB), ścisłych połączeniach (TJ) i przepuszczalności mikronaczyniowej4,5.
Obecnie, modele in vivo używane do badania wpływu uszkodzenia IR na BBB obejmują niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCAO), mikroembolizm oraz zwierzęta transgeniczne lub nokautujące. Jednak każdy z nich ma swoje wady i ograniczenia, jak omówiono w Hossmann6. Model MCAO służy do badania skutków stresu redoks, zmian w komunikacji połączeniowej BBB oraz interakcji między mózgiem a komórkami odpornościowymi. Wiążą się one jednak z różnymi wyzwaniami technicznymi, takimi jak konieczność precyzyjnych procedur mikrochirurgicznych i związane z tym trudności. Mikrozatorowość natychmiast rozbija barierę krew-mózg, podczas gdy wykorzystanie zwierząt transgenicznych lub nokautujących do badania niedokrwienia mózgu może wiązać się z wyzwaniami, takimi jak zależne od genów wpływy molekularne na powstawanie zawału, zmiany w anatomii naczyniowej i zmienna masa ciała6. W związku z tym modele niedokrwienia in vitro cieszą się w ostatnim czasie rosnącym zainteresowaniem, głównie ze względu na ich przydatność w wykonywaniu badań mechanistycznych leków. Wyniki badań in vitro mogą jednak nie odzwierciedlać w pełni badań in vivo i należy je interpretować z ostrożnością6.
Przeciwaktywny wpływ niskich stężeń tlenu na monowarstwy komórek śródbłonka i przepuszczalność mikronaczyń krwionośnych został zbadany przez Ogawa7. Komórki mikronaczyniowe śródbłonka mózgu szczura (RBMEC) wykorzystano do opracowania BBB in vitro. Technika deprywacji i reoksygenacji tlenowo-glukozowej (OGD-R) przedstawiona w tym protokole została zaadaptowana z badań Zulueta i wsp. oraz Zhu i wsp. 8,9. Wystawiliśmy komórki śródbłonka mózgu na działanie OGD-R, umieszczając je w komorze hipoksji/anoksji zawierającej 0% O2, 5% CO2 i 95% N2. Komórki zostały później ocenione pod kątem zmian w integralności TJ i tworzeniu włókien stresowych przy użyciu odpowiednio lokalizacji immunofluorescencyjnej i znakowania falloidyny rodaminy. Barwienie immunofluorescencyjne dla zonula occludens-1 (ZO-1) przeprowadza się w celu określenia integralności TJ, ponieważ ZO-1 jest ważnym białkiem TJ związanym z błoną rusztowania. Znakowanie falloidyny rodaminy określa nitkowatą aktynę (f-aktynę) w cytoszkielecie komórki i jest wyraźnym wskazaniem tworzenia włókien stresowych aktyny w komórkach śródbłonka.
Celem tej metody jest dostarczenie wglądu w rozwój OGD-R jako modelu IR in vitro do badania integralności komórek śródbłonka BBB TJ i tworzenia włókien stresowych f-aktyny. Wyniki dostarczą informacji na temat losów białka TJ, ZO-1 i powstawania włókien stresowych po OGD-R. Zrozumienie tych zależności będzie okazją do określenia podstawowych mechanizmów molekularnych, które są wyzwalane po leczeniu OGD-R i opracowania potencjalnych strategii terapeutycznych w celu wzmocnienia zaburzenia bariery krew-mózg po leczeniu OGD-R.

<table><tbody><tr><td>Proox model 110</td><td>Biospherix</td><td>Model 110</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, bez glukozy</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Life technologies</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Rabbit Polyclonal</td><td>Antibody Life technologies</td><td>617300</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab Tek II-CC 8&nbsp; dobrze sterylne, szkło&nbsp; Slajdy&nbsp;</td><td>Termo scientific</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne przeciwko królikowi oznaczone FITC&nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>sc-2090</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Thermo scientific</td><td>SH 30028.03</td><td>Można użyć dowolnego innego dostępnego PBS</td></tr></tbody></table>

deprywacja tlenowo-glukozowa i reoksygenacja jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro do badania dysfunkcji bariery krew-mózg

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Uraz niedokrwienno-reperfuzyjny (IR) jest znany z tego, że znacząco przyczynia się do zachorowalności i śmiertelności związanej z udarami niedokrwiennymi. Incydenty niedokrwienne naczyń mózgowych stanowią 80% wszystkich udarów. Częstą przyczyną uszkodzenia w podczerwieni jest szybki napływ płynów po ostrym/przewlekłym okluzji krwi, składników odżywczych, tlenu do tkanki, powodując powstawanie wolnych rodników.
Udar niedokrwienny powoduje dysfunkcję bariery krew-mózg (BBB) i naczyniopochodny obrzęk mózgu. Strukturalnie ścisłe połączenia (TJ) między komórkami śródbłonka odgrywają ważną rolę w utrzymaniu integralności bariery krew-mózg (BBB). Uraz IR jest wczesnym urazem wtórnym prowadzącym do niespecyficznej odpowiedzi zapalnej. Stres oksydacyjny i metaboliczny następujący po zapaleniu powoduje wtórne uszkodzenie mózgu, w tym przepuszczalność BBB i zakłócenie integralności połączenia ścisłego (TJ).
Nasz protokół przedstawia przykład in vitro deprywacji i reoksygenacji tlenu i glukozy (OGD-R) na integralność komórek śródbłonka mózgu szczura TJ i tworzenie włókien stresowych. Obecnie do badania skutków uszkodzenia spowodowanego podczerwienią wykorzystuje się kilka eksperymentalnych modeli in vivo; Mają jednak kilka ograniczeń, takich jak wyzwania techniczne związane z wykonywaniem operacji, wpływy molekularne zależne od genów i trudności w badaniu zależności mechanistycznych. Jednak modele in vitro mogą pomóc w przezwyciężeniu wielu z tych ograniczeń. Przedstawiony protokół może być wykorzystany do badania różnych mechanizmów molekularnych i zależności mechanistycznych w celu zapewnienia potencjalnych strategii terapeutycznych. Jednak wyniki badań in vitro mogą różnić się od standardowych badań in vivo i należy je interpretować z ostrożnością.

Komórki hodowane na szkiełkach komorowych Nunc II powlekanych uprzednio fibronektyną poddano OGD-R poprzez umieszczenie ich w komorze Biospherix ProOx model 110. Po poddaniu komórek OGD-R przetworzono je w celu wybarwienia białka połączeń ZO-1 z wykorzystaniem techniki immunofluorescence, jak pokazano na Rysunku 2, oraz oceny organizacji cytoszkieletu wskazującej na tworzenie się włókien stresowych F-aktyny przy użyciu barwienia rodaminą falloidynową, jak pokazano na Rysunku 3. Komórki k...

Uraz niedokrwienno-reperfuzyjny (IR) wiąże się z wysokim wskaźnikiem zachorowalności i śmiertelności. Celem opisanego tutaj modelu deprywacji i reoksygenacji tlenu i glukozy (OGD-R) in vitro jest ocena wpływu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego na różne komórki, szczególnie w komórkach śródbłonka bariery krew-mózg (BBB).

Deprywacja tlenowo-glukozowa i reoksygenacja jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro do badania dysfunkcji bariery krew-mózg

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie roli deprywacji tlenu i glukozy jako in vitro modelu uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego do badania dysfunkcji bariery krew-mózg. Jest to osiągane poprzez poddanie komórek śródbłonka mózgu hodowanych na szkiełkach komorowych deprywacji tlenu i glukozy poprzez zastąpienie pożywki pożywką beztlenową i bezglukozową oraz umieszczenie ich w komorze hipoksyjnej na dwie godziny, po czym komórki są przywracane do normalnych warunków na jedną godzinę w celu uzyskania reoksygenacji. Po przetworzeniu komórek wykonuje się barwienie immunofluorescencyjne dla białka ZO-1 oraz znakowanie aktyny filamentowej za pomocą rodaminy-faloidyny.Następnie komórki obrazuje się przy użyciu obiektywu imersyjnego z wodą 60x w mikroskopie konfokalnym, aby uzyskać pojedyncze przekroje optyczne do analizy. Procedurę zademonstruje Hem Nega, doktorant w moim laboratorium. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować pierwotną hodowlę komórek RBM z dorosłych szczurów linii Sprague Dawley. Dopuszczalne jest również użycie komercyjnie dostępnych linii komórkowych.Hoduj komórki R BM EECS w szalkach o średnicy 100 cm pokrytych fibronektyną w pożywce wzrostowej dla komórek śródbłonka mózgu szczura, wymieniając pożywkę co drugi dzień. Hoduj komórki do momentu osiągnięcia 80 do 90% konfluencji. Następnie delikatnie przemyj komórki pięcioma mililitrami PBS.Następnie odspój komórki od płytki, dodając najpierw jeden mililitr podgrzanego roztworu 0,25% trypsyny z EDTA i delikatnie potrząsając płytką. Następnie inkubuj komórki przez dwie do pięciu minut. Opukaj bok naczynia, aby zwiększyć stopień odspojenia komórek, a następnie obejrzyj je pod mikroskopem, aby potwierdzić ich odspojenie.Aby zakończyć trypsynizację, należy dodać pięć mililitrów pełnej pożywki, a następnie odpipetować pożywkę z ododerwanymi komórkami i przelać ją do probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów. Pożywkę z komórkami wirować przy 220 G przez pięć minut, a następnie odessać i usunąć nadsącz. Następnie osad komórkowy resuspenderować w trzech do pięciu mililitrach świeżej pożywki, delikatnie przepuszczając komórki przez pipetę o pojemności pięciu mililitrów.Następnie należy policzyć komórki i przenieść od 20 do 30 000 z nich do każdej studzienki ośmiostudniowej szkiełka z komorami pokrytymi fibryną i aktyną. Oczywiście, dla innych zastosowań komórki mogą być hodowane w inny sposób. Następnie inkubować szkiełko z komorami do czasu uzyskania konfluencji komórek w preparacie.Przygotuj i skalibruj system do hodowli komórek w warunkach hipoksji. Zgodnie z instrukcjami producenta, środowisko w komorze powinno składać się z 95% azotu i 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37°C. Następnie odtlenuj DMEM pozbawiony glukozy, umieszczając go w komorze hipoksycznej na okres od czterech do sześciu godzin.Rozpocznij stresowanie komórek, zastępując ich pożywkę odtlenionym DMEM pozbawionym glukozy, a następnie umieść komórki w komorze hipoksyjnej na dwie godziny. Po dwóch godzinach przenieś komórki z powrotem do pełnej pożywki dla komórek śródbłonka mózgu szczura. Następnie przeprowadź reoksygenację komórek, przywracając je do normalnych warunków na jedną godzinę.Rozpocznij od poddania każdej studni z monowarstwami R-B-M-E-C działaniu od 100 do 200 µL optymalnej pożywki z redukowaną surowicą i kontynuuj inkubację przez godzinę. Następnie wypłucz szkiełka komorowe trzy razy, używając od 100 do 200 µL PBS na studnię podczas każdego płukania. Utrwal komórki za pomocą 4% paraldehydu w PBS i inkubuj szkiełka przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wypłucz komórki trzy razy PBS-em w sposób opisany wcześniej.Następnie przeprowadź permeabilizację komórek, nakładając od 100 do 200 µL 0,5% Triton X 100 w PBS do każdego dołka, i inkubuj płytkę przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej. Po permeabilizacji komórek nałóż roztwór blokujący i pozostaw go na komórkach na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadź immunofluorescencję dla białka ZO one lub przeprowadź znakowanie F-aktyny.Aby przeprowadzić immunofluorescencję komórek w celu wykrycia białka ZO-1, należy inkubować je z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia komórki należy przemyć trzykrotnie w PBS, w taki sam sposób, jak podczas usuwania utrwalacza. Następnie komórki inkubuje się w 100 do 200 µL przeciwciała wtórnego antykrólika znakowanego FITC przez godzinę w temperaturze pokojowej, aby znakować komórki rodaminą.Po naniesieniu roztworu blokującego na jedną godzinę, inkubować komórki z 100 do 200 µL Rhodamine Phin w rozcieńczeniu 1:50 w 2% B-S-A-P-B-S przez 20 minut. Po inkubacji z przeciwciałem wtórnym lub Rhodamine Phin, ponownie przemyć komórki PBS 3 razy, tak jak wcześniej. Następnie usunąć komory, odklejając gumkę.Przystąp do montowania preparatów na szkiełkach za pomocą medium zawierającego środek zapobiegający blaknięciu i wykonaj obrazowanie DPI. Komórki obrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej w jednej płaszczyźnie przy użyciu obiektywu 60 x. Komórki hodowano w komorze pokrytej fibronektyną.Preparaty na szkiełkach poddano OGDR poprzez umieszczenie ich w komorze hipoksycznej. Zgodnie z opisem. Następnie komórki przygotowano do analizy ZO-1 w złączach.Barwienie komórek kontrolnych wykazało ciągłą integralność złączy, podczas gdy komórki pozbawione tlenu i glukozy miały złącza nieciągłe. Dodatkowo, za pomocą phalloidyny zaobserwowano zmiany w cytoszkielecie, aby uwidocznić aktynę F. W komórkach kontrolnych nie stwierdzono lub odnotowano minimalne tworzenie włókien stresowych aktyny F, natomiast w komórkach poddanych OGDR zaobserwowano zwiększone tworzenie włókien stresowych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu przeprowadzania deprywacji tlenu i glukozy oraz reoksygenacji. Metoda ta może być wykorzystywana jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego do badania bariery krew-mózg, integralności połączeń ścisłych oraz stresu i formowania włókien.

oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Odtwarzanie tlenu i glukozy oraz ponowne natlenienie jako in vitro model uszkodzenia wywołanego niedokrwieniem i reperfuzją do badania dysfunkcji bariery krew-mózg

Źródło: Alluri, H., et.al. Deprywacja tlenowo-glukozowa i redotlenowacja jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro do badania dysfunkcji bariery krew-mózg. J. Vis. Exp. (2015).Film pokazuje wpływ niedoboru tlenu i glukozy oraz późniejszego dotlenienia na komórki mikronaczyniowe śródbłonka mózgu szczura (RBMEC) poprzez symulację stanu niedotlenienia i braku składników odżywczych. Warunki te powodują zubożenie ATP, zwiększenie wewnątrzkomórkowego wapnia i wytwarzanie...

Wpływ deprywacji tlenowo-glukozowej i reoksygenacji na interakcje komórka-komórka

Obustronna niedrożność tętnicy szyjnej w połączeniu z niedociśnieniem ogólnoustrojowym powoduje globalne niedokrwienie mózgu u szczura, powodując uszkodzenie hipokampa z powtarzalnym nasileniem. Zwierzęta są upośledzone z przewidywalnymi wzorcami uszkodzeń mózgu, szybko wracają do zdrowia, a wskaźniki śmiertelności są stosunkowo niskie.

Okluzja / niedociśnienie 2-naczyniowe: szczurzy model globalnego niedokrwienia mózgu

Modele urazowego uszkodzenia mózgu in vitro są opracowywane do odtwarzania deformacji mózgu in vivo. Uraz wywołany rozciąganiem został zastosowany w przypadku astrocytów, neuronów, komórek glejowych, komórek aorty i śródbłonka mózgu. Jednak nasz system wykorzystuje model bariery krew-mózg (BBB), który posiada właściwości stanowiące legalny model bariery krew-mózg, aby ustanowić model TBI in vitro.

Rozciąganie w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (cEND) jako model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu bariery krew-mózg

Przedstawiono protokół dla organotypowych kultur entorhino-hipokampowych, który pozwala na odtworzenie wielu aspektów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu. Badając zmiany układu nerwowo-naczyniowego oprócz zmian w neuronach, protokół ten jest wszechstronnym narzędziem do badania zmian plastycznych w tkance nerwowej po urazie.

Analiza przebudowy nerwowo-naczyniowej w organotypowych kulturach entorhino-hipokampowych plastrów

Ten protokół opisuje powtarzające się wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, czyli krótkie ekspozycje na niedotlenienie ogólnoustrojowe, które zmniejszają objętość zawału i zaburzenie bariery krew-mózg po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy. Szczegółowo opisano również podwójną kwantyfikację objętości zawału i przerwania bariery krew-mózg po udarze, aby ocenić skuteczność ochrony nerwowo-naczyniowej.

Kwantyfikacja ochrony nerwowo-naczyniowej po powtarzającym się kondycjonowaniu wstępnym hipoksyjnym i przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy

Udar niedokrwienny jest złożonym zdarzeniem, w którym trudno jest zbadać specyficzny wpływ astrocytów na dotknięty obszar mózgu narażony na tlen, deprywację glukozy (OGD). W artykule przedstawiono metodologię otrzymywania izolowanych astrocytów oraz badania ich reaktywności i proliferacji w warunkach OGD.

Monitorowanie reaktywności i proliferacji astrocytów in vitro w warunkach podobnych do niedokrwiennych

Celem protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury tworzenia modelu bariery krew-mózg (BBB) in vitro opartego na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu świni (pBECs). Model wykazuje wysoką odtwarzalność, wysoką szczelność i nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym w odkrywaniu leków.

Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie wysoce powtarzalnej techniki oceny in vivo naruszenia bariery krew-mózg w szczurzych modelach udaru niedokrwiennego.

Ocena in vivo przerwania bariery krew-mózg w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Tutaj prezentujemy proste podejście wykorzystujące specyficzne podłoża hodowlane, które pozwala na tworzenie kultur wzbogaconych o neurony i astrocyty, lub kultur gleju neuronów z kory embrionalnej, o wysokiej wydajności i odtwarzalności.

Model hodowli komórkowej do badania roli interakcji neuron-glej w niedokrwieniu

Tutaj opisujemy metodę tworzenia modelu potrójnej hodowli komórkowej bariery krew-mózg na podstawie pierwotnych komórek śródbłonka mikronaczyniowego, astrocytów i perycytów ludzkiego mózgu. Ten wielokomórkowy model nadaje się do badań dysfunkcji jednostek nerwowo-naczyniowych podczas udaru niedokrwiennego in vitro lub do badań przesiewowych kandydatów na leki.

Potrójny pierwotny model hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg do badania udaru niedokrwiennego in vitro

Bariera krew-mózg (BBB) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilnego i zdrowego środowiska mózgu. Dysfunkcja bariery krew-mózg jest związana z wieloma chorobami neurologicznymi. Opracowaliśmy trójwymiarowy model bariery krew-mózg pochodzący z komórek macierzystych, aby zbadać patologię naczyń mózgowych, integralność bariery krew-mózg oraz sposób, w jaki bariera krew-mózg jest zmieniona przez genetykę i chorobę.

Rekonstrukcja bariery krew-mózg in vitro w celu modelowania i terapeutycznego ukierunkowania choroby neurologicznej

Poznaj model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro przy użyciu deprywacji tlenowo-glukozowej i reoksygenacji komórek śródbłonka bariery krew-mózg. Ta metoda pozwala badać mechanizmy dysfunkcji BBB.

Deprywacja tlenowo-glukozowa i reoksygenacja jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro do badania dysfunkcji bariery krew-mózg (Wideo) | JoVE Journal

Deprywacja tlenowo-glukozowa i reoksygenacja jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro do badania dysfunkcji bariery krew-mózg

Przeglądaj więcej filmów